Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Isolering av humane ventrikulære kardiomyocytter fra vibratom-cut myokardskiver

Published: May 10, 2020 doi: 10.3791/61167
Automatic Translation
1, 1,2, 1,2
1Institute of Cellular and Molecular Physiology, Friedrich-Alexander University Erlangen-Nürnberg, 2Muscle Research Center Erlangen (MURCE), Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

Summary

Presentert er en protokoll for isolering av menneskelige og animalske ventrikulære kardiomyocytter fra vibratom-cut myokardskiver. Høye utbytter av kalsiumtolerante celler (opptil 200 celler/mg) kan oppnås fra små mengder vev (<50 mg). Protokollen gjelder for myokardium utsatt for kald iskemi i opptil 36 timer.

Abstract

Isolering av ventrikulære hjerte myocytter fra dyre- og menneskehjerter er en grunnleggende metode i hjerteforskning. Dyr kardiomyocytter er ofte isolert av koronar perfusjon med fordøyelsesenzymer. Imidlertid er det utfordrende å isolere menneskelige kardiomyocytter fordi menneskelige myokardprøver vanligvis ikke tillater koronar perfusjon, og alternative isolasjonsprotokoller resulterer i dårlige utbytter av levedyktige celler. I tillegg er menneskelige myokardprøver sjeldne og bare regelmessig tilgjengelige på institusjoner med hjertekirurgi på stedet. Dette hindrer oversettelsen av funn fra dyr til menneskelige kardiomyocytter. Beskrevet her er en pålitelig protokoll som muliggjør effektiv isolering av ventrikulære myocytter fra humant og dyr myokardi. For å øke overflate-til-volum-forholdet samtidig som celleskade minimeres, genereres myokardvevsskiver 300 μm tykke fra myokardprøver med vibratom. Vevskiver fordøyes deretter med protease og kollagenase. Rotte myokardi ble brukt til å etablere protokollen og kvantifisere utbytter av levedyktige, kalsiumtolerante myocytter ved strømningscytokometrisk celletelling. Sammenligning med den brukte vev-chunk metoden viste betydelig høyere utbytter av stangformede kardiomyocytter (41,5 ± 11,9 vs. 7,89 ± 3,6%, p < 0,05). Protokollen ble oversatt til sviktende og ikke-sviktende humant myokardi, hvor utbyttene var like som i rotte myokardi og igjen markert høyere enn med vev-chunk-metoden (45,0 ± 15,0 vs. 6,87 ± 5,23 celler / mg, p < 0,05). Spesielt, med protokollen presentert er det mulig å isolere rimelige antall levedyktige menneskelige kardiomyocytter (9-200 celler / mg) fra minimale mengder vev (<50 mg). Dermed er metoden gjelder for sunn og sviktende myokardi fra både menneskelige og dyrehjerter. Videre er det mulig å isolere spennende og kontraktile myocytter fra menneskelige vevsprøver lagret i opptil 36 timer i kald kardioplegisk løsning, noe som gjør metoden spesielt nyttig for laboratorier ved institusjoner uten hjertekirurgi på stedet.

Introduction

En banebrytende teknikk som har banet vei til viktig innsikt i kardiomyocyte fysiologi er isolering av levende ventrikulære kardiomyocytter fra intaktehjerter 1. Isolerte kardiomyocytter kan brukes til å studere normal cellulær struktur og funksjon, eller konsekvensene av in vivo eksperimenter; for eksempel, for å vurdere endringer i cellulær elektrofysiologi eller eksitasjon-sammentrekning kobling i dyremodeller av hjertesykdom. I tillegg kan isolerte kardiomyocytter brukes til cellekultur, farmakologiske inngrep, genoverføring, vevsteknikk og mange andre applikasjoner. Derfor er effektive metoder for kardiomyocyte isolasjon av grunnleggende verdi til grunnleggende og translasjonell hjerteforskning.

Kardiomyocytter fra små pattedyr, som gnagere, og fra større pattedyr, som griser eller hunder, er vanligvis isolert av koronar perfusjon av hjertet med løsninger som inneholder rå kollagenaser og / eller proteaser. Dette har blitt beskrevet som "gullstandard" -metoden for kardiomyocyteisolasjon, noe som resulterer i utbytter på opptil 70% av levedyktige celler2. Tilnærmingen har også blitt brukt med menneskelige hjerter, noe som resulterer i akseptable kardiomyocyttergir 3,4,5. Men fordi koronar perfusjon bare er mulig hvis det intakte hjertet eller en stor myokardkile som inneholder en koronargren er tilgjengelig, er de fleste menneskelige hjerteprøver ikke egnet for denne tilnærmingen på grunn av deres lille størrelse og mangel på passende vaskulatur. Derfor er isolering av menneskelige kardiomyocytter utfordrende.

Humane myokardprøver består for det meste av vevsbiter av variabel størrelse (ca. 0,5 x 0,5 x 0,5 cm til 2 x 2 x 2 cm), oppnådd gjennom endomyocardialbiopsier 6, septal myectomies7,VAD implantasjoner8, eller fra utvåte hjerter9. De vanligste prosedyrene for kardiomyocyte isolasjon starter med å hakke vevet ved hjelp av saks eller en skalpell. Celle-til-celle-kontakter blir deretter forstyrret av nedsenking i kalsiumfrie eller lavkalsiumbuffere. Dette etterfølges av flere fordøyelsestrinn med rå enzymekstrakter eller rensede enzymer som proteaser (f.eks. trypsin), kollagnase, hyaluronidase eller elaastase, noe som resulterer i en oppløsning av den ekstracellulære matrisen og frigjøringen av kardiomyocytter. I et siste, kritisk trinn må en fysiologisk kalsiumkonsentrasjon gjenopprettes nøye, eller cellulær skade kan oppstå på grunn av kalsiumparadokset10,11,12. Denne isolasjontilnærmingen er praktisk, men vanligvis ineffektiv. For eksempel fant en studie at nesten 1 g myokardvev var nødvendig for å oppnå et tilstrekkelig antall kardiomyocytter egnet for påfølgende eksperimenter13. En mulig årsak til lave utbytter er den relativt harde metoden for å hakke vevet. Dette kan spesielt skade kardiomyocytter som ligger på chunk kantene selv om disse myocytter er mest sannsynlig å bli utgitt av enzymatisk fordøyelse.

Et annet aspekt som kan påvirke isolasjonseffektivitet og kvalitet på celler hentet fra menneskelige prøver er varigheten av vevsiskemi. De fleste protokoller nevner korte transporttider til laboratoriet som en forutsetning for gode resultater. Dette begrenser studiet av menneskelige ventrikulære kardiomyocytter til laboratorier med nærliggende hjertekirurgi fasiliteter. Sammen hindrer disse restriksjonene verifiseringen av viktige funn fra dyremodeller i menneskelige kardiomyocytter. Forbedrede isolasjonsprotokoller som tillater høye kardiomyocytteravlinger fra små mengder vev, helst uten alvorlig skade etter lengre transporttider, er derfor ønskelig.

Beskrevet her er en isolasjonsprotokoll basert på enzymatisk fordøyelse av tynne myokardvevskiver generert med en vibratom14,15. Vi viser at isolasjon fra vevskiver er mye mer effektiv enn det fra vevsbiter hakket med saks. Den beskrevne metoden gir ikke bare mulighet for høye utbytter av levedyktige menneskelige kardiomyocytter fra små mengder myokardvev, men gjelder også for prøver lagret eller transportert i kald kardioplegisk løsning i opptil 36 timer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle eksperimenter med rotter ble godkjent av Dyreomsorgs- og brukskomiteen Mittelfranken, Bayern, Tyskland. Innsamling og bruk av menneskelige hjertevevsprøver ble godkjent av institusjonelle gjennomgangsråd ved Universitetet i Erlangen-Nürnberg og Ruhr-Universitetet Bochum. Studier ble utført i henhold til Helsinkis retningslinjer. Pasientene ga sitt skriftlige informerte samtykke før vevsinnsamling.

Hunnrotter (150–200 g) ble kommersielt oppnådd, bedøvet ved å injisere 100 mg/kg tiopentalnatrium intraperitonalt, og eutanisert ved cervikal forvridning etterfulgt av thoracotomi og utskjæring av hjertet. Humane hjertevevsprøver ble samlet inn fra venstre-ventrikulær apical kjerne under implantasjon av mekaniske hjelpeenheter, fra septal myectomy, fra tetralogi av Fallot korrigerende kirurgi, eller fra den frie venstre-ventrikulær vegg av utflatede hjerter. Følgende protokoll beskriver isolasjonen fra humant ventrikulært vev. Isolering av rottekardiomyocytter ble utført tilsvarende, men med forskjellige enzymer (se Materialtabell). En skjematisk arbeidsflyt for protokollen er illustrert i figur 1.

1. Tilberedning av buffere, løsninger og enzymer

  1. Klargjør buffere og løsninger som er oppført i tabell 1.
  2. Varm opp oppløsninger 1, 2, 3 og den modifiserte Tyrodes oppløsning til 37 °C. Oppbevar skjæreoppløsningen ved 4 °C til den er i bruk.
    MERK: For 1–2 myokardskiver kreves det totalt ca. 15 ml, 8 ml og 5 ml oppløsninger 1, 2 og 3 for isolasjonen i en 35 mm vevskulturrett. Skaler opp tilsvarende for samtidige myocyte isolasjoner i flere retter. Skjæreoppløsningen kan fryses og oppbevares ved -20 °C i flere måneder.
  3. Vei 1 mg proteinase XXIV (se Materialsepp) inn i et prechilled 15 ml sentrifugerør og oppbevares på is til bruk. Dette er for behandling av ett utvalg. Skaler opp beløpet tilsvarende. Ikke bland proteinase og kollagen.
  4. Vei 8 mg kollagnase CLSI (se Materialsepp) inn i et prechilled 15 ml sentrifugerør og oppbevares på is til bruk. Dette er for behandling av ett utvalg. Skaler opp beløpet tilsvarende. Ikke bland proteinase og kollagen.
    FORSIKTIG: Bruk en ansiktsmaske eller arbeid under en røykhette for å unngå innånding av enzympulver.
    MERK: Enzymaktiviteten kan variere på forskjellige partier. Derfor kan den optimale konsentrasjonen variere og bør bestemmes med hvert nyinnkjøpte enzym16.

2. Lagring og transport av myokardvev

  1. Oppbevar og transport av humane hjerteprøver i avkjølt, 4 °C skjæreoppløsning (tabell 1).
  2. Bruk samme løsning for videre vevsbehandling og vibratomslicing.
    MERK: Biopsier og kirurgiske hjerteprøver skal overføres umiddelbart til skjæreløsningen ved 4 °C og kan deretter oppbevares eller transporteres ved 4 °C i maksimalt 36 timer før denne protokollen påføring.

3. Behandling og kutting av vevet

MERK: Protokollen for vevsslicing følger Fischer et al.15.

  1. Trimming av vevsblokken
    FORSIKTIG: Humant hjertevev er potensielt smittsomt. Bruk alltid verneklær og følg sikkerhetsforskriftene til institusjonen din. Håndter brukte blader forsiktig og kast i sikkerhetsbeholdere.
    1. Plasser prøven i en 100 mm vevskulturrett fylt med 20 ml kald skjæreløsning og hold deg på en avkjølt, 4 °C plate.
    2. Fjern overflødig fibrotisk vev og epiardialt fett med en skalpell. Ved transmuralprøve, fjern trabeculae og vevslag i nærheten av endokardiet.
      MERK: Fibrotisk vev er stivt og ser hvitt ut. Fett er vanligvis mykt og ser hvitt til gult. Trabeculae og endokardvevslag kan identifiseres fra deres løse vevssammensetning og en ikke-justert fiberorientering sammenlignet med myokardiet til de episke lagene
    3. For optimal vibratombehandling, kutt rektangulære vevsblokker på ca. 8 mm x 8 mm x 8 mm med en skalpell fra en større vevsprøve. For mindre biopsier hoppe dette trinnet og flytte til agarose innebygging.
  2. Innebygging av hjertevev i lavt smeltepunkt agarose
    1. Kok 400 mg lavt smeltepunkt oppsto i 10 ml skjæreoppløsning i et glassbeger.
      FORSIKTIG: Bruk hansker og vernebriller for å unngå brannskader. Håndter kun varmt glass med varmebeskyttelsesslitasje.
    2. Fyll en 10 ml sprøyte med den varme, oppløste agarosegelen. Forsegle sprøyten og la agarose å likevekt i et 37 °C vannbad i minst 15 min.
    3. Bruk tang til å plassere den trimmede hjerteprøven eller biopsien i en ren 35 mm vevskulturrett med epikondardiumet vendt ned og fjern overflødig væske med en steril vattpinne.
    4. Hell den likevektede agarose (trinn 3.2.2) over vevet ved å tømme sprøyten. Fest vevet mot bevegelse med tang mens du heller agarose. Pass på at vevet er helt nedsenket i agarose.
    5. Legg straks parabolen på isen og la agarosestørkning i 10 min.
  3. Kutte myokardiet
    1. Monter et nytt barberblad til bladholderen på vibratomen og kalibrer vibratomen ved å justere z-avbøyningen av bladet hvis mulig.
      MERK: Denne protokollen bruker en vibratom med en infrarød-assistert kalibreringsenhet for å justere bladet i horisontal stilling med minimal z-nedbøyning (målt nedbøyning <0,1 μm).
    2. Bruk en skalpell til å avgifte en agarose-vev blokk som passer prøveholderen av vibratom. For å sikre stabilitet, sørg for at vevet fortsatt er tilstrekkelig nedsenket i agarose (agarose marginer ≥ 8 mm).
    3. Fest agaroseblokken til prøveholderen med et tynt lag cyanoacrylat lim og mildt trykk.
    4. Plasser prøveholderen med vevet i vibratombadet. Fyll badet med skjæreoppløsning og hold ved 4–6 °C gjennom hele behandlingen med knust is, fylt ut den ytre kjøletanken på vibratomen.
    5. Generer 300 μm tykke skiver med en fremadstormende hastighet på ≤0,1 mm/s, en oscillerende frekvens på 80 Hz, en lateral amplitude på 1,5 mm og en bladvinkel på 15°. Når du håndterer skivene, hold agarose i stedet for vevet selv for å unngå vevsskade. Oppbevar skivene i skjæreoppløsningen ved 4 °C i maksimalt 2 timer, om nødvendig.
      MERK: Kardiomyocytter er orientert parallelt med epiardium. Derfor er det viktig å kutte parallelt med epikondium for å unngå overdreven myocyttskade. Det anbefales å kaste de første 1-3 skiver, da bare ensartede skiver av konstant tykkelse skal brukes til isolasjon. For små vevbiopsier, men bare kast den første skiven.
    6. Kontroller kardiomyocyttjusteringen under et standard lysmikroskop med en forstørrelse på 40-100x.

4. Vev fordøyelse

  1. Plasser varmeplaten på laboratoriet shaker og varm den til 37 °C. Start lab shaker på 65 rpm.
  2. Oppløs proteinasen (tilberedt i trinn 1,3) i 2 ml oppløsning 1 (trinn 1.1 og 1.2) og inkuber ved 37 °C til bruk. Ikke bland proteinase og kollagen.
  3. Løs opp kollagenasen (klargjort i trinn 1,4) i 2 ml oppløsning 1 (trinn 1.1 og 1.2) og inkuber ved 37 °C til bruk. Ikke bland proteinase og kollagen.
    FORSIKTIG: Bruk vernebriller og hansker, fordi oppløste enzymer kan forårsake hud- og øyeskader.
  4. Tilsett kalsiumklorid (CaCl2) i kollagenaseholdig oppløsning (tilberedt i trinn 4.3) til en endelig konsentrasjon på 5 μM.
  5. Bruk tang til å overføre en vevsskive fra vibratombadet til en ren 60 mm vevskulturrett fylt med 5 ml prechilled skjæreløsning (trinn 1.1 og 1.2) og hold på is.
  6. Fjern forsiktig agarose fra myokardvevet med blad eller tang.
    MERK: Unngå overflødig spenning og skjærstress på myokardskivene, fordi de kan skade kardiomyocytene.
  7. For å utføre den første vasken, legg en ren 35 mm vevskulturskål på varmeplaten og fyll den med 2 ml forhåndsvarmt (37 °C) oppløsning 1. Overfør 1–2 myokardskiver til den tilberedte parabolen med tang. Aspirer oppløsningen med en 1 ml pipette og utfør vasketrinnene 2x for å fjerne rester av skjæreløsning.
    MERK: Ikke aspirer hjerteskivene. Løsningene og skivene skal forbli ved en konstant temperatur på 35 °C på den opphissede varmeplaten. Juster varmeplatetemperaturen om nødvendig.
  8. Fjern oppløsning 1 fra fatet og tilsett 2 ml proteinoppløsning (trinn 4.2). Inkuber i 12 min på varmeplaten ved 65 omdr./min.
  9. Vask 2x med 2 ml forvarmet oppløsning 1 (37 °C).
  10. Fjern oppløsning 1 fra fatet og tilsett 2 ml kollagenaseløsning (trinn 4.3 og 4.4). Inkuber minst 30 min på varmeplaten ved 65 omdr./min.
  11. Sjekk for gratis individuelle myocytter på 30, 35, 40 min, etc., ved å plassere parabolen under et lett mikroskop. Arbeid raskt for å unngå betydelig kjøling av løsningen.
    MERK: Den nødvendige fordøyelsestiden kan variere avhengig av vevskonstitusjonen og graden av fibrose. Så snart vevet blir synlig mykt og dissosierer lett når det trekkes forsiktig, er den optimale fordøyelsestiden nådd. Hvis nok vev er tilgjengelig, kan flere skiver fordøyes parallelt med varierende fordøyelsestider.
  12. Når vevet fordøyes og individuelle myocytter er synlige (trinn 4.11), vask 2x med 2 ml prewarmed oppløsning 2 (37 ° C) og fyll igjen med 2 ml.

5. Vevdissosiasjon

  1. Dissosier de fordøyde vevsskivene med tang ved å forsiktig trekke fibrene fra hverandre.
  2. Pipette forsiktig flere ganger med en engangs Pasteur pipette (åpningsdiameter > 2 mm).
    MERK: Bruk av tang og pipettering kan indusere mekanisk stress og forårsake kardiomyocyttskade. Det er imidlertid et avgjørende skritt for separasjon av cellene. Bruk fine tang for å minimere celleskader og forsiktig dissosiere skivene til mindre stykker.
  3. Se etter de frigjorte stangformede kardiomyocytter under det lette mikroskopet.

6. Gjeninnføring av fysiologisk kalsiumkonsentrasjon

  1. Øk kalsiumkonsentrasjonen langsomt fra 5 μM til 1,5 mM mens den uroer ved 35 °C på varmeplaten. Bruk 10 mM og 100 mM CaCl2 lagerløsninger. Anbefalte trinn: 20, 40, 80, 100, 150, 200, 400, 800, 1200, 1500 μM. La cellene tilpasse seg de økte kalsiumnivåene i 5 min inkubasjonsintervaller mellom hvert trinn.
  2. Fjern ufordøyd vev biter nøye med tang eller filtrere celle suspensjon gjennom en nylon mesh med 180 μm pore størrelse på slutten av kalsium økning.

7. Fjerning av mekanisk frakoblingsmiddel

  1. Stopp agitasjonen og fjern langsomt en tredjedel av oppløsningen (~700 μL) fra toppen med en pipette på 1000 μL. Unngå aspirasjon av kardiomyocytter.
    MERK: Hvis ufordøyd vev ble fjernet, vil kardiomyocytter akkumuleres i midten av parabolen, noe som letter aspirasjon av cellefri løsning. Hvis ikke, overfør celleløsningen til et 15 ml sentrifugerør og la cellene sedimentere i 10 min ved 35 °C, deretter aspirere 700 μL av supernatanten og kast, resuspend cellene, overfør dem tilbake til en 35 mm vevskulturrett og fortsett med trinn 7.2.
  2. Tilsett 700 μL oppløsning 3 til cellene, gjenoppta agitasjon på varmeplaten og inkuber i 10 min.
  3. Gjenta trinn 7.1 og 7.2.
  4. Overfør løsningen til et 15 ml sentrifugerør og la kardiomyocytter sediment i minst 10 min og maksimalt 30 min ved romtemperatur eller spinn ved 50 x g i 1 min. Fjern det overnaturlige helt og resuspend i modifisert Tyrodes løsning eller ønsket eksperimenteringsbuffer.
    MERK: Kardiomyocytter kan oppbevares i modifisert Tyrodes oppløsning (tabell 1) i flere timer ved 37 °C og 5 % CO2 før bruk.
  5. Kontroller cellekvaliteten med et standard lysmikroskop ved 40x og 200x forstørrelse.
    MERK: Rundt 30–50 % av kardiomyocytene skal være stangformede, glatte uten membranblødninger og vise klare kryssstrisjoner. Bare 5–10 % av de levedyktige cellene skal vise spontane sammentrekninger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For å verifisere isolasjonseffektiviteten ble protokollen brukt med rotte myokardi, og det resulterende antallet levedyktige myocytter ble sammenlignet med tallene oppnådd ved isolasjon via koronar perfusjon og ved isolasjon fra små vevsbiter (delisolasjon, Figur 2). Chunk isolasjon og isolasjon fra vevskiver ble utført fra de samme hjertene. For isolasjon via koronar perfusjon ble imidlertid hele hjertet brukt. Koronar perfusjon ga overveiende stangformede og kryss-striated kardiomyocytter. Med isolasjoner fra myokardskiver ble det observert en lavere andel av stangformede celler, men det totale antallet var fortsatt høyt. I motsetning, etter isolasjon fra vev biter, bare få stangformede celler ble gjenfunnet (Figur 2A). Flow cytometri ble brukt til å sammenligne resultatene kvantitativt. På grunn av deres relativt store størrelse og kryss-striation, cardiomyocytes vanligvis viser store verdier for både fremover og side scatter. Disse egenskapene ble brukt til å telle stangformede myocytter med en flow-cytometrisk celleanalysator, og brukte en enkel gating-ordning som diskriminerte stangformet fra hyperkontrakterte og avrundede kardiomyocytter. (Tilleggstall 1). Representative prikkplott er avbildet i Figur 2B. Statistisk analyse viste tydelig høyere tellinger i kardiomyocyteporten CM1 for isolasjon fra skiver enn fra vevsbiter (41,5 ± 11,9 vs. 7,89 ± 3,6%, henholdsvis; n = 3 isolasjoner; p < 0.05, paired two-tailed t-test). As expected from visual inspection, coronary perfusion yielded the highest counts, with 71.0 ± 9.4% (n = 3 isolations; p < 0.05, unpaired two-tailed t-test) (Figur 2C). Dermed når isolasjonen av kardiomyocytter fra vevskiver ikke utbyttet oppnådd ved koronar perfusjon, men resulterer i et betydelig større antall stangformede myocytter enn isolasjon fra vevsbiter, noe som gir nok celler til påfølgende eksperimenter. I tillegg til celletall ble strukturelle parametere for rottekardiomyocytter kvantifisert. Cellelengde, cellebredde, og sarkomerlengde var ikke forskjellig i celler isolert av perfusjon eller fra vevsskiver (lengde = 110,0 ± 5,4 μm vs. 99,4 ± 3,2 μm, p ' 0,05; bredde = 33,9 ± 1,9 μm vs. 30,6 ± 1,2 μm, p ' 0,05, for n = 19 og n = 21 celler, henholdsvis; sarcomere lengde = 1,62 ± 0,04 μm vs. 1,68 ± 0,04 μm, p = 0,28, n = henholdsvis 24 og n = 23 celler) (Tilleggstall 2A–C). Bruk av Fluo-4 lastet myocytter utsatt for elektrisk feltstimulering17 funksjonelle parametere ble også vurdert (Tilleggstall 2D–F). Gjennomsnittlig aktiveringstid (27,5 ± 1,5 vs. 23,6 ± 2,5 ms, n = 100 vs. n = 31 celler; perfusjon vs. skive, p ) 0,05) (Tilleggstall 2D) og relativ forkortelse (12,2 ± 1,1 vs. 11,3 ± 2,5 %, n = 42 vs. n= 7 celler, perfusjon vs. skive, s . 0,05) (Tilleggstall 2F) av kardiomyocytter som responderte på stimulering, var ikke signifikant forskjellig mellom de to gruppene. Kalsiumtransient amplituden (maksimal normalisert Ca2+, F/F0) (Tilleggstall 2E) ble litt forsterket i kardiomyocytter isolert fra skiver sammenlignet med kardiomyocytter isolert ved perfusjon (4,9 ± 0,2 vs. 5,7 ± 0,3, n = 104 vs. n = 25 celler, perfusjon vs. skive, p < 0.05). Although the fraction of rod-shaped cardiomyocytes responding to electrical stimulation was approximately 15% higher in preparations obtained by perfusion, the majority of cells was also excitable in preparations from tissue slices (74.3 ± 4.2% vs. 62.1 ± 2.9%, perfusion vs. slice, p < 0.05, ten fields of view, 452 vs. 276 counted cells, respectively) (Tilleggstall 2G). For å vurdere cellekvalitet etter dyrking ble prosentandelen myocytter kontrahering som svar på elektrisk feltstimulering etter 48 timer i cellekultur bestemt17. Fraksjonen av responderende celler ble redusert med omtrent halvparten i begge gruppene (41,9 ± 3,6 % vs. 31,5 ± 2,3 %, perfusjon vs. skive, p < 0.05, 10 fields of view, n = 371 vs. n = 329 counted cells, respectively) (Tilleggstall 2H).

Deretter ble protokollen brukt på humant myokardi. Antall stangformede og levedyktige isolerte humane ventrikulære kardiomyocytter hentet fra vevskiver ble sammenlignet på samme måte med antallet hentet fra vevsbiter av de samme myokardprøvene (figur 3). Vi fant at isolasjonen fra myokardskiver ga en stor andel av stangformede og bare en liten andel avrundede kardiomyocytter (figur 3A). Vi telte stangformede myocytter fra bredfeltsbilder og normaliserte antallet med vevsvåtvekten som brukes til isolasjonen. Kvantifiseringen viste at isolasjon fra myokardskiver resulterte i et slående høyere antall stangformede myocytter enn isolasjon fra vevsbiter (45,0 ± 15,0 vs. 6,87 ± 5,23 celler/ mg, n = 7 isolasjoner, p < 0,05, paret to-tailed t-test) (figur 3B). Videre ble levedyktigheten vurdert med en MTT levedyktighetsanalyse14, normalisering av den fotometriske formazanabsorpsjonen til den totale mengden protein i cellelylat. Den fotometriske kvantifiseringen bekreftet en vesentlig høyere myocytt levedyktighet etter isolasjon fra myokardskiver (4,76 ± 0,47 vs. 1,09 ± 0,18 AU, n = 3 isolasjoner, p < 0,05, paret to-tailed t-test) (Figur 3C).

Totalt ble metoden brukt på myokardprøver fra 30 menneskelige hjerter med transporttider på opptil 36 timer. Fra 23 av de 30 prøvenes levedyktige celler ble oppnådd for påfølgende eksperimenter (se også tilleggstabell 1). Et eksempel på et mislykket eksperiment (det vil vil at <100 celler per fat) vises i tilleggsfigur 3. Her tolererer de fleste celler ikke høyt ekstracellulært kalsium og hyperkontratrasert. Vi vurderte kontraktilitet i myocytter fra 14 isolasjoner, og i to tilfeller reagerte cellene ikke på elektrisk stimulering. Merk at teknikken ikke bare fungerte med store prøver hentet fra voksne hjerter, men også med små biopsier (så lite som 40 mg) fra barnets hjerter (Tilleggsfigur 4).

For å vise at menneskelige celler isolert med den beskrevne protokollen kan bli utsatt for strukturell analyse, ble de farget med alfa-actinin, EC koblingsproteiner L-type kalsiumkanal (LTCC) og ryanodinereseptor (RyR), samt cellemembranen og kjernene, i henhold til en fargingsmetode beskrevet nylig i rotte myocytter17 (Figur 4). Alfa-actinin farging avslørte en tett, vanlig z-line mønster og en gjennomsnittlig sarcomere lengde på 1,92 ± 0,06 μm i hvile kardiomyocytter (n = 4, figur 4A). LTCC og RyR viste klare klynger og var, som forventet, colocalized nær cellemembranen og t-tubuli (figur 4B).

Den potentiometriske fargestoff FluoVolt18 og kalsiumfølsom fargestoff Fluo-417 ble brukt til å vise at menneskelige kardiomyocytter isolert med den beskrevne protokollen var spennende og kunne brukes til studier på cellulær elektrofysiologi eller eksitasjon-sammentrekningkobling (figur 5). Handlingspotensial (AP) form og varighet ble analysert (figur 5A,B). Verdiene på 50% og 90% AP varighet (APD50:400,6 ± 41,1 ms, APD90:748,9 ± 56,6 ms, n = 10 celler) var i området rapportert av andre for ventrikulære kardiomyocytter fra sviktende menneskeligehjerter 4,,6,,7,,9. Kalsiumtransientene som ble registrert ved konfokal linjeskanning av Fluo4-belastede celler (figur 5C,D) viste et klart oppslag etter stimulering og et akseptabelt signal-til-støy-forhold. Kalsiumtransient amplituden (maksimal F/F0)var 2,9 ± 0,5 (n = 31 celler). Kardiomyocytt forkortelse ved sammentrekning kan sees i eksemplet fra nedbøyning av den nedre cellegrensen, som hadde et gjennomsnitt på 4,6 ± 0,8% (n = 31 celler).

Figure 1
Figur 1: Arbeidsflyten av isolasjonsprotokollen fra menneskelige hjertevevsskiver. Vevsblokker eller biopsier fra humant myokardi (øverst til venstre) er innebygd i lavtsmeltende punkt agarose og 300 μm tykke skiver genereres med det oscillerende bladet til et vibratom (øvre midten). Skivene overføres til en kulturrett og fjernes fra den omkringliggende agarose (øverst til høyre). Vevsfordøyelsen utføres ved ~ 35 ° C og 65 rpm på en oppvarmet og opphisset plate (midten, venstre) og inkluderer: (trinn 4.8) Inkubasjon i nominelt kalsiumfri løsning supplert med proteinase, (trinn 4.10) Fordøyelsen av den ekstracellulære matrisen med kollagen, (trinn 5) Dissosiasjon og frigjøring av individuelle kardiomyocytter med tang og pipettering. (trinn 6) Langsom økning av den ekstracellulære kalsiumkonsentrasjonen fra 5 μM til 1,5 mM i intervaller på 5 min. (trinn 7) Trinnvis fjerning av den mekaniske ekle 2,3-butanedione monoksime (BDM). Stangformede og kryss-striated menneskelige kardiomyocytter hentes. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Kardiomyocytter av myokardskive, perfusjon og delisolering. (A)Representative lysmikrografer av rottekardiomyocytter isolert enten via koronarperfusjon (Perfusjon), fra vibratom-cut vev (Myokardskiver), eller fra hakket vev (Vev biter). (B)Henholdsvis representative flyt cytometri prikk tomter fra kardiomyocytter isolasjoner beskrevet i A. Sidesptrøområde (SSC-arealet) og spredningsområdet forover (FSC-området) ble brukt som indikatorer på henholdsvis cellulær detaljnivå og størrelse. Gating ordningen av porten CM1 for kardiomyocytter er indikert av den svarte linjen og de respektive fraksjonene av totale teller i prosent vises. (C) Gjennomsnittlig ± standardfeil av fraksjonene av kardiomyocytter (CM1) vurdert ved flow-cytometrisk analyse som beskrevet i B fra n = 3 celleisolasjoner per gruppe. Isolasjonen fra myokardskiver og vevsbiter ble utført fra de samme hjertene (paret to-tailed t-test). Isolasjon ved perfusjon ble utført fra hele hjerter av forskjellige dyr og sammenlignet med den ubetalte to-tailed t-test. *p < 0,05, etter flere sammenligningskorrigeringer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Sammenligning av utbytte og levedyktighet av humane kardiomyocytter etter isolasjon fra myokardskiver og hakket vevbiter. (A) Representativt bilde av kalsiumtolerante humane ventrikulære kardiomyocytter etter isolasjon fra vevskiver. Rod-formet og striated cardiomyocytes er dominerende (svart pil), med bare få avrundede og hyperkontrakterte celler (hvit pil). (B)Kvantifisering av kalsiumtolerante, stangformede myocytter isolert parallelt, enten fra myokardskiver eller vevsbiter talt fra brede feltmikrografer og normalisert til den våte vekten av inngangsmaterialet (i milligram) fra n = 7 parede isolasjoner. (C) Kvantifisering av kardiomyocytt levedyktighet ved fotometrisk måling av formazan fargestoff absorbans etter MTT analyse. Absorbansen ble normalisert til den totale proteinmengden, vurdert av BCA-analyse fra n = 3 parede isolasjoner. *p < 0,05, **p < 0,01 (paret med to-tailed t-test). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Mikrostrukturell karakterisering av menneskelige kardiomyocytter etter isolasjon. (A)Representant konfokal mikroskopisk bilde etter immunstaining av alfa-actinin (grønn) og kjernefysisk flekk med 4',6-diamidin-2-fenylindol (DAPI, blå). Sarkomallengden var 1,92 ± 0,06 μm (n = 4 myocytter), bestemt ved å analysere Fourier-spekteret. (B)Representative confocal mikroskopiske bilder av en fast menneskelig ventrikulær kardiomyocytt coimmunostained for L-type kalsiumkanal (LTCC) og hjerte ryanodine reseptor (RyR). Overlegget av RyR og LTCC (overlegg) og farging av den ekstracellulære matrisen med hvetekim agglutinin (WGA, magenta) er også vist. Nuclei ble farget med DAPI (blå). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Virkningspotensial og intracellulær kalsiumtransient i humane ventrikulære myocytter. (A)Todimensjonalt konfokalbilde av et isolert humant kardiomyocytt lastet med den potentiometriske fargestoff FluoVolt (grønn, 488 nm eksitasjon bølgelengde). Den røde boksen indikerer et element i t-rørsystemet som ble målt med en rask linjeskanning under elektrisk feltstimulering ved 0,5 Hz. (B) Gjennomsnittlig og baseline-normalisert FluoVolt fluorescens (F/F0) av fem påfølgende handlingspotensialer oppnådd ved konfokal avbildning som beskrevet i A. (C) Linjeskanning bilde av en isolert menneskelig kardiomyocytt lastet med kalsiumfølsom fargestoff Fluo-4 AM (488 nm eksitasjon bølgelengde) langs langsgående celle aksen. Fluorescensintensiteten vises i grå verdier [AU], og de blå prikkene indikerer den maksimale økningen av fluorescensintensiteten (dF/dtmaks)for hver piksel langs den skannede linjen. Samplingsfrekvensen var 529 Hz. (D) Kalsiumtransient oppnådd ved å gjennomsnittlig fluorescensen til hver piksel langs den skannede linjen fra bildet i C og normalisering til baselineverdier før stimulering (F/ F0). Alle eksperimenter ble utført ved romtemperatur.. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

navn Sammensetning i mmol/l Kosttilskudd Ph Nødvendig volum i ml
Løsning 1 20 KCl, 10 KH2PO4,10 MgCl2,10 glukose, 70 glutaminsyre, 20 taurin, 10 beta-hydroksybutyrat, 30 BDM 2 mg/ml storfe serumalbumin 7.3 med KOH 300
Løsning 2 20 KCl, 10 KH2PO4,10 MgCl2,10 glukose, 70 glutaminsyre, 20 taurin, 10 beta-hydroksybutyrat, 0,005 CaCl2, 30 BDM 10 mg/ml storfe serumalbumin 7.3 med KOH 300
Løsning 3 20 KCl, 10 KH2PO4,10 MgCl2,10 glukose, 70 glutaminsyre, 20 taurin, 10 beta-hydroksybutyrat, 1,5 CaCl2 10 mg/ml storfe serumalbumin 7.3 med KOH 300
Modifisert Tyrodes løsning 130 NaCl, 0,4 NaH2PO4,5.8 NaHCO3,5.4 KCl, 0.5 MgCl2,1.5 CaCl2, 25 HEPES, 22 glukose 2 mg/ml storfe serumalbumin 7,3 med NaOH ved 5 % CO2 100
Skjæreløsning 138 NaCl, 0,33 NaH2PO4,5,4 KCl, 2 MgCl2,0,5 CaCl2,10 HEPES, 10 glukose, 30 BDM 7.3 med NaOH 500

Tabell 1: Buffere og løsninger. Sammensetning av nødvendige buffere og løsninger.

Tilleggsfigur 1: Validering av kardiomyocyte (CM1) gating ordningen. Dot plott fra strømningscytometri, måling fremover- og side-scatter område (FSC-A, SSC-A) indikerer størrelse og detaljnivå av de oppdagede cellene i en kontrollprøve (CTRL) fra perfusjonsisolert rotte kardiomyocytter og etter inkubasjon av kardiomyocytter fra samme preparat i 15 min ved 37 ° C i modifisert Tyrodes løsning som inneholder 100 mM kalsium (kalsium overdose). Det høye ekstracellulære kalsiumet forårsaker hyperkontraksjon og avrunding av stangformede kardiomyocytter, noe som resulterer i en reduksjon av celler (87,6% vs. 6,00%) i den definerte porten (CM1). Vennligst klikk her for å laste ned dette tallet.

Tilleggsfigur 2: Kardiomyocytteregenskaper isolert ved perfusjon eller fra skiver. Cellelengde (A) og cellebredde (B) ble bestemt fra rottekardiomyocytter festet direkte etter isolasjon via perfusjon eller fra myokardskiver ved mikroskopi (n = henholdsvis 19 og n = 21 celler). Sarkomallengden (C) ble bestemt av mikroskopiske bilder etter immunstaining med alfa-actinin- og Fourier-analyse (n = henholdsvis 24 og n = 23 celler). Gjennomsnittlig aktiveringstid ( D ),maksimalF/F0 (E) og den relative forkortelsen (F) ble vurdert fra Fluo-4-belastede kardiomyocytter isolert av perfusjon eller fra myokardskiver og responsiv for elektrisk stimulering (n = 100/31 myocytter i D, n = 104/25 myocytter i E og n = 42/7 myocytter i F). Fraksjonen av stangformede kardiomyocytter (G) som kontraherte ved elektrisk stimulering, vurdert ved å telle det totale antallet stangformede celler og kontraktile celler i ti synsfelt ved 200x forstørrelse i et standard lysmikroskop ble vurdert for perfusjon og skiveisolering (n = 452/276 celler, henholdsvis). (H) Analyse som utført i G, men etter 48 timer dyrking (n = henholdsvis 371/329 celler). Vennligst klikk her for å laste ned dette tallet.

Supplerende figur 3: Human kardiomyocyttisolering med lavt utbytte. Representativt lysmikroskopbilde av myocytter fra en isolasjon med overveiende hyperkontrakt (blå) eller avrundede celler (svart) og bare få stangformede og striated celler (hvit). Vennligst klikk her for å laste ned dette tallet.

Tilleggsfigur 4: Kardiomyocyttisolering fra spedbarns hjertebiopsier. (A) Bilde av en endomyocardial biopsi (våt vekt ca. 40 mg) oppnådd under korrigerende kirurgi for tetralogi av Fallot hos et spedbarn. (B)Myokardskive fra vevet vist i A, innebygd i agarose. (C) Kardiomyocytter isolert fra en myokardskive som vist i B. Vennligst klikk her for å laste ned dette tallet.

Tilleggstabell 1: Data fra mennesker. En liste over antall prøver fra menneskelige pasienter inkludert i denne studien er gitt. Prøvene ble kategorisert i henhold til kirurgityper, alder, sykdomsetiologi og transporttid, med henholdsvis totalt antall prøver og antall vellykkede myocyttisolasjoner. Vennligst klikk her for å laste ned denne tabellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Selv om isolering av levende kardiomyocytter ble etablert for mer enn 40 år siden og fortsatt er en forutsetning for mange eksperimentelle tilnærminger i hjerteforskning, er det fortsatt en vanskelig teknikk med uforutsigbare resultater. Kardiomyocyte isolasjon via perfusjon av koronararteriene med enzymløsning brukes ofte til hjerter av små dyr og gir et stort antall levedyktige celler. Dette krever imidlertid et relativt komplekst system og kompetanse. Videre er de fleste menneskelige vevsprøver ikke egnet for denne metoden, på grunn av deres lille størrelse eller fravær av koronargrener, noe som gjør nye metoder for isolering av menneskelige kardiomyocytter ønskelig. Protokollen som er beskrevet her er basert på den atraumatiske generasjonen av tynne hjertevevsskiver, som deretter blir utsatt for enzymatisk fordøyelse. Det kan brukes på myokardprøver fra dyrehjerter og humant myokardi som apikale kjerner fra venstre-ventrikulær assisterende-enhet implantasjon, endomyocardial biopsier fra septal myectomy, eller explanted hjerter (se Supplerende tabell 1), og pålitelig produserer tilstrekkelige mengder levedyktig, kalsiumtolerante kardiomyocytter som kan brukes til påfølgende eksperimenter, som kardiomyocytedyrking 17.

En viktig årsak til høyere utbytte av myocytter fra vibratom-cut vev skiver enn fra hakket vev biter kan være en lavere grad av myocytt skade under kutting. Når koronar perfusjon ikke er mulig, er det nødvendig å kutte eller hakke vevsprøven for å øke kontaktoverflaten for å fordøye enzymer. Skivedimensjoner på ca. 8 mm x 8 mm x 0,3 mm gir god tilgang til enzymer på grunn av et relativt stort overflate-til-volum-forhold (~7 mm-1). Ved hjelp av saks kan et lignende overflate-til-volum-forhold (~6 mm-1) oppnås ved å hakke prøvene i små biter på ca. 1 mm x 1 mm x 1 mm. Selv om myocyttskader i skiver og hakket biter før enzymatisk fordøyelse ikke ble kvantifisert, forårsaker kutting på en vibratom sannsynligvis betydelig mindre skade fordi det muliggjør skånsom skjæring i fiberretningen. Faktisk ble det anslått at i vibratom-cut skiver færre enn 5% av myocytter er skadet19. Resultatene viser at menneskelige kardiomyocytter kan isoleres svært effektivt med protokollen gitt, med en mye høyere andel av levedyktige celler sammenlignet med vevbiter. Dette er i samsvar med en protokoll som brukte skiver fra atrievev20. Vår metode gir opptil 200 kalsiumtolerante ventrikulære myocytter per milligram vev og gir mulighet til å lagre eller transportere hjertevev i opptil 36 timer før isolasjon. Dette gjør protokollen gjeldende for laboratorier uten hjertekirurgi på stedet og utvider dermed mulighetene for samarbeid.

Kritiske trinn i protokollen er riktig behandling av myokardi til skiver på en vibratom og deres fordøyelse, samt de siste trinnene i kalsium-gjeninnføring og utvasking av BDM. I motsetning til andremetoder 19,21, er hjertevevet innebygd i agarose med lav smeltetemperatur for å unngå bevegelse under kuttingsprosedyren14,15. Dette var nødvendig for å stabilisere vevsblokken og å generere ensartede skiver. Ved innebygging av vevet skal agarose fortsatt være flytende, men temperaturen bør ikke overstige 37–38 °C for å unngå celleskade ved hypertermi. Omvendt, hvis agarose er for kald (<35 °C), bindes den ikke godt til vevsblokken og kan bryte under kuttingen. For å teste for myocyte levedyktighet etter vibratombehandling, foreslås en enkel MTT-analyse som muliggjør rask evaluering av celle levedyktighet ved lett mikroskopi og også for kvantifisering ved fotometrisk analyse14,22. Kardiomyocyttskade kan også oppstå under gjeninnføring av ekstracellulært kalsium etter en periode med inkubasjon i kalsiumfri oppløsning23,24. Dette kalsiumparadoksfenomenet i isolerte celler kan reduseres av en langsom, trinnvis økning av kalsiumnivået slik at kardiomyocytter kan tilpasse seg. Dette trinnet skal utføres nøye under kontinuerlig omrøring ved 35 °C og med intervaller på 5 min. Svak hypotermi (21 °C) øker kalsiumtoleransen for rottekardiomyocytter under gjeninnføring, som er i samsvar med tidligere rapporter25. Humane kardiomyocytter viste imidlertid ikke store forskjeller i kalsiumtoleranse ved 35 °C eller 21 °C. Bruken av BDM under skjæring, fordøyelse og gjeninnføring av kalsium forhindrer myocyttkontraksjon og cellulære energiforbruk samt hyperkontraksjon og er derfor beskyttende. Men for påfølgende eksperimenter som vurderer hjertekontraktilitet eller eksitasjon-sammentrekningskobling, må BDM fjernes26. En gradvis utvasking ble påført for å minimere spontane hyperkontraksjoner. BDM kan utelates, men dette vil markert øke mengden hyperkontrakt med myocytter, som observert i tidligere eksperimenter og studier6.

Den beskrevne protokollen bruker en løsning som inneholder høyt kalium og bare spor av natrium for fordøyelsen. Denne løsningen ga de høyeste utbyttene av stangformede, kryss-striated kardiomyocytter. For enzymatisk fordøyelse krevde det imidlertid en høyere konsentrasjon av kollagenase (4 mg/ml) sammenlignet med fordøyelsen i normal Tyrodes oppløsning (1,5 mg/ml). Høyt ekstracellulært natrium kan føre til intracellulær natriumoverbelastning, forverre de negative effektene av kalsiumparadokset, og dermed redusere celleavlinger27. Derfor foreslås det å bruke løsninger med høyt kalium og lavt natrium. En høy ekstracellulær magnesiumkonsentrasjon brukes ofte i kardiomyocytterisolasjonsprotokoller3,,28,og har vist seg å redusere iskemi-reperfusjonsskade29,,30 og forbedre hjertefunksjonen etter lengre perioder med kald iskemi31. Derfor inneholder løsningen som brukes her også en høy konsentrasjon av magnesium (10 mM). Det ble imidlertid vist at spenning, sammentrekningskraft og ledningshastighet kan reduseres med høye magnesiumkonsentrasjoner32. Selv om disse effektene viste seg å være reversible, kan effekter på isolerte kardiomyocytter ikke utelukkes. Dermed, ved hjelp av magnesium ved fysiologiske konsentrasjoner (1-2 mM), kan resultere i en lavere total celleutbytte, men forbedre spenningen.

Den optimale fordøyelsestiden er ganske variabel, da mengden ekstracellulær matrise eller fibrose kan variere betydelig hos humant sviktende myokardi. Skulle vevet fortsatt være fast tilkoblet på tidspunktet for dissosiasjon, med bare få levedyktige myocytter utgitt, øker fordøyelsestiden i trinn på 5 min og regelmessig sjekker gratis myocytter og teksturen av skivene anbefales. Hvis vevet forblir ufordøyd etter lengre perioder (> 45 min), øker konsentrasjonen av kollagennase i trinn på 1 mg / ml eller tester et annet enzymparti,anbefales 16. De respektive verdiene som presenteres i dette arbeidet kan tjene som en primer for en robust isolering av kardiomyocytter, men betingelsene for optimal utbytte og levedyktighet kan raffineres i hvert laboratorium, med hensyn til den store variasjonen av enzymaktiviteter og vevsforfatninger. En fordel med metoden er at på grunn av de små mengdene nødvendig vev og den enkle arbeidsflyten i små partier, kan flere tester utføres parallelt. Dermed kan en optimal protokoll oppnås raskt.

Generering av høykvalitets myokardskiver krever en høy presisjon vibratom. Behovet for en høypresisjons vevskiver eller vibratom er en mulig ulempe med metoden, fordi den ikke er lett tilgjengelig ved hvert laboratorium. Enheten som brukes til denne studien er beskrevet mer detaljert andre steder14,15. Ulike enheter har blitt brukt til å generere myokardskiver av andre grupper33,34,35. Derfor, hvis innstillingene for fremadstormende hastighet, bladamplitude og svingfrekvens kan oppfylles og en horisontal bladorientering med en z-nedbøyning under 0,1 μm er tilgjengelig, bør vellykket kutting og isolasjon være mulig med andre vibratomer. I tillegg er vevsslicing utdypet og forlenger signifikant varigheten av protokollen (ca. 1-2 timer). Bruken av BDM som et mekanisk frakoblingsmiddel har beskyttende effekter ved å redusere cellulær energieksponering, iskemisk skade og hyperkontraksjon26,,36,,37. Selv om den negative inotropiske effekten av BDM viste seg å være raskt reversibel etter utvasking38,39, er det ikke klart om BDM kan ha ukjente konsekvenser for kardiomyocytefunksjon40. Denne studien viser at celler kan isoleres med høye utbytter etter vevlagringstider på opptil 36 timer, og at menneskelige kardiomyocytter kan dyrkes i opptil tre dager etter isolasjon med denne metoden17. Vi la ikke merke til funksjonelle eller strukturelle forskjeller mellom myocytter med korte og lange lagringstider. Dette ble imidlertid ikke vurdert systematisk. På den annen side, for hele kaninhjerter, ble det vist at funksjonelle forskjeller mellom friske hjerter og hjerter utsatt for kald iskemi i ekstracellulær løsning som inneholder 30 mM BDM varubetydelige 31, og det samme kan være sant i dette tilfellet.

Den presenterte protokollen gir et solid grunnlag for alle typer eksperimenter med isolerte ventrikulære kardiomyocytter og kan være spesielt verdifull for forskning på menneskelige myokardprøver. Med noen tilpasninger virker isolering av andre hjerteceller, for eksempel fibroblaster eller endotelceller, også mulig41. Fordi det krever bare små mengder vev som kan sendes i kjølelagringsløsning fra andre laboratorier, kan anvendelsen av protokollen redusere antall ofret laboratoriedyr. Faktisk har protokollen blitt brukt på kanin og svin hjertevev. Videre, som eksperimenter med langsiktige dyrket myokardvev skiver øke21,33,42 og er stadig forbedret for å gi optimale kulturforhold15,43,44, kan metoden lett brukes etter skive dyrking. Encelleisolasjon fra dyrket myokardi kan derfor bidra til å karakterisere endringer i kardiomyocytter etter farmakologiske eller fysiske inngrep in vitro.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi vil gjerne takke Andreas Dendorfer fra Walter-Brendel-Centre of Experimental Medicine, LMU Munich, for å få hjelp med kutteprotokollen. For å gi menneskelige myokardvevsprøver vil vi gjerne takke Ghazali Minabari og Christian Heim fra Institutt for hjertekirurgi, Universitetssykehuset Erlangen, Hendrik Milting fra Erich & Hanna Klessmann Institute, Ruhr-University Bochum og Muhannad Alkassar fra Institutt for pediatrisk kardiologi, Universitetssykehuset Erlangen. For støtte til strømningscytometri vil vi takke Simon Völkl og kolleger fra det translasjonelle forskningssenteret (TRC), Universitetssykehuset Erlangen. Vi vil også takke Lorenz McCargo og Celine Grüninger fra Institutt for cellulær og molekylær fysiologi Erlangen for utmerket teknisk støtte.

Dette arbeidet ble støttet av DZHK (German Centre for Cardiovascular Research), av Tverrfaglig senter for klinisk forskning (IZKF) ved Universitetssykehuset ved Universitetet i Erlangen-Nürnberg, og Universitätsbund Erlangen-Nürnberg.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
2,3-butanedionemonoxime Carl Roth 3494.1 Purity>99%
Bovine serum albumin Carl Roth 163.2
CaCl2 Carl Roth 5239.2
Creatine monohydrate Alfa Aesar B250009
Glucose Merck 50-99-7
HEPES Carl Roth 9105.3
KCl Carl Roth P017.1
KH2PO4 Carl Roth 3904.2
L-glutamic acid Fluka Biochemica 49450
Low melting-point agarose Carl Roth 6351.5
MgCl2 x 6H2O Carl Roth A537.1
MgSO4 Sigma Aldrich M-7506
NaCl Carl Roth 9265.1
NaHCO3 Carl Roth 8551.2
Paraformaldehyde Sigma Aldrich P6148
Taurine Sigma Aldrich T8691
Dyes
Di-8-ANEPPS Thermo Fisher Scientific D3167
Fluo-4 AM Thermo Fisher Scientific F14201
FluoVolt Thermo Fisher Scientific F10488
Enzymes
Collagenase CLS type I Worthington LS004196 Used for human tissue at 4 mg/mL
(activity: 280 U/mg)
Collagenase CLS type II Worthington LS004176 Used for rat tissue at 1.5 mg/mL
(activity 330 U/mg)
Protease XIV Sigma Aldrich P8038 Used for rat tissue at 0.5 mg/mL
(activity ≥ 3.5 U/mg)
Proteinase XXIV Sigma Aldrich P5147 Used for human tissue at 0.5 mg/mL
(activity: 7-14 U/mg)
Material
Cell analyzer (LSR Fortessa) BD Bioscience 649225
Centrifuge tube, 15 mL Corning 430790
Centrifuge tube, 50 mL Corning 430829
Compact shaker Edmund Bühler KS-15 B control Agitation direction: horizontal
Disposable plastic pasteur-pipettes Carl Roth EA65.1 For cell trituration use only pipettes with an inner tip diameter ≥2 mm
Forceps FST 11271-30
Heatblock VWR BARN88880030
Nylon net filter, 180 µm Merck NY8H04700
TC Dish 100, Standard Sarstedt 83.3902
TC Dish 35, Standard Sarstedt 83.3900
TC Dish 60, Standard Sarstedt 83.3901
Vibratome (VT1200S) Leica 1491200S001 Includes VibroCheck for infrared-assisted correction of z-deflection

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Powell, T., Twist, V. W. A rapid technique for the isolation and purification of adult cardiac muscle cells having respiratory control and a tolerance to calcium. Biochemical and Biophysical Research Communications. 13, 258-283 (1976).
  2. Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51, 288-298 (2011).
  3. Isenberg, G., Klockner, U. Calcium Tolerant Ventricular Myocytes Prepared by preincubation in a KB Medium. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 395, 6-18 (1982).
  4. Beuckelmann, D. J., Näbauer, M., Erdmann, E. Intracellular calcium handling in isolated ventricular myocytes from patients with terminal heart failure. Circulation. 85, 1046-1055 (1992).
  5. Brixius, K., Hoischen, S., Reuter, H., Lasek, K., Schwinger, R. H. G. Force/shortening-frequency relationship in multicellular muscle strips and single cardiomyocytes of human failing and nonfailing hearts. Journal of Cardiac Failure. 7, 335-341 (2001).
  6. Peeters, G. A., et al. Method for isolation of human ventricular myocytes from single endocardial and epicardial biopsies. The American Journal of Physiology. 268, 1757-1764 (1995).
  7. Coppini, R., et al. Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples. Journal of Visualized Experiments. (86), e51116 (2014).
  8. Seidel, T., et al. Sheet-Like Remodeling of the Transverse Tubular System in Human Heart Failure Impairs Excitation-Contraction Coupling and Functional Recovery by Mechanical Unloading. Circulation. 135, 1632-1645 (2017).
  9. Hartmann, N., et al. Antiarrhythmic effects of dantrolene in human diseased cardiomyocytes. Heart Rhythm. 14, 412-419 (2017).
  10. Bkaily, G., Sperelakis, N., Doane, J. A new method for preparation of isolated single adult myocytes. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 247, 1018-1026 (1984).
  11. Trube, G. Enzymatic Dispersion of Heart and Other Tissues. Single-Channel Recording. Sakmann, B., Neher, E. , Springer. Boston, MA. 69-76 (1983).
  12. Schlüter, K. D., Schreiber, D. Adult Ventricular Cardiomyocytes. Basic Cell Culture Protocols. 290, 305-314 (2004).
  13. Del Monte, F., et al. Restoration of contractile function in isolated cardiomyocytes from failing human hearts by gene transfer of SERCA2a. Circulation. 100, 2308-2311 (1999).
  14. Brandenburger, M., et al. Organotypic slice culture from human adult ventricular myocardium. Cardiovascular Research. 93, 50-59 (2012).
  15. Fischer, C., et al. Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro. Nature Communications. 10, (2019).
  16. Worthington-Biochemical. Worthington Tissue Dissociation Guide. , Available from: http://www.worthington-biochem.com/tissuedissociation/default.html (2019).
  17. Seidel, T., et al. Glucocorticoids preserve the t-tubular system in ventricular cardiomyocytes by upregulation of autophagic flux. Basic Research in Cardiology. 114 (6), 47 (2019).
  18. Lipsett, D. B., et al. Cardiomyocyte substructure reverts to an immature phenotype during heart failure. Journal of Physiology. 597, 1833-1853 (2019).
  19. Watson, S. A., et al. Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals. Nature Protocols. 12, 2623-2639 (2017).
  20. Guo, G. R., et al. A modified method for isolation of human cardiomyocytes to model cardiac diseases. Journal of Translational Medicine. 16, 1-9 (2018).
  21. Kang, C., et al. Human Organotypic Cultured Cardiac Slices: New Platform For High Throughput Preclinical Human Trials. Scientific Reports. 6, 1-13 (2016).
  22. Gomez, L. A., Alekseev, A. E., Aleksandrova, L. A., Brady, P. A., Terzic, A. Use of the MTT assay in adult ventricular cardiomyocytes to assess viability: Effects of adenosine and potassium on cellular survival. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 29, 1255-1266 (1997).
  23. Zimmerman, A. N. E., Hülsmann, W. C. Paradoxical influence of calcium ions on the permeability of the cell membranes of the isolated rat heart. Nature. 211, 646-647 (1966).
  24. Piper, H. M. The calcium paradox revisited An artefact of great heuristic value. Cardiovascular Research. 45, 123-127 (2000).
  25. Boink, A. B. T. J., Ruigrok, T. J. C., de Moes, D., Maas, A. H. J., Zimmerman, A. N. E. The effect of hypothermia on the occurrence of the calcium paradox. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 385, 105-109 (1980).
  26. Mulieri, L. A., Hasenfuss, G., Ittleman, F., Blanchard, E. M., Alpert, N. R. Protection of human left ventricular myocardium from cutting injury with 2,3-butanedione monoxime. Circulation Research. 65, 1441-1444 (1989).
  27. Busselen, P. Effects of sodium on the calcium paradox in rat hearts. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 408, 458-464 (1987).
  28. Voigt, N., Zhou, X. B., Dobrev, D. Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+Transients and Membrane Currents. Journal of Visualized Experiments. (77), e50235 (2013).
  29. Leor, J., Kloner, R. An Experimental Model Examining the Role of Magnesium in the Therapy of Acute Myocardial Infarction. The American Journal of Cardiology. 75, 1292-1293 (1995).
  30. Herzog, W. R., et al. Timing of Magnesium Therapy Affects Experimental Infarct Size. Circulation. 92, 2622-2626 (1995).
  31. Stringham, J. C., Paulsen, K. L., Southard, J. H., Mentzer, R. M., Belzer, F. O. Forty-hour preservation of the rabbit heart: Optimal osmolarity, [Mg2+], and pH of a modified UW solution. The Annals of Thoracic Surgery. 58, 7-13 (1994).
  32. Hall, S. K., Fry, C. H. Magnesium affects excitation, conduction, and contraction of isolated mammalian cardiac muscle. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 263 (2), Pt 2 622-633 (1992).
  33. Bussek, A., et al. Tissue Slices from Adult Mammalian Hearts as a Model for Pharmacological Drug Testing. Cellular Physiology and Biochemistry. 24, (2009).
  34. Wang, K., et al. Living cardiac tissue slices: An organotypic pseudo two-dimensional model for cardiac biophysics research. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 115, 314-327 (2014).
  35. Thomas, R. C., et al. A Myocardial Slice Culture Model Reveals Alpha-1A-Adrenergic Receptor Signaling in the Human Heart. Journal of the American College of Cardiology: Basic to Translational Science. 1, 155-167 (2016).
  36. Perreault, C. L., et al. Cellular basis of negative inotropic effect of 2,3-butanedione monoxime in human myocardium. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 263, 503-510 (1992).
  37. Vahl, C. F., Bonz, A., Hagl, C., Hagl, S. Reversible desensitization of the myocardial contractile apparatus forcalcium: A new concept for improving tolerance to cold ischemia in human myocardium. European Journal of Cardio-thoracic Surgery. 8, 370-378 (1994).
  38. Horiuti, K., et al. Mechanism of action of 2, 3-butanedione 2-monoxime on contraction of frog skeletal muscle fibres. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 9, 156-164 (1988).
  39. Li, T., Sperelakis, N., Teneick, R. E., Solaro, R. J. Effects of diacetyl monoxime on cardiac excitation-contraction coupling. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 232, 688-695 (1985).
  40. Sellin, L. C., Mcardle, J. J. Multiple Effects of 2,3 Butanedione Monoxime. Pharmacology and Toxicology. 74, 305-313 (1993).
  41. Eghbali-Webb, M., Agocha, A. E. A simple method for preparation of cultured cardiac fibroblasts from adult human ventricular tissue. Novel Methods in Molecular and Cellular Biochemistry of Muscle. Pierce, G. N., Claycomb, W. C. , Springer US. 195-198 (1997).
  42. Camelliti, P., et al. Adult human heart slices are a multicellular system suitable for electrophysiological and pharmacological studies. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51, 390-398 (2011).
  43. Watson, S. A., et al. Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro. Nature Communications. 10, 2168 (2019).
  44. Watson, S. A., Terracciano, C. M., Perbellini, F. Myocardial Slices: an Intermediate Complexity Platform for Translational Cardiovascular Research. Cardiovascular Drugs and Therapy. 33, 239-244 (2019).

Tags

Biologi Utgave 159 human hjertesvikt myokardskiver kardiomyocyttisolering vibratom kontraktile myocytter kalsiumavbildning hjerteeksitasjonskobling
Isolering av humane ventrikulære kardiomyocytter fra vibratom-cut myokardskiver
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fiegle, D. J., Volk, T., Seidel, T.… More

Fiegle, D. J., Volk, T., Seidel, T. Isolation of Human Ventricular Cardiomyocytes from Vibratome-Cut Myocardial Slices. J. Vis. Exp. (159), e61167, doi:10.3791/61167 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter