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Artigo de método

Descoberta de genes driver em tumores de câncer derivados de HT29 derivados do câncer colorretal

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DOI:

10.3791/61077

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22 de julho de 2020

 ,  ,  , 
1Radiation Biology Research Center, Institute for Radiological Research, Chang Gung University, Chang Gung Memorial Hospital at Linkou, 2Department of Medical Imaging and Radiological Sciences, Chang Gung University, 3Department of Radiation Oncology, Chang Gung Memorial Hospital, 4Department of Laboratory Medicine, Mackay Memorial Hospital

Neste artigo

Resumo

Apresentado aqui é um protocolo para descobrir os genes condutores superexpressos mantendo as células-tronco de câncer estabelecidas derivadas de células HT29 colorretais. RNAseq com bioinformática disponível foi realizado para investigar e tela redes de expressão genética para elucidar um mecanismo potencial envolvido na sobrevivência de células tumorais direcionadas.

Resumo

As células-tronco cancerígenas desempenham um papel vital contra as terapias clínicas, contribuindo para a recaída do tumor. Há muitos oncogenes envolvidos na tumorigênese e no início das propriedades de câncer. Como a expressão genética na formação de tumores derivados do câncer colorretal não é clara, leva tempo para descobrir os mecanismos que trabalham em um gene de cada vez. Este estudo demonstra um método para descobrir rapidamente os genes condutores envolvidos na sobrevivência das células-tronco do câncer colorretal in vitro. Foram selecionadas e utilizadas neste estudo as células cancerígenas Colorretal HT29 que expressam o LGR5 quando cultivadas como esferoides e acompanham um aumento dos marcadores de caule CD133. O protocolo apresentado é usado para realizar o RNAseq com bioinformática disponível para descobrir rapidamente os genes de driver superexpressos na formação de tumores derivados de haste HT29 colorretais. A metodologia pode rapidamente rastrear e descobrir potenciais genes driver em outros modelos de doenças.

Introdução

O câncer colorretal (C CRC) é uma das principais causas de morte com alta prevalência e mortalidade em todo o mundo1,2. Devido a mutações genéticas e amplificações, as células cancerígenas crescem sem controle proliferativo, o que contribui para a sobrevivência celular3, anti-apoptose4e câncer5,,6,7. Dentro de um tecido tumoral, a heterogeneidade tumoral permite que as células tumorais se adaptem e sobrevivam durante os tratamentos terapêuticos8. As células-tronco cancerígenas (CSCs), com maior taxa de autoconexão e pluripotência do que os tipos diferenciais de câncer, são as principais responsáveis pela recidiva do tumor9,,10 e CRC metastática11. Os CSCs apresentam mais resistência a medicamentos12,,13,14 e propriedades anti-apoptose15,16, sobrevivendo assim às quimioterapias tumorais.

Aqui, a fim de investigar o mecanismo potencial de stemness nas células-tronco CRC selecionadas, rnAseq foi realizado para tela de genes expressos diferencialmente em esferoides tumorais. As células cancerígenas podem formar esferoides (também chamados de tumores) quando cultivadas em condições de baixa adesão e estimuladas por fatores de crescimento adicionados ao meio cultivado, incluindo EGF, bFGF, HGF e IL6. Por isso, selecionamos células tumorais CRC HT29 que resistem às quimioterapias com aumento do STAT3 fosforilado quando tratadas com oxaliplatina e irinotecon17. Além disso, o HT29 expressou marcadores de maior caule quando cultivado nas condições de cultura descritas. O modelo CSC derivado do HT29 expressou maiores quantidades de receptor g-proteína-acoplado à proteína G 5 (LGR5)18, um marcador específico das células-tronco CRC19,,20. Além disso, o CD133, considerado um biomarcador geral para células-tronco cancerosas, também é altamente expresso na linha21 celular HT29. O objetivo deste protocolo é descobrir grupos de genes condutores nos tumores semelhantes a câncer estabelecidos com base em conjuntos de dados bioinformáticas em vez de investigar oncogenes individuais22. Investiga potenciais mecanismos moleculares através da análise RNAseq seguida de análises bioinformática disponíveis.

O sequenciamento da próxima geração é um método de sequenciamento de DNA de alta produtividade, facilmente disponível e confiável baseado na ajuda computacional, usado para rastrear abrangentemente genes do driver para orientar as terapias tumorais23. A tecnologia também é usada para detectar expressão genética a partir da transcrição reversa de uma amostra isolada de RNA24. No entanto, ao fazer a triagem com RNAseq, os genes mais importantes para atingir a terapia podem não ter o maior diferencial de expressão entre amostras experimentais e de controle. Assim, algumas bioinformáticas foram desenvolvidas para classificar e identificar genes com base em conjuntos de dados atuais como KEGG25, GO26,27ou PANTHER28, incluindo Ingenuity Pathway Analysis (IPA)29 e NetworkAnalyst30. Este protocolo mostra a integração do RNAseq e do NetworkAnalyst para descobrir rapidamente um grupo de genes nos esferoides derivados de HT29 selecionados em comparação com as células HT29 parentais. A aplicação desse método a outros modelos de doenças também é sugerida para descobrir diferenças em genes importantes.

Em comparação com a investigação da expressão genética individual, uma técnica de alto rendimento fornece vantagens para encontrar genes potenciais driver facilmente para a medicina de precisão tumoral. Com conjuntos de dados úteis como KEGG, GO ou PANTHER, genes específicos podem ser identificados com base nos modelos de doença, caminhos de sinalização ou funções específicas, e isso permite focar rapidamente em genes específicos e importantes, economizando tempo e custos de pesquisa. Uma aplicação semelhante é usada em estudos anteriores14,,18,31. Particularmente, um tumor é mais complicado porque diferentes tipos de tumores expressam genes e caminhos distintos para sobrevivência e proliferação. Portanto, este protocolo pode captar genes que distinguem diferentes tipos de tumores em diferentes circunstâncias. Há o potencial de encontrar estratégias eficazes contra os cânceres, entendendo o mecanismo de expressão genética específica.

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Protocolo

1. Cultura celular e formação da tumorfera

  1. Cultura HT29 células em um prato de 10 cm contendo o meio de águia modificada de Dulbecco (DMEM) com 10% de soro bovino fetal (FBS) e 1% antibiótico penicilina-estreptomicina (P/S).
  2. Cresça as células em uma incubadora a 37 °C com 5% de CO2 e 95% de umidade em condições assépticas, até atingirem 80% de confluência.
  3. Trippsinize células HT29 com 1 mL de 0,25% de trippsina por 5 min a 37 °C e, consequentemente, neutralizar a trippsina adicionando 2 mL de DMEM com 10% de FBS e 1% P/S.
  4. Conte as células HT29 usando um hemótmetro.
  5. Adicione 2.000 células/bem a uma baixa fixação de 6 placas de poço com 2 mL de DMEM sem soro com 1% de P/S e suplementada com 0,2% de B27, 20 ng/mL de fator de crescimento epidérmico (EGF), 20 ng/mL de fator de crescimento do fibroblasto (bFGF), 20 ng/mL de fator de crescimento hepatócito (HGF) e 20 ng/mL de interleucina 6 (IL6).
  6. Cresça as células a 37 °C com 5% de CO2 e 95% de umidade em condições assépticas.
  7. Adicione 0,5 mL de câncer de células-tronco a cada 2 dias até que os tumores meçam >100 μm de diâmetro por pelo menos 7 dias.
  8. Observe e meça o diâmetro da tumorfera usando um microscópio invertido com um sistema de imagem celular digital.
  9. Quando os tumores atingirem >100 μm de diâmetro, tentepsinizar os tumores com 0,25% de trippsina por 5 min a 37 °C e neutralizar a trippsina adicionando 2x o volume do meio de crescimento. Conte as células usando um hemócito.
  10. Centrifugar a 1.200 rpm por 10 min e remover o supernaspe.
  11. Incubar 5 x 104 células com 2 μL de anti-LGR5-PE e 2 μL de anti-CD133-PE em 100 μL de DMEM individualmente por 30 minutos à temperatura ambiente, tremendo a 200 rpm.
    NOTA: CD133 é um biomarcador geral de células-tronco de câncer que é altamente expresso em células HT29.
  12. Adicione 900 μL de PBS e analise a expressão LGR5 e CD133 usando citometria de fluxo. Uma mudança na fluorescência no canal FL2-H indica expressão genética.

2. Isolamento do RNA

NOTA: Use um kit comercial (ver Tabela de Materiais) com uma coluna rápida para isolamento de RNA seguindo as instruções do fabricante.

  1. Adicione 50 μL de PBS às células colhidas (2 x 105 células) e resuspense-as com pipetação.
  2. Adicione 200 μL de tampão de lise contendo 2 μL de beta-mercaptoetanol (β-ME). Vórtice rapidamente e deixe ficar por 5 minutos.
  3. Centrifugar a solução a 16.000 x g por 10 min. Colete o supernascido e misture com 200 μL de 70% de etanol.
  4. Use a coluna anexada para remover o solvente por centrifugação a 14.000 x g por 1 min.
  5. Lave usando a solução de lavagem 1 e 2 para remover completamente os não-RNAs por centrifugação a 14.000 x g por 1 min.
  6. Centrífuga novamente a 14.000 x g por 2 min para remover etanol residual.
  7. Adicione 50 μL de água destilada, centrífuga a 14.000 x g por 1 min, e colete a solução.
  8. Meça a concentração de RNA usando OD260 com um espectrofotômetro.
    Concentração de RNA (μg/mL) = (OD260) x (40 μg RNA/mL) e OD260/OD280 > 2. As amostras de RNA devem ter um número de integridade de RNA (RIN) > 7.

3. Análise de perfil e bioinformática da RNAseq

NOTA: A análise rnAseq foi realizada comercialmente (ver Tabela de Materiais) para investigar os genes diferenciais nas tumores derivadas de HT29 em comparação com as células HT29 parentais.

  1. Use serviços comerciais para etapas rnAseq, incluindo construção de biblioteca, controle de qualidade da biblioteca e sequenciamento de DNA.
  2. O relatório de dados deve conter informações importantes, incluindo as contagens de leitura, alteração de compartilhamento de log2 e valor p. Selecione os genes diferenciais de acordo com os seguintes parâmetros: genes com uma alteração de 1 2 dobras de log2 com contagem de leitura >100 no grupo tumorsphere HT29, e genes <-1 log2 dobra com contagem de leitura >100 no grupo parental HT29. Neste caso, foi considerado aceitável um valor p < 0,05 e utilizados os dados (Tabela 1).
    NOTA: Aqui, uma contagem genética >100 foi usada como limiar para continuar o estudo de um determinado gene e validar sua expressão.
  3. Use software de análise estatística (ver Tabela de Materiais),para mostrar um mapa de calor e identificar genes superexpressos >1 e genes regulados e downregulated < 1 em alteração de dobra de log2.
  4. Use o software R para desenhar o Gráfico do Vulcão com x: log2 fold change; y: -log10 (valor p) para mostrar os genes diferenciais.
    1. Instalar biblioteca R
      install.packages (biblioteca(calibrar))
    2. Leia os dados no RStudio com o seguinte programa:
      res <-read.csv("/Users/xxx.csv", header=T)
      cabeça(res)
      com(res, plot(log2FoldChange, -log10(pvalue), pch=19, main="HT29CSC vs HT29", xlim=c(-6,6), col="#C0C0C0"))
      com(subconjunto(res, pvalue<.05 & log2FoldChange>1), pontos(log2FoldChange, -log10(pvalue), pch=19, col="vermelho"))
      com (subconjunto(res, pvalue<.05 & log2FoldChange<(-1)), pontos (log2FoldChange, -log10(pvalue), pch=19, col="azul"))
      com(subconjunto(res, pvalue>.05), pontos (log2FoldChange, -log10(pvalue), pch=19, col="#444444"))
      abline(h=1,3, lty=2)
      abline (v=1, lty=2)
      abline(v=(-1), lty=2)
    3. Execute a corrida para obter o Enredo do Vulcão.

4. Seleção de genes de motorista

  1. Selecione Entrada de gene único no NetworkAnalyst.
  2. Copie e cole os genes superexpressos selecionados da Tabela 1 com "humano" especificado como o organismo e o tipo de ID Official Gene Symbol.
    NOTA: Alternativamente, use o Ensembl Gene ID para copiar e colar.
  3. Insira os dados clicando em Upload e Proceder para analisá-los usando interação proteína-proteína (PPI) seguindo o PPI genético.
  4. Use o banco de dados interactome STRING com um corte de pontuação de confiança de 900 para mostrar os genes de sementes que cruzam os genes carregados. Os genes de sementes que se associam a mais genes individuais foram selecionados como genes condutores que podem estar envolvidos na manutenção da formação de tumores derivados de HT29.
    NOTA: Existem três conjuntos de dados interactome para uso: IMEx, STRING e Rolland. String contém evidências experimentais de maior confiança. Com números de genes mais baixos, o IMEx pode ser selecionado para prever e captar os genes do driver nas redes interactome.
  5. Selecione Prosseguir na visão geral do mapeamento.
  6. Selecione Branco no Plano de Fundo e Atlas de Força no botão Layout.
  7. Selecione PANTHER BP para analisar o grupo genético de regulação.
    NOTA: Isso mostra que o HSPA5 foi responsável pela antipoptose nas tumores derivados do HT29 neste estudo(Figura 3A). Para reduzir a classificação de campo funcional específico, a classificação KEGG, GO ou PANTHER pode ser usada alternativamente para selecionar os genes específicos do driver.

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Resultados

Para estabelecer o modelo de investigação do mecanismo em células-tronco cancerosas, as células colorretais HT29 foram usadas para cultivar tumores semelhantes a troncos de câncer in vitro em uma placa de baixa fixação contendo B27, EGF, bFGF, HGF e IL6. Os tumores >100 μm de diâmetro foram formados em 7 dias(Figura 1A). Os tumores foram tentados em células únicas e analisados usando citometria de fluxo para detectar a expressão LGR5 e CD133. O LGR5 aumentou nos tumores HT29-drived de 1,1...

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Discussão

Neste estudo, tumores semelhantes a câncer cultivados foram utilizados como modelo na análise dos dados rnAseq com bioinformática disponível. Para um modelo de doença, foram utilizadas tumores derivados de HT29. Como os tumores têm resistência a medicamentos contra terapias tumorais, o modelo estabelecido pode ser usado para investigar os mecanismos detalhados de resistência, investigando diferenças na expressão genética. Além disso, a tecnologia genômica usando rnAseq com bioinformática disponível fornece uma compreensã...

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Divulgações

Os autores não têm divulgações financeiras relevantes.

Agradecimentos

Os autores agradecem ao Laboratório Central de Biologia da Radiação do Instituto de Pesquisa Radiológica, Chang Gung Memorial Hospital, pelo apoio técnico. Este estudo foi apoiado por subsídios do Hospital Memorial Chang Gung (CMRPD1J0321), Do Hospital Geral cheng Hsin (CHGH 106-06) e do Mackay Memorial Hospital (MMH-CT-10605 e MMH-106-61). Os órgãos financiadores não influenciaram na concepção do estudo e coleta de dados, análise e interpretação dos dados ou na redação do manuscrito.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Sistema de Imagem Celular Digital iRiSLogos Biosystems, IncI10999para observar a formação de esferas tumorais
Citometria de fluxoBD biosciencesFACSCaliburpara detecção de LGR5 e CD133 nas esferas tumorais
anti-LGR5-PEBiolegend373803reagente de detecção LGR5
anti-CD133-PEBiolegend372803detecção de CD133 reagente
EGFGenScriptZ00333para cultura de esferas tumorais
bFGFGenScriptZ03116para cultura de esferas tumorais
HGFGenScriptZ03229para cultura de esferas tumorais
IL6GenScriptZ03034para cultura de esferas tumorais Kit de
extração de RNA PureLink Invitrogenisolado de 12183025 RNA total para análise de RNAseq
Desempenho de RNAseqBiotools, TaiwanA análise de RNAseq é feita comercialmente pela Biotools, Ttaiwan
NetworkAnalystInstitute of Parasitology, McGill University, Montreal, Quebec, Canadahttp://www.networkanalyst.ca/
PrismGraphPad Softwareum software de análise estatística

Referências

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