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Artigo de método

Análise Temporal Espacial do Fluxo de Campo na Microvasculatura

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DOI:

10.3791/60493

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18 de novembro de 2019

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1Biocomplexity Institute, Indiana University, 2Department of Intelligent Systems Engineering, Indiana University, 3Department of Physics, Indiana University, 4Scientific Designs, 5Department of Medicine, Indiana University, 6School of Public Health, Indiana University

Neste artigo

Resumo

Para quantificar o fluxo microvascular de sequências de imagem capilar de fluxo de alta velocidade, desenvolvemos o software STAFF (Spatial Temporal Analysis of Fieldwise Flow). Em todo o campo de imagem completo e ao longo do tempo, a EQUIPE avalia as velocidades de fluxo e gera uma sequência de mapas espaciais codificados por cores para visualização e saída tabular para análises quantitativas.

Resumo

As alterações na velocidade e distribuição do fluxo sanguíneo são vitais para manter a perfusão de tecidos e órgãos em resposta às diferentes necessidades celulares. Além disso, o aparecimento de defeitos na microcirculação pode ser um indicador primário no desenvolvimento de múltiplas patologias. Os avanços nas imagens ópticas fizeram da microscopia intravital (IVM) uma abordagem prática, permitindo imagens a nível celular e subcelular em animais vivos em alta velocidade ao longo do tempo. No entanto, apesar da importância de manter a perfusão de tecido adequada, a variabilidade espacial e temporal no fluxo capilar raramente é documentada. Na abordagem padrão, um pequeno número de segmentos capilares são escolhidos para imagens ao longo de um tempo limitado. Para quantificar de forma abrangente o fluxo capilar de uma forma imparcial, desenvolvemos a Análise Temporal Espacial do Fluxo De Campo (STAFF), uma macro para o software de análise de imagem de código aberto de FIJI. Usando sequências de imagem de alta velocidade de campos cheios de fluxo sanguíneo dentro de capilares, staff produz imagens que representam o movimento ao longo do tempo chamado kymographs para cada intervalo de tempo para cada segmento vascular. A partir dos kymographs STAFF calcula velocidades da distância que os glóbulos vermelhos se movem ao longo do tempo, e fornece os dados de velocidade como uma seqüência de mapas espaciais codificados por cores para visualização e saída tabular para análises quantitativas. Em fígados de camundongos normais, a STAFF analisa diferenças profundas quantificadas na velocidade do fluxo entre regiões pericentrais e periportal dentro dos lóbulos. Ainda mais inesperadas são as diferenças na velocidade do fluxo observadas entre os sinusoids que estão lado a lado e flutuações observadas dentro de segmentos vasculares individuais ao longo de segundos. A EQUIPE É uma nova ferramenta poderosa capaz de fornecer novos insights, permitindo a medição da complexa dinâmica espaçotemporal do fluxo capilar.

Introdução

A microvasculatura desempenha um papel crítico na fisiologia, garantindo uma perfusão eficaz de tecidos em condições de mudança. A disfunção microvascular está associada a inúmeras condições, incluindo morbidade cardiovascular e mortalidade a longo prazo, desenvolvimento de demência e doença de fígado e rim e, portanto, é um fator-chave de interesse em uma ampla gama de investigações biomédicas1,2,3,4,5. Embora várias técnicas tenham sido usadas para avaliar a perfusão de tecidos, apenas a microscopia intravital permite a coleta de dados na resolução temporal e espacial necessária para caracterizar o fluxo sanguíneo no nível de capilares individuais.

O fluxo microvascular pode ser visualizado em microscopia de fluorescência pelo movimento de microesferas fluorescentes ou pelo movimento dos glóbulos vermelhos no contexto de marcadores fluorescentes impermeant da membrana (por exemplo, dextran fluorescente-etiquetados ou albumina)6,7. O fluxo microvascular pode ser imageado em camadas de células superficiais usando microscopia widefield ou em profundidade usando microscopia confocal ou multifoton. No entanto, as taxas de fluxo capilar são tais que a passagem de glóbulos vermelhos geralmente não pode ser capturada a velocidades inferiores a 60 quadros/s. Uma vez que a maioria dos microscópios confocal e multifoton de varredura a laser exigem 1-5 s para digitalizar um campo de imagem completo, essa velocidade geralmente pode ser realizada apenas limitando o campo de visão, às vezes a uma única linha de digitalização8. O processo de limitação de medições a segmentos capilares selecionados (1) tem o potencial de introduzir viés de seleção e (2) torna impossível a captura de heterogeneidade espacial e temporal nas taxas de fluxo sanguíneo capilar. Em contraste, imagens de redes capilares podem ser coletadas em velocidades superiores a 100 fps usando microscópios digitais widefield equipados com câmeras científicas complementares de semicondutores de óxido metálico (sCMOS)9,10. Estes sistemas baratos, comuns em laboratórios biomédicos típicos tornam possível a imagem de fluxo microvascular em redes bidimensionais inteiras, essencialmente continuamente. O problema, em seguida, torna-se um de encontrar uma abordagem de análise que é capaz de extrair dados quantitativos significativos dos conjuntos de dados de imagem maciça e complexa gerada pela microscopia de vídeo de alta velocidade.

Para permitir a análise de dados de fluxo de campo completo, desenvolvemos a STAFF, novo software de análise de imagem que pode medir continuamente o fluxo microvascular em campos de microscópio inteiros de séries de imagens coletadas em alta velocidade11. A abordagem é compatível com uma variedade de diferentes sistemas experimentais e modalidades de imagem e o software de análise de imagem STAFF é implementado como um conjunto de ferramentas macro para a implementação de Fiji do ImageJ12. O princípio subjacente usado aqui para visualizar o fluxo microvascular é que, em primeiro lugar, algum contraste deve ser fornecido para ser capaz de imagem dos glóbulos vermelhos dentro de capilares. Em nossos estudos, o contraste é fornecido por uma sonda fluorescente em massa que é excluída pelos glóbulos vermelhos. A velocidade do fluxo pode então ser quantificada a partir do deslocamento dos glóbulos vermelhos que aparecem como uma mancha negativa dentro do plasma fluorescente mente rotulado em imagens coletadas em alta velocidade de um animal vivo8. Em seguida, usamos a EQUIPE para fazer parcelas de distância ao longo de cada segmento capilar ao longo de vários intervalos de tempo chamados kymographs, em seguida, detectar as encostas presentes nos kymographs13,e a partir dessas encostas calcular as taxas de fluxo microvascular. A abordagem pode ser aplicada a imagens coletadas de qualquer leito capilar que possa ser acessado para imagens. Aqui descrevemos a aplicação de IVM e STAFF para estudos de fluxo sanguíneo no fígado.

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Protocolo

Todos os experimentos com animais foram aprovados e realizados de acordo com as diretrizes do Institutional Animal Care and Use Committee da Universidade de Indiana, e aderiram ao guia nrc para o cuidado e uso de animais.

1. Preparação cirúrgica para microscopia intravital

Nota: Isto não é uma cirurgia de sobrevivência. Uma vez iniciada a seção 1 "Preparação cirúrgica para microscopia intravital", os trabalhos não podem ser pausados até a conclusão da seção 2 "Microscopia Intravital".

  1. Aclimatize 9-10 ratos machos C57BL/6, por pelo menos 4 dias e rápido para 16 h antes dos estudos.
  2. Pese o animal, sedado com 5% isoflurane e coloque em uma almofada de aquecimento para manter a temperatura corporal. Use uma taxa de fluxo de oxigênio de 1-2 L/min e mantenha a sedação com isoflurane de 1-2%. Verifique os reflexos por pitada do dedo do dedo do dedo do dedo do dedo do dedo do dia Monitore a temperatura usando um termômetro retal. Monitorar a freqüência cardíaca e respiração visualmente.
  3. Quando a anestesia é estável, raspar a área para a colocação de cannulação jugular e a área abaixo da caixa torácica para a exposição do fígado.
  4. Para a cannulação jugular, faça uma incisão ventral esquerda de 1 cm 1-2 cm abaixo da mandíbula do mouse. Limpe toda a gordura e fáscia em torno da veia jugular. Amarre a extremidade anterior da jugular usando 06 corda de sutura para evitar sangramento.
    1. Faça um pequeno corte na veia jugular e deslize a cânula (30 G x 1/2 em, agulha), suporte de agulha e tubos de polietileno (0,011 x 0,024 polegadas2 ligado a um adaptador de restadura Luer e preenchido com 0,9% saline) em cerca de 1 cm, e seguro na extremidade posterior da jugular usando 0-6 suture string.
  5. Usando a cânula jugular entregar 70 kDa fluorescein dextran (a uma dose de 30 mg/kg através da injeção de 0,1 mL de uma solução de 9 mg/mL em sorino).
  6. Expor o fígado para a imagem, fazendo uma incisão de 4-6 cm em todo o tronco, 1-2 cm abaixo do meio da caixa torácica.
  7. Coloque um molhado (embebido em 0,9% saline) 2 x 2 polegadas2 esponja de gaze abaixo do lobo do fígado lateral esquerdo. Coloque a fita na periferia da janela de vidro de um prato de 40 mm com fundo de capa e aplique adesivo de cianoacrilato à fita. Pressione a placa de vidro para o fígado e usando aplicadores de algodão derrubado pressione a gaze na cola na fita para minimizar o movimento do tecido para microscopia.
  8. Mova o animal para o estágio do microscópio. Adicione a soro-a-leiina estérel de 0,9% no prato com fundo de deslizamento de capa para manter o fígado úmido durante toda a sessão de imagem. Mantenha a temperatura em 36-37 °C através das almofadas de aquecimento montadas no estágio, uma almofada de aquecimento coloc sobre o animal e um calededor objetivo.

2. Microscopia Intravital

  1. Realize microscopia intravital em um microscópio de epifluorescência invertida equipado com uma câmera de vídeo capaz de captura de imagem de alta velocidade.
    Nota: Aqui, uma lâmpada de arco Xenon, excitação específica de fluoresceina (480-500 nm) e filtros de emissão (507-543 nm), Plano Fluor 20x, N.A. 0,75 objetivo de imersão de água e uma câmera sCMOS de alta velocidade foram usadas.
  2. Selecione a área de interesse para a análise do fluxo sanguíneo capilar usando iluminação mínima.
  3. Defina o tempo de exposição curto o suficiente para que a câmera seja capaz de adquirir 100 fps. Ajuste o nível da iluminação para visualizar claramente sombras vermelhas da pilha de sangue e a topologia da vasculatura ao igualmente evitar a fototoxicidade e o photobleaching da ponta de prova fluorescente.
  4. Coletar imagens a uma taxa de 100 fps. Defina a resolução de pixels da câmera entre ~0,65 e ~1,3 μm/pixel. Defina o tamanho do quadro entre 512 x 512 e 1024 x 1024 pixels. Definir pouco de profundidade entre 8 e 16 bits. Use a maior resolução, tamanho do quadro e profundidade de bit que ainda permite a coleta de imagem de 100 fps no sistema.
  5. Economize o arquivo da série de tempo (s) como uma seqüência de arquivos TIF ou como formato de câmera/microscópio nativo se bioformatos14 em FIJI puderem abrir os arquivos de formato nativo.
  6. Imagem várias áreas ao longo do tempo. Mantenha o mouse no estágio do microscópio por até 2 h. Eutanasiar o mouse no final da imagem.
    Nota: A duração da série de tempo será baseada em equilibrar a necessidade de imagem por um intervalo de tempo que abrange a variabilidade, sem afetar a viabilidade do tecido. A duração da série de tempo também pode ser ditada por considerações de tamanho do arquivo; uma série de tempo de 1 min de 1024 x 1024 pixel 16 bits imagens coletadas em 100 fps irá gerar um arquivo que é de 12 GB de tamanho. Considerações de tamanho do arquivo também podem ditar o tamanho do quadro e a profundidade do bit usada. Não há limites de tamanho explícitos dentro do STAFF.

3. Definir a rede vascular usando TrakEM2 em FIJI

Nota: O protocolo pode ser pausado após o trabalho de poupança em qualquer ponto da seção 3.

  1. Baixe e instale FIJI de https://imagej.net/Fiji/Downloads.
    Nota: Versão 1.51n de Fiji foi usado para este projeto, e pode ser baixado de https://downloads.imagej.net/fiji/Life-Line/fiji-win64-20170530.zip. Note que no Windows, FIJI deve ser instalado no espaço do usuário e não em arquivos do programa.
  2. Abra o arquivo do filme em FIJI usando Arquivo > Aberto ou usando Arquivo > Importação > Sequência de imagem. Selecione uma única imagem das imagens estáveis entre respirações onde a topologia da rede vascular é fácil de ver. Selecione Image > Duplicar e duplicar a imagem única selecionada (não a pilha) e salvar a imagem em uma nova pasta. Não inclua espaços em nomes de arquivos ou pastas.
  3. Configure um novo projeto trakem2 em branco selecionando File > New > TrakEM2 (em branco). Selecione a nova pasta contendo a única imagem do filme como a pasta do projeto. As janelas trakem2 serão abertas.
  4. Clique à direita na principal área de trabalho e selecione Import > Imagem de Importação . Navegar para a única imagem salva na etapa 3.3 e selecioná-la.
  5. Clique direito na área de trabalho principal novamente e selecione Display > Autoresize tela /Camada definida. Clique à esquerda na janela de trabalho principal. A imagem encherá a área de trabalho.
  6. Para selecionar as áreas na imagem que contêm a rede vascular, a seleção da lista da área da configuração em TrakEM2. Na janela trakem2 menor (modelo, objetos do projeto, camadas) clique direito em "• qualquer coisa". Selecione Adicionar nova lista de crianças > área.
  7. Na janela trakem2 menor, arraste "Template > qualquer coisa" para "Project Objects > projeto". Em seguida, arraste "Template > qualquer coisa > • lista de área" para "Project Objects > projeto > qualquer coisa". Em "Project Objects > project > anything", • a lista de áreas agora estará presente.
  8. Na janela trakem2 principal a guia espacial Z, uma lista de área sacada em barra foi criada. Clique para selecioná-lo. Na janela principal trakem2 também selecionar a ferramenta pincel. Pressione shift e role a roda do mouse para selecionar um tamanho apropriado para o pincel, por exemplo, menor do que o diâmetro da vasculatura. Para salvar as chaves trakem2 de controle de imprensa de configuração + S.
  9. Pinte a rede vascular usando a ferramenta de pincel. Para apagar alt enquanto estiver usando a ferramenta de pincel. Não inclua regiões fora de foco. Economize com frequência usando controle + S.
  10. Quando a rotulagem da rede vascular estiver completa, clique à direita na janela principal do TrakEM2 e selecione Export > AreaLists como rótulos (tif). Na janela pop-up selecione Escala 100% e ExportA Lista de toda a área. Feche as janelas TrakEM2 e escolha sim para salvar projeto.
  11. A imagem de AreaLists abrirá e pode aparecer como uma imagem preta em branco. No menu principal fiji selecione imagem > ajuste > brilho/ contraste. Na janela B&C pressione o botão de automóvel e o AreaList ficará visível. No menu principal fiji selecionar Imagem > Lookup Tables > Invert LUT. Salve esta imagem de etiquetas pretas em fundo branco e feche a imagem.
  12. Abra o arquivo de etiquetas em FIJI. Selecione Plugins > Skeleton > Skeletonize. Salve a imagem esqueletizada como um tif. Use o arquivo skeleton.tif como um dos arquivos de entrada necessários para executar a análise de fluxo da EQUIPE. Ao salvar o arquivo, não use espaços no nome do arquivo.
  13. Edite manualmente o arquivo esqueleto conforme necessário, colocando uma lacuna (usando a ferramenta de tinta)no desenho de linha, por exemplo, em locais onde os ramos da vasculatura não foram capturados porque saem do plano de imagem.

4. Prepare a seqüência do filme para a análise da equipe de funcionários

  1. Abra o arquivo do filme em FIJI usando Arquivo > Aberto ou Arquivo > Importação > Sequência de imagem. Selecione um período de tempo da seqüência de imagem para análise de fluxo (pode ser segundos a minutos, centenas a dezenas de milhares de quadros), onde a posição do tecido permaneceu estável ao longo do tempo, exceto durante a respiração.
  2. Selecione Image > Duplicar e duplicar a parte selecionada da seqüência, digitando os números dos quadros de início e fim. Verifique a calibração espacial e temporal de imagem em Image > Propriedades e corrigir, se necessário. Salve o arquivo de imagem como um TIF (ou como um AVI não comprimido). Este movie.tif é necessário como um arquivo de entrada para executar a análise pessoal. Não inclua espaços no nome do arquivo.

5. Instalar macros pessoal em FIJI

NOTA: (Importante) Pastas múltiplas dentro dos subdiretores da pasta FIJI têm nomes de arquivos semelhantes, alguns capitalizados, outros não. Tenha certeza de que as pastas corretas são selecionadas ao instalar o PESSOAL.

  1. Baixe as macros staff de https://github.com/icbm-iupui/STAFF.
  2. Para instalar, primeiro abra a pasta FIJI.
    1. No Windows encontrar a pasta onde FIJI é instalado no espaço do usuário, mais comumente na área de trabalho. No MacOS encontre o ícone fiji na pasta de aplicativos, clique à direita e selecione Open.
  3. Na pasta FIJI, abra a pasta de plugins. Dentro da pasta dos plugins, abra a pasta Macros. Copie STAFF.ijm nesta pasta Macros: Fiji\plugins\Macros\STAFF.ijm.
  4. Na pasta FIJI, abra a pasta de plugins. Copie STAFF_Dir.jar nesta pasta plugins: Fiji \plugins\STAFF_Dir.jar.
  5. Na pasta FIJI, abra a pasta macros. Dentro desta pasta macros, abra a pasta AutoRun. Copie STAFF_Loader.ijm nesta pasta AutoRun: Fiji\macros\AutoRun\STAFF_Loader.ijm.
  6. Iniciar FIJI e verificar a instalação macro. Para verificar a instalação, selecione Plugins > Macros. Quando instalado corretamente, o menu de entrega incluirá: Projeto open-create, analise esqueleto, edite intervalos de tempo, analise o fluxo e produza o mapa espacial.
  7. Se esses comandos não estiverem presentes no menu Macros, selecione Plugins > Macros > Instale,abra a pasta Fiji\plugins\Macros, selecione o arquivo STAFF.ijm e clique no botão OK. Os comandos devem agora aparecer no menu Plugins > Macros.

6. Quantificar o fluxo vascular usando a equipe de funcionários

  1. Criar um novo projeto.
    1. Selecione Plugins > Macros > Projeto Open-Create e siga solicitações para criar ou atualizar um arquivo de configuração.
    2. A partir do menu Open-Create Project, navegue e selecione o Diretório do Projeto, a Pasta de Arquivos de Entrada e os arquivos de entrada Movie.tif e Skeleton.tif. Eite os nomes de arquivos de saída auto-preenchidos, se necessário.
    3. Valores de entrada para o comprimento mais curto do segmento (20 μm), velocidade máxima medida (2.000 μm/s) e velocidade máxima mapeada (1.000 μm/s).
      Nota: O produto do comprimento mais curto do segmento e dos quadros por segundo dá a velocidade máxima do fluxo que pode teòrica ser medida. As maiores velocidades de fluxo capilar relatadas na literatura são em torno de 2.000 μm/s15. No fígado, observamos que as velocidades capilares de fluxo geralmente em média em torno de 300 μm/s e raramente excediam 1.000 μm/s.
    4. Digite os valores para o tamanho do pixel e taxa de quadros para a seqüência de imagem (a partir de metadados de imagem ou notas experimentais). Esses valores exigem a entrada do usuário. Verifique a caixa de correção flicker se as imagens tiverem cintilação periódica de intensidade de fundo.
    5. Selecione parâmetros para melhor visualização dos dados. Selecione a velocidade máxima mapeada para incluir cerca de 95% dos dados para que os dados sejam mapeados em toda a gama da escala de cores. A EQUIPE mapeia outliers de alta velocidade para a extremidade de alta velocidade da escala de cores.
  2. Analise o esqueleto.
    1. Selecione Plugins > Macros > Analise esqueleto. O arquivo skeleton.tif será aberto e o Gerente da Região de Interesse (ROI) abrirá e funcionará.
      Nota: Analise skeleton classifica cada pixel por seu número de vizinhos como em um ponto final, em uma junção ou dentro de um segmento. Para cada segmento, um número de identificação (número de identificação), um comprimento de ramo calibrado e as coordenadas espaciais das extremidades do ramo são registrados.
    2. Aguarde que as didas do segmento apareçam no esqueleto, a lista de segmentos apareça no gerente do ROI e um pop-up indicando que o arquivo roi manager para o esqueleto é salvo. Clique OK.
    3. Verifique se entre os movimentos respiratórios, o esqueleto permanece sobre onde os glóbulos vermelhos passam pelo capilar (por exemplo, não a borda e não fora do capilar). Exibir os segmentos rotulados como uma sobreposição no filme, abrindo o arquivo do filme, em seguida, arrastando o arquivo zip ROI para o filme aberto. Jogue o filme com os segmentos sobrepostos.
  3. Selecione intervalos de tempo.
    1. Selecione Plugins > Macros > Select Time Intervals. Espere enquanto a macro gera um kymograph de um único segmento ao longo do tempo total para o filme. A partir deste kymograph, o usuário seleciona intervalos de tempo para análise. Use controle + + chaves para aumentar o tamanho do kymograph, se necessário.
    2. A ferramenta de seleção do retângulo é ativada automaticamente. Desenhe um retângulo em torno de cada intervalo de tempo. Um bom ponto de partida para o comprimento do intervalo de tempo é o intervalo de 1-2 entre as respirações, que são aparentes como regiões borradas horizontais no kymograph.
    3. Clique na tecla T ou no botão Adicionar no gerente de ROI para registrar seleções de intervalo de tempo. Repita por tantos intervalos de tempo quanto desejado. Faça seleções sequencialmente do topo (ou esquerda) para baixo (ou direita) do kymograph.
    4. Avalie as opções de parâmetros (do Open-Create Project) selecionando um pequeno número de intervalos de tempo (3 a 4) e completando a análise para apenas esses intervalos, uma vez que o Fluxo de Análise (o próximo passo) pode levar horas para grandes conjuntos de dados.
    5. Clique ok no Fazer um ROI para cada janela intervalo de tempo quando feito. Uma janela pop-up aparece quando os intervalos selecionados foram salvos na Pasta do Projeto. Clique OK.
  4. Analise o fluxo.
    1. Selecione Plugins > Macros > Analise o fluxo e a caixa de diálogo analisação dos parâmetros de fluxo abre e exibe os valores inseridos na etapa do Projeto Open-Create. Eite, se necessário, em seguida, clique OK.
    2. A caixa de diálogo Output File Names abre e exibe os nomes inseridos na etapa do Projeto Open-Create. Eite, se necessário, em seguida, clique OK.
    3. Uma caixa de diálogo abre perguntando se o usuário está pronto para começar a análise. Clique OK e a análise começará. Aguarde uma caixa de diálogo que se abre para indicar quando a Análise de Fluxo estiver concluída.
      Nota: O tempo necessário depende da velocidade do processador e do tamanho do conjunto de dados.
    4. Confirme que os arquivos de resultados foram armazenados como arquivos de planilha de formato .csv na Pasta do Projeto.
      Nota: Os arquivos de saída incluem: segment_velocities.csv contém valores de velocidade que têm valores positivos e negativos indicando direção de fluxo. As células que representam segmentos inferiores ao comprimento mínimo contêm o texto SHORT. Células com valores de velocidade maiores do que a velocidade máxima medida contêm o texto OUT (para outlier). kym_ang.csv contém ângulos de kymografia medidos pelo plugin directionality em FIJI. good_fit.csv contém bondade de ajuste de uma curva para a distribuição de ângulos medidos a partir de cada kymograph. Pobre bondade de ajuste (< 0,8) pode indicar pontos de ramificação ocultos em um segmento, mudança de velocidade durante o intervalo de tempo, lâmpada ou cintilação de luz do quarto.
    5. Verifique se segment_velocities.csv contém poucos valores out. Se houver um grande número de valores de OUT, verifique se o comprimento mínimo do segmento para analisar não é inferior a 15-20 μm, em seguida, reexecutar analisar o fluxo. Se o novo segment_velocities.csv ainda contém uma grande proporção de valores out, em seguida, verifique a caixa de correção de cintilação, em seguida, reexecutar analisar fluxo.
  5. Produzir mapas espaciais.
    1. Selecione Plugins > Macros > Produzir Mapa Espacial e a janela de parâmetros do mapa espacial será aberta, exibindo os valores inseridos na etapa do Projeto Open-Create. Eite, se necessário, ou para continuar a selecionar OK.
    2. Veja como uma seqüência temporal de mapas espaciais de velocidades de fluxo é gerada com cor indicando velocidade de fluxo. A saída é na forma de uma pilha de imagem .tif com uma imagem para cada intervalo de tempo. Percorra a pilha .tif para visualizar a variação espacial e temporal no fluxo. Salve a pilha como um arquivo AVI (descomprimido para a portabilidade máxima) para compartilhar como um filme.

7. Análise quantitativa usando a saída da equipe de funcionários

  1. Abra o arquivo segment_velocities.csv em uma planilha ou programa de análise estatística. Esses valores têm sinal positivo ou negativo que indica direção de fluxo em relação aos pontos de partida/parada desse segmento (registrados no arquivo ROI do Segmento).
  2. Faça uma nova página de planilha contendo os valores absolutos de todos os valores de velocidade. Use esses valores para calcular a velocidade média geral do fluxo, a velocidade média do fluxo para todos os segmentos vasculares ao longo do tempo, a velocidade do fluxo para cada segmento vascular ao longo do tempo e faça histogramas de distribuições de velocidade.
  3. Calcule valores em torno de regiões morfológicas específicas, ou de outras regiões de interesse, encontrando primeiro os segmentos relevantes específicos no esqueleto rotulado e, em seguida, realizando análises sobre esses segmentos selecionados.

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Resultados

A análise da equipe gera um censo completo de velocidades microvasculares em campos de microscópio inteiros ao longo de períodos de tempo que se estende de segundos a minutos. Os resultados representativos são apresentados na Figura 1, Figura 2, Figura 3e Figura 4. A Figura 1 mostra um exemplo de uma série temporal da rede microvascular no fígado de um camundongo, a geração...

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Discussão

Há vários passos críticos neste protocolo. Primeiro, a minimização do movimento durante a imagem intravital do fígado é essencial para gerar filmes que são utilizáveis para análise de fluxo capilar usando staff. Devido à proximidade do diafragma, ocorrem curtos períodos de movimento induzido pela respiração, com o fígado seguro retornando à sua posição inicial após cada respiração. Proteger o fígado exposto cirurgicamente contra o prato com fundo de coverslip usando gaze, em seguida, a imagem de baixo usando um microscóp...

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Divulgações

Os autores não relatam nenhum interesse concorrente.

Agradecimentos

Estudos apresentados aqui foram apoiados por financiamento dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH U01 GM111243 e NIH NIDDK P30 DK079312). Estudos de microscopia intravital foram realizados no Indiana Center for Biological Microscopy. Agradecemos ao Dr. Malgorzata Kamocka por assistência técnica com microscopia.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
# 5 fórcepsFine Science Tools11251-20Dumont # 5 Inox Fórceps
C57BL / 6 camundongosJackson Labsmacho 9-12 semanas de idade
CânulaInstechBTPE-10Tubo de polietileno 0,011 x 0,024 polegadas
Câmera CMOSHamamatsuC11440-42U304.0LT Scientific CMOS
Prato com fundo de lamínulaMicroscopia eletrônica SciencesWillCo Tesoura de dissecação com fundo de vidro GWST5040
de ciências
fiais Fiji ImageJ Softwarehttps://fiji.sc/ ; https://downloads.imagej.net/fiji/Life-Line/fiji-win64-20170530.zip
Fluoresceína dextranaThermo Fisher, InvitrogenD1822Dextran, Fluoresceína, 70.000 MW, aniônico, lisina fixável
Esponja de gazeFisher22-415-5042x2 polegadas Dukal esponjas de gaze estéril
Almofada de aquecimentoReptithermRH-4entre o mouse e o palco
Almofada de aquecimentoSunbeam000732-500-000Usobre o mouse
Microscópio de epifluorescência invertidaNikonNikon TiE microscópio invertido
Isis Rodent barbeador elétricoBraun AesculapGT420
IsofluoranoAbbott GmbHPZN4831850
Adaptador de ponta LuerFisher14-826-19EAdaptador de cateter
Micro tesoura CastroViejo
Objetiva de microscópioNikonPlan Fluor 20x, NA 0,75 agulha de imersão em água
Fisher30 G x1/2"
Agulha suporteOlsen-Hegar
Aquecedor de objetivaBioScience ToolsMTC-HLS-025Controlador de temperatura com aquecedor de objetiva
Termômetro retalBraintree Scientific, INCTH-5AMonitoramento da temperatura corporal do mouse
STAFF macroshttps://github.com/icbm-iupui/STAFF
Cordão de suturaHarvard Bioscience723288sutura de seda preta
Ferramentas de análise de imagem

Referências

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