Artigo de método

Preparação de amostras biológicas para especiação em temperatura criogênica usando espectroscopia de absorção de raios-X de alta resolução

DOI:

10.3791/60849

⸱

27 de maio de 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1University Grenoble Alpes, INSERM UA7, Synchrotron Radiation for Biomedicine (STROBE), 2CNRS, UMR 5254, Université Pau & Pays Adour, E2S UPPA, Institut des Sciences Analytiques et de Physicochimie pour l'Environnement et les Matériaux, 3Institut Jacques Monod, UMR 7592 CNRS, Université Paris Diderot, 4OSUG, UMS 832 CNRS, Université Grenoble Alpes, 5FAME and FAME-UHD beamlines, ESRF, the European Synchrotron, 6ID16A beamline, ESRF, the European Synchrotron

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo apresenta um procedimento detalhado para preparar criosamples biológicas para experimentos de espectroscopia de absorção de raios-X baseados em síncrotrons. Descrevemos todas as etapas necessárias para otimizar a preparação da amostra e a criopreservação com exemplos do protocolo com células cancerígenas e fitoplâncton. Este método fornece um padrão universal de preparação crio-de-amostra.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O estudo de elementos com espectroscopia de absorção de raios-X (XAS) é de particular interesse ao estudar o papel dos metais em sistemas biológicos. A preparação da amostra é um procedimento fundamental e muitas vezes complexo, particularmente para amostras biológicas. Embora as técnicas de especiação de raios-X sejam amplamente utilizadas, nenhum protocolo detalhado ainda foi divulgado para os usuários da técnica. Além disso, a modificação do estado químico é preocupante, e técnicas baseadas em crio-claro são recomendadas para analisar as amostras biológicas em seu estado hidratado quase nativo para fornecer a máxima preservação da integridade química das células ou tecidos. Aqui, propomos um protocolo de preparação celular baseado em amostras crio-preservadas. É demonstrado em uma fluorescência detectada por fluorescência de alta resolução de raios-X estudo de espectroscopia de selênio em células cancerosas e um estudo de ferro em fitoplâncton. Este protocolo pode ser usado com outras amostras biológicas e outras técnicas de raio-X que podem ser danificadas por irradiação.

Introdução

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O estudo das biotransformações celulares de elementos essenciais ou tóxicos requer técnicas de especiação com alta sensibilidade e deve minimizar as etapas de preparação da amostra que muitas vezes são propensas à modificação de espécies químicas.

Elementos fisiológicos como selênio e ferro são conhecidos por serem particularmente difíceis de especiar devido à sua química complexa, várias stabilidades das espécies de selênio ou ferro, e sua baixa concentração na faixa ppm (mg/kg) ou mesmo sub-ppm. Assim, o estudo da especiação desses elementos pelo XAS pode ser extremamente desafiador. O Síncrotron XAS e especialmente a fluorescência de alta resolução de energia detectada xas (HERFD-XAS), que permite uma relação sinal-fundo muito baixa1, estão disponíveis em fontes síncrotrons para especiar elementos altamente diluídos em matrizes biológicas complexas 2,3. As medidas convencionais de fluorescência-XAS podem ser realizadas usando um detector de estado sólido resolvido com energia (SSD) com uma largura de banda de energia ~150-250 eV, na linha de feixe CRG-FAME no European Synchrotron Radiation Facility (ESRF)4, enquanto as medidas HERFD-XAS precisam de um espectrômetro de analisador de cristal (CAS), com uma largura de banda de energia ~1-3 eV, na linha de feixe CRG-FAME-UHD no ESRF2 . Os fótons de fluorescência são discriminados em relação à sua energia com processos eletrônicos ou ópticos, respectivamente.

A crio-preparação amostral é essencial para preservar estruturas e manter a integridade química composicional, permitindo assim análises próximas ao estado nativo biológico5. Além disso, análises realizadas a temperaturas criogênicas tão baixas quanto 10 K usando resfriamento criogênico de hélio líquido (LN2), permitem que os danos causados pela radiação diminuam e preservem a especiação elementar para XAS. Embora algumas revisões sobre técnicas de XAS aplicadas a amostras biológicas informem a necessidade de preparar e analisar amostras em condições criogênicas (por exemplo, Sarret et al.6, Porcaro et al.7), nenhuma delas descreve claramente o protocolo detalhado relacionado. Nesta publicação, um método de crio-preparação de células cancerosas e microrganismos de plâncton é descrito para a especiação HERFD-XAS de Se8 e Fe9 à temperatura criogênica.

Boas práticas para preparação e ambiente de amostras durante as medições de espectroscopia XAS de última geração requerem 1) uma configuração; 2) procedimento de análise que limite ao máximo os efeitos dos danos causados pela radiação; e 3) uma amostra (ou referência composta modelo) o mais homogênea possível em relação ao tamanho do feixe de fótons de raios-X. O primeiro item é levado em conta realizando a aquisição a uma temperatura baixa, utilizando um criostat de hélio líquido. O segundo item é tratado realizando cada aquisição em uma nova área da amostra, movendo-a com relação à viga. Por fim, considerando a terceira condição, amostras (pelotas) e referências (pós) são condicionadas em pelotas a granel prensadas, a fim de limitar as porosidades e inhomogeneidades tanto quanto possível, e evitar rugosidades em relação ao tamanho do feixe na superfície da amostra sondada por raios-X. Explicamos como o protocolo lida com todos esses pontos.

Usamos a linha de células de próstata humana PC-3 (alto potencial metastático) e a linha de células ovarianas OVCAR-3 (que representa até 70% de todos os casos de câncer de ovário) para investigar as propriedades antiproliferativas em relação às células cancerosas de nanopartículas de selênio (Se-NPs) e diatom de tristórcula de Phaeodactylum como espécie modelo para investigar a sequestração de ferro em filtoplâncton.

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Protocolo

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1. Preparação das pelotas humanas de células cancerígenas PC-3 e OVCAR-3 para especiação de selênio

NOTA: O seguinte protocolo é adaptado de Weekley et al.10. Todas as etapas devem ser realizadas sob uma capa de cultura celular sob condições e restrições de nível 2 de biossegurança, utilizando técnicas assépticas.

  1. Conte as células usando uma câmara de contagem de células Malassez. Semente 150.000-200.000 células por frasco para a linha celular PC-3 e 300.000 células para a linha celular OVCAR-3.
  2. Células de sementes em frascos T-75 (três frascos por condição para ter triplicados) na mídia de cultura celular adequada (Tabela 1) sob a capa de fluxo laminar.
  3. Deixe as culturas celulares crescerem em uma incubadora a 37 °C e uma atmosfera umidificada com 5% de CO2 até atingirem 80% de confluência. Normalmente, as linhas de células cancerígenas de próstata PC-3 dobram após 24 h, enquanto as linhas de células cancerígenas de ovário OVCAR-3 tomam 72 h. Os frascos devem ser deixados na incubadora.
  4. Enquanto isso, diluir os Se-NPs utilizados para o tratamento para uma concentração final que corresponde ao IC20 (concentração inibitória para atingir 20% de morte celular) que foi predeterminado pelo MTT (3-(4,5-dimetilthiazol-2-yl)-2,5-difeniltetrazolium brometo) para avaliação de citotoxicidade. Essas concentrações são específicas para cada tipo se-NPs, mas também específicas para a linha celular estudada.
    1. Coloque a solução de caldo nanopartícula (2 mg/mL de albumina de soro bovino [BSA] ou se-NPs revestida de chitosan) em um banho de água de ultrassom por 30 minutos à temperatura ambiente (RT).
    2. Diluir a solução Se-NPs por diluições seriais em meio de cultura celular completa para atingir concentrações de trabalho. Entre cada diluição, vórtice por 1 min.
  5. Prepare um controle positivo de selênio com sal de selênio diluído para tratamento.
    1. Prepare uma solução aquosa de estoque de selenita de sódio (1 mg/mL) em um tubo de polipropileno de 15 mL. Misture 1 mg de pó de selenita de sódio com 1 mL de água ultrapura.
    2. Vórtice a solução de estoque por 1 min.
    3. Diluir a solução de estoque de selenita de sódio por diluições seriais em meio de cultura celular completa para atingir concentrações de trabalho.
      NOTA: Não se esqueça de encanar várias vezes antes de cada diluição para homogeneizar a solução.
  6. Exponha as células cancerígenas aos tratamentos de selênio.
    NOTA: Esta parte do protocolo deve ser repetida para cada nanopartícula (PN) testada. Aqui, os NPs são de dois tipos, BSA e Se-NPs revestidos de chitosan, além dos controles. A solução de selenita de sódio é o controle positivo e nenhum tratamento é o controle negativo.
    1. Abra os três frascos T-75 contendo as células no capô de fluxo laminar.
    2. Retire o meio e lave as células suavemente 2x com 5 mL de salina tamponada de fosfato (PBS).
    3. Suavemente, na parte inferior do frasco e não diretamente na camada celular, adicione 15 mL do tratamento em cada frasco usando uma pipeta automática equipada com pipetas plásticas estéreis de 25 mL. Coloque as tampas nos frascos. Não feche bem as tampas.
      NOTA: Conforme descrito nas etapas 1.3 e 1.4, as soluções de tratamento devem ter sido resuspendidas previamente para serem homogeneizadas.
    4. Deixe os três frascos horizontalmente em uma incubadora a 37 °C e uma atmosfera umidificada com 5% de CO2 por 24 h.
  7. Preparação das pelotas de célula
    1. Lave suavemente as células 2x com 5 mL de PBS aquecido (37 °C) diretamente nos frascos T75.
    2. Adicione 6 mL de cultura celular aquecida (37 °C) na camada celular no frasco T-75 usando um menino pipeta equipado com pipetas plásticas estéreis de 10 mL.
    3. Colete as células através de raspagem suave usando um raspador de células. Use um raspador de célula por frasco.
    4. Usando um menino pipeta e uma pipeta de 10 mL, aspire o líquido e lave a célula/meio na superfície do frasco, a fim de coletar todas as células. Repita este passo várias vezes para dissociar e individualizar as células. Colete o meio que contém as células em um tubo de polipropileno de 15 mL.
    5. Gire a 250 x g por 5 min na RT. Aspire o supernatante.
    6. Enxágüe as células reutilizando-as em 5 mL de PBS.
    7. Gire a 250 x g por 5 min na RT. Aspire o supernasciente e repita os passos 1.6.5 e 1.6.6 2x para se livrar de todos os traços restantes do tratamento.
    8. Resuspenda as células em 1 mL de PBS e transfira-as para um tubo de polipropileno de 1,5 mL. Finalmente, gire-os a 250 x g por 5 min no RT. A figura 1 representa a pelota de célula obtida após a centrifugação e o descarte do supernante.
    9. Remova suavemente todo o supernatante PBS usando uma pipeta de 200 μL.
      NOTA: Tenha cuidado para não tocar e danificar a pelota da célula. O ideal é que a pelota tenha de 2 a 3 mm de altura ou espessura, com diâmetro de 3 a 6 mm. Para a linha celular PC-3, são necessárias células 9 x 106-10 x 106 para o ensaio. Para a linha celular OVCAR-3, são necessárias 8 x 10células 6-9 x 106 (Figura 1). Algumas células provavelmente serão perdidas durante as etapas subsequentes de lavagem de buffer. Quanto maior o número de celular, melhor será a pelota.
  8. Congelamento relâmpago das pelotas celulares
    1. Mergulhe a parte inferior do tubo de 1,5 mL contendo a pelota em nitrogênio líquido (LN2) até o nível da pelota celular.
    2. Em uma caixa de luvas totalmente purgada com uma atmosfera inerte como gás nitrogênio, colete a pelota celular tocando suavemente o tubo de 1,5 mL na superfície plana de um bloco de cobre LN2 refrigerado (Figura 2). A pelota é então coletada sem perda de celular.
      NOTA: Use equipamentos de crioproteção, jaleco, sapatos fechados, luvas crio-e um escudo facial ou óculos de segurança para manuseio LN2 .
    3. Se necessário, uma agulha resfriada LN2 pode ser usada para ajudar a tirar a pelota.
      NOTA: A pelota de célula congelada resultante pode se fragmentar. Essas etapas devem ser realizadas no espaço de alguns minutos e dependem da destreza e velocidade do pesquisador.
    4. As dimensões da pelota congelada devem se encaixar no suporte da amostra criostat. Utilizando o equipamento descrito, se a pelota celular for maior que 2 mm de altura e ligeiramente menor do que o orifício do suporte de amostra usado para XAS, a amostra pode ser usada diretamente. Se não, ou se uma superfície plana para a análise for desejada, uma pelota cilíndrica a granel deve ser preparada, mantendo a pelota em seu estado congelado. Se a pelota da célula for fragmentada, os seguintes passos podem ser usados idealmente em uma caixa de luvas totalmente purgada com uma atmosfera inerte.
  9. Preparação das pelotas cilíndricas congeladas a granel
    1. Mergulhe todas as partes de uma prensa hidráulica manual que estará em contato com a amostra na LN2 (Figura 3A; 3 ou 5 mm de diâmetro morre, molde, pistão/fio puxando).
    2. Transfira os fragmentos de pelotas rapidamente congelados para o molde carregado com as mortes apropriadas da pelota (Figura 3B).
    3. Pelota rápida com a prensa hidráulica. O uso de 1,5 toneladas para uma pelota de 5 mm de diâmetro ou 0,5 toneladas para uma pelota de 3 mm de diâmetro é suficiente (Figura 3C).
      NOTA: Após cada preparação de pelotas com a prensa hidráulica, todos os materiais precisam ser descongelados e secos adequadamente usando gás nitrogênio para evitar problemas com a geada e umidade restantes.
    4. Colete a pelota a granel de células congeladas rapidamente e coloque-a em um criotubo adequado para armazenamento.
    5. Armazene-o de volta no tanque LN2 para armazenamento a longo prazo.
    6. Transfira e monte as cápsulas crio-pelotas para análise. A pelota armazenada em um criotube refrigerado LN2 é transferida para um suporte de amostra criostat pré-cozido de 77 K no líquido N2 (Figura 4, como usado para uma linha de feixe CRG-FAME-UHD). Esta etapa deve ser realizada o mais rápido possível, mas pode levar alguns minutos. Em seguida, transfira o suporte da amostra para o criostat e mantenha-o em 10 K durante toda a análise XAS.
      NOTA: As etapas 1.9.3 e 1.9.6 são difíceis porque precisam ser feitas rapidamente para evitar qualquer formação de geada que bloqueie o pistão e o molde. Uma alternativa é realizar esses passos sob uma tenda de plástico totalmente purgada com gás nitrogênio. A massa de cobre2-cool LN permite que a pelota seja mantida congelada.

2. Preparação das células de plâncton para especiação de ferro

NOTA: A água do mar sintética utilizada para este protocolo foi preparada adicionando sais marinhos de água ultrauso, ácido propanesulfônico de morfolino, nitrato de amônio, nitrato de sódio, pentahidrato metasilicato de sódio, monobásico fosfato de sódio, estoque de vitaminas, estoque de metais de traço, estoque de antibióticos e tampão HEPES em pH = 7,9. As concentrações de cada componente estão indicadas na Tabela de Materiais. Detalhes sobre a cultura podem ser encontrados em Sutak et al.11

  1. Centrifugar uma cultura de diatom p. tricornutum em um tubo de polipropileno de 50 mL a 1.100 x g por 6 min e transfira a pelota em um frasco com meio fresco.
  2. Deixe a cultura crescer em água do mar sintética em uma câmara de crescimento por 24 horas.
  3. Centrifugar a cultura do plâncton por 6 min a 1.100 x g e transferir a pelota para um meio fresco contendo fe-citrato (1 μM na cultura final). Incubar por 72 h.
  4. Prepare as células de plâncton
    1. Centrifugar as células por 3 min a 1.100 x g e enxágue com meio sem ferro.
    2. Transfira a pelota para um tubo de polipropileno de 1,5 mL, lave com água ultrauso e centrífuga 2x por 3 min a 1.100 x g. Remova o supernatante.
    3. Mergulhe a parte inferior do tubo de polipropileno de 1,5 mL contendo a pelota na LN2 , conforme descrito na etapa 1.8.
    4. Transfira as células congeladas em um molde congelado LN2 e pressione rapidamente usando uma prensa de pelotas XRF (Figura 3 e Figura 7) conforme descrito na etapa 1.9.
    5. Remova a pelota e armazene-a em um tanque LN2 para armazenamento a longo prazo.
    6. Siga o passo 1.9.6 (ver Figura 4 para a transferência para o suporte da amostra criostat).

3. Preparação e medição do composto de referência

NOTA: Os compostos de referência (sólidos ou líquidos) representativos da espécie e que se espera que sejam encontrados no sistema biológico devem ser preparados e analisados pelo XAS para comparação com amostras biológicas experimentais. Os espectros de referência também podem ser encontrados em bancos de dados 12,13,14 e podem ser utilizados desde que as condições de medição (por exemplo, resolução espectral) fossem semelhantes às amostras experimentais.

  1. Para referências em solução aquosa, pese compostos iniciais em pó ou líquido sob condição anaeróbica ou atmosfera inerte. Prepare referências sensíveis ao redox em uma atmosfera inerte (ou seja, em um porta-luvas anaeróbica ou em uma linha Schlenk, consulte a Figura 5 e a Figura 6) para evitar qualquer reação oxido-redutiva e preservar a integridade química do composto, que pode ser altamente reativa e instável no ar ambiente). Aqui, todas as referências de selênio foram preparadas utilizando uma linha Schlenk e água ultrapura desgasificada (Figura 6). Líquido FeIII-malate e ferritina foram preparados no ar ambiente.
  2. Misture com a solução adequada para alcançar uma concentração final de 1% wt do elemento estudado (ou seja, selênio ou ferro) para coleta no modo fluorescência.
    NOTA: A água ultrauso é a solução mais utilizada para preparar referências XAS. A adição de glicerol (15%-20%) é necessária para líquidos medidos usando fluorescência XAS padrão para evitar artefatos decorrentes da difração de raios-X por cristais de gelo e qualidade preservada do sinal XAS coletado com o detector de estado sólido. No entanto, para HERFD-XAS, o glicerol não é obrigatório. Usando um espectrômetro analisador de cristal em vez de um detector de estado sólido, a energia é selecionada com uma resolução extremamente alta e a difração induzida por cristais de gelo não afeta a coleta de dados do elementoestudado 1.
  3. Preserve e armazene a solução preparada em um balão Schlenk selado (Figura 5) ou em um tubo de polipropileno de 1,5 mL até medir nas mesmas condições das amostras.
  4. Para referências sólidas, pese pós compostos compostos de selênio ou ferro no ar ambiente ou em uma caixa de luvas se a espécie for sensível ao redox. Aqui, referências sólidas feII (Fe II-acetato e vivianite) foram preparadas em um porta-luvas N2 gasosa, enquanto FeIII (Fe(OH)3, e FeIII-fosfato) foram preparados no ar ambiente.
  5. Pesar pó de nitreto de boro de alta pureza e misturar com os compostos do modelo pós, a fim de alcançar uma concentração final de 1% wt do elemento estudado (Figura 7A).
  6. Triture em pó fino usando uma argamassa por pelo menos 15 minutos.
  7. Coloque a mistura em pó no molde para preparar pelotas com a prensa hidráulica (Figura 7B, semelhante à Figura 3A para a pelota de amostra).
  8. Feche o molde com o pistão (Figura 7C, semelhante à Figura 3B para a pelota amostral).
  9. Pressione para obter a pelota a granel (Figura 7D, semelhante à Figura 3C para a pelota amostral).
  10. Armazene as pelotas a granel preparadas no porta-luvas até que sejam analisadas nas mesmas condições das amostras.
    NOTA: A pelota a granel às vezes gruda nos pistões, dependendo da compacidade em pó, por exemplo. Removê-lo suavemente sem quebrá-lo, então pode ser difícil. Nesse caso, deve ser utilizado o procedimento a seguir usando discos de poliimida (por exemplo, Kapton).
  11. Coloque uma gota de etanol em cada lado dos pistões que estarão em contato com o pó (Figura 8A).
  12. Prepare dois discos de poliimida com diâmetro ligeiramente menor que os pistões. A espessura do poliimídeo precisa ser de 10-25 μm (mais fino será difícil de manipular, mais grosso absorverá muito dos fótons de raios-X durante a análise).
  13. Coloque os discos nos pistões. Eles vão ficar por ação capilar (Figura 8B).
  14. Monte o molde com o pistão, adicione o pó e coloque no segundo pistão (Figura 8C).
  15. Pressione (ver o passo 3.11) e remova a pelota a granel compactada dos pistões.
    NOTA: As referências sólidas podem ser montadas no suporte de amostra específico do criostat como as amostras (ver passo 1.8.6). As referências líquidas podem ser montadas no suporte de amostra específico do criostat. Consulte a Figura 9A para obter um suporte de amostra de criostat CRG-FAME. O mesmo procedimento pode ser aplicado utilizando um suporte de amostra CRG-FAME-UHD, mostrado na Figura 4D, utilizando o procedimento a seguir.
  16. Montagem de referência líquida no suporte da amostra criostat.
    1. Defina a fita de poliimida (por exemplo, Kapton) (25 μm de espessura) para selar um lado do orifício no suporte da amostra em RT (Figura 9B).
    2. Usando uma seringa, encha a cavidade lentamente com a solução até chegar ao topo. Evite bolhas. O reservatório deve ser preenchido (Figura 9C, à esquerda).
    3. Sele o outro lado da cavidade com a fita (Figura 9C, à direita).
    4. Mergulhe o suporte de amostra selado em LN2 (Figura 9D, T0-T 3).
    5. Uma reação termica induz LN2 borbulhando. Aguarde até que o borbulhante pare, sinalizando o fim da reação (Figura 9D, T3-T 5).
    6. Transfira o titular da amostra em 77 K para o criostat da linha de feixe antes de iniciar a coleta de dados (Figura 9D, T6) ou armazenar no LN2 Dewar.
      NOTA: A solução congelada é bem disseminada na cavidade e forma uma pelota uniforme e homogênea (Figura 9D, T7).

4. HERFD-XAS: procedimento de medição

  1. Otimize todos os cristais do CAS em condições de Bragg em relação à energia de interesse da linha fluorescência. Este procedimento pode ser feito com um composto de referência concentrado.
  2. Calibrar a energia do feixe monocromático incidente usando uma referência para a qual a posição de energia da borda de absorção é conhecida (tipicamente uma folha metálica pura). Esta referência pode ser posicionada em uma segunda etapa após a amostra, no modo de transmissão dupla, a fim de poder verificar a calibração de cada espectro obtido e, eventualmente, alinhá-los pós-tratamento.
  3. Posicione a amostra em criostat de hélio líquido para amostras biológicas seguindo o procedimento adequado descrito na etapa 1.9.6.
  4. Feche a cabana experimental seguindo as regras de segurança síncrotron.
  5. Realize a aquisição do XAS em uma faixa de energia que cubra a borda de absorção selecionada.
  6. Após cada aquisição espectral, mova a amostra pelo menos o dobro do tamanho do feixe na direção do movimento antes de iniciar uma nova aquisição.
    NOTA: Neste caso, foram realizadas medições utilizando cristais Ge(440) para selecionar a linha Fe Ka1 e utilizando cristais Ge(844) para selecionar a linha Se Ka1. O tamanho do feixe na amostra foi de 200 x 100 μm² (H x V Largura Máxima). O movimento amostral entre cada aquisição foi de 500 μm em ambas as direções, a fim de sondar a homogeneidade estrutural e analisar uma nova área livre de possíveis danos de radiação anteriores a cada vez. Espectros individuais são comparados e mesclados se forem sobreimposáveis dentro do ruído. A medição é interrompida para uma determinada amostra quando a qualidade do espectro fundido está correta. Em seguida, a análise de dados pode ser realizada usando qualquer software dedicado à análise XAS, especialmente aqueles que permitem um encaixe de combinação linear de espectros normalizados, como athena e artemis (grupo de medidor de software)15, SixPack16 ou Viper17. Explicações completas e detalhadas da análise XAS estão fora do escopo deste protocolo e podem ser encontradas em artigos recentes18,19, alguns deles mais especificamente dedicados a amostras biológicas20. Os espectros de referência selenium XANES já estão reunidos no banco de dados de espectros SSHADE21.

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Resultados

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Os principais objetivos dessas preparações foram investigar a interação entre nanopartículas de selênio (Se-NPs) e células cancerosas, e ligação de ferro e sequestro no fitoplâncton.

Os espectros HERFD-XANES do selênio no estado inicial (BSA Se-NPs) e em células incubadas em meio nutritivo (BSA Se-NPs após a incubação de 24 h) são mostrados na Figura 10. Os resultados mostraram que o selênio nos Se-NPs iniciais estava presente tanto como formas se(0) qu...

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Discussão

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Este protocolo foi utilizado para estudar a forma química de selênio e ferro em amostras biológicas por espectroscopia de absorção de raios-X. Concentra-se na crio-preparação e armazenamento de amostras biológicas e compostos de referência, bem como nas medições HERFD-XAS.

Crio-preparação e armazenamento
A crio-preparação das pelotas de amostra biológica a granel permite a preservação da integridade química das espécies presentes nas amostras. Isso é crucial, pois foram obs...

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Divulgações

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Os autores não têm conflitos de interesse.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Somos gratos pelas contribuições financeiras para o desenvolvimento da linha de travesso pelo CEMHTI (Orleans, França, ANR-13-BS08-0012-01) e Labex OSUG@2020 (Grenoble, França, ANR-10-LABX-0056). O projeto FAME-UHD é apoiado financeiramente pelo "grande emprunt" francês EquipEx (EcoX, ANR-10-EQPX-27-01), pelo consórcio CEA-CNRS CRG e pelo instituto INSU CNRS. Agradecemos todas as contribuições durante os experimentos, especialmente todas as pessoas que trabalham no BM30B e BM16. Os autores reconhecem o Centro Europeu de Radiação Síncrotron para o fornecimento de tempo de radiação síncrotron. Também reconhecemos o projeto PHYTOMET ANR para apoio financeiro (ANR-16-CE01-0008) e o projeto SEDMAC para apoio financeiro (INCA-Plan câncer-ASC16019CS).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Nitrato de amônioSigma-AldrichA3795NH4NO3, 2,66 mg/L de água miliQ
Câmara anaeróbicaCoy Laboratory, EUAequipado com Monitor Anaeróbico (CAM-12)
Estoque de antibióticosSigma-AldrichA0166 para ampicilina, S9137 para sulfato de estreptomicina1 mL/L de água milliQ (ampicilina sódica e sulfato de estreptomicina, 100 mg/mL)
Nitreto de boro em póCâmara de contagem
Neubauer ou Malassez
15 mL e 50 mL
Citrato férrico Fe/citrato = 1/20Sigma-AldrichF3388solução aquosa de FeCl3 50 mM e Na-citrato 1M pH 6,5
Soro Fetal BovinoGIBCOA31604-02Performance Plus, certificado formato One Shot, origem americana
FrascosSigma-AldrichZ707503TPP 150 cm2 área
de crescimentoSanyoSanyo MLR-352em 20 & C e sob um regime escuro de 12:12 (3.000 lux)
HEPES bufferSigma-AldrichH40341 g/L de água milliQ HEPES Serosa
de alto grau, OVCAR-3ATCC, Rockville, MDHTB-161Temperatura de armazenamento: temperatura de vapor de nitrogênio líquido
IncubadoraIncubadora a 37° C, atmosfera umidificada com 5% de CO2
Solução de insulina de pâncreas bovinoSigma-AldrichI051610 mg/mL de insulina em HEPES 25mM, pH 8,2, BioReagent, filtrado estéril, adequado para cultura de células
Prensa hidráulica manualSpecac, EUA
Diatomácea marinha Phaeodactylum tricornutumColeção de cultura RoscoffRCC69http://roscoff-culture-collection.org/rcc-strain-details/69
Ácido morfolina-propanossulfônicoSigma-AldrichM3183MOPS, 250 mg/L de água miliQ (pH 7,3)
Microscópio
PC-3ECCAC, Salisbury, Reino Unido90112714 Temperaturade armazenamento: temperatura do vapor de nitrogênio líquido
Penicilina-estreptomicinaSigma-AldrichP4333Solução estabilizada, com 10.000 unidades de penicilina e 10 mg de estreptomicina/mL, filtrada estéril, BioReagente, adequada para cultura de células
Pipeta-boy25mL-, 10mL- e 5mL pipetas plásticas estéreis
Produtos de cultura de plâncton, meio Mf: Sais marinhosSigma-AldrichS988340g/L de miliQ de água. Composição: Cl- 19,29 g, Na+ 10,78 g, SO42- 2,66 g, Mg2+ 1,32 g, K+ 420 mg, Ca2+ 400 mg, CO32- /HCO3- 200 mg, Sr2+ 8,8 mg, BO2- 5,6 mg, Br- 56 mg, I- 0,24 mg, Li+ 0,3 mg, F- 1 mg
Pinças de plásticoOxford InstrumentAGT 5230
RPMI MEDIUM 1640 (Modificação ATCC)GIBCOA10491-01Solução com 4,5 g/L de D-glicose, 1,5 g/L de bicarbonato de sódio, 110 mg/L (1 mM) de piruvato de sódio, 2,388 g/L (10 mM) de tampão HEPES e 300 mg/L de L-glutamina para uso em pesquisa
Nanopartículas de selênio (Se-NPs), revestidas com BSA, 2 mg/mLNANOCS Company, EUASe50-BS-1Solução de Se-NPs estabilizada com BSA. Tamanho médio de cerca de 30 nm. Armazenado a 4° C no escuro, protegido da luz.
Nanopartículas de selênio (Se-NPs), revestidas com quitosana, 2 mg/mLNANOCS Company, EUA11. Se50-CS-1Solução de Se-NPs estabilizada com quitosana. Tamanho médio de cerca de 30 nm. Armazenado a 4° C no escuro, protegido da luz.
Metassilicato de sódio pentahidratadoSigma-Aldrich71746Na2SiO3.5H2O, 22,8 mg/L de água miliQ
Nitrato de sódioSigma-AldrichS5022NaNO3, 75 mg/L de água miliQ
Fosfato de sódio monobásicoSigma-AldrichS5011NaH2PO4, 15 mg/L de água miliQ
Frascos
Capuzde cultura de tecidos
Estoque de traços de metalSigma-AldrichM5005, Z1001, M1651, C2911, 450243, 451193, 2298571 mL/L de água miliQ (MnCl2.4H2O 200 mg/L, ZnSO4.7H2O 40 mg/L, Na2MoO4.2H2O 20mg/L, CoCl2.6H2O 14 mg/L, Na3VO4.nH2O 10 mg/L, NiCl2 10 mg/L, H2SeO3 10 mg/L)
Solução de Azul de Tripano (0,4%)GIBCO15250061
Tripsina-EDTA (0,05%), vermelho de fenolGIBCO25300-054
Estoque de vitaminasSigma-AldrichT1270 para tiamina, B4639 para biotina, V6629 para B121 mL/L de água milliQ (tiamina HCl 20 mg/L, biotina 1 mg/L, B12 1 mg/L)
Banho-maria 37° O
de células Sigma-Aldrich 255475 Raspador de células Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS)GIBCO 14190-094 Sem Cálcio, Magnésio, Vermelho de Fenol Tubos Eppendorf 0,5 mL e 1,5 mL Tubos Falcon Câmara ópticoT-75

Referências

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