Summary
Presenteras här är ett protokoll för att upptäcka överuttryckta föraren gener upprätthålla etablerade cancer stamceller som härrör från kolorektal HT29 celler. RNAseq med tillgängliga bioinformatik utfördes för att undersöka och screen gen uttryck nätverk för att belysa en potentiell mekanism som deltar i överlevnaden av riktade tumörceller.
Abstract
Cancer stamceller spelar en viktig roll mot kliniska terapier, bidrar till tumör återfall. Det finns många onkogener inblandade i tumorigenesis och inledandet av cancer stemness egenskaper. Eftersom genuttryck i bildandet av kolorektal cancer-härledda tumörersfärer är oklart, tar det tid att upptäcka de mekanismer som arbetar på en gen i taget. Denna studie visar en metod för att snabbt upptäcka föraren gener som deltar i överlevnaden av kolorektal cancer stamceller in vitro. Kolorektal HT29 cancerceller som uttrycker LGR5 när odlade som sfäroider och åtfölja en ökning CD133 stamhet markörer valdes ut och används i denna studie. Protokollet presenteras används för att utföra RNAseq med tillgängliga bioinformatics att snabbt avslöja överuttryckt föraren gener i bildandet av kolorektal HT29-härledda stam-liknande tumorspheres. Metoden kan snabbt screena och upptäcka potentiella förargener i andra sjukdomsmodeller.
Introduction
Kolorektal cancer (CRC) är en ledande dödsorsak med hög prevalens och dödlighet i världen1,2. På grund av genmutationer och förstärkningar växer cancerceller utan proliferativ kontroll, vilket bidrar till cellöverlevnad3, anti-apoptos4och cancerstamness5,,6,7. Inom en tumörvävnad tillåter tumörens heterogenitet tumörceller att anpassa sig och överleva under terapeutiska behandlingar8. Cancer stamceller (CSCs), med en högre grad av självförnyelse och pluripotens än olika cancertyper, är huvudansvariga för tumör återkommande9,,10 och ögonbevarande CRC11. CSCs presentera mer resistens12,13,14 och anti-apoptos egenskaper15,16, vilket överlevande tumör kemoterapi.
Här, för att undersöka den potentiella mekanismen för stamhet i de valda CRC stamceller, RNAseq utfördes för att skärmen differentially uttryckta gener i tumör sfäroider. Cancercellerna kan bilda sfäroider (även kallade tumorspheres) när de odlas i låga följsamhet villkor och stimuleras av tillväxtfaktorer läggas till odlade medium, inklusive EGF, bFGF, HGF, och IL6. Därför valde vi CRC HT29 tumörceller som motstår kemoterapier med en ökning av fosforylerade STAT3 när de behandlades med oxaliplatin och irinotecon17. Dessutom uttryckte HT29 högre stamhet markörer när odlade i den beskrivna kulturförhållanden. Den HT29-härledda CSC-modellen uttryckte högre mängder leucinrika upprepa-innehållande G-protein-kopplad receptor 5 (LGR5)18, en specifik markör för CRC-stamceller19,20. Dessutom uttrycks CD133, som anses vara en allmän biomarkör för cancerceller, också starkt uttryckt i HT29-cellinje21. Detta protokoll syfte är att upptäcka grupper av förare gener i den etablerade cancer stem-liknande tumörersfärer baserade på bioinformatik dataset i motsats till att undersöka enskilda onkogener22. Den undersöker potentiella molekylära mekanismer genom RNAseq-analys följt av tillgängliga bioinformatikanalyser.
Nästa generations sekvensering är en hög genomströmning, lättillgänglig, och tillförlitlig DNA-sekvensering metod baserad på beräkningshjälp, som används för att omfattande screen driver gener för vägledande tumörterapier23. Tekniken används också för att upptäcka genuttryck från omvänd transkription av ett isolerat RNA-prov24. Men vid screening med RNAseq, de viktigaste generna att rikta med terapi kanske inte har den högsta uttrycksskillnaden mellan experimentella och kontroll prover. Därför har vissa bioinformatik utvecklats för att klassificera och identifiera gener baserade på aktuella datamängder som KEGG25,GO26,27eller PANTHER28, inklusive Ingenuity Pathway Analysis (IPA)29 och NetworkAnalyst30. Detta protokoll visar integrationen av RNAseq och NetworkAnalyst att snabbt upptäcka en grupp gener i de utvalda HT29-härledda sfäroider jämfört med föräldrarnas HT29 celler. Tillämpning av denna metod till andra sjukdomsmodeller föreslås också för att upptäcka skillnader i viktiga gener.
Jämfört med undersökning av individuella genuttryck ger en teknik med hög genomströmning fördelar med att enkelt hitta potentiella förargener för tumörprecisionsmedicin. Med användbara datamängder som KEGG, GO eller PANTHER kan specifika gener identifieras baserat på sjukdomsmodeller, signalvägar eller specifika funktioner, och detta möjliggör snabbt fokus på specifika, viktiga gener, vilket sparar tid och forskningskostnader. En liknande tillämpning används i tidigare studier14,18,31. Särskilt är en tumör mer komplicerad eftersom olika typer av tumörer uttrycker särskiljande gener och vägar för överlevnad och spridning. Därför kan detta protokoll plocka upp gener som skiljer olika tumörtyper under olika omständigheter. Det finns potential att hitta effektiva strategier mot cancer genom att förstå mekanismen för specifika genuttryck.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cellodling och tumörsfärbildning
- Kultur HT29 celler i en 10 cm maträtt som innehåller Dulbecco modifierade örn medium (DMEM) med 10% fetala nötkreatur serum (FBS) och 1% penicillin-streptomycin antibiotika (P / S).
- Odla cellerna i en inkubator vid 37 °C med 5% CO2 och 95% luftfuktighet under aseptiska förhållanden, tills de når 80% confluency.
- Trypsinize HT29 celler med 1 ml 0,25% trypsin i 5 min vid 37 °C och därmed neutralisera trypsin genom att lägga till 2 ml DMEM med 10% FBS och 1% P / S.
- Räkna HT29-cellerna med hjälp av en hemocytometer.
- Tillsätt 2 000 celler/brunn till låga fäst 6 brunnsplattor med 2 ml serumfritt DMEM med 1% P/S och kompletterat med 0,2% B27, 20 ng/ml epidermal tillväxtfaktor (EGF), 20 ng/ml fibroblast tillväxtfaktor (bFGF), 20 ng/ml hepatocytetillväxtfaktor (HGF) och 20 ng/ml interleukin 6 (IL6).
- Odla cellerna vid 37 °C med 5% CO2 och 95% luftfuktighet under aseptiska förhållanden.
- Tillsätt 0,5 ml cancerstamcellsmedium varannan dag tills tumörsfärerna mäter >100 μm i diameter i minst 7 dagar.
- Observera och mät tumörsfärdiametern med hjälp av ett inverterat mikroskop med ett digitalt cellavbildningssystem.
- När tumörsfärerna når >100 μm i diameter, trypsinize tumorspheres med 0,25% trypsin i 5 min vid 37 °C och neutralisera trypsin genom att lägga till 2x volymen av tillväxtmedium. Räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer.
- Centrifugera vid 1200 varv/min i 10 min och ta bort supernatanten.
- Inkubera 5 x 104 celler med 2 μl anti-LGR5-PE och 2 μl anti-CD133-PE i 100 μl DMEM individuellt i 30 min vid rumstemperatur, skakar vid 200 varv/min.
OBS: CD133 är en allmän cancerstamcellsbiomarkör som uttrycks högt i HT29-celler. - Tillsätt 900 μl PBS och analysera LGR5- och CD133-uttrycket med flödescytometri. En förändring av fluorescens i FL2-H-kanalen indikerar genuttryck.
2. RNA-isolering
OBS: Använd en kommersiell sats (se Tabell över material) med en snabb kolumn för RNA-isolering enligt tillverkarens anvisningar.
- Tillsätt 50 μl PBS till de skördade cellerna (2 x 105 celler) och resuspend dem med pipettering.
- Tillsätt 200 μl lysbuffert som innehåller 2 μl beta-merkaptoetanol (β-ME). Vortex snabbt och låt stå i 5 min.
- Centrifugera lösningen på 16 000 x g i 10 min. Samla upp supernatanten och blanda med 200 μL 70% etanol.
- Använd den bifogade kolonnen för att avlägsna lösningsmedlet genom centrifugering vid 14 000 x g i 1 min.
- Tvätta med tvättlösning 1 och 2 för att helt avlägsna icke-RNA genom centrifugering vid 14 000 x g i 1 min.
- Centrifugera igen vid 14 000 x g i 2 min för att avlägsna restetanol.
- Tillsätt 50 μl destillerat vatten, centrifug på 14 000 x g i 1 min och samla upp lösningen.
- Mät RNA-koncentrationen med OD260 med en spektrofotometer.
RNA-koncentration (μg/ml) = (OD260) x (40 μg RNA/ml) och OD260/OD280 > 2. RNA-prover ska ha ett RNA-integritetsnummer (RIN) > 7.
3. RNAseq profilering och bioinformatik analys
OBS: RNAseq analys utfördes kommersiellt (se Tabell över material) för att undersöka de differentiella generna i HT29-härledda tumörer jämfört med föräldrarnas HT29 celler.
- Använd kommersiella tjänster för RNAseq-steg, inklusive bibliotekskonstruktion, bibliotekskvalitetskontroll och DNA-sekvensering.
- Datarapporten ska innehålla viktig information, inklusive läsantal, log2-vikningsändring och p-värde. Välj differentialgener enligt följande parametrar: gener med en > 1 log2 gånger förändring med läsantal >100 i HT29 tumorsphere gruppen, och gener <-1 log2 gånger förändring med läsantal >100 i HT29 föräldragruppen. I detta fall ansågs ett p-värde < 0,05 godtagbart och uppgifterna användes(tabell 1).
OBS: Här användes ett genantal >100 som tröskel för att fortsätta studien av en viss gen och validera dess uttryck. - Använd programvara för statistisk analys (se Tabell över material), för att visa en värmekarta och identifiera överuttryckda gener >1 och nedreglerade gener < 1 i log2 fold change.
- Använd R programvara för att rita Volcano Plot med x: log2 gånger förändring; y: -log10 (p värde) för att visa differentialgener.
- Installera R-bibliotek
install.packages(library(calibrate)) - Läs data i RStudio med följande program:
res <-read.csv("/Users/xxx.csv", header=T)
huvud(res)
med(res, plot(log2FoldChange, -log10(pvalue), pch=19, main="HT29CSC vs HT29", xlim=c(-6,6), col="#C0C0C0"))
med(delmängd(om, pvalue<.05 & log2FoldChange>1), points(log2FoldChange, -log10(pvalue), pch=19, col="red"))
med(delmängd(om, pvalue<.05 & log2FoldChange<(-1)), points(log2FoldChange, -log10(pvalue), pch=19, col="blue"))
med(delmängd(res, pvalue>.05), points(log2FoldChange, -log10(pvalue), pch=19, col="#444444"))
abline(h=1.3, lty=2)
abline(v=1, lty=2)
abline(v=(-1), lty=2) - Utför körningen för att få volcano plot.
- Installera R-bibliotek
4. Val av förargen
- Välj Engeningsinmatning i NetworkAnalyst.
- Kopiera och klistra in de utvalda överuttryckda generna från tabell 1 med "människa" angivet som den officiella gensymbolenför organism och ID-typ .
Obs: Alternativt kan du använda Ensembl Gene ID för att kopiera och klistra in. - Infoga data genom att klicka på Ladda upp och fortsätt att analysera den med protein-protein interaktion (PPI) efter genetisk PPI.
- Använd STRING interactome databasen med en förtroende poäng cutoff på 900 för att visa utsäde gener korslänka uppladdade gener. Frögener associera med mer enskilda gener valdes som föraren gener som kan vara inblandade i att upprätthålla bildandet av HT29-härledda tumörersfärer.
Det finns tre interactome-datauppsättningar för användning: IMEx, STRING och Rolland. STRING innehåller mer förtroende experimentella bevis. Med lägre uppladdade gennummer kan IMEx väljas för att förutsäga och plocka upp förarens gener i interactomenätverken. - Välj Fortsätt i mappningsöversikten.
- Välj Vit i bakgrunds- och kraftatlasen i layoutknappen.
- Välj PANTHER BP för att analysera gengruppen för uppreglering.
OBS: Detta visar att HSPA5 var ansvarig för anti-apoptos i HT29-härledda tumörersfärer i denna studie (figur 3A). För att begränsa det specifika funktionella området kan KEGG, GO eller PANTHER-klassificering användas alternativt för att välja specifika förargener.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att fastställa modellen för att undersöka mekanismen i cancer stamceller, kolorektal HT29 celler användes för att odla cancer stem-liknande tumörersfärer in vitro i en låg-fastsättning platta som innehåller B27, EGF, bFGF, HGF, och IL6. Tumörsfärerna >100 μm i diameter bildades i 7 dagar (figur 1A). Tumorspheres var trypsinized till enstaka celler och analyseras med hjälp av flöde cytometri att upptäcka LGR5 och CD133 uttryck. LGR5 ökade i HT29-drived tumörersfärer från 1,1% till 11,4% och cellerna upptäcktes med hjälp av flöde cytometri (Figur 1B). En annan stamhet markör, CD133, ökade också från 61,8% till 81,1% i odlade HT29-härledda tumörersfärer jämfört med föräldrarnas HT29 celler (Figur 1C). Sedan var tumorspheres redo för RNAseq undersökning.
RNAseq användes för att undersöka genuttrycksprofilen i de HT29-härledda tumorspheres jämfört med föräldrarnas HT29-celler. Felprocenten vid nukleotidavläsning var 0,03 % för båda proverna. Den totala gen kartläggning var 87,87% för HT29 och 87,25% för HT29-härledda tumörer. Fragment per kilobase av avskrift per miljon (FPKM), normalisera detektiv räknas för att ange avskrift (mRNA) uttryck, intervall mellan 0 och 1 var 75,87% för HT29 celler och 77,16% för HT29-härledda tumorspheres. Resultaten var lämpliga för därav följande sekvensering. Efter sekvensering läser, de gener med log2 gånger förändring >1 i uppreglering och <-1 i nedreglering med p värde < 0,05 visas av heatmap (Figur 2A,Tabell 1,Tabell 2) valdes. Det fanns 79 uppreglerade gener och 33 nedreglerade gener utvalda. Dessutom användes vulkantomten med log2 fold förändring och p-värde (-log10 p värde) för att skilja de betydande generna mellan HT29-härledda tumörersfärer och föräldrarnas HT29 celler (figur 2B). Baserat på det preliminära urvalet identifierades tre potentiellt uppreglerade gener, inklusive ACSS2, HMGCS1och PCSK9, i de HT29-härledda tumörsfärerna (figur 2A). För att identifiera förarens gener, inte enbart enligt log2-vikändringen, användes NetworkAnalyst. De uppreglerade generna med log2-vikningsförändring >1 med p-värde <0,05 analyserades och resulterade i 10 frögener som korslänkade gennätverken, inklusive HSPA5, HSP90AA1, BRCA1, SFN, E2F1, CYCS, CDC6, ALYREF, SQSTM1och TOMM40 (Figur 3A). För att identifiera utsädesgenernas funktion och betydelse kan klassificeringsgränssnittet användas för att utföra PANTHER BP för att bestämma de gener som är involverade i antiapoptos i HT29-härledda tumörsfärer. Resultaten visade att HSPA5 och SQSTM1 var associerade med negativ reglering av apoptos (figur 3A). Dessutom validerades de utvalda 10 generna. uttrycket ökade i de HT29-härledda tumörsfärerna som bekräftats med qPCR (figur 3B).
Figur 1: Inrättande av cancer stam-liknande tumorsphere in vitro. (A) HT29 användes för att bilda tumorspheres och (B) LGR5 upptäcktes i HT29-härledda tumörersfärer (Skala bar = 100 μm). (C)CD133 användes som en annan markör för att identifiera stamhet tecken i de etablerade tumorspheres. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Heatmap och Volcano tomt användes för att välja differentialgener i HT29-härledda tumorspheres. Log2 fold change >1 och <-1 med läsantal >100, p-värde < 0,05 användes för att utesluta oansenliga gener och se till att uppgifterna var korrekta. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: NetworkAnalyst användes för att identifiera föraren gener i HT29-härledda tumorspheres. (A) De uppreglerade generna valdes ut och analyserades följaktligen, och ett klassificeringsgränssnitt, PANTHER BP, förutsatt att de potentiella funktionerna för differentialdrivargener. (B) Sedan användes qPCR för att validera de 10 gener som var uppreglerade i HT29-härledda tumörsfärer jämfört med föräldrarnas HT29-celler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 1: De uppreglerade generna i HT29-serived tumorspheres jämfört med föräldrarnas HT29 celler analyseras av RNAseq. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Tabell 2: De nedreglerade generna i HT29-serived tumorspheres jämfört med föräldrarnas HT29 celler analyseras av RNAseq. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denna studie, odlade cancer stem-liknande tumorspheres användes som en modell för att analysera RNAseq data med tillgängliga bioinformatik. För en sjukdom modell, HT29-härledda tumorspheres användes. Eftersom tumörsfärerna har läkemedelsresistens mot tumörterapier kan den etablerade modellen användas för att undersöka de detaljerade mekanismerna för resistens genom att undersöka skillnader i genuttryck. Dessutom ger genomisk teknik som använder RNAseq med tillgängliga bioinformatik snabb förståelse för studiemodellen så att de gener som potentiellt är inblandade kan valideras med högre förtroende. Dessutom kan den typ av gener som är involverade i bildandet av tumörsfärer identifieras.
RNA-kvalitet är avgörande för RNAseq-analysen32. Se till att provet har RIN >7, eftersom det ökar säkerheten mellan kartläggning av läsningar, mappning av gener och FPKM. Vid analys av RNAseq-data var IPA29 och NetworkAnalyst30 tillgängliga för att identifiera potentiella gener och signalvägar. Det är dock viktigt att utesluta onödiga gener enligt följande parametrar: gener som visar en >1 log2 gånger förändring med läsantal >100 i den experimentella gruppen, och gener <-1 log2 gånger förändras med läsantal > 100 i kontrollgruppen. Högre läsantal är lättare för efterföljande validering med qPCR eller västerländska blots.
Baserat på förståelsen av biologiska funktioner och processer finns det många bioinformatiska verktyg som möjliggör en snabb undersökning av de potentiella mekanismerna för sjukdomar av intresse. Kombinerat med ett verktyg med hög genomströmning för att screena för genuttryck som RNAseq kan potentiella mekanismer som reglerar utvecklingen av de studerade sjukdomarna föreslås och undersökas. Här visade metoden för att undersöka bildandet av CRC stam-liknande tumorspheres härrör från HT29 att SQSTM1 och HSPA5 var målet gener uppreglerade och involverade i anti-apoptos i tumorspheres. Därför kan fler experiment utformas för att undersöka den detaljerade mekanismen för dessa gener, vilket resulterar i mer förtroende och effekt när man genomför forskningsstudier.
Här analyserades endast de uppreglerade generna i tumorspheresna, därför att upregulation var ansett för att framkallas av tillägget av tillväxt factorsna. Annars, om experimentet används gen knockdown i tumörcellerna, de nedreglerade generna skulle betraktas som mål som kan väljas för undersökning med hjälp av bioinformatik. Även om metoden är snabb och pålitlig behövs fortfarande efterföljande validering via qPCR och Western blots. Det föreslås också att fler cellinjer användas för validering av genuttryck, särskilt för kliniska prover.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga relevanta finansiella upplysningar.
Acknowledgments
Författarna tackar Strålbiologi Core Laboratory of Institute for Radiological Research, Chang Gung Memorial Hospital, för tekniskt stöd. Denna studie stöddes av bidrag från Chang Gung Memorial hospital (CMRPD1J0321), Cheng Hsin General Hospital (CHGH 106-06), och Mackay Memorial Hospital (MMH-CT-10605 och MMH-106-61). Finansieringsorganen hade inget inflytande över utformningen av studien och datainsamling, analys och tolkning av data eller skriftligen manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| iRiS Digital Cell Imaging System | Logos Biosystems, Inc | I10999 | for observing the formation of tumorspheres |
| Flow cytometry | BD biosciences | FACSCalibur | for detecting the LGR5 and CD133 in the tumorspheres |
| anti-LGR5-PE | Biolegend | 373803 | LGR5 detection reagent |
| anti-CD133-PE | Biolegend | 372803 | CD133 detection reagent |
| EGF | GenScript | Z00333 | for culture of tumorspheres |
| bFGF | GenScript | Z03116 | for culture of tumorspheres |
| HGF | GenScript | Z03229 | for culture of tumorspheres |
| IL6 | GenScript | Z03034 | for culture of tumorspheres |
| PureLink RNA extraction kit | Invitrogen | 12183025 | isolate total RNA for RNAseq analysis |
| RNAseq performance | Biotools, Taiwan | RNAseq analysis is done commerially by Biotools, Ttaiwan | |
| NetworkAnalyst | Institute of Parasitology, McGill University, Montreal, Quebec, Canada | http://www.networkanalyst.ca/ | |
| Prism | GraphPad Software | a statistical analysis software |
References
- Rawla, P., Sunkara, T., Barsouk, A. Epidemiology of colorectal cancer: incidence, mortality, survival, and risk factors. Przegląd Gastroenterologiczny. 14 (2), 89-103 (2019).
- Wong, M. C., Ding, H., Wang, J., Chan, P. S., Huang, J. Prevalence and risk factors of colorectal cancer in Asia. Intestinal Research. 17 (3), 317-329 (2019).
- Liu, Q., et al. Positive expression of basic transcription factor 3 predicts poor survival of colorectal cancer patients: possible mechanisms involved. Cell Death & Disease. 10 (7), 509 (2019).
- Slattery, M. L., et al. Dysregulated genes and miRNAs in the apoptosis pathway in colorectal cancer patients. Apoptosis. 23 (3-4), 237-250 (2018).
- Arteaga, C. L., Engelman, J. A. ERBB receptors: from oncogene discovery to basic science to mechanism-based cancer therapeutics. Cancer Cell. 25 (3), 282-303 (2014).
- Yarden, Y., Pines, G. The ERBB network: at last, cancer therapy meets systems biology. Nature Reviews Cancer. 12 (8), 553-563 (2012).
- Cheng, C. C., et al. YM155 as an inhibitor of cancer stemness simultaneously inhibits autophosphorylation of epidermal growth factor receptor and G9a-mediated stemness in lung cancer cells. PLoS One. 12 (8), 0182149 (2017).
- Prasetyanti, P. R., Medema, J. P. Intra-tumor heterogeneity from a cancer stem cell perspective. Molecular Cancer. 16 (1), 41 (2017).
- Zhao, Y., et al. CD133 expression may be useful as a prognostic indicator in colorectal cancer, a tool for optimizing therapy and supportive evidence for the cancer stem cell hypothesis: a meta-analysis. Oncotarget. 7 (9), 10023-10036 (2016).
- Choi, J. E., et al. Expression of epithelial-mesenchymal transition and cancer stem cell markers in colorectal adenocarcinoma: Clinicopathological significance. Oncology Reports. 38 (3), 1695-1705 (2017).
- Massard, C., Deutsch, E., Soria, J. C. Tumour stem cell-targeted treatment: elimination or differentiation. Annals of Oncology. 17 (11), 1620-1624 (2006).
- Grillet, F., et al. Circulating tumour cells from patients with colorectal cancer have cancer stem cell hallmarks in ex vivo culture. Gut. 66 (10), 1802-1810 (2017).
- Dallas, N. A., et al. Chemoresistant colorectal cancer cells, the cancer stem cell phenotype, and increased sensitivity to insulin-like growth factor-I receptor inhibition. Cancer Research. 69 (5), 1951-1957 (2009).
- Chang, Y. F., et al. STAT3 induces G9a to exacerbate HER3 expression for the survival of epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitors in lung cancers. BMC Cancer. 19 (1), 959 (2019).
- Catalano, V., et al. Colorectal cancer stem cells and cell death. Cancers (Basel). 3 (2), 1929-1946 (2011).
- Piggott, L., et al. Suppression of apoptosis inhibitor c-FLIP selectively eliminates breast cancer stem cell activity in response to the anti-cancer agent, TRAIL. Breast Cancer Research. 13 (5), 88 (2011).
- Chung, S. Y., et al. Two novel SHP-1 agonists, SC-43 and SC-78, are more potent than regorafenib in suppressing the in vitro stemness of human colorectal cancer cells. Cell Death Discovery. 4, 25 (2018).
- Cheng, C. C., et al. STAT3 exacerbates survival of cancer stem-like tumorspheres in EGFR-positive colorectal cancers: RNAseq analysis and therapeutic screening. Journal of Biomedical Science. 25 (1), 60 (2018).
- Kleist, B., Xu, L., Li, G., Kersten, C. Expression of the adult intestinal stem cell marker Lgr5 in the metastatic cascade of colorectal cancer. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 4 (4), 327-335 (2011).
- Medema, J. P. Targeting the Colorectal Cancer Stem Cell. New England Journal of Medicine. 377 (9), 888-890 (2017).
- Sahlberg, S. H., Spiegelberg, D., Glimelius, B., Stenerlow, B., Nestor, M. Evaluation of cancer stem cell markers CD133, CD44, CD24: association with AKT isoforms and radiation resistance in colon cancer cells. PLoS One. 9 (4), 94621 (2014).
- Xia, J., Gill, E. E., Hancock, R. E. NetworkAnalyst for statistical, visual and network-based meta-analysis of gene expression data. Nature Protocols. 10 (6), 823-844 (2015).
- Gagan, J., Van Allen, E. M. Next-generation sequencing to guide cancer therapy. Genome Medicine. 7 (1), 80 (2015).
- Panichnantakul, P., Bourgey, M., Montpetit, A., Bourque, G., Riazalhosseini, Y. RNA-Seq as a Tool to Study the Tumor Microenvironment. Methods in Molecular Biology. 1458, 311-337 (2016).
- Kanehisa, M., Sato, Y. KEGG Mapper for inferring cellular functions from protein sequences. Protein Science. 29 (1), 28-35 (2020).
- Ashburner, M., et al. Gene ontology: tool for the unification of biology. The Gene Ontology Consortium. Nature Genetics. 25 (1), (2000).
- The Gene Ontology Collective. The Gene Ontology Resource: 20 years and still GOing strong. Nucleic Acids Research. 47, 330-338 (2019).
- Mi, H., Muruganujan, A., Thomas, P. D. PANTHER in 2013: modeling the evolution of gene function, and other gene attributes, in the context of phylogenetic trees. Nucleic Acids Research. 41, Database issue 377-386 (2013).
- Yu, F., Shen, X. Y., Fan, L., Yu, Z. C. Genome-wide analysis of genetic variations assisted by Ingenuity Pathway Analysis to comprehensively investigate potential genetic targets associated with the progression of hepatocellular carcinoma. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 18 (15), 2102-2108 (2014).
- Zhou, G., et al. NetworkAnalyst 3.0: a visual analytics platform for comprehensive gene expression profiling and meta-analysis. Nucleic Acids Research. 47 (1), 234-241 (2019).
- Cheng, C. C., et al. Epidermal growth factor induces STAT1 expression to exacerbate the IFNr-mediated PD-L1 axis in epidermal growth factor receptor-positive cancers. Molecular Carcinogenesis. 57 (11), 1588-1598 (2018).
- Gallego Romero, I., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification. BMC Biology. 12, 42 (2014).
