Anvendelse af fryseoptøede embryoner til højeffektiv produktion af genetisk modificerede mus
Summary
Her præsenterer vi en modificeret metode til kryopræservering af encellede embryoner samt en protokol, der kobler brugen af fryseoptøede embryoner og elektroporation til effektiv generation af genetisk modificerede mus.
Abstract
Brugen af genetisk modificerede (GM) mus er blevet afgørende for at forstå genfunktionen og dechifrere de underliggende mekanismer i menneskelige sygdomme. CRISPR/Cas9-systemet giver forskerne mulighed for at ændre genomet med hidtil uset effektivitet, troskab og enkelhed. Udnyttelse af denne teknologi, forskere søger en hurtig, effektiv og nem protokol til at generere GM-mus. Her introducerer vi en forbedret metode til kryopræservering af encellede embryoner, der fører til en højere udviklingsrate af fryseoptøede embryoner. Ved at kombinere det med optimerede elektroporationsbetingelser giver denne protokol mulighed for generering af knockout- og knock-in-mus med høj effektivitet og lave mosaikhastigheder inden for kort tid. Desuden viser vi en trinvis forklaring på vores optimerede protokol, der dækker FREMSTILLING AF CRISPR-reagenser, in vitro-befrugtning, kryopræservering og optøning af encellede embryoner, elektroporation af CRISPR-reagenser, musegenerering og genotyping af grundlæggerne. Ved hjælp af denne protokol, forskere bør være i stand til at forberede GM mus med uovertruffen lethed, hastighed, og effektivitet.
Introduction
Det grupperede regelmæssigt interspacerede korte palindromiske gentagelser (CRISPR)/CRISPR-associeret protein 9 (Cas9) er et videnskabeligt gennembrud, der giver hidtil uset målrettet modifikation i genomet1. CRISPR/Cas9-systemet består af Cas9-protein og guide RNA (gRNA) med to molekylære komponenter: et målspecifikt CRISPR RNA (crRNA) og et transaktiverende CRISPR RNA (tracrRNA)2. En gRNA dirigerer Cas9 protein til den specifikke locus i genomet, 20 nukleotider supplerer crRNA, og støder op til protospacer tilstødende motiv (PAM). Cas9-proteinet binder sig til målsekvensen og inducerer dobbeltstrengede brud (DSB’er), der repareres ved enten fejltilbøjelige nonhomologe endesammenføjning (NHEJ) eller high fidelity homology-rettet reparation (HDR)3,4,5. Den NHEJ fører til indsættelser og / og sletninger (indels), og dermed til gentab af funktion, når en kodning sekvens er målrettet. HDR fører til præcis genomredigering i nærværelse af en reparationsskabelon , der indeholder homologisekvenser3,4,5. NHEJ og HDR er blevet udnyttet til at generere knockout og knock-in mus, henholdsvis.
Mens CRISPR/Cas9-systemet har accelereret genereringen af GM-mus markant med fremragende effektivitet og troskab, støder forskere, der anvender disse metoder, ofte på tekniske udfordringer. For det første kræver konventionelle protokoller mikroinjektion for at indføre CRISPR-redigeringsværktøjerne i pronucleusen af befrugtede æg6,7. Denne teknik er tidskrævende og kræver normalt omfattende træning. Flere grupper erstattede således mikroinjektion med elektroporation8,9,10,11,12,13. Men i de tidlige elektroporationsprotokoller blev der anvendt friske embryoner til elektroporation. Dette forårsagede et andet problem, fordi det er vanskeligt at forberede friske embryoner før hvert eksperiment14.
For nylig har vi og andre kombineret brugen af fryse-optøet embryoner og elektroporation til genom redigering, som letter dannelsen af GM mus15,16. Denne protokol gør det muligt for forskere uden avancerede embryo manipulation færdigheder til hurtigt at generere dyremodeller af menneskelige sygdomme med høj effektivitet. Protokollen reducerer også de praktiske udfordringer i at generere GM-mus, såsom genetisk heterogenitet i grundlæggerne16. For at overvinde mosaicism udfører vi elektroporationen af CRISPR-reagenser inden for 1 time efter embryooptøning for at sikre, at redigeringsker før den første replikering af genomet. En anden forbedring omfatter brugen af Cas9 protein i stedet for Cas9 mRNA til at reducere uønsket mosaicism17. Desuden har vi udviklet en optimal metode til en-celle embryo kryopræservering, der øger udviklingen til to-celle fase16: brug af føtale kvæg serum (FBS) dramatisk forbedrer overlevelsen af fryse-optøet oocytter efter befrugtning, måske ved den samme mekanisme, der gør fryse-optøet ubefrugtede oocytter mere modstandsdygtige18.
Her præsenterer vi en omfattende protokol for generering af GM-mus ved hjælp af fryseoptøede embryoner, herunder den modificerede metode til kryopræservering af encellede C57BL/6J-embryoner. Det omfatter 1) gRNA design, CRISPR reagens forberedelse og samling; 2) IVF, kryopræservering, og optøning af encellede embryoner; 3) Elektroporation af CRISPR-reagenser til fryseoptøede embryoner; 4) Embryo overførsel til oviduct af pseudogravide kvindelige mus; og 5) Genotyping og sekvens analyse af F0 grundlægger dyr.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den beskrevne protokol giver mulighed for generering af GM-mus med høj effektivitet og lave mosaikhastigheder (tabel 1). Det gør det nemt for forskere uden avancerede embryomanipulationsevner at skabe mutantmus, fordi det udnytter de nyeste og mest nyttige fremskridt inden for både reproduktionsteknik og genomredigeringsteknologier: CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein (RNP) og elektroporation til fryseoptøede embryoner. Disse fremskridt lettede og fremskyndede generationen af GM-musene. Som beskrevet i <st…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne takke Hitomi Sawada og Elizabeth Garcia for dyrepleje. Dette arbejde blev støttet af KAKENHI (15K20134, 17K11222, 16H06276 og 16K01946) og Hokugin Research Grant (til H.N.), og Jichi Medical University Young Investigator Award (til H.U.). Otsuka Toshimi Scholarship Foundation støttede M.D.
Materials
| 0.25 M Sucrose | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) | SUCROSE | |
| 1 M DMSO | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) | 1M DMSO | |
| Butorphanol | Meiji Seika Pharma Co., Ltd. (Tokyo, Japan) | Vetorphale 5mg | |
| Cas9 protein: Alt-R® S.p. HiFi Cas9 Nuclease 3NLS | Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA) | 1081060 | |
| C57BL/6J mice | Japan SLC (Hamamatsu, Japan) | N/A | |
| DAP213 | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) | DAP213 | |
| FBS | Sigma-Aldrich, Inc. (St. Louis, MO) | ES-009-C | |
| hCG | MOCHIDA PHARMACEUTICAL CO., LTD (Tokyo, Japan) | HCG Mochida 3000 | |
| HTF | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) | HTF | |
| ICR mice | Japan SLC (Hamamatsu, Japan) | N/A | |
| Isoflurane | Petterson Vet Supply, Inc. (Greeley, CO) | 07-893-1389 | |
| KSOM | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) | KSOM | |
| LN2 Tank | Chart Industries (Ball Ground, GA) | XC 34/18 | |
| M2 | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) | M2 | |
| Medetomidine | Nippon Zenyaku Kogyo Co.,Ltd. (Koriyama, Japan) | 1124401A1060 | |
| Microscope | Nikon Co. (Tokyo, Japan) | SMZ745T | |
| Midazolam | Sandoz K.K. (Tokyo, Japan) | 1124401A1060 | |
| Nuclease free buffer | Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA) | 1072570 | |
| Nucleospin DNA extraction kit | Takara Bio Inc (Kusatsu, Japan) | 740952 .5 | |
| One-hole slide glass | Matsunami Glass Ind., Ltd. (Kishiwada, Japan) | S339929 | |
| One-step type Electroporator | BEX Co., Ltd. (Tokyo, Japan) | CUY21EDIT II | |
| Paraffin Liquid | NACALAI TESQUE Inc. (Kyoto, Japan) | SP 26137-85 | |
| Platinum plate electrode | BEX Co., Ltd. (Tokyo, Japan) | LF501PT1-10, GE-101 | |
| PMSG | ASKA Animal Health Co., Ltd (Tokyo, Japan) | SEROTROPIN 1000 | |
| Povidone iodide | Professional Disposables International, Inc. (Orangeburg, NY) | C12400 | |
| Reduced-Serum Minimal Essential Medium: OptiMEM I | Sigma-Aldrich, Inc. (St. Louis, MO) | 22600134 | |
| Two-step type Electroporator | Nepa Gene Co., Ltd. (Ichikawa, Japan) | NEPA21 |
Referências
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA – guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-822 (2012).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/VCas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
- Mashiko, D., et al. Generation of mutant mice by pronuclear injection of circular plasmid expressing Cas9 and single guided RNA. Scientific Reports. 3, 3355 (2013).
- Yen, S. T., et al. Somatic mosaicism and allele complexity induced by CRISPR/Cas9 RNA injections in mouse zygotes. Biologia do Desenvolvimento. 393 (1), 3-9 (2014).
- Kaneko, T., Mashimo, T. Simple genome editing of rodent intact embryos by electroporation. PLoS ONE. 10 (11), 1-7 (2015).
- Qin, W., et al. Efficient CRISPR/cas9-mediated genome editing in mice by zygote electroporation of nuclease. Genética. 200 (2), 423-430 (2015).
- Kaneko, T., Sakuma, T., Yamamoto, T., Mashimo, T. Simple knockout by electroporation of engineered endonucleases into intact rat embryos. Scientific Reports. 4, 6382 (2014).
- Hashimoto, M., Takemoto, T. Electroporation enables the efficient mRNA delivery into the mouse zygotes and facilitates CRISPR/Cas9-based genome editing. Scientific Reports. 5, 11315 (2015).
- Chen, S., Lee, B., Lee, A. Y. F., Modzelewski, A. J., He, L. Highly efficient mouse genome editing by CRISPR ribonucleoprotein electroporation of zygotes. Journal of Biological Chemistry. 291 (28), 14457-14467 (2016).
- Modzelewski, A. J., et al. Efficient mouse genome engineering by CRISPR-EZ technology. Nature Protocols. 13 (6), 1253-1274 (2018).
- Teixeira, M., et al. Electroporation of mice zygotes with dual guide RNA/Cas9 complexes for simple and efficient cloning-free genome editing. Scientific Reports. 8, 474 (2018).
- Nakagawa, Y., et al. Production of knockout mice by DNA microinjection of various CRISPR/Cas9 vectors into freeze-thawed fertilized oocytes. BMC Biotechnology. 15 (1), 1-10 (2015).
- Darwish, M., et al. Rapid and high-efficient generation of mutant mice using freeze-thawed embryos of the C57BL/6J strain. Journal of Neuroscience Methods. 317, 149-156 (2019).
- Hashimoto, M., Yamashita, Y., Takemoto, T. Electroporation of Cas9 protein/sgRNA into early pronuclear zygotes generates non-mosaic mutants in the mouse. Biologia do Desenvolvimento. 418 (1), 1-9 (2016).
- Sakamoto, W., Kaneko, T., Nakagata, N. Use of frozen-thawed oocytes for efficient production of normal offspring from cryopreserved mouse spermatozoa showing low fertility. Comparative Medicine. 55 (2), 136-139 (2005).
- Naito, Y., Hino, K., Bono, H., Ui-Tei, K. CRISPRdirect: Software for designing CRISPR/Cas guide RNA with reduced off-target sites. Bioinformatics. 31 (7), 1120-1123 (2015).
- Torres-Perez, R., Garcia-Martin, J. A., Montoliu, L., Oliveros, J. C., Pazos, F. WeReview: CRISPR Tools-Live Repository of Computational Tools for Assisting CRISPR/Cas Experiments. Bioengenharia. 6 (3), 63 (2019).
- Okamoto, S., Amaishi, Y., Maki, I., Enoki, T., Mineno, J. Highly efficient genome editing for single-base substitutions using optimized ssODNs with Cas9-RNPs. Scientific Reports. 9, 4811 (2019).
- Takeo, T., Nakagata, N. Superovulation using the combined administration of inhibin antiserum and equine chorionic gonadotropin increases the number of ovulated oocytes in C57BL/6 female mice. PLoS ONE. 10 (5), 1-11 (2015).
- Wuri, L., Agca, C., Agca, Y. Euthanasia via CO2 inhalation causes premature cortical granule exocytosis in mouse oocytes and influences in vitro fertilization and embryo development. Molecular Reproduction and Development. 86 (7), 825-834 (2019).
- Nakagata, N. High survival rate of unfertilized mouse oocytes after vitrification. Journal of Reproduction and Fertility. 87 (2), 479-483 (1989).
- Dehairs, J., Talebi, A., Cherifi, Y., Swinnen, J. V. CRISP-ID: Decoding CRISPR mediated indels by Sanger sequencing. Scientific Reports. 6, 28973 (2016).
- Nakagawa, Y., Sakuma, T., Takeo, T., Nakagata, N., Yamamoto, T. Electroporation-mediated genome editing in vitrified/warmed mouse zygotes created by ivf via ultra-superovulation. Experimental Animals. 67 (4), 535-543 (2018).
- Nakajima, K., Nakajima, T., Takase, M., Yaoita, Y. Generation of albino Xenopus tropicalis using zinc-finger nucleases. Development Growth and Differentiation. 54 (9), 777-784 (2012).
- Hur, J. K., et al. Targeted mutagenesis in mice by electroporation of Cpf1 ribonucleoproteins. Nature Biotechnology. 34, 807-808 (2016).
- Dumeau, C. E., et al. Introducing gene deletions by mouse zygote electroporation of Cas12a/Cpf1. Transgenic Research. 28 (5-6), 525-535 (2019).
- Chen, S., et al. CRISPR-READI: Efficient Generation of Knockin Mice by CRISPR RNP Electroporation and AAV Donor Infection. Cell Reports. 27 (13), 3780-3789 (2019).
- Mizuno, N., et al. Intra-embryo Gene Cassette Knockin by CRISPR/Cas9-Mediated Genome Editing with Adeno-Associated Viral Vector. iScience. 9, 286-297 (2018).
- Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly Efficient RNA-guide genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
- Vakulskas, C. A., et al. A high-fidelity Cas9 mutant delivered as a ribonucleoprotein complex enables efficient gene editing in human hematopoietic stem and progenitor cells. Nature Medicine. 24 (8), 1216-1224 (2018).
- Rodriguez-Rodriguez, J. A., et al. Distinct Roles of RZZ and Bub1-KNL1 in Mitotic Checkpoint Signaling and Kinetochore Expansion. Current Biology. 28 (21), 3422-3429 (2018).
- Smits, A. H., et al. Biological Plasticity Rescues Target Activity in CRISPR Knockouts. Nature Methods. 16, 1087-1093 (2019).
