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Biology

Aislamiento de cardiomiocitos ventriculares humanos de rebanadas de miocardio de corte de vibratome

Published: May 10, 2020 doi: 10.3791/61167
Automatic Translation
1, 1,2, 1,2
1Institute of Cellular and Molecular Physiology, Friedrich-Alexander University Erlangen-Nürnberg, 2Muscle Research Center Erlangen (MURCE), Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

Summary

Presentado es un protocolo para el aislamiento de cardiomiocitos ventriculares humanos y animales de rodajas de miocardio cortados por vibratome. Se pueden obtener altos rendimientos de células tolerantes al calcio (hasta 200 células/mg) a partir de pequeñas cantidades de tejido (<50 mg). El protocolo es aplicable al miocardio expuesto a isquemia fría durante un máximo de 36 h.

Abstract

El aislamiento de los miocitos cardíacos ventriculares de corazones animales y humanos es un método fundamental en la investigación cardíaca. Los cardiomiocitos animales son comúnmente aislados por perfusión coronaria con enzimas digestivas. Sin embargo, aislar los cardiomiocitos humanos es un reto porque los especímenes de miocardio humano generalmente no permiten la perfusión coronaria, y los protocolos de aislamiento alternativos resultan en rendimientos pobres de células viables. Además, los especímenes de miocardio humano son raros y solo están disponibles regularmente en instituciones con cirugía cardíaca in situ. Esto dificulta la traducción de los hallazgos de cardiomiocitos animales a humanos. Aquí se describe un protocolo fiable que permite el aislamiento eficiente de los miocitos ventriculares del miocardio humano y animal. Para aumentar la relación superficie-volumen y minimizar el daño celular, se generan rebanadas de tejido miocárdico de 300 m de espesor a partir de muestras de miocárdico con un vibratome. Las rodajas de tejido se digieren con proteasa y colagenasa. El miocardio de rata se utilizó para establecer el protocolo y cuantificar los rendimientos de miocitos viables y tolerantes al calcio mediante el recuento de células citométricas de flujo. La comparación con el método de trozos de tejido comúnmente utilizado mostró rendimientos significativamente más altos de los cardiomiocitos en forma de varilla (41,5 a 11,9 frente a 7,89 a 3,6%, p < 0,05). El protocolo se tradujo al miocardio humano en defecto y sin fallos, donde los rendimientos eran similares a los del miocardio de rata y, de nuevo, notablemente más altos que con el método de tejido-trozo (45,0 a 15,0 frente a 6,87 a 5,23 células/mg, p < 0,05). En particular, con el protocolo presentado es posible aislar un número razonable de cardiomiocitos humanos viables (9–200 células/mg) de cantidades mínimas de tejido (<50 mg). Por lo tanto, el método es aplicable al miocardio sano y en defecto de los corazones humanos y animales. Además, es posible aislar miocitos excitables y contráctiles de muestras de tejido humano almacenadas hasta 36 h en solución cardiopléjica en frío, haciendo que el método sea particularmente útil para laboratorios en instituciones sin cirugía cardíaca in situ.

Introduction

Una técnica seminal que ha allanado el camino a información importante sobre la fisiología cardiomiocitos es el aislamiento de cardiomiocitos ventriculares vivos de corazones intactos1. Cardiomiocitos aislados se pueden utilizar para estudiar la estructura celular normal y la función, o las consecuencias de los experimentos in vivo; por ejemplo, para evaluar los cambios en la electrofisiología celular o el acoplamiento excitación-contracción en modelos animales de enfermedad cardíaca. Además, los cardiomiocitos aislados se pueden utilizar para el cultivo celular, intervenciones farmacológicas, transferencia de genes, ingeniería de tejidos y muchas otras aplicaciones. Por lo tanto, los métodos eficientes para el aislamiento de cardiomiocitos son de valor fundamental para la investigación cardíaca básica y traslacional.

Los cardiomiocitos de pequeños mamíferos, como los roedores, y de mamíferos más grandes, como cerdos o perros, son comúnmente aislados por perfusión coronaria del corazón con soluciones que contienen colágenos crudos y/o proteasas. Esto ha sido descrito como el método "estándar de oro" para el aislamiento de cardiomiocitos, lo que resulta en rendimientos de hasta el 70% de las células viables2. El enfoque también se ha utilizado con los corazones humanos, lo que resulta en rendimientos de cardiomiocitos aceptables3,,4,5. Sin embargo, debido a que la perfusión coronaria sólo es factible si el corazón intacto o una cuña miocárdica grande que contiene una rama de la arteria coronaria está disponible, la mayoría de los especímenes cardíacos humanos no son adecuados para este enfoque debido a su pequeño tamaño y la falta de vasculatura adecuada. Por lo tanto, el aislamiento de los cardiomiocitos humanos es un desafío.

Los especímenes de miocardio humano consisten principalmente en trozos de tejido de tamaño variable (aproximadamente 0,5 x 0,5 x 0,5 cm a 2 x 2 x 2 cm), obtenidos a través de biopsias endomiocardiales6, miectomies septal7, implantaciones de VAD8, o de corazones explantados9. Los procedimientos más comunes para el aislamiento de cardiomiocitos comienzan con la picadura del tejido usando tijeras o un bisturí. Los contactos de célula a célula se interrumpen por inmersión en tampones libres de calcio o de bajo contenido de calcio. Esto es seguido por múltiples pasos de digestión con extractos de enzimas brutas o enzimas purificadas como proteasas (por ejemplo, tripina), colagenasa, hialuronidasa, o elastasa, lo que resulta en una desintegración de la matriz extracelular y la liberación de los cardiomiocitos. En un paso final y crítico, una concentración fisiológica de calcio tiene que ser restaurada cuidadosamente, o el daño celular puede ocurrir debido a la paradoja de calcio10,11,12. Este enfoque de aislamiento es conveniente, pero generalmente ineficiente. Por ejemplo, un estudio encontró que casi 1 g de tejido miocárdico era necesario para obtener un número suficiente de cardiomiocitos adecuado para experimentos posteriores13. Una posible razón para los bajos rendimientos es el método relativamente duro de picar el tejido. Esto puede dañar particularmente los cardiomiocitos ubicados en los bordes de los trozos, aunque estos miocitos son más propensos a ser liberados por digestión enzimática.

Otro aspecto que puede influir en la eficiencia del aislamiento y la calidad de las células obtenidas de muestras humanas es la duración de la isquemia tisular. La mayoría de los protocolos mencionan los tiempos de transporte cortos al laboratorio como un requisito previo para obtener buenos resultados. Esto restringe el estudio de cardiomiocitos ventriculares humanos a laboratorios con instalaciones de cirugía cardíaca cercanas. Juntos, estas restricciones dificultan la verificación de hallazgos importantes de modelos animales en cardiomiocitos humanos. Por lo tanto, son deseables protocolos de aislamiento mejorados que permiten altos rendimientos de cardiomiocitos a partir de pequeñas cantidades de tejido, preferiblemente sin daños graves después de tiempos de transporte prolongados.

Aquí se describe un protocolo de aislamiento basado en la digestión enzimática de las rebanadas de tejido miocárdico delgado generadas con un vibratoma14,,15. Demostramos que el aislamiento de las rodajas de tejido es mucho más eficiente que el de los trozos de tejido picados con tijeras. El método descrito no sólo permite altos rendimientos de cardiomiocitos humanos viables a partir de pequeñas cantidades de tejido miocárdico, sino que también es aplicable a muestras almacenadas o transportadas en solución cardiopléjica en frío hasta 36 h.

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Protocol

Todos los experimentos con ratas fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Mittelfranken, Baviera, Alemania. La recolección y el uso de muestras de tejido cardíaco humano fueron aprobados por las Juntas de Revisión Institucional de la Universidad de Erlangen-Núremberg y el Ruhr-Universidad Bochum. Los estudios se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices de la Declaración de Helsinki. Los pacientes dieron su consentimiento informado por escrito antes de la recolección de tejidos.

Las ratas Wistar hembras (150–200 g) se obtuvieron comercialmente, anestesiadas mediante la inyección de 100 mg/kg de tiopental-sodio intraperitonealmente, y eutanasiadas por dislocación cervical seguida de toracotomía y escisión del corazón. Las muestras de tejido cardíaco humano se recogieron del núcleo apical ventricular izquierdo durante la implantación de dispositivos de asistencia mecánica, de la miectomía septal, de la tetralogía de la cirugía correctiva de Fallot o de la pared ventricular izquierda libre de corazones explantados. El siguiente protocolo describe el aislamiento del tejido ventricular humano. El aislamiento de los cardiomiocitos de rata se realizó en consecuencia, pero con diferentes enzimas (ver Tabla de Materiales). Un flujo de trabajo esquemático del protocolo se ilustra en la Figura 1.

1. Preparación de tampones, soluciones y enzimas

  1. Prepare los buffers y las soluciones como se indica en la Tabla 1.
  2. Calentar las soluciones 1, 2, 3 y la solución modificada de Tyrode a 37 oC. Conservar la solución de corte a 4oC hasta su uso.
    NOTA: Para 1-2 rebanadas de miocardio se requieren un total de aproximadamente 15 ml, 8 ml y 5 ml de las soluciones 1, 2 y 3 para el aislamiento en un plato de cultivo de tejido de 35 mm. Amplíe en consecuencia para los aislamientos simultáneos de miocitos en varios platos. La solución de corte se puede congelar y mantener a -20 oC durante varios meses.
  3. Pesar 1 mg de proteinasa XXIV (ver Tabla de Materiales)en un tubo centrífugo prechilled de 15 ml y conservar en hielo hasta su uso. Esto es para procesar una muestra. Amplíe la cantidad en consecuencia. No mezcle la proteinasa y la colagenasa.
  4. Pesar 8 mg de colagenasa CLSI (ver Tabla de Materiales)en un tubo centrífugo prechilled de 15 ml y conservar en hielo hasta su uso. Esto es para procesar una muestra. Amplíe la cantidad en consecuencia. No mezcle la proteinasa y la colagenasa.
    ADVERTENCIA: Use una mascarilla facial o trabaje bajo una campana de humo para evitar la inhalación de polvo enzimático.
    NOTA: La actividad enzimática puede variar en diferentes lotes. Por lo tanto, la concentración óptima puede diferir y debe determinarse con cada enzima recién adquirida16.

2. Almacenamiento y transporte de tejido miocárdico

  1. Almacenar y transportar muestras cardíacas humanas en solución de corte enfriada de 4oC(Tabla 1).
  2. Utilice la misma solución para el procesamiento de tejidos adicionales y el corte de vibratomas.
    NOTA: Las biopsias y las muestras quirúrgicas del corazón deben transferirse inmediatamente a la solución de corte a 4 oC y luego pueden almacenarse o transportarse a 4 oC durante un máximo de 36 h antes de la aplicación de este protocolo.

3. Procesamiento y corte del tejido

NOTA: El protocolo para el corte de tejidos sigue Fischer et al.15.

  1. Recorte del bloque de tejido
    ADVERTENCIA: El tejido cardíaco humano es potencialmente infeccioso. Utilice siempre el desgaste protector y siga las normas de seguridad de su institución. Manipule cuidadosamente las cuchillas usadas y deseche en contenedores de seguridad.
    1. Colocar la muestra en un plato de cultivo de tejido de 100 mm lleno de solución de corte en frío de 20 ml y mantener en una placa enfriada de 4 oC.
    2. Retire el exceso de tejido fibroso y la grasa epicardial con un bisturí. En caso de una muestra transmuros, retire las trabeculas y las capas de tejido cerca del endocardio.
      NOTA: El tejido fibroso es rígido y aparece blanco. La grasa es típicamente suave y aparece de color blanco a amarillo. Las capas de trabeculas y tejido endocardial se pueden identificar a partir de su composición de tejido suelto y una orientación de fibra no alineada en comparación con el miocardio de las capas epicardiales
    3. Para un procesamiento óptimo del vibratoma, corte bloques de tejido rectangular de aproximadamente 8 mm x 8 mm x 8 mm con un bisturí de una muestra de tejido más grande. Para biopsias más pequeñas, omita este paso y pase a la incrustación de agarosa.
  2. Incorporación de tejido cardíaco en agarosa de punto de fusión bajo
    1. Hervir 400 mg de agarosa de punto de fusión baja en 10 ml de solución de corte en un vaso de precipitados de vidrio.
      ADVERTENCIA: Use guantes y gafas de seguridad para evitar quemaduras. Manipule la cristalería caliente solo con desgaste de protección contra el calor.
    2. Llene una jeringa de 10 ml con el gel de agarosa caliente y disuelto. Selle la jeringa y deje que la agarosa se equilibre en un baño de agua de 37 oC durante al menos 15 minutos.
    3. Utilice fórceps para colocar la muestra cardíaca recortada o una biopsia en una placa limpia de cultivo de tejido de 35 mm con el epicardium hacia abajo y eliminar el exceso de líquido con un hisopo estéril.
    4. Vierta la agarosa equilibrada (paso 3.2.2) sobre el tejido vaciando la jeringa. Asegure el tejido contra el movimiento con fórceps mientras vierte la agarosa. Asegúrese de que el tejido esté completamente sumergido en agarosa.
    5. Coloque inmediatamente el plato sobre hielo y deje que la agarosa se solidifique durante 10 minutos.
  3. Cortar el miocardio
    1. Monte una nueva cuchilla de afeitar en el soporte de la hoja del vibratome y calibre el vibratomo ajustando la desviación z de la cuchilla si es posible.
      NOTA: Este protocolo utiliza un vibratome con un dispositivo de calibración asistido por infrarrojos para alinear la hoja en una posición horizontal con una desviación z mínima (desviación medida <0,1 m).
    2. Usa un bisturí para extirpar un bloque de tejido agarosa que se ajuste al soporte de la muestra del vibratomo. Para garantizar la estabilidad, asegúrese de que el tejido esté suficientemente sumergido en agarosa (márgenes de agarosa a 8 mm).
    3. Fije el bloque de agarosa al soporte de la muestra con una fina capa de pegamento de cianoacrilato y una presión suave.
    4. Coloque el soporte de la muestra con el tejido en el baño del vibratomo. Llene el baño con solución de corte y manténgalo a 4-6 oC durante todo el procesamiento con hielo triturado, rellenando el tanque de enfriamiento exterior del vibratomo.
    5. Genere rodajas de 300 m de espesor con una velocidad de avance de 0,1 mm/s, una frecuencia oscilante de 80 Hz, una amplitud lateral de 1,5 mm y un ángulo de hoja de 15o. Cuando manipule las rodajas, sostenga la agarosa en lugar del tejido en sí para evitar daños en los tejidos. Conservar las rodajas en la solución de corte a 4oC durante un máximo de 2 h, si es necesario.
      NOTA: Los cardiomiocitos están orientados en paralelo al epicardio. Por lo tanto, es importante cortar en paralelo al epicardio para evitar daños excesivos en miocitos. Se recomienda desechar los primeros 1-3 cortes, ya que solo se deben utilizar rebanadas uniformes de espesor constante para el aislamiento. Para biopsias de tejido pequeño, sin embargo, sólo deseche la primera rebanada.
    6. Compruebe la alineación de los cardiomiocitos bajo un microscopio de luz estándar con un aumento de 40-100x.

4. Digestión de tejidos

  1. Coloque la placa de calor en la coctelera de laboratorio y caléctela a 37 oC. Encienda el agitador de laboratorio a 65 rpm.
  2. Disolver la proteinasa (preparada en el paso 1.3) en 2 ml de la solución 1 (paso 1.1 y 1.2) e incubar a 37oC hasta su uso. No mezcle la proteinasa y la colagenasa.
  3. Disolver la colagenasa (preparada en el paso 1.4) en 2 ml de la solución 1 (paso 1.1 y 1.2) e incubar a 37oC hasta su uso. No mezcle la proteinasa y la colagenasa.
    ADVERTENCIA: Use gafas y guantes protectores, ya que las enzimas disueltas pueden causar lesiones en la piel y los ojos.
  4. Añadir cloruro de calcio (CaCl2) a la solución que contiene colagenasa (preparada en el paso 4.3) a una concentración final de 5 oM.
  5. Utilice fórceps para transferir una rebanada de tejido del baño de vibratoma a un plato de cultivo de tejido limpio de 60 mm lleno de 5 ml de solución de corte prechilled (paso 1.1 y 1.2) y mantener en hielo.
  6. Retire cuidadosamente la agarosa del tejido miocárdico con cuchilla o fórceps.
    NOTA: Evite el exceso de tensión y tensión de cizallamiento en las rodajas de miocárdico, ya que pueden dañar los cardiomiocitos.
  7. Para realizar el lavado inicial, coloque un plato de cultivo de tejido limpio de 35 mm en la placa de calor y llénelo con 2 ml de solución precalentada (37 oC) 1. Transfiera 1–2 rodajas de miocardio al plato preparado con fórceps. Aspirar la solución con una pipeta de 1 ml y realizar los pasos de lavado 2x para eliminar los restos de solución de corte.
    NOTA: No aspire las rodajas cardíacas. Las soluciones y las rodajas deben permanecer a una temperatura constante de 35 oC en la placa de calor agitada. Ajuste la temperatura de la placa de calor si es necesario.
  8. Retire la solución 1 del plato y añada 2 ml de la solución proteasa (paso 4.2). Incubar durante 12 min en la placa de calor a 65 rpm.
  9. Lavar 2x con 2 ml de solución precalentada 1 (37oC).
  10. Retire la solución 1 del plato y añada 2 ml de solución de colagenasa (pasos 4.3 y 4.4). Incubar al menos 30 min en la placa de calor a 65 rpm.
  11. Compruebe si hay miocitos individuales gratuitos a 30, 35, 40 minutos, etc., colocando el plato bajo un microscopio ligero. Trabaje rápidamente para evitar el enfriamiento significativo de la solución.
    NOTA: El tiempo de digestión requerido puede variar dependiendo de la constitución del tejido y el grado de fibrosis. Tan pronto como el tejido se vuelve visiblemente suave y se disocia fácilmente cuando se tira suavemente, se ha alcanzado el tiempo óptimo de digestión. Si hay suficiente tejido disponible, se pueden digerir varias rodajas en paralelo con diferentes tiempos de digestión.
  12. Cuando se digiere el tejido y los miocitos individuales son visibles (paso 4.11), lavar 2x con 2 ml de solución precalentada 2 (37 oC) y llenar de nuevo con 2 ml.

5. Disociación de tejidos

  1. Disociar las rodajas de tejido digerido con fórceps tirando cuidadosamente de las fibras.
  2. Pipeta cuidadosamente varias veces con una pipeta Pasteur de un solo uso (diámetro de apertura >2 mm).
    NOTA: El uso de fórceps y pipeteo puede inducir estrés mecánico y causar daño cardiomiocitos. Sin embargo, es un paso crucial para la separación de las células. Utilice fórceps finos para minimizar el daño celular y disociar cuidadosamente las rebanadas en trozos más pequeños.
  3. Compruebe si hay cardiomiocitos liberados en forma de varilla bajo el microscopio de luz.

6. Reintroducción de la concentración fisiológica de calcio

  1. Aumente lentamente la concentración de calcio de 5 a 1,5 mM mientras agita a 35 oC en la placa de calor. Utilice soluciones de stock de 10 mM y 100 mM CaCl2. Pasos recomendados: 20, 40, 80, 100, 150, 200, 400, 800, 1.200, 1.500 m. Permiten que las células se adapten al aumento de los niveles de calcio en intervalos de incubación de 5 minutos entre cada paso.
  2. Retire los trozos de tejido no digeridos cuidadosamente con fórceps o filtre la suspensión celular a través de una malla de nylon con un tamaño de poro de 180 m al final del aumento de calcio.

7. Eliminación del agente mecánico de desacoplamiento

  1. Detenga la agitación y retire lentamente un tercio de la solución (700 l) de la parte superior con una pipeta de 1.000 l. Evitar la aspiración de los cardiomiocitos.
    NOTA: Si se extrajo tejido no digerido, los cardiomiocitos se acumularán en el centro del plato, lo que facilita la aspiración de una solución libre de células. Si no es así, transfiera la solución celular a un tubo centrífugo de 15 ml y permita que las células se sedimenten durante 10 min a 35 oC, luego aspire 700 ml del sobrenadante y deseche, resusptale las células, transfiera de nuevo a un plato de cultivo de tejido de 35 mm y proceda con el paso 7.2.
  2. Añadir 700 l de solución 3 a las células, reanudar la agitación en la placa de calor e incubar durante 10 min.
  3. Repita los pasos 7.1 y 7.2.
  4. Transfiera la solución a un tubo centrífugo de 15 ml y permita que los cardiomiocitos sedimenten durante un mínimo de 10 min y un máximo de 30 min a temperatura ambiente o giren a 50 x g durante 1 min. Retire el sobrenadante por completo y resuspendir en la solución modificada de Tyrode o en el búfer de experimentación deseado.
    NOTA: Los cardiomiocitos se pueden almacenar en la solución modificada de Tyrode (Tabla 1) durante varias horas a 37 oC y 5% de CO2 antes de su uso.
  5. Verifique la calidad celular con un microscopio de luz estándar a 40x y 200x de aumento.
    NOTA: Alrededor del 30-50% de los cardiomiocitos deben tener forma de varilla, lisas sin manchas de membrana, y mostrar claras estrías cruzadas. Sólo entre el 5 y el 10% de las células viables deben mostrar contracciones espontáneas.

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Representative Results

Para verificar la eficiencia del aislamiento, el protocolo se utilizó con miocardio de rata y el número resultante de miocitos viables se comparó con los números obtenidos por aislamiento a través de perfusión coronaria y por aislamiento de pequeños trozos de tejido (aislamiento de trozos, Figura 2). El aislamiento de los trozos y el aislamiento de las rebanadas de tejido se realizaron desde los mismos corazones. Para el aislamiento a través de perfusión coronaria, sin embargo, se utilizó todo el corazón. La perfusión coronaria produjo predominantemente cardiomiocitos en forma de varilla y estriados cruzados. Con los aislamientos de las rodajas de miocardio se observó una menor proporción de células en forma de varilla, pero el número total seguía siendo alto. Por el contrario, después del aislamiento de los trozos de tejido, sólo se recuperaron pocas células en forma de varilla (Figura 2A). La citometría de flujo se utilizó para comparar los resultados cuantitativamente. Debido a su tamaño relativamente grande y la estrías cruzadas, los cardiomiocitos suelen mostrar grandes valores tanto para la dispersión hacia adelante como para la dispersión lateral. Estas propiedades se utilizaron para contar miocitos en forma de varilla con un analizador de células citométricas de flujo, aplicando un esquema de gating simple que discriminaba en forma de varilla a partir de cardiomiocitos hipercontrados y redondeados. (Figura complementaria 1). Las gráficas de puntos representativas se representan en Figura 2B. El análisis estadístico mostró recuentos distintivamente más altos en la puerta de cardiomiocitos CM1 para el aislamiento de las rodajas que de los trozos de tejido (41,5 a 11,9 frente a 7,89 a 3,6%, respectivamente; n á 3 aislamientos; p < 0.05, paired two-tailed t-test). As expected from visual inspection, coronary perfusion yielded the highest counts, with 71.0 ± 9.4% (n = 3 isolations; p < 0.05, unpaired two-tailed t-test) (Figura 2C). Por lo tanto, el aislamiento de los cardiomiocitos de las rodajas de tejido no alcanza el rendimiento obtenido por perfusión coronaria, pero resulta en un número considerablemente mayor de miocitos en forma de varilla que el aislamiento de los trozos de tejido, proporcionando suficientes células para experimentos posteriores. Además del recuento celular, se cuantificaron los parámetros estructurales de los cardiomiocitos de rata. La longitud de la celda, el ancho de celda y la longitud de los sarcomos no eran diferentes en las células aisladas por perfusión o de las rodajas de tejido (longitud 110,0 a 5,4 m frente a 99,4 a 3,2 m, p> 0,05; anchura, 33,9 a 1,9 m frente a. 30,6 a 1,2 m, p> 0,05, para las celdas n a 19 y n a 21, respectivamente; longitud de sarcomere a 1,62 a 0,04 m frente a 1,68 a 0,04 m, p a 0,28, n a 24 y n a 23 células respectivamente ) (p a 0,28, n a 24 y n a 23 células respectivamente) (p a 0,28, n a 24 y n a 23 células respectivamente) (Figura Suplementaria 2A–C). Uso de miocitos cargados de Fluo-4 sometidos a estimulación de campo eléctrico17 también se evaluaron los parámetros funcionales (Figura complementaria 2D–F). Tiempo medio de activación (27,5 a 1,5 frente a 23,6 a 2,5 ms, n a 100 frente a n a 31 celdas; perfusión frente a rebanada, p > 0,05) (Figura complementaria 2D) y el acortamiento relativo (12,2 x 1,1 frente a 11,3 a 2,5%, n a 42 frente a las células n-7, perfusión frente a rebanada, p > 0,05) (Figura complementaria 2F) de cardiomiocitos que respondieron a la estimulación no diferían significativamente entre los dos grupos. La amplitud transitoria de calcio (Ca normalizado máximo2+, F/F0) (Figura complementaria 2E) se aumentó ligeramente en cardiomiocitos aislados de rodajas en comparación con los cardiomiocitos aislados por perfusión (4,9 a 0,2 frente a 5,7 a 0,3, n a 104 frente a n a 25 células, perfusión frente a corte, p < 0.05). Although the fraction of rod-shaped cardiomyocytes responding to electrical stimulation was approximately 15% higher in preparations obtained by perfusion, the majority of cells was also excitable in preparations from tissue slices (74.3 ± 4.2% vs. 62.1 ± 2.9%, perfusion vs. slice, p < 0.05, ten fields of view, 452 vs. 276 counted cells, respectively) (Figura complementaria 2G). Para evaluar la calidad celular después del cultivo, se determinó el porcentaje de miocitos que se contraen en respuesta a la estimulación eléctrica del campo después de 48 h en el cultivo celular17. La fracción de las células que respondieron se redujo aproximadamente a la mitad en ambos grupos (41,9 a 3,6% frente a 31,5 a 2,3%, perfusión frente a rebanada, p < 0.05, 10 fields of view, n = 371 vs. n = 329 counted cells, respectively) (Figura complementaria 2H).

A continuación, el protocolo se aplicó al miocardio humano. El número de cardiomiocitos humanos aislados en forma de varilla y viables obtenidos a partir de rodajas de tejido se comparó por pares con el número obtenido de trozos de tejido de las mismas muestras de miocárdico (Figura 3). Encontramos que el aislamiento de las rodajas de miocardio producía una gran proporción de varilla en forma de varilla y sólo una pequeña proporción de cardiomiocitos redondeados (Figura 3A). Contamos miocitos en forma de varilla a partir de imágenes de campo ancho y normalizamos su número por el peso húmedo de tejido utilizado para el aislamiento. La cuantificación mostró que el aislamiento de las rodajas de miocardio dio lugar a un número notablemente mayor de miocitos en forma de varilla que el aislamiento de trozos de tejido (45,0 a 15,0 frente a 6,87 a 5,23 células/mg, n a 7 aislamientos, p < 0,05, prueba t de dos colas emparejadas) (Figura 3B). Además, la viabilidad se evaluó con un ensayo de viabilidad de MTT14, normalizando la absorción de formazan fotométrica a la cantidad total de proteína en el izado celular. La cuantificación fotométrica confirmó una viabilidad de miocitos sustancialmente mayor después del aislamiento de las rodajas de miocárdico (4,76 a 0,47 frente a 1,09 a 0,18 UA, n a 3 aislamientos, p < 0,05, combinado de dos colas)(Figura 3C).

En total, el método se aplicó a especímenes miocárdicos de 30 corazones humanos con tiempos de transporte de hasta 36 h. De 23 de las 30 células viables de los 30 especímenes se obtuvieron para experimentos posteriores (véase también la Tabla Suplementaria 1). Un ejemplo de un experimento fallido (es decir, <100 celdas por plato) se muestra en la Figura suplementaria 3. Aquí, la mayoría de las células no toleraron el calcio extracelular alto e hipercontratadas. Evaluamos la contractilidad en miocitos de 14 aislamientos, y en dos casos las células no respondieron a la estimulación eléctrica. Tenga en cuenta que la técnica no sólo funcionó con especímenes grandes obtenidos de corazones adultos, sino también con pequeñas biopsias (tan solo 40 mg) de corazones infantiles(Figura Suplementaria 4).

Para demostrar que las células humanas aisladas con el protocolo descrito pueden someterse a análisis estructurales, se mancharon con alfa-actinin, las proteínas de acoplamiento CE canal de calcio tipo L (LTCC) y receptor de ryanodina (RyR), así como la membrana celular y los núcleos, según un método de tinción descrito recientemente en miocitos de rata17 (Figura 4). La tinción de alfa-actiniina reveló un patrón denso y regular de la línea z y una longitud media de sarcomere de 1,92 a 0,06 m en cardiomiocitos en reposo (n a 4, Figura 4A). LTCC y RyR mostraron racimos claros y fueron, como era de esperar, colocados cerca de la membrana celular y los t-tubulos (Figura 4B).

El colorante potenciométrico FluoVolt18 y el tinte sensible al calcio Fluo-417 se utilizaron para demostrar que los cardiomiocitos humanos aislados con el protocolo descrito eran excitables y podían utilizarse para estudios sobre electrofisiología celular o acoplamiento de excitación-contracción(Figura 5). Se analizaron la forma y duración del potencial de acción (AP)(Figura 5A,B). Los valores de 50% y 90% de duración AP (APD50: 400,6 a 41,1 ms, APD90: 748,9 a 56,6 ms, n a 10 células) estaban en el rango reportado por otros para cardiomiocitos ventriculares de corazones humanos en mal estado4,,6,7,9. Los transitorios de calcio registrados por el escaneo de línea confocal de células cargadas con Fluo4(Figura 5C,D) mostraron un claro upstroke después de la estimulación y una relación señal-ruido aceptable. La amplitud transitoria de calcio (F/F0)máxima fue de 2,9 a 0,5 (n a 31 células). El acortamiento de cardiomiocitos por contracción se puede ver en el ejemplo de la desviación del borde inferior de la célula, que tenía una media de 4,6 a 0,8% (n a 31 células).

Figure 1
Figura 1: Flujo de trabajo del protocolo de aislamiento de las rebanadas de tejido cardíaco humano. Los bloques de tejido o biopsias del miocardio humano (arriba a la izquierda) están incrustados en la agarosa de punto de fusión bajo y se generan rodajas de 300 m de espesor con la hoja oscilante de un vibratoma (centro superior). Las rodajas se transfieren a un plato de cultivo y se retiran de la agarosa circundante (arriba a la derecha). La digestión del tejido se lleva a cabo a 35 oC y 65 rpm sobre una placa calentada y agitada (media, izquierda) e incluye: (paso 4.8) Incubación en solución nominal libre de calcio suplementada con proteinasa, (paso 4.10) Digestión de la matriz extracelular con colagenasa, (paso 5) Disociación y liberación de cardiomiocitos individuales con fórceps y pipeteo. (paso 6) Aumento lento de la concentración de calcio extracelular de 5 a 1,5 mM en intervalos de 5 min (paso 7) Eliminación escalonada del desacoplador mecánico 2,3-butanedione monoxime (BDM). Se recuperan cardiomiocitos humanos en forma de varilla y estriados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Rendimientos de cardiomiocitos de la rebanada de miocardio, perfusión y aislamiento de trozos. (A) Micrografías ligeras representativas de cardiomiocitos de rata aislados ya sea a través de perfusión coronaria (perfusión), de tejido cortado en vibratome (rebanadas de miocardio), o de tejido picado (trozos de tejido). (B) Trazados de puntos de citometría de flujo representativos respetuosos a partir de aislamientos cardiomiocitos descritos en A. El área de dispersión lateral (SSC-Area) y el área de dispersión hacia adelante (FSC-Area) se utilizaron como indicadores de granularidad y tamaño celular, respectivamente. El esquema de gating de la puerta CM1 para cardiomiocitos está indicado por la línea negra y se muestran las fracciones respectivas de los recuentos totales en porcentaje. (C) Medio: error estándar de las fracciones de cardiomiocitos (CM1) evaluados por análisis flujo-citométrico como se describe en B de n a 3 aislamientos celulares por grupo. El aislamiento de las rebanadas de miocardio y los trozos de tejido se realizó desde los mismos corazones (prueba t de dos colas emparejada). El aislamiento por perfusión se realizó a partir de corazones enteros de diferentes animales y se comparó por la prueba t de dos colas no parís. *p < 0.05, después de la corrección de comparación múltiple. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Comparación del rendimiento y la viabilidad de los cardiomiocitos humanos después del aislamiento de las rodajas de miocárdico y los trozos de tejido picado. (A) Imagen representativa de cardiomiocitos ventriculares humanos tolerantes al calcio después del aislamiento de las rodajas de tejido. Los cardiomiocitos estriados y en forma de varilla son predominantes (flecha negra), con sólo unas pocas células redondeadas e hipercontratadas (flecha blanca). (B) Cuantificación de miocitos en forma de varilla tolerantes al calcio aislados en paralelo, ya sea a partir de rodajas de miocardio o trozos de tejido contados a partir de micrografías de campo ancho y normalizados al peso húmedo del material de entrada (en miligramos) de n aislamiento combinado. (C) Cuantificación de la viabilidad del cardiomiocitos mediante la medición fotométrica de la absorbancia del tinte formazan después del ensayo MTT. La absorbancia se normalizó a la cantidad total de proteínas, evaluada por el ensayo de BCA a partir de n .3 aislamientos combinados. *p < 0.05, **p < 0.01 (prueba t de dos colas emparejada). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Caracterización microestructural de cardiomiocitos humanos después del aislamiento. (A) Imagen microscópica confocal representativa después de la inmunomantina (verde) y la mancha nuclear con 4o,6-diamidin-2-phenylindol (DAPI, azul). La longitud de la sarcoría fue de 1,92 a 0,06 m (n x 4 miocitos), determinada mediante el análisis del espectro de Fourier. (B) Imágenes microscópicas confocales representativas de un cardiomiocito ventricular humano fijo coimmunostenados para el canal de calcio de tipo L (LTCC) y el receptor de ryanodina cardiaca (RyR). También se muestra la superposición de RyR y LTCC (superposición) y la tinción de la matriz extracelular con aglutinina germinal de trigo (WGA, magenta). Los núcleos se teñiron con DAPI (azul). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Potencial de acción y transitorio de calcio intracelular en miocitos ventriculares humanos. (A) Imagen confocal bidimensional de un cardiomiocito humano aislado cargado con el tinte potenciométrico FluoVolt (verde, longitud de onda de excitación de 488 nm). La caja roja indica un elemento del sistema t-tubular que se midió con un escaneo de línea rápido durante la estimulación de campo eléctrico a 0,5 Hz. (B) Fluorescencia de FluoVolt con promedio y normalización de línea de base (F/F0)de cinco potenciales de acción consecutivos obtenidos por imágenes confocales como se describe en A. (C) Imagen de escaneo de línea de un cardiomiocito humano aislado cargado con el tinte sensible al calcio Fluo-4 AM (longitud de onda de excitación de 488 nm) a lo largo del eje celular longitudinal. La intensidad de fluorescencia se muestra en valores grises [AU] y los puntos azules indican el aumento máximo de la intensidad de fluorescencia (dF/dtmax)de cada píxel a lo largo de la línea escaneada. La frecuencia de muestreo fue de 529 Hz. (D) Transitorio de calcio obtenido promediando la fluorescencia de cada píxel a lo largo de la línea escaneada desde la imagen en C y la normalización a los valores basales antes de la estimulación (F/F0). Todos los experimentos se realizaron a temperatura ambiente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Nombre Composición en mmol/L Suplementos Ph Volumen requerido en ml
Solución 1 20 KCl, 10 KH2PO4, 10 MgCl2, 10 glucosa, 70 ácido glutámico, 20 taurina, 10 beta-hidroxibutirato, 30 BDM 2 mg/ml de albúmina sérica bovina 7.3 con KOH 300
Solución 2 20 KCl, 10 KH2PO4, 10 MgCl2, 10 glucosa, 70 ácido glutámico, 20 taurina, 10 beta-hidroxibutirato, 0.005 CaCl2, 30 BDM 10 mg/ml de albúmina sérica bovina 7.3 con KOH 300
Solución 3 20 KCl, 10 KH2PO4, 10 MgCl2, 10 glucosa, 70 ácido glutámico, 20 taurina, 10 beta-hidroxibutirato, 1,5 CaCl2 10 mg/ml de albúmina sérica bovina 7.3 con KOH 300
Solución modificada de Tyrode 130 NaCl, 0,4 NaH2PO4, 5,8 NaHCO3, 5,4 KCl, 0,5 MgCl2, 1,5 CaCl2, 25 HEPES, 22 glucosa 2 mg/ml de albúmina sérica bovina 7,3 con NaOH al 5 % de CO2 100
Solución de corte 138 NaCl, 0,33 NaH2PO4, 5,4 KCl, 2 MgCl2, 0,5 CaCl2, 10 HEPES, 10 glucosa, 30 BDM 7.3 con NaOH 500

Tabla 1: Zonas de influencia y soluciones. Composición de los buffers y soluciones requeridos.

Figura suplementaria 1: Validación del esquema de gating de cardiomiocitos (CM1). Gráficos de puntos a partir de citometría de flujo, midiendo el área de dispersión directa y lateral (FSC-A, SSC-A) indicando el tamaño y la granularidad de las células detectadas en una muestra de control (CTRL) a partir de cardiomiocitos de rata aislados por perfusión y después de la incubación de cardiomiocitos de la misma preparación durante 15 minutos a 37 oC en la solución modificada de Tyrode que contiene 100 mM de calcio). El calcio extracelular alto causa hipercontración y redondeo de cardiomiocitos en forma de varilla, lo que resulta en una reducción de las células (87,6% frente a 6,00%) en la puerta definida (CM1). Haga clic aquí para descargar esta figura.

Figura suplementaria 2: Características de los cardiomiocitos aisladas por perfusión o por rodajas. La longitud de la célula (A) y el ancho de la célula (B) se determinaron a partir de cardiomiocitos de rata fijados directamente después del aislamiento a través de la perfusión o de las rodajas de miocárdico por microscopía (n a 19 y n a 21 células, respectivamente). La longitud de la sarcomere (C) se determinó a partir de imágenes microscópicas después de la inmunosumanidad con análisis de alfa-actinina y Fourier (n a 24 y n a 23 células, respectivamente). El tiempo medio de activación (D), el F/Fmáximo 0 (E) y el acortamiento relativo (F) se evaluaron a partir de cardiomiocitos cargados por Fluo-4 aislados por perfusión o de rodajas de miocardio y que responden a la estimulación eléctrica (n a 100/31 miocitos en D, n a 104/25 miocitos en miocitos E y n a 42/7 en F). Se evaluó la fracción de cardiomiocitos en forma de varilla (G) que se contrajo tras la estimulación eléctrica, evaluada contando el número total de células en forma de varilla y las células de tracción en diez campos de visión con un aumento de 200x en un microscopio de luz estándar para la perfusión y el aislamiento de la rebanada (n a 452/276 células, respectivamente). (H) Análisis tal como se realiza en G pero después de 48 h de cultivo (n a 371/329 células, respectivamente). Haga clic aquí para descargar esta figura.

Figura suplementaria 3: Aislamiento de cardiomiocitos humanos con bajo rendimiento. Imagen representativa del microscopio de luz de miocitos de un aislamiento con células predominantemente hipercontratadas (azul) o redondeadas (negras) y solo pocas células estriadas y en forma de varilla (blancas). Haga clic aquí para descargar esta figura.

Figura suplementaria 4: Aislamiento de cardiomiocitos de biopsias cardíacas infantiles. (A) Imagen de una biopsia endomiocardial (peso húmedo aproximadamente 40 mg) obtenida durante la cirugía correctiva para la tetralogía de Fallot en un bebé. (B) Rebanada de miocardio del tejido mostrado en A,incrustado en la agarosa. (C) Cardiomiocitos aislados de una rebanada de miocardio como se muestra en B. Haga clic aquí para descargar esta figura.

Tabla suplementaria 1: Datos de pacientes humanos. Se proporciona una lista del número de muestras de pacientes humanos incluidas en este estudio. Las muestras se clasificaron según los tipos de cirugía, la edad, la etiología de la enfermedad y el tiempo de transporte, con el número total respectivo de muestras y el número de aislamientos de miocitos exitosos. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

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Discussion

Aunque el aislamiento de los cardiomiocitos vivos se estableció hace más de 40 años y sigue siendo un requisito previo para muchos enfoques experimentales en la investigación cardíaca, sigue siendo una técnica difícil con resultados impredecibles. El aislamiento de cardiomiocitos a través de la perfusión de las arterias coronarias con solución enzimática se utiliza comúnmente para corazones de animales pequeños y produce un gran número de células viables. Sin embargo, esto requiere un sistema y experiencia relativamente complejos. Además, la mayoría de las muestras de tejido humano no son adecuadas para este método, debido a su pequeño tamaño o la ausencia de ramas de las arterias coronarias, lo que hace deseables nuevos métodos para el aislamiento de los cardiomiocitos humanos. El protocolo descrito aquí se basa en la generación atraumática de rebanadas de tejido cardíaco delgado, que luego se someten a la digestión enzimática. Se puede aplicar a muestras miocárdicas de corazones de animales y miocardio humano como núcleos apicales de implantación de dispositivos de asistencia ventricular izquierda, biopsias de endomiocardio de miectomía septal o corazones explantados (ver Tabla Suplementaria 1),y produce de manera confiable cantidades suficientes de cardiomiocitos viables y tolerantes al calcio que se pueden utilizar para experimentos posteriores, como el cultivo de cardiomiocitos17.

Una razón importante para mayores rendimientos de miocitos de las rodajas de tejido cortados con vibratome que de trozos de tejido picado podría ser un menor grado de daño de miocitos durante el corte. Cuando la perfusión coronaria no es posible, cortar o picar la muestra de tejido es necesario para aumentar la superficie de contacto para digerir las enzimas. Las dimensiones de las rebanadas de aproximadamente 8 mm x 8 mm x 0,3 mm permiten un buen acceso a las enzimas debido a una relación superficie-volumen relativamente grande (7 mm-1). Usando tijeras, se puede lograr una relación superficie-volumen similar (-6 mm-1)mediante la picadura de las muestras en trozos pequeños de aproximadamente 1 mm x 1 mm x 1 mm. Aunque no se cuantificó el daño de miocitos en rodajas y trozos picados antes de la digestión enzimática, cortar en un vibratome probablemente causa considerablemente menos daño porque permite un corte suave en la dirección de la fibra. De hecho, se estimó que en rodajas cortadas en vibratome menos del 5% de los miocitos están dañados19. Los resultados muestran que los cardiomiocitos humanos pueden aislarse de manera muy eficiente con el protocolo proporcionado, con una proporción mucho mayor de células viables en comparación con los trozos de tejido. Esto está de acuerdo con un protocolo que utiliza rebanadas de tejido auricular20. Nuestro método produce hasta 200 miocitos ventriculares tolerantes al calcio por miligramo de tejido y proporciona la posibilidad de almacenar o transportar tejido cardíaco hasta 36 h antes del aislamiento. Esto hace que el protocolo sea aplicable a los laboratorios sin cirugía cardíaca in situ y, por lo tanto, amplía las posibilidades de colaboración.

Los pasos críticos en el protocolo son el procesamiento correcto de miocardio a rodajas en un vibratome y su digestión, así como los pasos finales de la reintroducción de calcio y lavado de BDM. A diferencia de otros métodos19,21, el tejido cardíaco está incrustado en la agarosa con una baja temperatura de fusión para evitar el movimiento durante el procedimiento de corte14,15. Esto era necesario para estabilizar el bloque de tejido y generar rodajas uniformes. Al incrustar el tejido, la agarosa debe seguir siendo líquida, pero la temperatura no debe exceder de 37-38 oC para evitar daños celulares por hipertermia. Por el contrario, si la agarosa es demasiado fría (<35 oC), no se une bien al bloque de tejido y puede romperse durante el corte. Para probar la viabilidad de los miocitos después del procesamiento del vibratoma, se sugiere un ensayo simple de MTT que permite una evaluación rápida de la viabilidad celular por microscopía de luz y también para la cuantificación mediante análisis fotométrico14,,22. El daño por cardiomiocitos también puede ocurrir durante la reintroducción de calcio extracelular después de un período de incubación en la solución libre de calcio23,24. Este fenómeno de la paradoja del calcio en las células aisladas puede ser mitigado por un aumento lento y escalonado de los niveles de calcio para permitir que los cardiomiocitos se adapten. Este paso debe llevarse a cabo cuidadosamente durante la agitación continua a 35 oC y con intervalos de 5 min. Una ligera hipotermia (21 oC) aumenta la tolerancia al calcio de los cardiomiocitos de rata durante la reintroducción, que está de acuerdo con los informes anteriores25. Sin embargo, los cardiomiocitos humanos no mostraron diferencias importantes en la tolerancia al calcio a 35 oC o 21 oC. El uso de BDM durante el corte, la digestión y la reintroducción de calcio previene la contracción de los miocitos y el gasto de energía celular, así como la hipercontractión y, por lo tanto, es protector. Sin embargo, para experimentos posteriores que evalúen la contractilidad cardíaca o el acoplamiento excitación-contracción, es necesario retirar BDM26. Se aplicó un lavado gradual para minimizar las hipercontracciones espontáneas. BDM se puede omitir, pero esto aumentará notablemente la cantidad de miocitos hipercontratados, como se observó en experimentos y estudios anteriores6.

El protocolo descrito utiliza una solución que contiene alto contenido de potasio y solo trazas de sodio para la digestión. Esta solución dio los mayores rendimientos de cardiomiocitos en forma de varilla, estriados cruzados. Para la digestión enzimática, sin embargo, requirió una mayor concentración de colágeno (4 mg/ml) en comparación con la digestión en la solución normal de Tyrode (1,5 mg/ml). El alto sodio extracelular puede conducir a una sobrecarga de sodio intracelular, exacerbando los efectos negativos de la paradoja del calcio, reduciendo así los rendimientos celulares27. Por lo tanto, se sugiere utilizar soluciones con alto contenido de potasio y bajo contenido de sodio. Una alta concentración extracelular de magnesio se emplea con frecuencia en los protocolos de aislamiento de cardiomiocitos3,28, y se ha demostrado para reducir la lesión de isquemia-reperfusión29,30 y mejorar la función cardíaca después de períodos prolongados de isquemia fría31. Por lo tanto, la solución aplicada aquí también contiene una alta concentración de magnesio (10 mM). Sin embargo, se demostró que la excitabilidad, la fuerza de contracción y la velocidad de conducción pueden reducirse mediante altas concentraciones de magnesio32. Aunque estos efectos fueron demostrados reversibles, no se pueden excluir los efectos sobre los cardiomiocitos aislados. Por lo tanto, el uso de magnesio en concentraciones fisiológicas (1-2 mM), podría resultar en un menor rendimiento celular global, pero mejorar la excitabilidad.

El tiempo óptimo de digestión es bastante variable, ya que la cantidad de matriz extracelular o fibrosis puede variar considerablemente en el miocardio que falla en el ser humano. En caso de que el tejido siga firmemente conectado en el momento de la disociación, con sólo unos pocos miocitos viables liberados, se recomienda aumentar el tiempo de digestión en pasos de 5 min y comprobar regularmente si hay miocitos libres y la textura de las rodajas. Si el tejido permanece sin digerirse después de períodos prolongados (>45 min), se recomienda aumentar la concentración de colagenasa en pasos de 1 mg/ml o probar un lote de enzimas diferente16. Los valores respectivos presentados en este trabajo pueden servir como imprimación para un aislamiento robusto de los cardiomiocitos, pero las condiciones para un rendimiento y viabilidad óptimos pueden ser refinadas en cada laboratorio, teniendo en cuenta la gran variabilidad de las actividades enzimáticas y las constituciones tisulares. Una ventaja del método es que debido a las pequeñas cantidades de tejido requerido y el flujo de trabajo simple en pequeños lotes, varias pruebas se pueden llevar a cabo en paralelo. Por lo tanto, un protocolo óptimo se puede lograr rápidamente.

La generación de rodajas de miocardio de alta calidad requiere un vibratoma de alta precisión. La necesidad de una cortadora de tejido de alta precisión o vibratome es un posible inconveniente del método, ya que no está fácilmente disponible en todos los laboratorios. El dispositivo utilizado para este estudio se describe con más detalle en otros lugares14,15. Diferentes dispositivos se han utilizado con éxito para generar rebanadas de miocardio por otros grupos33,,34,35. Por lo tanto, si se pueden cumplir los ajustes de velocidad de avance, amplitud de la hoja y frecuencia de oscilación y se dispone de una orientación horizontal de la hoja con una desviación z por debajo de 0,1 m, el corte y el aislamiento exitosos deben ser factibles con otros vibratomes. Además, el corte de tejido es elaborado y prolonga significativamente la duración del protocolo (aproximadamente 1–2 h). El uso de BDM como agente mecánico de desacoplamiento tiene efectos protectores al reducir la exposición a la energía celular, lesiones isquémicas e hipercontración26,,36,,37. Aunque el efecto inotrópico negativo de la BDM demostró ser rápidamente reversible después del lavado38,39, no está claro si BDM puede tener consecuencias desconocidas sobre la función de cardiomiocitos40. Este estudio muestra que las células pueden ser aisladas con altos rendimientos después de tiempos de almacenamiento de tejido de hasta 36 horas y que los cardiomiocitos humanos pueden ser cultivados hasta tres días después del aislamiento con este método17. No notamos diferencias funcionales o estructurales entre miocitos con tiempos de almacenamiento cortos y largos. Sin embargo, esto no se evaluó sistemáticamente. Por otro lado, para corazones de conejo enteros, se demostró que las diferencias funcionales entre corazones frescos y corazones expuestos a isquemia fría en solución extracelular que contenía 30 mM de BDM eraninsignificantes 31,y lo mismo puede ser cierto en este caso.

El protocolo presentado proporciona una base sólida para todo tipo de experimentos con cardiomiocitos ventriculares aislados y podría ser especialmente valioso para la investigación en muestras de miocárdico humano. Con algunas adaptaciones, el aislamiento de otras células cardíacas, como fibroblastos o células endoteliales también parece posible41. Debido a que sólo requiere pequeñas cantidades de tejido que se pueden enviar en solución de almacenamiento en frío de otros laboratorios, la aplicación del protocolo puede reducir el número de animales de laboratorio sacrificados. De hecho, el protocolo se ha aplicado con éxito al tejido cardíaco de conejo y porcino. Además, a medida que los experimentos con rodajas de tejido miocárdico cultivadas a largo plazo aumentan21,33,42 y se mejoran constantemente para proporcionar condiciones óptimas de cultivo15,43,44, el método se puede aplicar fácilmente después del cultivo de la rebanada. Por lo tanto, el aislamiento de una sola célula del miocardio cultivado puede ayudar a caracterizar los cambios en los cardiomiocitos después de intervenciones farmacológicas o físicas in vitro.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Nos gustaría dar las gracias a Andreas Dendorfer, del Centro Walter-Brendel de Medicina Experimental, LMU Munich, por su ayuda con el protocolo de corte. Por proporcionar muestras de tejido miocárdico humano, nos gustaría agradecer a Ghazali Minabari y Christian Heim del Departamento de Cirugía Cardíaca, Hospital Universitario Erlangen, Hendrik Milting del Instituto Erich & Hanna Klessmann, Ruhr-University Bochum y Muhannad Alkassar del Departamento de Cardiología Pediátrica, Hospital Universitario Erlangen. Para el apoyo con la citometría de flujo, nos gustaría dar las gracias a Simon V-ll y a sus colegas del Centro de Investigación Traslacional (TRC), Hospital Universitario Erlangen. También nos gustaría dar las gracias a Lorenz McCargo y a Celine Gracianinger del Instituto de Fisiología Celular y Molecular de Erlangen por su excelente apoyo técnico.

Este trabajo fue apoyado por el DZHK (Centro Alemán de Investigación Cardiovascular), por el Centro Interdisciplinario de Investigación Clínica (IZKF) en el Hospital Universitario de la Universidad de Erlangen-Núremberg, y la Universidad erlangen-Núremberg.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
2,3-butanedionemonoxime Carl Roth 3494.1 Purity>99%
Bovine serum albumin Carl Roth 163.2
CaCl2 Carl Roth 5239.2
Creatine monohydrate Alfa Aesar B250009
Glucose Merck 50-99-7
HEPES Carl Roth 9105.3
KCl Carl Roth P017.1
KH2PO4 Carl Roth 3904.2
L-glutamic acid Fluka Biochemica 49450
Low melting-point agarose Carl Roth 6351.5
MgCl2 x 6H2O Carl Roth A537.1
MgSO4 Sigma Aldrich M-7506
NaCl Carl Roth 9265.1
NaHCO3 Carl Roth 8551.2
Paraformaldehyde Sigma Aldrich P6148
Taurine Sigma Aldrich T8691
Dyes
Di-8-ANEPPS Thermo Fisher Scientific D3167
Fluo-4 AM Thermo Fisher Scientific F14201
FluoVolt Thermo Fisher Scientific F10488
Enzymes
Collagenase CLS type I Worthington LS004196 Used for human tissue at 4 mg/mL
(activity: 280 U/mg)
Collagenase CLS type II Worthington LS004176 Used for rat tissue at 1.5 mg/mL
(activity 330 U/mg)
Protease XIV Sigma Aldrich P8038 Used for rat tissue at 0.5 mg/mL
(activity ≥ 3.5 U/mg)
Proteinase XXIV Sigma Aldrich P5147 Used for human tissue at 0.5 mg/mL
(activity: 7-14 U/mg)
Material
Cell analyzer (LSR Fortessa) BD Bioscience 649225
Centrifuge tube, 15 mL Corning 430790
Centrifuge tube, 50 mL Corning 430829
Compact shaker Edmund Bühler KS-15 B control Agitation direction: horizontal
Disposable plastic pasteur-pipettes Carl Roth EA65.1 For cell trituration use only pipettes with an inner tip diameter ≥2 mm
Forceps FST 11271-30
Heatblock VWR BARN88880030
Nylon net filter, 180 µm Merck NY8H04700
TC Dish 100, Standard Sarstedt 83.3902
TC Dish 35, Standard Sarstedt 83.3900
TC Dish 60, Standard Sarstedt 83.3901
Vibratome (VT1200S) Leica 1491200S001 Includes VibroCheck for infrared-assisted correction of z-deflection

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Aislamiento de cardiomiocitos ventriculares humanos de rebanadas de miocardio de corte de vibratome
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Fiegle, D. J., Volk, T., Seidel, T.… More

Fiegle, D. J., Volk, T., Seidel, T. Isolation of Human Ventricular Cardiomyocytes from Vibratome-Cut Myocardial Slices. J. Vis. Exp. (159), e61167, doi:10.3791/61167 (2020).

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