Artigo de método

Análise Quantitativa do Lipidome Celular de Saccharomyces Cerevisiae Usando Cromatografia Líquida Juntamente com Espectrometria de Massa de Tandem

DOI:

10.3791/60616

⸱

8 de março de 2020

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Concordia University, 2Department of Chemistry and Biochemistry, Centre for Biological Applications of Mass Spectrometry, Concordia University

Neste artigo

Resumo

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Apresentamos um protocolo utilizando cromatografia líquida juntamente com espectrometria de massa tandem para identificar e quantificar os principais lipídios celulares em Saccharomyces cerevisiae. O método descrito para uma avaliação quantitativa das principais classes lipídicas dentro de uma célula de levedura é versátil, robusto e sensível.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lipídios são moléculas anfípticas estruturalmente diversas que são insolúveis em água. Os lipídios são contribuintes essenciais para a organização e função das membranas biológicas, armazenamento e produção de energia, sinalização celular, transporte vesicular de proteínas, biogênese organela e morte celular regulada. Como a levedura brotante Saccharomyces cerevisiae é um eucariote unicelular passível de análises moleculares completas, seu uso como organismo modelo ajudou a descobrir mecanismos que ligam o metabolismo lipídico e o transporte intracelular a processos biológicos complexos dentro de células eucarióticas. A disponibilidade de um método analítico versátil para a avaliação quantitativa robusta, sensível e precisa das principais classes de lipídios dentro de uma célula de levedura é crucial para obter insights profundos sobre esses mecanismos. Aqui apresentamos um protocolo de utilização de cromatografia líquida juntamente com espectrometria de massa tandem (LC-MS/MS) para a análise quantitativa dos principais lipídios celulares de S. cerevisiae. O método LC-MS/MS descrito é versátil e robusto. Permite a identificação e quantificação de inúmeras espécies (incluindo diferentes formas isóbaras ou isóricas) dentro de cada uma das 10 classes lipídicas. Este método é sensível e permite a identificação e quantitação de algumas espécies lipídicas em concentrações tão baixas quanto 0,2 pmol/μL. O método tem sido aplicado com sucesso na avaliação de lipidomas de células inteiras de levedura e suas organelas purificadas. O uso de aditivos de fase móvel alternativos para espectrometria de massa de ionização eletrospray neste método pode aumentar a eficiência da ionização para algumas espécies lipídicas e, portanto, pode ser usado para melhorar sua identificação e quantitação.

Introdução

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Um conjunto de evidências indica que os lipídios, uma das principais classes de biomoléculas, desempenham papéis essenciais em muitos processos vitais dentro de uma célula eucariótica. Esses processos incluem a montagem de bicamadas lipídicas que constituem a membrana plasmática e as membranas ao redor de organelas celulares, o transporte de pequenas moléculas através das membranas celulares, a resposta a alterações no ambiente extracelular e transdução de sinal intracelular, geração e armazenamento de energia, importação e exportação de proteínas confinadas a diferentes organelas, tráfico vesicular de proteínas dentro do sistema de endomembrana e secreção de proteínas, e vários modos de regulação da célula ,2,3,4,5,6,7,8,9,10.

A levedura brotante S. cerevisiae, um organismo eucaótico unicelular, tem sido usada com sucesso para descobrir alguns dos mecanismos subjacentes aos papéis essenciais dos lipídios nestes processos celulares vitais4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 ,16,17,18,19,20. S. cerevisiae é um organismo modelo valioso para a descoberta desses mecanismos, pois é passível de análises abrangentes bioquímicas, genéticas, biológicas, biológicas químicas, biológicas do sistema e microfluidas21,22,23,24,25. Avanços adicionais na compreensão de mecanismos através dos quais o metabolismo lipídico e o transporte intracelular contribuem para esses processos celulares vitais requer tecnologias sensíveis de espectrometria de massa para a caracterização quantitativa do lipidome celular, compreensão da complexidade molecular lipidome e integração de lipidomia quantitativa em uma plataforma multidisciplinar de biologia de sistemas1,2,3,26, 27,28,29,30.

Os métodos atuais para a lipdomia quantitativa assistida por espectrometria de massa de células de levedura e células de outros organismos eucaóticos não são suficientemente versáteis, robustos ou sensíveis. Além disso, esses métodos atualmente utilizados são incapazes de diferenciar várias espécies lipídicas isobarricas ou isóricas umas das outras. Aqui descrevemos um método versátil, robusto e sensível que permite o uso de cromatografia líquida juntamente com espectrometria de massa tandem (LC-MS/MS) para análise quantitativa dos principais lipídios celulares de S. cerevisiae.

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Protocolo

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1. Preparação de mídia estéril para cultivar levedura

  1. Prepare 90 mL de um meio YP completo que contenha 1% (c/v) de extrato de levedura e 2% (c/v) bactopepnona.
  2. Preparar 90 mL de um meio ynb mínimo sintético contendo 0,67% (c/v) base de nitrogênio de levedura sem aminoácidos, 20 mg/L -histidina, 30 mg/L -leucina, 30 mg/L -lysina e 20 mg/L uracil.
  3. Divida 90 mL do meio YP completo igualmente em dois frascos erlenmeyer de 250 mL (ou seja, 45 mL cada).
  4. Divida 90 mL do meio sintético mínimo YNB em dois frascos Erlenmeyer de 250 mL (ou seja, 45 mL cada).
  5. Autoclave os frascos com mídia YP e YNB a 15 psi/121 °C por 45 min antes de usar.

2. Cepa de levedura

  1. Use a cepa tipo selvagem BY4742(MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0).

3. Cultivar levedura no meio YP completo com glicose

  1. Autoclave uma solução de estoque de 20% (w/v) de glicose a 15 psi/121 °C por 45 min antes de usar.
  2. Adicione 5 mL da solução estéril de 20% (c/v) de glicose a cada um dos dois frascos Erlenmeyer contendo o meio YP estéril para uma concentração final de glicose de 2% (c/v).
  3. Use um laço microbiológico para inocular células da cepa do tipo selvagem BY4742 em cada um dos dois frascos Erlenmeyer contendo o meio YP com glicose.
  4. Cultura as células durante a noite a 30 °C com agitação rotacional a 200 rpm.
  5. Pegue uma alíquota da cultura da levedura. Use um hemocímetro para determinar o número total de células de levedura por mL de cultura.

4. Transferir levedura para e cultivar-as no meio sintético mínimo YNB com glicose

  1. Adicione 5 mL da solução estéril de 20% (c/v) de glicose a cada um dos dois frascos Erlenmeyer contendo o meio YNB estéril a uma concentração final de glicose de 2% (c/v).
  2. Use uma pipeta estéril para transferir um volume da cultura de levedura durante a noite que contenha o número total de células 5.0 x 107 em cada um dos dois frascos Erlenmeyer contendo o meio YNB com glicose.
  3. Cultura as células por pelo menos 24 h (ou mais, se o experimento exigir) a 30 °C com agitação rotacional a 200 rpm.

5. Preparação de reagentes, labware e equipamentos para extração lipídica

  1. Prepare-se o seguinte: 1) alto grau (>99,9%) clorofórmio; 2) alta nota (>99,9%) metanol; 3) Solução de hidróxido de amônio (v/v) em água nano-pura; 4) contas de vidro (lavadas com ácido, 425-600 μM); 5) um vórtice com adaptador apropriado; 6) tubos de centrífuga de vidro de alta velocidade de 15 mL com tampas forradas de politetrafluoroetileno; 7) 17:1 e 2:1 misturas de clorofórmio e metanol; 8) uma mistura de clorofórmio/metanol (2:1) com hidróxido de amônio de 0,1% (v/v); 9) Solução ABC (bicarbonato de amônio de 155 mM, pH = 8,0); 10) uma mistura de normas lipídicas internas preparadas em uma mistura de 2:1 de clorofórmio e metanol conforme indicado na Tabela 1; e 11) frascos de amostra de vidro de 2 mL com tampas forradas de politetrafluoetileno para extração de lipídios celulares.

6. Preparação de reagentes, labware e equipamentos para LC

  1. Preparar o seguinte: 1) mistura de acetonitrilo/2-propanol/nano-puro (65:35:5); 2) um vórtice com adaptador apropriado; 3) um sônico ultrassônico; 4) frascos de vidro com pastilhas para uma placa de poço; 5) um sistema LC equipado com uma bomba binária, degasser e um autosampler; 6) uma coluna de fase reversa C18 (2,1 mm; 75 mm; tamanho dos poros 130 Å; faixa de pH de 1-11) acoplada a um sistema de pré-coluna; 7) mistura A: acetonitrilo/água (60:40); e 8) mistura B: isopropanol/acetonitrilo (90:10).

7. Extração lipídica de células de levedura

  1. Pegue uma alíquota da cultura da levedura. Use um hemocytometro ou meça OD600 para determinar o número total de células de levedura por mL de cultura.
  2. Pegue um volume de cultura de levedura que contém um número total de 5,0 x 107 células (3,3 unidades OD600). Coloque este volume de cultura em um tubo de microcentrífuga pré-refrigerado de 1,5 mL.
  3. Colher as células por centrifugação a 16.000 x g por 1 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante.
  4. Adicione 1,5 mL de água nano-pura gelada e lave as células por centrifugação a 16.000 x g por 1 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante.
  5. Adicione 1,5 mL de solução ABC gelada e lave as células por centrifugação a 16.000 x g por 1 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante. A pelota celular pode ser armazenada a -80 °C antes da extração lipídica.
  6. Para começar a extração lipídica, descongele a pelota celular no gelo.
  7. Resuspenda a pelota celular em 200 μL de água nano-pura gelada. Transfira a suspensão celular para um tubo de centrífuga superior de 15 mL com uma tampa forrada de politetrafluoroetileno. Adicione o seguinte a este tubo: 1) 25 μL da mistura de padrões lipídicos internos preparados na mistura clorofórmio/metanol (2:1); 2) 100 μL de 425-600 μM de contas de vidro lavadas com ácido; e 3) 600 μL de mistura clorofórmio/metanol (17:1).
  8. Vórtice o tubo em alta velocidade por 5 min à temperatura ambiente (RT) para interromper as células.
  9. Vórtice o tubo em baixa velocidade por 1h em RT para facilitar a extração de lipídios.
  10. Incubar a amostra por 15 min no gelo para promover a precipitação proteica e a separação das fases aquosas e orgânicas umas das outras.
  11. Centrifugar o tubo em uma centrífuga clínica a 3.000 x g por 5 min em RT. Esta etapa centrífuga permite separar a fase aquosa superior da fase orgânica inferior, que contém todas as classes lipídicas.
  12. Use uma pipeta de vidro borosilicato para transferir a fase orgânica inferior (~400 μL) para outro tubo de centrífuga superior de 15 mL com uma tampa forrada de politetrafluoetileno. Não interrompa as contas de vidro ou a fase aquosa superior durante essa transferência. Mantenha a fase orgânica inferior o fluxo de gás nitrogênio.
  13. Adicione 300 μL de mistura clorofórmio-metanol (2:1) à fase aquosa superior restante para permitir a extração de esfinges e PA, PS, PI e CL. Vortex o tubo vigorosamente por 5 min em RT.
  14. Centrifugar o tubo em uma centrífuga clínica a 3.000 x g por 5 min em RT.
  15. Use uma pipeta de vidro borossilicato para transferir a fase orgânica inferior (~ 200 μL) formada após centrifugação para a fase orgânica coletada na etapa 7.13.
  16. Use o fluxo de gás nitrogênio para evaporar o solvente nas fases orgânicas combinadas. Feche os tubos contendo o filme lipídico o fluxo de gás nitrogênio. Armazene estes tubos a -80 °C.

8. Separação dos lipídios extraídos por LC

  1. Adicionar 500 μL de acetonitrila/2-propanol/nano-puro de água (65:35:5) a um tubo contendo a película lipídica obtida na etapa 7.16. Vórtice o tubo 3x para 10 s em RT.
  2. Submeta o conteúdo do tubo à sônica ultrassônica por 15 min. Vórtice o tubo 3x para 10 s em RT.
  3. Pegue 100 μL de uma amostra do tubo e adicione-a a um frasco de vidro com uma inserção usada para uma placa de poço. Elimine as bolhas de ar na pastilha antes de aperhá-la na placa de poço.
  4. Use um sistema LC para separar diferentes espécies lipídicas em uma coluna CSH c18 de fase inversa acoplada a um sistema de pré-coluna (ver Tabela de Materiais). Durante a separação, mantenha a coluna a 55 °C e a uma vazão de 0,3 mL/min. Mantenha a amostra na placa de poço supérflua em RT.
  5. Utilize as fases móveis que consistem na mistura A (acetonitrila/água [60:40 (v/v)]) e a mistura B (isopropanol/acetonitrila [90:10 (v/v)]). Para um modo positivo de detecção de íons-mãe criados usando a fonte de íons de ionização eletrospray (ESI), o modo ESI (+), as fases móveis A e B contêm formato de amônio na concentração final de 10 mM. Para um modo negativo de detecção de íons-pais, o modo ESI (-), as fases móveis A e B contêm acetato de amônio na concentração final de 10 mM.
  6. Use um volume amostral de 10 μL para a injeção no modo ESI (+) e ESI (-).
  7. Separar diferentes espécies lipídicas por LC utilizando o seguinte gradiente de LC: 0-1 min 10% (fase B); 1-4 min 60% (fase B); 4-10 min 68% (fase B); 21/10 97% (fase B); 21-24 min 97% (fase B); 24-33 min 10% (fase B).
  8. Executar espaços de extração como a primeira amostra, entre cada quatro amostras, e como a última amostra. Subtraia o plano de fundo para normalizar os dados.
  9. Um cromatograma total representativo de íons de LC/MS de lipídios extraídos de células da cepa do tipo selvagem BY4742 é mostrado na Figura 1.

9. Análise espectrométrica em massa de lipídios separados por LC

  1. Utilize um espectrômetro de massa equipado com uma fonte de íons HESI (ionização de eletrospray aquecido) para analisar lipídios separados por LC. Use as configurações fornecidas na Tabela 2.
  2. Use o analisador de transformação Fourier para detectar íons-mãe (MS1) em uma resolução de 60.000 e dentro da faixa de massa de 150-2.000 Da.
  3. Use as configurações fornecidas na Tabela 3 para detectar íons secundários (MS2).

10. Identificação e quantitação de diferentes classes e espécies lipídicas por meio do processamento de dados brutos da LC-MS/MS

  1. Consulte a Tabela de Materiais para software para realizar a identificação e quantificar diferentes lipídios de arquivos LC-MS/MS brutos. Este software usa o maior banco de dados lipídico, contendo mais de 1,5 milhões de precursores de íons lipídicos (MS1) e seus íons fragmentados previstos (MS2). O software também usa picos MS1 para quantificar lipídicos e MS2 para identificação lipídica. Um cromatograma representativo de duas formas de fosfaticidade isomórica (34:0) que têm o mesmo valor de m/z, mas tempos de retenção diferentes, bem como seus espectros MS1 e MS2, são mostrados na Figura 2, Figura 3e Figura 4,respectivamente.
  2. Pesquisar arquivos brutos LC-MS contendo dados MS1 de varredura completa e dados MS2 dependentes de dados para ácidos graxos gratuitos (não esestrdiados) (FFA), cardiolipina (CL), fitoceramide (APS), fitosofingosina (PHS), fosfatadilina (PC), fosfatidaletanol classes de fosphatidylglycerol (PG), fosphatidylinositol (PI), fosfatitidylserina (PS) e tríacilglicelerol (TAG) aulas lipídicas utilizando uma tolerância m/z de 5 ppm para íons precursores e 10 ppm para íons do produto. Outros parâmetros de pesquisa são mostrados na Tabela 4. Siga as instruções fornecidas no manual do usuário do software. As identidades dos padrões lipídicos internos e das espécies lipídicas com composição incomum de ácidos graxos precisam ser verificadas manualmente.
  3. Para identificar e quantificar diferentes classes e espécies lipídicas com a ajuda de alternativas de código aberto disponíveis gratuitamente para o software Lipid Search, use o Lipid Data Analyzer(http://genome.tugraz.at/lda2/lda_download.shtml),MZmine 2(http://mzmine.github.io/)ou XCMS(https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/xcms.html)software para processar dados brutos de LC-MS/MS.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nosso método para uma avaliação quantitativa dos principais lipídios celulares dentro de uma célula de levedura com a ajuda de LC-MS/MS foi versátil e robusto. Permitiu identificar e quantificar 10 classes lipídicas diferentes em células s. cerevisiae cultivadas no meio nINS mínimo sintético contendo inicialmente 2% de glicose. Estas classes lipídicas incluem ácidos graxos gratuitos (não esestrdiados) (AFa), CL, fitoceramide (APS), fitosofingosina (PHS), PC, PE, PG, PI, PS e TAG<...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As seguintes precauções são importantes para a implementação bem sucedida do protocolo descrito aqui:

1. Clorofórmio e metanol são tóxicos. Eles extraem eficientemente várias substâncias de superfícies, incluindo plástico de laboratório e sua pele. Portanto, manuseie esses solventes orgânicos com cautela, evitando o uso de plásticos em etapas que envolvam contato com clorofórmio e/ou metanol, utilizando pipetas de vidro borossilicato para estas etapas, e enxaguando essas pipetas com clorofórmi...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Somos gratos aos atuais e antigos membros do laboratório Titorenko pelas discussões. Reconhecemos o Centro de Aplicações Biológicas da Espectrometria de Massa e o Centro de Genômica Estrutural e Funcional (ambos na Universidade de Concórdia) por serviços de destaque. Este estudo foi apoiado por bolsas do Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia (NSERC) do Canadá (RGPIN 2014-04482) e do Concordia University Chair Fund (CC0113). K.M. foi apoiado pelo Prêmio de Mérito da Universidade de Concórdia.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tubos de centrífuga de vidro de alta velocidade de 15 mL com tampas revestidas de TeflonPYREX05-550
Frascos de amostra de vidro de 2 mL com tampas revestidas de TeflonFisher Scientific60180A-SV9-1P
2-PropanolFisher ScientificA461-500
AcetonitrilaFisher ScientificA9554
Agilent 1100 series LC systemAgilent TecnologiasG1312A
Agilent1100 WellplateAgilent TechnologiesG1367A
Acetato de amônioFisher ScientificA11450
Bicarbonato de amônioSigma9830
Formato de amônioFisher ScientificA11550
Hidróxido de amônioFisher ScientificA470-250
BactopeptonaFisher ScientificBP1420-2
CardiolipinaAvanti Lipídios Polares750332
Centrífuga clínica Centra CL2Thermo Scientific004260F
CeramidaAvanti Lipídios Polares860517
ClorofórmioFisher ScientificC297-4
CSH C18 VanGuardSistemadepré-coluna
Ácido graxo livre (19:0)Matreya1028
Contas de vidro (lavadas com ácido, 425-600 μ M)Sigma-AldrichG8772
GlicoseFisher ScientificD16-10
HemacitômetroFisher Scientific267110
L< / em>-histidinaSigmaH8125
Software de pesquisa lipídica (V4.1)Fisher ScientificV4.1LC-MS / MS
L< / em>-leucinaSigmaL8912
L-lisinaSigmaL5501
MetanolFisher ScientificA4564
FosfatidilcolinaAvanti Lipídios Polares850340
FosfatidiletanolaminaAvanti Lipídios Polares850704
FosfatidilglicerolAvanti Lipídios Polares
FosfatidilinositolAvanti Lipídios PolaresLM1502
FosfatidilserinaAvanti Lipídios Polares840028
Coluna de fase reversa CSH C18Águas186006102
EsfingosinaAvanti Lipídios Polares860669
Thermo Orbitrap Velos MSFisher ScientificETD-10600
TricilglicerolLarodan, MalmoTAG Misturado FA
Sonicador ultrassônicoFisher Scientific15337416
UracilSigmaU0750
VortexFisher Scientific2215365
Extrato de leveduraFisher ScientificBP1422-2
Base de nitrogênio de levedura sem aminoácidosFisher ScientificDF0919-15-3
Cepa de levedura BY4742DharmaconYSC1049
Waters 186006944 Software de análise 840446

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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