Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Kolorektal HT29 türetilmiş Kanser Kök Benzeri Tümörkürelerde Sürücü Genlerinin Keşfi

Published: July 22, 2020 doi: 10.3791/61077
Automatic Translation
1, 4, 1, 1,2,3
1Radiation Biology Research Center, Institute for Radiological Research, Chang Gung University, Chang Gung Memorial Hospital at Linkou, 2Department of Medical Imaging and Radiological Sciences, Chang Gung University, 3Department of Radiation Oncology, Chang Gung Memorial Hospital, 4Department of Laboratory Medicine, Mackay Memorial Hospital

Summary

Burada sunulan kolorektal HT29 hücrelerinden elde edilen kurulan kanser kök benzeri hücreleri koruyan aşırı ifade sürücü genleri keşfetmek için bir protokoldür. RNAseq mevcut biyoinformatik ile araştırılmış ve hedeflenen tümör hücrelerinin hayatta kalma dahil potansiyel bir mekanizma açıklığa kavuşturmak için gen ekspresyonu ağları ekran.

Abstract

Kanser kök hücreleri klinik tedavilere karşı hayati bir rol oynar, tümör nüks katkıda. Tümörigenez ve kanser sapı özelliklerinin başlatılması nda birçok onkogen vardır. Kolorektal kanser kaynaklı tümör kürelerinin oluşumunda gen ekspresyonu belirsiz olduğundan, bir seferde bir gen üzerinde çalışan mekanizmaları keşfetmek zaman alır. Bu çalışma, kolorektal kanser kök benzeri hücrelerin in vitro hayatta kalma dahil sürücü genleri hızlı bir şekilde keşfetmek için bir yöntem göstermektedir. Kolorektal HT29 kanser hücreleri, küresel olarak kültürlendiğinde LGR5'i ifade eden ve bu çalışmada CD133 kök belirteçlerinin artmasına eşlik eden kanser hücreleri seçilmiş ve kullanılmıştır. Sunulan protokol, kolorektal HT29 kaynaklı kök benzeri tümör kürelerinin oluşumunda aşırı ifade edilen sürücü genlerini hızlı bir şekilde ortaya çıkarmak için mevcut biyoinformatik ile RNAseq'yi gerçekleştirmek için kullanılır. Metodoloji hızlı bir şekilde tarama ve diğer hastalık modellerinde potansiyel sürücü genleri keşfetmek.

Introduction

Kolorektal kanser (CRC) yüksek yaygınlık ve mortalite dünya çapında 1 ile önde gelen ölüm nedenidir1,2. Gen mutasyonları ve amplifikasyonlar nedeniyle, kanser hücreleri proliferatif kontrol olmadan büyümek, hangi hücre sağkalım katkıda3, anti-apoptosis4, ve kanser sapı5,6,7. Tümör dokusu içinde tümör heterojenitesi tümör hücrelerinin terapötik tedaviler sırasında uyum sağlamasını ve hayatta kalmalarını sağlar8. Kanser kök hücreleri (CSCs), diferansiyel kanser türlerine göre kendini yenileme ve pluripotency daha yüksek bir oranda, esas olarak tümör nüks sorumludur9,10 ve metastatik CRC11. CSCs daha fazla ilaç direnci mevcut12,13,14 ve anti-apoptoz özellikleri15,16, böylece tümör kemoterapi hayatta.

Burada, seçilen CRC kök hücrelerinde köklük için potansiyel mekanizmayı araştırmak amacıyla, Tümör sferoidlerinde farklı olarak ifade edilen genleri taramak için RNAseq uygulandı. Kanser hücreleri, düşük yapışma koşullarında büyüdüğünde ve EGF, bFGF, HGF ve IL6 gibi kültürlü ortama eklenen büyüme faktörleri tarafından uyarıldığında küresel (tümör küreleri olarak da adlandırılır) oluşturabilir. Bu nedenle oksaliplatin ve irinoteon17ile tedavi edildiğinde fosforilasyonLU STAT3 artışı ile kemoterapiye direnen CRC HT29 tümör hücrelerini seçtik. Buna ek olarak, HT29 açıklanan kültür koşullarında kültürlü zaman yüksek kök belirteçleri ifade etti. HT29 türetilmiş CSC modeli lösin açısından zengin tekrar içeren G-protein-çiftreseptör 5 (LGR5)18,CRC kök hücrelerinin belirli bir belirteç19,,20yüksek miktarlarda ifade . Ayrıca, CD133, kanser kök hücreleri için genel bir biyomarker olarak kabul, ayrıca yüksek HT29 hücre hattı21ifade edilir. Bu protokolün amacı, bireysel onkogenlerin araştırılması yerine biyoinformatik veri setlerine dayalı kanser sapı benzeri tümör kürelerinde sürücü genlerinin gruplarını keşfetmektir22. Mevcut biyoinformatik analizleri takip eden RNAseq analizi ile potansiyel moleküler mekanizmaları inceler.

Yeni nesil sıralama, tümör tedavileri23rehberlik için kapsamlı ekran sürücü genleri için kullanılan hesaplamalı yardıma dayalı, yüksek iş gücü, kolayca kullanılabilir ve güvenilir DNA sıralama yöntemidir. Bu teknoloji aynı zamanda gen ekspresyonunu izole edilmiş bir RNA örneğinin ters transkripsiyonundan tespit etmek için de kullanılır24. Ancak RNAseq ile tarama yapılırken, tedavi ile hedeflenene en önemli genler deneysel ve kontrol örnekleri arasında en yüksek ekspresyon farkı olmayabilir. Bu nedenle, bazı biyoinformatik sınıflandırmak ve KEGG25, GO26,27, veya PANTHER28gibi mevcut veri setleri dayalı genlerin sınıflandırılması ve tanımlanması için geliştirilmiştir , Marifet Pathway Analizi dahil (IPA)29 ve NetworkAnalyst30. Bu protokol, seçilen HT29 türetilmiş küresel hücrelerdeki bir grup geni ebeveyn HT29 hücrelerine kıyasla hızlı bir şekilde keşfetmek için RNAseq ve NetworkAnalyst'in entegrasyonunu göstermektedir. Bu yöntemin diğer hastalık modellerine uygulanması da önemli genlerdeki farklılıkların keşfedilmesi için önerilmektedir.

Bireysel gen ekspresyonunun araştırılmasıile karşılaştırıldığında, yüksek iş gücü tekniği tümör hassas tıbbı için potansiyel sürücü genlerini kolayca bulma nın avantajlarını sağlar. KEGG, GO veya PANTHER gibi yararlı veri kümeleri ile, belirli genler hastalık modelleri, sinyal yolları veya belirli fonksiyonlara göre tanımlanabilir ve bu hızlı bir şekilde belirli, önemli genlere odaklanmanızı, zaman ve araştırma maliyetlerinden tasarruf etmenizi sağlar. Benzer bir uygulama önceki çalışmalarda14,18,31kullanılır. Özellikle, tümörlerin farklı türleri hayatta kalma ve çoğalma için ayırt edici genler ve yollar ifade çünkü bir tümör daha karmaşıktır. Bu nedenle, bu protokol farklı koşullar altında farklı tümör tiplerini ayıran genleri toplayabilir. Spesifik gen ekspresyonunun mekanizmasını anlayarak kanserlere karşı etkili stratejiler bulma potansiyeli vardır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Hücre kültürü ve tümörlü küre oluşumu

  1. Kültür HT29 hücreleri 10 cm çanak Dulbecco modifiye kartal orta içeren (DMEM) ile 10% fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin-streptomisin antibiyotik (P / S).
  2. Hücreleri 37 °C'de % 5 CO2 ve %95 nem oranıyla aseptik koşullarda %80 biraraya gelene kadar büyütün.
  3. 37 °C'de 5 dakika boyunca %0,25 tripsin ile 1 mL'lik HT29 hücrelerini tripsini nötralize etmek ve dolayısıyla %10 FBS ve %1 P/S ile 2 mL DMEM ekleyerek tripsini nötralize edin.
  4. Hemositometre kullanarak HT29 hücrelerini say.
  5. %1 P/S ile 2 mL serumsuz DMEM içeren ve %0,2 B27 ile desteklenen düşük bağlı 6 kuyu plakasına 2.000 hücre/kuyu ekleyin, Epidermal büyüme faktörünün 20 ng/mL'si (EGF), fibroblast büyüme faktörünün 20 ng/mL'si (bFGF), 20 ng/mL hepatosit büyüme faktörü (HGF) ve 20 ng/mL ininterlökin 6 (IL6).
  6. Hücreleri 37 °C'de %5 CO2 ve %95 nem ile aseptik koşullarda büyütün.
  7. Tümör küreleri en az 7 gün çapı >100 μm ölçene kadar her 2 günde bir 0,5 mL kanser kök hücre lisi ekleyin.
  8. Dijital hücre görüntüleme sistemi ile ters bir mikroskop kullanarak tümörküre çapını gözlemleyin ve ölçün.
  9. Tümör küreleri >100 μm çapa ulaştığında, 37 °C'de 5 dk için %0.25 tripsin ile tümör kürelerini deneyin ve büyüme ortamının hacmini 2 katlayarak tripsini nötralize edin. Hemositometre kullanarak hücreleri say.
  10. 10 dakika için 1.200 rpm santrifüj ve supernatant kaldırın.
  11. 5 x 104 hücreleri 2 μL anti-LGR5-PE ve 2 μL anti-CD133-PE 100 μL dmem ayrı ayrı 30 dakika oda sıcaklığında, 200 rpm sallayarak.
    NOT: CD133 ht29 hücrelerinde yüksek ifade edilen genel bir kanser kök hücre biyomarker.
  12. 900 μL PBS ekleyin ve akış sitometrisini kullanarak LGR5 ve CD133 ifadesini analiz edin. FL2-H kanalında floresan değişimi gen ekspresyonunu gösterir.

2. RNA yalıtımı

NOT: Üreticinin talimatları doğrultusunda RNA yalıtımı için hızlı bir sütuniçeren ticari bir kit (Bkz. Malzeme Tablosu)kullanın.

  1. Hasat edilen hücrelere (2 x 105 hücre) 50 μL PBS ekleyin ve pipetleme ile yeniden askıya alın.
  2. 2 μL beta-mercaptoetanol (β-ME) içeren 200 μL likte tampon ekleyin. Girdap hızlı ve 5 dakika bekletin.
  3. Çözeltiyi 10 dk için 16.000 x g'da santrifüj edin.
  4. 1 dk için 14.000 x g santrifüj ile çözücü kaldırmak için ekli sütun kullanın.
  5. 1 dk boyunca 14.000 x g'de santrifüj ile rna olmayanları tamamen temizlemek için 1 ve 2'yi yıkama solüsyonu kullanarak yıkayın.
  6. Santrifüj tekrar 14.000 x g için 2 dakika artık etanol kaldırmak için.
  7. 50 μL distile su ekleyin, 14.000 x g'de 1 dk santrifüj alın ve çözeltiyi toplayın.
  8. RNA konsantrasyonunu OD260 kullanarak spektrofotometre ile ölçün.
    RNA konsantrasyonu (μg/mL) = (OD260) x (40 μg RNA/mL) ve OD260/OD280 > 2. RNA örneklerinde RNA bütünlük numarası (RIN) > 7 olmalıdır.

3. RNAseq profilleme ve biyoinformatik analizi

NOT: HT29 türetilmiş tümörkürelerdeki diferansiyel genleri ebeveyn HT29 hücrelerine göre araştırmak için rnaseq analizi ticari olarak (Bkz. Malzeme Tablosu)yapıldı.

  1. Kütüphane inşaatı, kütüphane kalite kontrolü ve DNA dizilemesi gibi RNAseq adımları için ticari hizmetler kullanın.
  2. Veri raporu, okuma sayıları, log2 kat değişikliği ve p değeri gibi önemli bilgiler içermelidir. Diferansiyel genleri aşağıdaki parametrelere göre seçin: HT29 tümörküre grubunda okuma sayıları >100 ile 1 log2 kat değişim, HT29 ebeveyn grubunda okuma sayısı >100 ile genler >100 ile genler değişim. Bu durumda, p değeri < 0.05 kabul edilebilir kabul edildi ve veriler kullanıldı (Tablo 1).
    NOT: Burada, belirli bir genin incelenmesine devam etmek ve ekspresyonunu doğrulamak için eşik olarak bir gen sayısı >100 kullanılmıştır.
  3. Bir ısı haritası göstermek ve aşırı ifade edilmiş genleri tanımlamak için istatistiksel analiz yazılımını kullanın (bkz.
  4. X ile Volkan Arsa çizmek için R yazılımı kullanın: log2 kat değiştirmek; y: -log10 (p değeri) diferansiyel genleri göstermek için.
    1. R kitaplığını yükleme
      install.packages(library(calibrate))
    2. Aşağıdaki programile RStudio'daki verileri okuyun:
      res <-read.csv("/Kullanıcılar/xxx.csv", başlık=T)
      kafa(res)
      ile(res, plot(log2FoldChange, -log10(pvalue), pch=19, main="HT29CSC vs HT29", xlim=c(-6,6), col="#C0C0C0"))
      ile (subset(res, pvalue<.05 & log2FoldChange>1), points(log2FoldChange, -log10(pvalue), pch=19, col="red"))
      ile (subset(res, pvalue<.05 & log2FoldChange<(-1)), points(log2FoldChange, -log10(pvalue), pch=19, col="mavi"))
      ile (subset(res, pvalue>.05), points(log2FoldChange, -log10(pvalue), pch=19, col="#444444"))
      abline(h=1.3, lty=2)
      abline(v=1, lty=2)
      abline(v=(-1), lty=2)
    3. Volkan Arsa elde etmek için çalıştırmak yürütmek.

4. Sürücü gen seçimi

  1. NetworkAnalyst'de Tek gen Girişi'ni seçin.
  2. Seçilen aşırı ifade edilen genleri Tablo 1'den organizma ve Kimlik tipi Resmi Gen Sembolüolarak belirtilen "insan" ile kopyalayıp yapıştırın.
    NOT: Alternatif olarak, kopyalama kullanabilirsiniz ve yapıştırın ensembl Gen Kimliği'ni kullanın.
  3. Verileri Yükle'ye tıklayarak ekleyin ve genetik ÜFE'yi takiben protein-protein etkileşimi (ÜFE) kullanarak analiz edin.
  4. Dize etkileşimom veritabanını 900'lük bir güven puanı kesintisi ile kullanarak tohum genlerinin yüklenen genleri çapraz bağlattığını gösterin. Daha bireysel genlerle ilişki kuranan tohum genleri, HT29 kaynaklı tümör kürelerinin oluşumunu sürdürmede rol oynayan sürücü genleri olarak seçilmiştir.
    NOT: Kullanım için üç etkileşimli veri kümesi vardır: IMEx, STRING ve Rolland. STRING daha yüksek güven deneysel kanıt içerir. Yüklenen gen numaralarının daha düşük olmasıyla, IMEx etkileşimağlarındaki sürücü genlerini tahmin etmek ve almak için seçilebilir.
  5. Haritalama genel bakışta Devam et'i seçin.
  6. Arka Planda Beyaz'ı ve Düzen tonundaki Atlası Zor'u seçin.
  7. Regülasyon gen grubunu analiz etmek için PANTHER BP'yi seçin.
    NOT: Bu çalışmada HT29 türetilmiş tümörkürelerde Anti-apoptozdan HSPA5 sorumlu olduğunu göstermektedir(Şekil 3A). Belirli fonksiyonel alanı daraltmak için, KEGG, GO veya PANTHER sınıflandırması alternatif olarak belirli sürücü genlerini seçmek için kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Kanser kök hücrelerinde mekanizmayı araştırmak için modeli oluşturmak için, kolorektal HT29 hücreleri B27, EGF, bFGF, HGF ve IL6 içeren düşük ekli plaka içinde kanser kök benzeri tümörküreler in vitro kültür için kullanılmıştır. Tümör küreleri >100 μm çapında 7 gün içinde oluşmuştur (Şekil 1A). Tümör küreler tek hücrelere triptik edilmiştir ve LGR5 ve CD133 ekspresyonu saptanması için akış sitometrisi kullanılarak analiz edilmiştir. HT29 güdülü tümörkürelerde LGR5 %1.1'den %11.4'e yükselmiştir ve hücreler akış sitometrisi kullanılarak saptanmıştır(Şekil 1B). Bir diğer köklük belirteci CD133 de kültürlü HT29 türetilmiş tümörkürelerde ebeveyn HT29 hücrelerine göre %61,8'den %81,1'e yükselmiştir(Şekil 1C). Sonra, tümör küreler RNAseq soruşturması için hazırdı.

RNAseq, ht29 türetilmiş tümörkürelerde ebeveyn HT29 hücrelerine göre gen ekspresyonu profilini araştırmak için kullanıldı. Nükleotid okumada hata oranı her iki örnek için %0.03 idi. Toplam gen haritalama oranı HT29 için %87.87, HT29 türetilmiş tümörküreler için %87.25 idi. Milyonda transkriptin kilobaz (FPKM) başına düşen parçaları, transkript (mRNA) ifadesini, 0 ile 1 arasındaki aralığıht29 hücreleri için %75,87, HT29 türetilmiş tümör küreler için %77,16 olarak belirlendi. Sonuçlar sonuç sıralaması için uygundu. Sıralama okumalardan sonra log2 kat değişimi >1 upregülasyonve <-1'de p değeri < 0.05 ısı haritası ile gösterilen genler seçilmiştir (Şekil 2A,Tablo 1,Tablo 2) . 79 düzensiz gen ve 33 indirgenmiş gen seçilmişti. Buna ek olarak, log2 kat değişimi ve p değeri (-log10 p değeri) kullanarak Volkan çizimi HT29 kaynaklı tümör küreler ve ebeveyn HT29 hücreleri arasındaki önemli genleri ayırt etmek için kullanılmıştır(Şekil 2B). Ön seçime dayanarak HT29 türetilmiş tümörkürelerde ACSS2, HMGCS1ve PCSK9dahil olmak üzere üç adet potansiyel olarak güncellenemeyen gen tespit edilmiştir(Şekil 2A). Ayrıca, sürücü genlerini sadece log2 kat değişimine göre tanımlamak için NetworkAnalyst kullanılmıştır. Log2 kat değişimi >1 p değeri >0.05 ile güncellenmiş genler analiz edildi ve HSPA5, HSP90AA1, BRCA1, SFN, E2F1, CYCS, CDC6, ALYREF, SQSTM1, ve TOMM40 (Şekil 3A) dahil olmak üzere gen ağları çapraz bağlantı 10 tohum genleri sonuçlandı. Tohum genlerinin işlevini ve önemini belirlemek için, sınıflandırma arayüzü HT29 türetilmiş tümörkürelerde anti-apoptosis dahil genleri belirlemek için PANTHER BP gerçekleştirmek için kullanılabilir. Sonuçlar HSPA5 ve SQSTM1'in apoptozun negatif regülasyonu ile ilişkili olduğunu göstermiştir(Şekil 3A). Ayrıca, seçilen 10 gen sonuç olarak doğrulandı; ht29 türetilmiş tümörkürelerde ifade artmış qPCR kullanılarak doğrulanmış olarak (Şekil 3B).

Figure 1
Şekil 1: Kanser sapı benzeri tümörsferin in vitro olarak kurulması. (A) HT29 tümör küreleri oluşturmak için kullanıldı veHT29türetilmiş tümörkürelerde (Ölçek çubuğu = 100 μm) LGR5 saptandı. (C) CD133 kurulan tümörferferlerde kök karakterlerini tanımlamak için başka bir belirteç olarak kullanılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: HT29 türetilmiş tümör kürelerinde diferansiyel genleri seçmek için ısı haritası ve Volkan çizimi kullanılmıştır. Log2 kat değişimi >1 ve <-1 okuma sayısı >100, p değeri < 0.05 önemsiz genleri dışlamak ve verilerin doğru olduğundan emin olmak için kullanıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: NetworkAnalyst HT29 türetilmiş tümörkürelerde sürücü genlerini tanımlamak için kullanılmıştır. (A) Upregulated genler seçilmiş ve sonuç olarak analiz edildi ve bir sınıflandırma arayüzü, PANTHER BP, diferansiyel sürücü genleri için potansiyel işlevleri sağladı. (B) Daha sonra, ht29 türetilmiş tümörkürelerde ebeveyn HT29 hücrelerine göre güncellenen 10 geni doğrulamak için qPCR kullanıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: HT29 serived tümörkürelerinde, RNAseq tarafından analiz edilen ebeveyn HT29 hücrelerine göre düzensiz genler. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tablo 2: HT29 serived tümörkürelerinde, RNAseq tarafından analiz edilen ebeveyn HT29 hücrelerine göre küçültülen genler. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu çalışmada, mevcut biyoinformatik ile RNAseq verilerinin analizinde kültürkanser sapbenzeri tümörküreler model olarak kullanılmıştır. Bir hastalık modeli için HT29 türetilmiş tümör küreler kullanıldı. Tümör küreleri tümör tedavilerine karşı ilaç direncine sahip olduğundan, gen ekspresyonundaki farklılıkları araştırarak direnç lerinin ayrıntılı mekanizmalarını araştırmak için kurulan model kullanılabilir. Ayrıca, mevcut biyoinformatik ile RNAseq kullanarak genomik teknoloji potansiyel olarak ilgili genler daha yüksek güven ile doğrulanabilir böylece çalışma modelinin hızlı bir anlayış sağlar. Ayrıca, tümör kürelerinin oluşumunda rol oynayan genlerin türü tespit edilebilir.

RNA kalitesi RNAseq analizi için çok önemlidir32. Numunenin RIN >7 olduğundan emin olun, çünkü okumaların haritalaması, genlerin haritalaması ve FPKM arasındaki kesinliği artırır. RNAseq verileri analiz edilirken, IPA29 ve NetworkAnalyst30 potansiyel genleri ve sinyal yollarını belirlemek için mevcutdu. Ancak, aşağıdaki parametrelere göre gereksiz genlerin ekarte etmek esastır: deney grubunda okuma sayıları >100 ile >1 log2 kat değişim gösteren genler ve kontrol grubunda okuma sayısı > 100 ile genler >-1 log2 kat değişimi. Daha yüksek okuma sayıları qPCR veya Western lekeleri kullanarak bunun sonucuna göre doğrulama için daha kolaydır.

Biyolojik fonksiyonlar ve süreçler anlayışına dayanarak, ilgi hastalıklarının potansiyel mekanizmalarının hızlı bir şekilde araştırılmasını sağlayan birçok biyoinformatik aracı vardır. RNAseq gibi gen ekspresyonunu taramak için yüksek iş letim atası ile birlikte, incelenen hastalıkların gelişimini düzenleyen potansiyel mekanizmalar önerilebilir ve araştırılabilir. Burada HT29'dan elde edilen CrC kök benzeri tümör kürelerinin oluşumunu araştırma yöntemi, SQSTM1 ve HSPA5'in hedef genler olduğunu ve tümör kürelerinde anti-apopozda yer aldığını ortaya koymuştur. Bu nedenle, daha fazla deney bu genlerin ayrıntılı mekanizmasını araştırmak için tasarlanabilir, bu da araştırma çalışmaları yaparken daha fazla güven ve etkinlikle sonuçlanır.

Burada sadece tümör kürelerdeki düzensiz genler analiz edildi çünkü büyüme faktörlerinin eklenmesiyle upregülasyonun indüklediği düşünüldü. Aksi takdirde, deney tümör hücrelerinde gen nakavt kullanılırsa, indirgenmiş genler biyoinformatik kullanılarak araştırma için seçilebilir hedef olarak kabul edilecektir. Metodoloji hızlı ve güvenilir olmasına rağmen, qPCR ve Western lekeleri ile sonraki doğrulamaya ihtiyaç vardır. Ayrıca gen ekspresyonu doğrulaması için, özellikle klinik örnekler için daha fazla hücre hattı kullanılması önerilmektedir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların konuyla ilgili herhangi bir mali açıklamaları yoktur.

Acknowledgments

Yazarlar Radyasyon Biyoloji çekirdek laboratuvarı Radyolojik Araştırma Enstitüsü, Chang Gung Memorial Hastanesi, teknik destek için teşekkür ederiz. Bu çalışma Chang Gung Memorial Hastanesi (CMRPD1J0321), Cheng Hsin General Hospital (CHGH 106-06) ve Mackay Memorial Hastanesi (MMH-CT-10605 ve MMH-106-61) tarafından desteklenmiştir. Finansman kuruluşlarının çalışmanın ve verilerin toplanması, analiz ve yorumlanmasında veya makalenin yazımında herhangi bir etkisi yoktu.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
iRiS Digital Cell Imaging System Logos Biosystems, Inc I10999 for observing the formation of tumorspheres
Flow cytometry BD biosciences FACSCalibur for detecting the LGR5 and CD133 in the tumorspheres
anti-LGR5-PE Biolegend 373803 LGR5 detection reagent
anti-CD133-PE Biolegend 372803 CD133 detection reagent
EGF GenScript Z00333 for culture of tumorspheres
bFGF GenScript Z03116 for culture of tumorspheres
HGF GenScript Z03229 for culture of tumorspheres
IL6 GenScript Z03034 for culture of tumorspheres
PureLink RNA extraction kit Invitrogen 12183025 isolate total RNA for RNAseq analysis
RNAseq performance Biotools, Taiwan RNAseq analysis is done commerially by Biotools, Ttaiwan
NetworkAnalyst Institute of Parasitology, McGill University, Montreal, Quebec, Canada http://www.networkanalyst.ca/
Prism GraphPad Software a statistical analysis software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rawla, P., Sunkara, T., Barsouk, A. Epidemiology of colorectal cancer: incidence, mortality, survival, and risk factors. Przegląd Gastroenterologiczny. 14 (2), 89-103 (2019).
  2. Wong, M. C., Ding, H., Wang, J., Chan, P. S., Huang, J. Prevalence and risk factors of colorectal cancer in Asia. Intestinal Research. 17 (3), 317-329 (2019).
  3. Liu, Q., et al. Positive expression of basic transcription factor 3 predicts poor survival of colorectal cancer patients: possible mechanisms involved. Cell Death & Disease. 10 (7), 509 (2019).
  4. Slattery, M. L., et al. Dysregulated genes and miRNAs in the apoptosis pathway in colorectal cancer patients. Apoptosis. 23 (3-4), 237-250 (2018).
  5. Arteaga, C. L., Engelman, J. A. ERBB receptors: from oncogene discovery to basic science to mechanism-based cancer therapeutics. Cancer Cell. 25 (3), 282-303 (2014).
  6. Yarden, Y., Pines, G. The ERBB network: at last, cancer therapy meets systems biology. Nature Reviews Cancer. 12 (8), 553-563 (2012).
  7. Cheng, C. C., et al. YM155 as an inhibitor of cancer stemness simultaneously inhibits autophosphorylation of epidermal growth factor receptor and G9a-mediated stemness in lung cancer cells. PLoS One. 12 (8), 0182149 (2017).
  8. Prasetyanti, P. R., Medema, J. P. Intra-tumor heterogeneity from a cancer stem cell perspective. Molecular Cancer. 16 (1), 41 (2017).
  9. Zhao, Y., et al. CD133 expression may be useful as a prognostic indicator in colorectal cancer, a tool for optimizing therapy and supportive evidence for the cancer stem cell hypothesis: a meta-analysis. Oncotarget. 7 (9), 10023-10036 (2016).
  10. Choi, J. E., et al. Expression of epithelial-mesenchymal transition and cancer stem cell markers in colorectal adenocarcinoma: Clinicopathological significance. Oncology Reports. 38 (3), 1695-1705 (2017).
  11. Massard, C., Deutsch, E., Soria, J. C. Tumour stem cell-targeted treatment: elimination or differentiation. Annals of Oncology. 17 (11), 1620-1624 (2006).
  12. Grillet, F., et al. Circulating tumour cells from patients with colorectal cancer have cancer stem cell hallmarks in ex vivo culture. Gut. 66 (10), 1802-1810 (2017).
  13. Dallas, N. A., et al. Chemoresistant colorectal cancer cells, the cancer stem cell phenotype, and increased sensitivity to insulin-like growth factor-I receptor inhibition. Cancer Research. 69 (5), 1951-1957 (2009).
  14. Chang, Y. F., et al. STAT3 induces G9a to exacerbate HER3 expression for the survival of epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitors in lung cancers. BMC Cancer. 19 (1), 959 (2019).
  15. Catalano, V., et al. Colorectal cancer stem cells and cell death. Cancers (Basel). 3 (2), 1929-1946 (2011).
  16. Piggott, L., et al. Suppression of apoptosis inhibitor c-FLIP selectively eliminates breast cancer stem cell activity in response to the anti-cancer agent, TRAIL. Breast Cancer Research. 13 (5), 88 (2011).
  17. Chung, S. Y., et al. Two novel SHP-1 agonists, SC-43 and SC-78, are more potent than regorafenib in suppressing the in vitro stemness of human colorectal cancer cells. Cell Death Discovery. 4, 25 (2018).
  18. Cheng, C. C., et al. STAT3 exacerbates survival of cancer stem-like tumorspheres in EGFR-positive colorectal cancers: RNAseq analysis and therapeutic screening. Journal of Biomedical Science. 25 (1), 60 (2018).
  19. Kleist, B., Xu, L., Li, G., Kersten, C. Expression of the adult intestinal stem cell marker Lgr5 in the metastatic cascade of colorectal cancer. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 4 (4), 327-335 (2011).
  20. Medema, J. P. Targeting the Colorectal Cancer Stem Cell. New England Journal of Medicine. 377 (9), 888-890 (2017).
  21. Sahlberg, S. H., Spiegelberg, D., Glimelius, B., Stenerlow, B., Nestor, M. Evaluation of cancer stem cell markers CD133, CD44, CD24: association with AKT isoforms and radiation resistance in colon cancer cells. PLoS One. 9 (4), 94621 (2014).
  22. Xia, J., Gill, E. E., Hancock, R. E. NetworkAnalyst for statistical, visual and network-based meta-analysis of gene expression data. Nature Protocols. 10 (6), 823-844 (2015).
  23. Gagan, J., Van Allen, E. M. Next-generation sequencing to guide cancer therapy. Genome Medicine. 7 (1), 80 (2015).
  24. Panichnantakul, P., Bourgey, M., Montpetit, A., Bourque, G., Riazalhosseini, Y. RNA-Seq as a Tool to Study the Tumor Microenvironment. Methods in Molecular Biology. 1458, 311-337 (2016).
  25. Kanehisa, M., Sato, Y. KEGG Mapper for inferring cellular functions from protein sequences. Protein Science. 29 (1), 28-35 (2020).
  26. Ashburner, M., et al. Gene ontology: tool for the unification of biology. The Gene Ontology Consortium. Nature Genetics. 25 (1), (2000).
  27. The Gene Ontology Collective. The Gene Ontology Resource: 20 years and still GOing strong. Nucleic Acids Research. 47, 330-338 (2019).
  28. Mi, H., Muruganujan, A., Thomas, P. D. PANTHER in 2013: modeling the evolution of gene function, and other gene attributes, in the context of phylogenetic trees. Nucleic Acids Research. 41, Database issue 377-386 (2013).
  29. Yu, F., Shen, X. Y., Fan, L., Yu, Z. C. Genome-wide analysis of genetic variations assisted by Ingenuity Pathway Analysis to comprehensively investigate potential genetic targets associated with the progression of hepatocellular carcinoma. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 18 (15), 2102-2108 (2014).
  30. Zhou, G., et al. NetworkAnalyst 3.0: a visual analytics platform for comprehensive gene expression profiling and meta-analysis. Nucleic Acids Research. 47 (1), 234-241 (2019).
  31. Cheng, C. C., et al. Epidermal growth factor induces STAT1 expression to exacerbate the IFNr-mediated PD-L1 axis in epidermal growth factor receptor-positive cancers. Molecular Carcinogenesis. 57 (11), 1588-1598 (2018).
  32. Gallego Romero, I., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification. BMC Biology. 12, 42 (2014).

Tags

Retraksiyon Sayı 161 kolorektal kanser kanser kök hücre CD133 HT29 LGR5 RNAseq NetworkAnalyst
Kolorektal HT29 türetilmiş Kanser Kök Benzeri Tümörkürelerde Sürücü Genlerinin Keşfi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cheng, C. C., Hsu, P. J., Sie, Z.… More

Cheng, C. C., Hsu, P. J., Sie, Z. L., Chen, F. H. Discovery of Driver Genes in Colorectal HT29-derived Cancer Stem-Like Tumorspheres. J. Vis. Exp. (161), e61077, doi:10.3791/61077 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter