Descoberta de genes driver em tumores de câncer derivados de HT29 derivados do câncer colorretal

Resumo

Apresentado aqui é um protocolo para descobrir os genes condutores superexpressos mantendo as células-tronco de câncer estabelecidas derivadas de células HT29 colorretais. RNAseq com bioinformática disponível foi realizado para investigar e tela redes de expressão genética para elucidar um mecanismo potencial envolvido na sobrevivência de células tumorais direcionadas.

Resumo

As células-tronco cancerígenas desempenham um papel vital contra as terapias clínicas, contribuindo para a recaída do tumor. Há muitos oncogenes envolvidos na tumorigênese e no início das propriedades de câncer. Como a expressão genética na formação de tumores derivados do câncer colorretal não é clara, leva tempo para descobrir os mecanismos que trabalham em um gene de cada vez. Este estudo demonstra um método para descobrir rapidamente os genes condutores envolvidos na sobrevivência das células-tronco do câncer colorretal in vitro. Foram selecionadas e utilizadas neste estudo as células cancerígenas Colorretal HT29 que expressam o LGR5 quando cultivadas como esferoides e acompanham um aumento dos marcadores de caule CD133. O protocolo apresentado é usado para realizar o RNAseq com bioinformática disponível para descobrir rapidamente os genes de driver superexpressos na formação de tumores derivados de haste HT29 colorretais. A metodologia pode rapidamente rastrear e descobrir potenciais genes driver em outros modelos de doenças.

Introdução

O câncer colorretal (C CRC) é uma das principais causas de morte com alta prevalência e mortalidade em todo o mundo^1,2. Devido a mutações genéticas e amplificações, as células cancerígenas crescem sem controle proliferativo, o que contribui para a sobrevivência celular³, anti-apoptose⁴e câncer^5,,6,7. Dentro de um tecido tumoral, a heterogeneidade tumoral permite que as células tumorais se adaptem e sobrevivam durante os tratamentos terapêuticos⁸. ....

Protocolo

1. Cultura celular e formação da tumorfera

1. Cultura HT29 células em um prato de 10 cm contendo o meio de águia modificada de Dulbecco (DMEM) com 10% de soro bovino fetal (FBS) e 1% antibiótico penicilina-estreptomicina (P/S).
2. Cresça as células em uma incubadora a 37 °C com 5% de CO₂ e 95% de umidade em condições assépticas, até atingirem 80% de confluência.
3. Trippsinize células HT29 com 1 mL de 0,25% de trippsina por 5 min a 37 °C e, consequentemente, neutralizar a trippsina adicionando 2 mL de DMEM com 10% de FBS e 1% P/S.
4. Conte as células HT29 usando um hemótmetro.
5. Adicione 2.000 células/bem a uma baixa fixa....

Resultados

Para estabelecer o modelo de investigação do mecanismo em células-tronco cancerosas, as células colorretais HT29 foram usadas para cultivar tumores semelhantes a troncos de câncer in vitro em uma placa de baixa fixação contendo B27, EGF, bFGF, HGF e IL6. Os tumores >100 μm de diâmetro foram formados em 7 dias(Figura 1A). Os tumores foram tentados em células únicas e analisados usando citometria de fluxo para detectar a expressão LGR5 e CD133. O LGR5 aumentou nos tumores HT29-drived de 1,1.......

Discussão

Neste estudo, tumores semelhantes a câncer cultivados foram utilizados como modelo na análise dos dados rnAseq com bioinformática disponível. Para um modelo de doença, foram utilizadas tumores derivados de HT29. Como os tumores têm resistência a medicamentos contra terapias tumorais, o modelo estabelecido pode ser usado para investigar os mecanismos detalhados de resistência, investigando diferenças na expressão genética. Além disso, a tecnologia genômica usando rnAseq com bioinformática disponível fornece uma compreensã.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Sistema de Imagem Celular Digital iRiS	Logos Biosystems, Inc	I10999	para observar a formação de esferas tumorais
Citometria de fluxo	BD biosciences	FACSCalibur	para detecção de LGR5 e CD133 nas esferas tumorais
anti-LGR5-PE	Biolegend	373803	reagente de detecção LGR5
anti-CD133-PE	Biolegend	372803	detecção de CD133 reagente
EGF	GenScript	Z00333	para cultura de esferas tumorais
bFGF	GenScript	Z03116	para cultura de esferas tumorais
HGF	GenScript	Z03229	para cultura de esferas tumorais
IL6	GenScript	Z03034	para cultura de esferas tumorais Kit de
extração de RNA PureLink Invitrogen		isolado de 12183025	RNA total para análise de RNAseq
Desempenho de RNAseq	Biotools, Taiwan		A análise de RNAseq é feita comercialmente pela Biotools, Ttaiwan
NetworkAnalyst	Institute of Parasitology, McGill University, Montreal, Quebec, Canada		http://www.networkanalyst.ca/
Prism	GraphPad Software		um software de análise estatística