Summary
Presentert her er en protokoll for å oppdage de overuttrykte drivergenene som opprettholder de etablerte kreftstamlignende cellene avledet fra kolorektal HT29-celler. RNAseq med tilgjengelig bioinformatikk ble utført for å undersøke og screene genuttrykksnettverk for å belyse en potensiell mekanisme involvert i overlevelsen av målrettede tumorceller.
Abstract
Kreft stamceller spiller en viktig rolle mot kliniske terapier, bidrar til tumor tilbakefall. Det er mange onkogener involvert i tumorigenesis og initiering av kreft stemness egenskaper. Siden genuttrykk i dannelsen av kolorektal kreftavledede tumorsfærer er uklart, tar det tid å oppdage mekanismene som arbeider på ett gen om gangen. Denne studien viser en metode for raskt å oppdage drivergenene som er involvert i overlevelsen av de kolorektalkreft stamceller in vitro. Kolorektal HT29 kreftceller som uttrykker LGR5 når dyrket som sfæroider og følge en økning CD133 stemness markører ble valgt og brukt i denne studien. Protokollen som presenteres brukes til å utføre RNAseq med tilgjengelig bioinformatikk for raskt å avdekke de overuttrykte drivergenene i dannelsen av kolorektal HT29-avledede stammelignende tumorsfærer. Metodikken kan raskt screene og oppdage potensielle drivergener i andre sykdomsmodeller.
Introduction
Kolorektal kreft (CRC) er en ledende dødsårsak med høy prevalens og dødelighet over hele verden1,,2. På grunn av genmutasjoner og forsterkninger vokser kreftceller uten proliferativ kontroll, noe som bidrar til celleoverlevelse3,anti-apoptose4og kreftstamme5,6,7. Innenfor et tumorvev tillater tumor heterogenitet tumorceller å tilpasse seg og overleve under terapeutiske behandlinger8. Kreftstamceller (CSCer), med en høyere grad av selvfornyelse og pluripotency enn differensialkrefttyper, er hovedsakelig ansvarlig for tumortilfall9,,10 og metastatisk CRC11. CsCs presentere mer narkotikaresistens12,13,14 og anti-apoptose egenskaper15,16, dermed overlevende tumor kjemoterapi.
Her, for å undersøke den potensielle mekanismen for stemness i de valgte CRC stamceller, RNAseq ble utført for å screene differensial uttrykte gener i tumor sfæroider. Kreftcellene kan danne sfæroider (også kalt tumorsfærer) når dyrket i lave tilslutning forhold og stimulert av vekstfaktorer lagt til kultivert medium, inkludert EGF, bFGF, HGF, og IL6. Derfor valgte vi CRC HT29 tumorceller som motstår kjemoterapi med en økning i fosforoid STAT3 når de behandles med oksaliplatin og irinotekon17. I tillegg uttrykte HT29 høyere stenktetthetsmarkører når de dyrkes i de beskrevne kulturforholdene. Den HT29-avledede CSC-modellen uttrykte høyere mengder leucinrike repeterende G-protein-koblet reseptor 5 (LGR5)18, en bestemt markør for CRC stamceller19,,20. Videre er CD133, ansett som en generell biomarkør for kreft stamceller, også sterkt uttrykt i HT29 cellelinje21. Denne protokollen sin hensikt er å oppdage grupper av drivergener i de etablerte kreftstammelignende tumorsfærene basert på bioinformatikk datasett i motsetning til å undersøke individuelle onkogener22. Den undersøker potensielle molekylære mekanismer gjennom RNAseq-analyse etterfulgt av tilgjengelige bioinformatikkanalyser.
Neste generasjons sekvensering er en høygjennomstrømning, lett tilgjengelig og pålitelig DNA-sekvenseringsmetode basert på beregningshjelp, som brukes til å omfattende skjermdrivergener for å veilede tumorterapi23. Teknologien brukes også til å oppdage genuttrykk fra omvendt transkripsjon av en isolert RNA-prøve24. Men når du screener med RNAseq, kan det hende at de viktigste genene som er målrettet mot terapi, ikke har den høyeste uttrykksforskjellen mellom eksperimentelle og kontrollprøver. Derfor ble noen bioinformatikk utviklet for å klassifisere og identifisere gener basert på nåværende datasett som KEGG25,GO26,,27eller PANTHER28,inkludert Ingenuity Pathway Analysis (IPA)29 og NetworkAnalyst30. Denne protokollen viser integreringen av RNAseq og NetworkAnalyst for raskt å oppdage en gruppe gener i de valgte HT29-avledede sfæroidene sammenlignet med foreldrenes HT29-celler. Anvendelse av denne metoden til andre sykdomsmodeller er også foreslått for å oppdage forskjeller i viktige gener.
Sammenlignet med undersøkelse av individuelle genuttrykk, gir en høy gjennomstrømningsteknikk fordeler med å finne potensielle drivergener lett for tumorpresisjonsmedisin. Med nyttige datasett som KEGG, GO eller PANTHER kan spesifikke gener identifiseres basert på sykdomsmodellene, signalveiene eller spesifikke funksjoner, og dette gjør det mulig å fokusere raskt på spesifikke, viktige gener, noe som sparer tid og forskningskostnader. En lignende applikasjon brukes i tidligere studier14,18,31. Spesielt er en svulst mer komplisert fordi ulike typer svulster uttrykker skille gener og veier for overlevelse og spredning. Derfor kan denne protokollen plukke opp gener som skiller forskjellige tumortyper under forskjellige omstendigheter. Det er potensial til å finne effektive strategier mot kreft ved å forstå mekanismen for spesifikt genuttrykk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cellekultur og tumorsfæredannelse
- Kultur HT29 celler i en 10 cm tallerken som inneholder Dulbecco modifisert eagle medium (DMEM) med 10% foster storfe serum (FBS) og 1% penicillin-streptomycin antibiotika (P / S).
- Øk cellene i en inkubator ved 37 °C med 5 % CO2 og 95 % fuktighet under aseptiske forhold, til de når 80 % samløpet.
- Trypsinisere HT29 celler med 1 ml 0,25% trypsin i 5 min ved 37 °C og dermed nøytralisere trypsin ved å legge til 2 ml DMEM med 10% FBS og 1% P / S.
- Tell HT29-cellene ved hjelp av et hemocytometer.
- Tilsett 2000 celler / brønn til en lav festet 6 brønnplater med 2 ml serumfri DMEM med 1% P / S og supplert med 0,2% B27, 20 ng/ml epidermal vekstfaktor (EGF), 20 ng/ml fibroblast vekstfaktor (bFGF), 20 ng/ml hepatocytvekstfaktor (HGF) og 20 ng/ml interleukin 6 (IL6).
- Øk cellene ved 37 °C med 5 % CO2 og 95 % fuktighet under aseptiske forhold.
- Tilsett 0,5 ml kreftstamcellemedium annenhver dag til tumorsfærene måler > 100 μm i diameter i minst 7 dager.
- Observer og mål tumorsfæren diameter ved hjelp av et omvendt mikroskop med et digitalt cellebildesystem.
- Når tumorsfærene når > 100 μm i diameter, trypsinisere tumorsfærer med 0,25% trypsin i 5 min ved 37 ° C og nøytralisere trypsin ved å legge 2x volumet av vekstmedium. Tell cellene ved hjelp av et hemocytometer.
- Sentrifuge på 1200 rpm i 10 min og fjerne supernatant.
- Inkuber 5 x 104 celler med 2 μL anti-LGR5-PE og 2 μL anti-CD133-PE i 100 μL DMEM individuelt i 30 min ved romtemperatur, risting ved 200 rpm.
MERK: CD133 er en generell kreft stamcelle biomarkør som er sterkt uttrykt i HT29 celler. - Tilsett 900 μL PBS og analyser LGR5- og CD133-uttrykket ved hjelp av strømningscytometri. En endring i fluorescens i FL2-H-kanalen indikerer genuttrykk.
2. RNA-isolasjon
MERK: Bruk et kommersielt sett (se Materialkommand)med en rask kolonne for RNA-isolasjon etter produsentens instruksjoner.
- Tilsett 50 μL PBS i de høstede cellene (2 x 105 celler) og resuspend dem med pipettering.
- Tilsett 200 μL lysisbuffer som inneholder 2 μL beta-mercaptoethanol (β-ME). Vortex raskt og la stå i 5 min.
- Sentrifuger oppløsningen ved 16.000 x g i 10 min. Samle supernatanten og bland med 200 μL på 70% etanol.
- Bruk den vedlagte kolonnen til å fjerne oppløsningsvæsken ved sentrifugering ved 14 000 x g i 1 min.
- Vask med vaskeoppløsning 1 og 2 for å fjerne ikke-RNA ved sentrifugering ved 14 000 x g i 1 min.
- Sentrifuge igjen på 14.000 x g for 2 min for å fjerne gjenværende etanol.
- Tilsett 50 μL destillert vann, sentrifuger ved 14 000 x g i 1 min, og samle opp løsningen.
- Mål RNA-konsentrasjonen ved hjelp av OD260 med et spektrofotometer.
RNA-konsentrasjon (μg/ml) = (OD260) x (40 μg RNA/ml) og OD260/OD280 > 2. RNA-prøver bør ha et RNA-integritetsnummer (RIN) > 7.
3. RNAseq profilering og bioinformatikk analyse
MERK: RNAseq-analysen ble utført kommersielt (se Tabell over materialer) for å undersøke differensialgenene i de HT29-avledede tumorsfærene sammenlignet med foreldrenes HT29-celler.
- Bruk kommersielle tjenester for RNAseq-trinn, inkludert bibliotekkonstruksjon, bibliotekkvalitetskontroll og DNA-sekvensering.
- Datarapporten skal inneholde viktig informasjon, inkludert lesetellinger, log2 fold endring, og p verdi. Velg differensialgenene i henhold til følgende parametere: gener med en > 1 log2 fold endring med lesetall > 100 i HT29 tumorsfæregruppen, og gener <-1 log2 fold endring med leseantall > 100 i HT29 foreldregruppen. I dette tilfellet ble en p-verdi < 0,05 ansett som akseptabelt, og dataene ble brukt (Tabell 1).
MERK: Her ble et gentall >100 brukt som terskel for å fortsette studien av et bestemt gen og validere uttrykket. - Bruk statistisk analyseprogramvare (se Materialbord), for å vise et varmekart og identifisere overuttrykte gener >1 og nedregulerte gener < 1 i log2 fold endring.
- Bruk R programvare for å tegne Volcano Plot med x: log2 fold endring; y: -log10 (p verdi) for å vise differensialgener.
- Installere R-bibliotek
install.packages (bibliotek(kalibrer)) - Les dataene i RStudio med følgende program:
res <-read.csv("/Brukere/xxx.csv", header=T)
hode(res)
med(res, plot(log2FoldChange, -log10(pvalue), pch=19, main="HT29CSC vs HT29", xlim=c(-6,6), col="#C0C0C0"))
med(delsett(res, pvalue<.05 & log2FoldChange>1), punkt(log2FoldChange, -log10(pvalue), pch=19, col="red"))
med(delsett(res, pvalue<.05 & log2FoldChange<(-1)), punkt(log2FoldChange, -log10(pvalue), pch=19, col="blå"))
med(delsett(res, pvalue>.05), punkt (log2FoldChange, -log10(pvalue), pch=19, col="#444444"))
abline(h=1.3, lty=2)
abline(v = 1, lty = 2)
abline(v=(-1), lty=2) - Utfør løpet for å få vulkanplottet.
- Installere R-bibliotek
4. Valg av drivergen
- Velg Enkelt geninngang i NetworkAnalyst.
- Kopier og lim inn de valgte overexpressed genene fra tabell 1 med "menneske" spesifisert som organisme og ID type Official Gene Symbol.
MERK: Alternativt kan du bruke Ensembl Gene ID for å kopiere og lime inn. - Sett inn dataene ved å klikke Last opp og fortsett for å analysere dem ved hjelp av protein-protein interaksjon (PPI) etter genetisk PPI.
- Bruk STRING interactome-databasen med en konfidensscore cutoff på 900 for å vise frøgenene som knytter de opplastede genene sammen. Frøgenene som assosierer med mer individuelle gener ble valgt som drivergener som kan være involvert i å opprettholde dannelsen av HT29-avledede tumorsfærer.
MERK: Det finnes tre datasett for interactome for bruk: IMEx, STRING og Rolland. STRING inneholder høyere tillit eksperimentelle bevis. Med lavere opplastede gennumre kan IMEx velges for å forutsi og plukke opp drivergenene i interactome-nettverkene. - Velg Fortsett i tilordningsoversikten.
- Velg Hvit i Bakgrunnen og Tving Atlas i Oppsett-knappen.
- Velg PANTHER BP for å analysere oppreguleringsgengruppen.
MERK: Dette viser at HSPA5 var ansvarlig for anti-apoptose i HT29-avledede tumorsfærer i denne studien (figur 3A). For å begrense det spesifikke funksjonsfeltet kan KEGG-, GO- eller PANTHER-klassifisering brukes alternativt til å velge de spesifikke drivergenene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å etablere modellen for å undersøke mekanismen i kreft stamceller, kolorektal HT29 celler ble brukt til å kultur kreft stammen-lignende tumorsfærer in vitro i en lav-vedlegg plate som inneholder B27, EGF, bFGF, HGF, og IL6. Tumorsfærene > 100 μm i diameter ble dannet i 7 dager (figur 1A). Tumorsfærene ble trypsinisert til enkeltceller og analysert ved hjelp av strømningscytometri for å oppdage LGR5 og CD133-uttrykk. LGR5 økte i HT29-drivde tumorsfærer fra 1,1% til 11,4% og cellene ble oppdaget ved hjelp av strømningscytometri (figur 1B). En annen stemness markør, CD133, økte også fra 61,8% til 81,1% i de kultiverte HT29-avledede tumorsfærer sammenlignet med foreldrenes HT29 celler (Figur 1C). Deretter var tumorsfærene klare for RNAseq-undersøkelse.
RNAseq ble brukt til å undersøke genuttrykksprofilen i de HT29-avledede tumorsfærene sammenlignet med de foreldre HT29-cellene. Feilfrekvensen i nukleotidavlesning var 0,03 % for begge prøvene. Den totale genkartleggingsraten var 87,87 % for HT29 og 87,25 % for HT29-avledede tumorsfærer. Fragmentene per kilobase av transkripsjon per million (FPKM), normalisering detektivtellingen for å indikere transkripsjonen (mRNA) uttrykk, intervall mellom 0 og 1 var 75,87% for HT29 celler, og 77,16% for HT29-avledede tumorsfærer. Resultatene var egnet for påfølgende sekvensering. Etter sekvensering leser, genene med log2 fold endring > 1 i upregulering og <-1 i nedregulering med p verdi < 0,05 vist av varmekartet (Figur 2A,Tabell 1,Tabell 2) ble valgt. Det var 79 oppregulerte gener og 33 nedregulerte gener valgt. I tillegg ble vulkanplottet ved hjelp av log2 fold endring og p verdi (-log10 p verdi) brukt til å skille de betydelige genene mellom HT29-avledede tumorsfærer og foreldre HT29 celler (Figur 2B). Basert på det foreløpige utvalget ble det identifisert tre potensielt upregulerte gener, inkludert ACSS2, HMGCS1og PCSK9,i de HT29-avledede tumorsfærene (figur 2A). Videre, for å identifisere drivergenene som ikke bare er i henhold til log2 fold endring, NetworkAnalyst ble brukt. De upregulerte genene med log2 fold endring > 1 med p verdi <0,05 ble analysert og resulterte i 10 frø gener krysskobling gennettverkene, inkludert HSPA5, HSP90AA1, BRCA1, SFN, E2F1, CYCS, CDC6, ALYREF, SQSTM1, og TOMM40 (Figur 3A). For å identifisere funksjonen og betydningen av frøgenene, kan klassifiseringsgrensesnittet brukes til å utføre PANTHER BP for å bestemme genene som er involvert i anti-apoptose i HT29-avledede tumorsfærer. Resultatene indikerte at HSPA5 og SQSTM1 var forbundet med negativ regulering av apoptose (figur 3A). Videre ble de utvalgte 10 genene derfor validert; økning i de HT29-avledede tumorsfærene som bekreftet ved bruk av qPCR (Figur 3B).
Figur 1: Etablering av kreft stammen-lignende tumorsfære in vitro. (A) HT29 ble brukt til å danne tumorsfærer, og (B) LGR5 ble oppdaget i HT29-avledede tumorsfærer (Skala bar = 100 μm). (C) CD133 ble brukt som en annen markør for å identifisere stammetegnene i de etablerte tumorsfærene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Heatmap og Volcano plot ble brukt til å velge differensialgener i HT29-avledede tumorsfærer. Log2 fold endring > 1 og <-1 med leseantall > 100, p verdi < 0,05 ble brukt til å utelukke ikke-ubetydelige gener og sørge for at dataene var nøyaktige. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: NetworkAnalyst ble brukt til å identifisere drivergenene i de HT29-avledede tumorsfærene. (A) De upregulerte genene ble valgt og analysert følgelig, og et klassifiseringsgrensesnitt, PANTHER BP, ga de potensielle funksjonene for differensialdrivergenene. (B) Deretter ble qPCR brukt til å validere de 10 genene som ble oppregulert i HT29-avledede tumorsfærer sammenlignet med foreldrenes HT29-celler. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Tabell 1: De upregulerte genene i HT29-serived tumorsfærer sammenlignet med foreldrenes HT29-celler analysert av RNAseq. Vennligst klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tabell 2: De nedregulerte genene i HT29-serived tumorsfærer sammenlignet med foreldrenes HT29-celler analysert av RNAseq. Vennligst klikk her for å laste ned denne tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne studien ble kultiverte kreftstammelignende tumorsfærer brukt som modell for å analysere RNAseq-data med tilgjengelig bioinformatikk. For en sykdomsmodell ble HT29-avledede tumorsfærer brukt. Fordi tumorsfærene har legemiddelresistens mot tumorterapi, kan den etablerte modellen brukes til å undersøke de detaljerte resistensmekanismene ved å undersøke forskjeller i genuttrykk. Videre gir genomteknologi ved hjelp av RNAseq med tilgjengelig bioinformatikk rask forståelse av studiemodellen slik at genene som potensielt er involvert, kan validerer med høyere tillit. Også den type gener som er involvert i dannelsen av tumorsfærer, kan identifiseres.
RNA-kvalitet er avgjørende for RNAseq-analysen32. Sørg for at prøven har RIN >7, fordi det øker sikkerheten mellom kartlegging av lesing, kartlegging av gener og FPKM. Ved analyse av RNAseq-data var IPA29 og NetworkAnalyst30 tilgjengelige for å identifisere potensielle gener og signalveier. Det er imidlertid viktig å utelukke unødvendige gener i henhold til følgende parametere: gener som viser en > 1 log2 fold endring med lesetellinger > 100 i den eksperimentelle gruppen, og gener <-1 log2 fold endring med lesetelling > 100 i kontrollgruppen. Høyere lesetall er enklere for påfølgende validering ved hjelp av qPCR eller vestlige blots.
Basert på forståelsen av biologiske funksjoner og prosesser, er det mange bioinformatikkverktøy som tillater rask undersøkelse av de potensielle mekanismene for sykdommer av interesse. Kombinert med et høygjennomstrømningsverktøy for å screene for genuttrykk som RNAseq, kan potensielle mekanismer som regulerer utviklingen av de studerte sykdommene foreslås og undersøkes. Her viste metoden for å undersøke dannelsen av CRC-stammelignende tumorsfærer avledet fra HT29 at SQSTM1 og HSPA5 var målgenene som ble oppregulert og involvert i anti-apoptose i tumorsfærer. Derfor kan flere eksperimenter utformes for å undersøke den detaljerte mekanismen til disse genene, noe som resulterer i mer tillit og effekt når du utfører forskningsstudier.
Her ble bare de upregulerte genene i tumorsfærene analysert fordi upregulering ble ansett å være indusert av tilsetning av vekstfaktorene. Ellers, hvis eksperimentet brukte gennedslag i tumorcellene, ville de nedregulerte genene betraktes som mål som kan velges for undersøkelse ved hjelp av bioinformatikk. Selv om metodikken er rask og pålitelig, er etterfølgende validering fortsatt nødvendig via qPCR og vestlige blots. Det foreslås også at flere cellelinjer brukes til validering av genuttrykk, spesielt for kliniske prøver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen relevante finansielle avsløringer.
Acknowledgments
Forfatterne takker Radiation Biology Core Laboratory of Institute for Radiological Research, Chang Gung Memorial Hospital, for teknisk støtte. Denne studien ble støttet av tilskudd fra Chang Gung Memorial hospital (CMRPD1J0321), Cheng Hsin General Hospital (CHGH 106-06), og Mackay Memorial Hospital (MMH-CT-10605 og MMH-106-61). Finansieringsorganer hadde ingen innflytelse i utformingen av studien og datainnsamling, analyse og tolkning av data eller skriftlig manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| iRiS Digital Cell Imaging System | Logos Biosystems, Inc | I10999 | for observing the formation of tumorspheres |
| Flow cytometry | BD biosciences | FACSCalibur | for detecting the LGR5 and CD133 in the tumorspheres |
| anti-LGR5-PE | Biolegend | 373803 | LGR5 detection reagent |
| anti-CD133-PE | Biolegend | 372803 | CD133 detection reagent |
| EGF | GenScript | Z00333 | for culture of tumorspheres |
| bFGF | GenScript | Z03116 | for culture of tumorspheres |
| HGF | GenScript | Z03229 | for culture of tumorspheres |
| IL6 | GenScript | Z03034 | for culture of tumorspheres |
| PureLink RNA extraction kit | Invitrogen | 12183025 | isolate total RNA for RNAseq analysis |
| RNAseq performance | Biotools, Taiwan | RNAseq analysis is done commerially by Biotools, Ttaiwan | |
| NetworkAnalyst | Institute of Parasitology, McGill University, Montreal, Quebec, Canada | http://www.networkanalyst.ca/ | |
| Prism | GraphPad Software | a statistical analysis software |
References
- Rawla, P., Sunkara, T., Barsouk, A. Epidemiology of colorectal cancer: incidence, mortality, survival, and risk factors. Przegląd Gastroenterologiczny. 14 (2), 89-103 (2019).
- Wong, M. C., Ding, H., Wang, J., Chan, P. S., Huang, J. Prevalence and risk factors of colorectal cancer in Asia. Intestinal Research. 17 (3), 317-329 (2019).
- Liu, Q., et al. Positive expression of basic transcription factor 3 predicts poor survival of colorectal cancer patients: possible mechanisms involved. Cell Death & Disease. 10 (7), 509 (2019).
- Slattery, M. L., et al. Dysregulated genes and miRNAs in the apoptosis pathway in colorectal cancer patients. Apoptosis. 23 (3-4), 237-250 (2018).
- Arteaga, C. L., Engelman, J. A. ERBB receptors: from oncogene discovery to basic science to mechanism-based cancer therapeutics. Cancer Cell. 25 (3), 282-303 (2014).
- Yarden, Y., Pines, G. The ERBB network: at last, cancer therapy meets systems biology. Nature Reviews Cancer. 12 (8), 553-563 (2012).
- Cheng, C. C., et al. YM155 as an inhibitor of cancer stemness simultaneously inhibits autophosphorylation of epidermal growth factor receptor and G9a-mediated stemness in lung cancer cells. PLoS One. 12 (8), 0182149 (2017).
- Prasetyanti, P. R., Medema, J. P. Intra-tumor heterogeneity from a cancer stem cell perspective. Molecular Cancer. 16 (1), 41 (2017).
- Zhao, Y., et al. CD133 expression may be useful as a prognostic indicator in colorectal cancer, a tool for optimizing therapy and supportive evidence for the cancer stem cell hypothesis: a meta-analysis. Oncotarget. 7 (9), 10023-10036 (2016).
- Choi, J. E., et al. Expression of epithelial-mesenchymal transition and cancer stem cell markers in colorectal adenocarcinoma: Clinicopathological significance. Oncology Reports. 38 (3), 1695-1705 (2017).
- Massard, C., Deutsch, E., Soria, J. C. Tumour stem cell-targeted treatment: elimination or differentiation. Annals of Oncology. 17 (11), 1620-1624 (2006).
- Grillet, F., et al. Circulating tumour cells from patients with colorectal cancer have cancer stem cell hallmarks in ex vivo culture. Gut. 66 (10), 1802-1810 (2017).
- Dallas, N. A., et al. Chemoresistant colorectal cancer cells, the cancer stem cell phenotype, and increased sensitivity to insulin-like growth factor-I receptor inhibition. Cancer Research. 69 (5), 1951-1957 (2009).
- Chang, Y. F., et al. STAT3 induces G9a to exacerbate HER3 expression for the survival of epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitors in lung cancers. BMC Cancer. 19 (1), 959 (2019).
- Catalano, V., et al. Colorectal cancer stem cells and cell death. Cancers (Basel). 3 (2), 1929-1946 (2011).
- Piggott, L., et al. Suppression of apoptosis inhibitor c-FLIP selectively eliminates breast cancer stem cell activity in response to the anti-cancer agent, TRAIL. Breast Cancer Research. 13 (5), 88 (2011).
- Chung, S. Y., et al. Two novel SHP-1 agonists, SC-43 and SC-78, are more potent than regorafenib in suppressing the in vitro stemness of human colorectal cancer cells. Cell Death Discovery. 4, 25 (2018).
- Cheng, C. C., et al. STAT3 exacerbates survival of cancer stem-like tumorspheres in EGFR-positive colorectal cancers: RNAseq analysis and therapeutic screening. Journal of Biomedical Science. 25 (1), 60 (2018).
- Kleist, B., Xu, L., Li, G., Kersten, C. Expression of the adult intestinal stem cell marker Lgr5 in the metastatic cascade of colorectal cancer. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 4 (4), 327-335 (2011).
- Medema, J. P. Targeting the Colorectal Cancer Stem Cell. New England Journal of Medicine. 377 (9), 888-890 (2017).
- Sahlberg, S. H., Spiegelberg, D., Glimelius, B., Stenerlow, B., Nestor, M. Evaluation of cancer stem cell markers CD133, CD44, CD24: association with AKT isoforms and radiation resistance in colon cancer cells. PLoS One. 9 (4), 94621 (2014).
- Xia, J., Gill, E. E., Hancock, R. E. NetworkAnalyst for statistical, visual and network-based meta-analysis of gene expression data. Nature Protocols. 10 (6), 823-844 (2015).
- Gagan, J., Van Allen, E. M. Next-generation sequencing to guide cancer therapy. Genome Medicine. 7 (1), 80 (2015).
- Panichnantakul, P., Bourgey, M., Montpetit, A., Bourque, G., Riazalhosseini, Y. RNA-Seq as a Tool to Study the Tumor Microenvironment. Methods in Molecular Biology. 1458, 311-337 (2016).
- Kanehisa, M., Sato, Y. KEGG Mapper for inferring cellular functions from protein sequences. Protein Science. 29 (1), 28-35 (2020).
- Ashburner, M., et al. Gene ontology: tool for the unification of biology. The Gene Ontology Consortium. Nature Genetics. 25 (1), (2000).
- The Gene Ontology Collective. The Gene Ontology Resource: 20 years and still GOing strong. Nucleic Acids Research. 47, 330-338 (2019).
- Mi, H., Muruganujan, A., Thomas, P. D. PANTHER in 2013: modeling the evolution of gene function, and other gene attributes, in the context of phylogenetic trees. Nucleic Acids Research. 41, Database issue 377-386 (2013).
- Yu, F., Shen, X. Y., Fan, L., Yu, Z. C. Genome-wide analysis of genetic variations assisted by Ingenuity Pathway Analysis to comprehensively investigate potential genetic targets associated with the progression of hepatocellular carcinoma. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 18 (15), 2102-2108 (2014).
- Zhou, G., et al. NetworkAnalyst 3.0: a visual analytics platform for comprehensive gene expression profiling and meta-analysis. Nucleic Acids Research. 47 (1), 234-241 (2019).
- Cheng, C. C., et al. Epidermal growth factor induces STAT1 expression to exacerbate the IFNr-mediated PD-L1 axis in epidermal growth factor receptor-positive cancers. Molecular Carcinogenesis. 57 (11), 1588-1598 (2018).
- Gallego Romero, I., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification. BMC Biology. 12, 42 (2014).
