Summary
Sunulan vibratome kesilmiş miyokardiyal dilimlerden insan ve hayvan ventriküler kardiyomiyosit izolasyon için bir protokoldür. Kalsiyuma dayanıklı hücrelerin yüksek verimi (200 hücre/mg'a kadar) az miktarda dokudan (<50 mg) elde edilebilir. Protokol soğuk iskemiye maruz kalan miyokardiyum için 36 saate kadar geçerlidir.
Abstract
Ventriküler kardiyak miyositlerin hayvan ve insan kalplerinden izole edilmesi kardiyak araştırmalarda temel bir yöntemdir. Hayvan kardiyomiyositler genellikle sindirim enzimleri ile koroner perfüzyon ile izole edilir. Ancak, insan kardiyomiyositleri izole etmek zordur çünkü insan miyokardiyal numuneler genellikle koroner perfüzyona izin vermez ler ve alternatif izolasyon protokolleri canlı hücrelerin verimlerinin düşük olmasıyla sonuçlanır. Buna ek olarak, insan miyokardiyal örnekler nadirdir ve sadece düzenli olarak yerinde kalp cerrahisi olan kurumlarda mevcuttur. Bu da bulguların hayvandan insan kardiyomiyositlerine çevrilmesini engellemektedir. Burada açıklanan insan ve hayvan miyokardiyum ventriküler miyositlerin verimli izolasyon sağlayan güvenilir bir protokoldür. Hücre hasarını en aza indirirken yüzey-hacim oranını artırmak için miyokard doku dilimleri 300 m kalınlığında miyokardiyal örneklerden vibratom ile üretilir. Doku dilimleri daha sonra proteaz ve kollajenaz ile sindirilir. Sıçan miyokardiyum protokolü kurmak ve akış-sitometrik hücre sayımı ile uygulanabilir, kalsiyuma dayanıklı miyositlerin verimlerini ölçmek için kullanılmıştır. Yaygın olarak kullanılan doku-öbek yöntemi ile karşılaştırıldığında çubuk şekilli kardiyomiyositlerin (41.5 ± 11.9 vs. %7.89 ± %3.6, p < 0.05) önemli ölçüde daha yüksek verimi saptandı. Protokol, verimin fare miyokardiyumundakine benzer olduğu ve yine doku-öbek yöntemine göre belirgin bir şekilde daha yüksek olduğu başarısız ve başarısız olmayan insan miyokardiyumuna çevrildi (45.0 ± 15.0 vs. 6.87 ± 5.23 hücre/mg, p < 0.05). Özellikle sunulan protokol ile makul sayıda insan kardiyomiyositini (9-200 hücre/mg) az miktarda dokudan (<50 mg) izole etmek mümkündür. Bu nedenle, yöntem hem insan hem de hayvan kalplerinden sağlıklı ve başarısız miyokardiçin geçerlidir. Ayrıca, soğuk kardiyoplejik solüsyonda 36 saate kadar saklanan insan doku örneklerinden uyarılabilir ve kontraktil miyositleri izole etmek mümkündür ve bu yöntem, yerinde kalp ameliyatı olmayan kurumlardaki laboratuvarlar için özellikle yararlı hale getirilmektedir.
Introduction
Kardiyomiyosit fizyolojisi içine önemli anlayışlar için yol açtı bir seminal tekniği bozulmamış kalplerden yaşayan ventriküler kardiyomiyositizolasyonolduğunu 1. İzole kardiyomiyositler normal hücresel yapı ve fonksiyon, ya da in vivo deneylerin sonuçlarını incelemek için kullanılabilir; örneğin, kardiyak hastalığın hayvan modellerinde hücresel elektrofizyoloji veya uyarma-daralma kaplin değişiklikleri değerlendirmek için. Ayrıca, izole kardiyomiyositler hücre kültürü, farmakolojik müdahaleler, gen transferi, doku mühendisliği ve diğer birçok uygulama için kullanılabilir. Bu nedenle, kardiyomiyosit izolasyonu için etkili yöntemler temel ve çevirisel kardiyak araştırmalar için temel değere dayanır.
Kemirgenler gibi küçük memelilerden ve domuz lar veya köpekler gibi daha büyük memelilerden gelen kardiyomiyositler, genellikle kalbin koroner perfüzyonu ile ham kollajenler ve/veya proteazlar içeren çözeltiler ile izole edilir. Bu kardiyomiyosit izolasyoniçin "altın standart" yöntemi olarak tarif edilmiştir, canlı hücrelerin% 70'e kadar verimleri sonuçlanan2. Yaklaşım aynı zamanda kabul edilebilir kardiyomiyosit verimleri 33sonuçlanan,insan kalpleri ile kullanılmıştır ,4,5. Ancak, koroner perfüzyon sadece sağlam kalp veya koroner arter dalı içeren büyük bir miyokardkin kama mevcut olduğunda mümkün olduğundan, çoğu insan kardiyak örnekleri küçük boyutu ve uygun vaskülatür eksikliği nedeniyle bu yaklaşım için uygun değildir. Bu nedenle, insan kardiyomiyositizolasyon zordur.
İnsan miyokardiyal örnekler çoğunlukla değişken boyutta doku parçaları oluşur (yaklaşık 0.5 x 0.5 x 0.5 cm için 2 x 2 x 2 cm), endomiyokardiyal biyopsiler ile elde6, septal miektomiler7, VAD implantasyonları8, veya eksplant kalpler9. Kardiyomiyosit izolasyonu için en yaygın prosedürler makas veya neşter kullanarak doku kıyma ile başlar. Hücre-hücre temasları daha sonra kalsiyumsuz veya düşük kalsiyum tamponlar daldırma tarafından bozulur. Bunu, proteazlar (örneğin, tripsin), kollajenaz, hyaluronidaz veya elastaz gibi ham enzim ekstreleri veya saflaştırılmış enzimler ile birden fazla sindirim adımı takip eder ve bu da ekstrasellüler matriksin parçalanması ve kardiyomiyositlerin serbestleşmesiile sonuçlanır. Son, kritik bir adımda, fizyolojik kalsiyum konsantrasyonu dikkatle restore edilmelidir, ya da hücresel hasar kalsiyum-paradoks10nedeniyle oluşabilir,11,12. Bu izolasyon yaklaşımı kullanışlıdır ancak genellikle verimsizdir. Örneğin, bir çalışmada yaklaşık 1 g miyokardiyal doku sonraki deneyler için uygun kardiyomiyosit yeterli sayıda elde etmek için gerekli olduğunu bulundu13. Düşük verim için olası bir nedeni doku kıyma nispeten sert bir yöntemdir. Bu miyositler enzimatik sindirim tarafından serbest olma olasılığı en yüksek olmasına rağmen bu özellikle yığın kenarlarında bulunan kardiyomiyositler zarar verebilir.
İnsan örneklerinden elde edilen hücrelerin izolasyon verimliliğini ve kalitesini etkileyebilecek bir diğer husus da doku iskemi süresidir. Çoğu protokol, iyi sonuçlar için bir ön koşul olarak laboratuvara kısa ulaşım süreleri söz. Bu, insan ventriküler kardiyomiyositlerin çalışmasını yakındaki kalp cerrahisi tesisleri olan laboratuvarlarla sınırlandırmaktadır. Birlikte, bu kısıtlamalar insan kardiyomiyositlerde hayvan modellerinden elde edilen önemli bulguların doğrulanmasını engellemektedir. Bu nedenle, düşük miktarda dokudan yüksek kardiyomiyosit verimi sağlayan, tercihen uzun taşıma sürelerinden sonra ciddi hasar olmadan geliştirilmiş izolasyon protokolleri tercih edilir.
Burada açıklanan bir vibratom14,,15ile oluşturulan ince miyokard doku dilimleri enzimatik sindirim dayalı bir izolasyon protokolüdür. Doku dilimlerinden izolasyonun makasla doğrama dan çok daha verimli olduğunu gösteriyoruz. Açıklanan yöntem sadece miyokard dokusunun küçük miktarlarda canlı insan kardiyomiyosityüksek verimleri için izin verir ama aynı zamanda depolanan veya soğuk kardiyoplejik çözelti taşınan örnekler için de geçerlidir 36 saat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Farelerle yapılan tüm deneyler Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi Mittelfranken, Bavyera, Almanya tarafından onaylandı. İnsan kardiyak doku örneklerinin toplanması ve kullanımı Erlangen-Nürnberg Üniversitesi ve Ruhr-Üniversitesi Bochum Kurumsal İnceleme Kurulları tarafından onaylanmıştır. Çalışmalar Helsinki Bildirgesi'ne göre yürütülmüştür. Hastalar doku toplamadan önce yazılı bilgilendirilmiş onay larını verdiler.
Dişi Wistar sıçanları (150-200 g) ticari olarak elde edildi, 100 mg/kg tiopental-sodyum intraperitoneal enjekte edilerek anestezi yapıldı ve servikal çıkış ve ardından kalp torakotomi ve eksizyonu ile ötenazi yapıldı. İnsan kardiyak doku örnekleri mekanik yardımcı cihazların implantasyonu sırasında sol-ventrikül apikal çekirdekten, septal miektomiden, Fallot düzeltici cerrahi tetralojisi veya eksplant kalplerin serbest sol-ventriküler duvarından alındı. Aşağıdaki protokol, insan ventriküler dokusundan izolasyon açıklar. Sıçan kardiyomiyositlerinin izolasyonu buna göre, ancak farklı enzimlerle gerçekleştirildi (bkz. Malzemeler Tablosu). Protokolün şematik iş akışı Şekil 1'degösterilmiştir.
1. Tamponların, çözeltilerin ve enzimlerin hazırlanması
- Tablo 1'delistelenen arabellek ve çözümleri hazırlayın.
- Isınma çözeltileri 1, 2, 3 ve modifiye Tyrode çözeltisi 37 °C' ye ısıtın. Kesme çözeltisini kullanıma kadar 4 °C'de saklayın.
NOT: 1-2 miyokardiyal dilim için 35 mm doku kültürü çanağı nın izolasyonu için toplam 15 mL, 8 mL ve 5 mL çözelti 1, 2 ve 3 mL'dir. Birden fazla tabakta eşzamanlı miyosit izolasyonları için buna göre ölçeklendirin. Kesme çözeltisi dondurularak -20 °C'de aylarca saklanabilir. - Tartmak 1 mg proteinaz XXIV (Malzemeler Tablosubakınız) önceden aşınmış 15 mL santrifüj tüp içine ve kullanıma kadar buz üzerinde saklayın. Bu, bir numuneyi işlemek içindir. Miktarı buna göre ölçeklendirin. Proteinaz ve kollajenaz karışımı etmeyin.
- Tartmak 8 mg kollajenaz CLSI (Malzemeler Tablosubakınız) önceden itil 15 mL santrifüj tüp içine ve kullanıma kadar buz üzerinde saklayın. Bu, bir numuneyi işlemek içindir. Miktarı buna göre ölçeklendirin. Proteinaz ve kollajenaz karışımı etmeyin.
DİkKAT: Enzim tozunun solunmasını önlemek için yüz maskesi takın veya duman kaputunun altında çalışın.
NOT: Enzim aktivitesi farklı kuralarda değişiklik gösterebilir. Bu nedenle, optimal konsantrasyon farklı olabilir ve her yeni satın alınan enzim16ile belirlenmelidir.
2. Miyokardiyal dokunun depolanması ve taşınması
- İnsan kardiyak örneklerini soğutulmuş, 4 °C kesme çözeltisinde saklayın ve nakledin (Tablo 1).
- Daha fazla doku işleme ve vibratome dilimleme için aynı çözeltiyi kullanın.
NOT: Biyopsiler ve cerrahi kalp örnekleri hemen 4 °C'de kesme çözeltisine aktarılmalı ve bu protokol uygulanmadan önce 4 °C'de en fazla 36 saat saklanabilir veya taşınabilir.
3. Doku ların işlenmesi ve dilimlenmesi
NOT: Doku dilimleme protokolü Fischer ve ark.15izler.
- Doku bloğunun budama
DİkKAT: İnsan kardiyak dokusu potansiyel olarak bulaşıcıdır. Her zaman koruyucu aşınma kullanın ve kurumunuzun güvenlik yönetmeliklerine uyun. Kullanılmış bıçakları dikkatlice talın ve emniyet kaplarına atın.- Numuneyi 20 mL soğuk kesme solüsyonu yla dolu 100 mm'lik doku kültürü kabına yerleştirin ve soğutulmuş, 4 °C'lik bir tabla tutun.
- Bir neşter ile aşırı fibrotik doku ve epikardiyal yağ çıkarın. Transmural bir örnek olması durumunda, endokardiyumyakınında trabeculae ve doku tabakalarını çıkarın.
NOT: Fibrotik doku sert ve beyaz görünür. Yağ genellikle yumuşak ve sarı beyaz görünür. Trabekül ve endokardiyal doku tabakaları gevşek doku bileşimlerinden ve epikardiyal tabakaların miyokardiyumuna göre hizalanmamış lif oryantasyonlarından saptanabilir. - Optimum vibratom işleme için, yaklaşık 8 mm x 8 mm x 8 mm dikdörtgen doku bloklarını daha büyük bir doku örneğinden neşterle kesin. Küçük biyopsiler için bu adımı atlayın ve agarose katıştırma hareket.
- Kardiyak dokunun düşük erime noktası agarose içine gömüşme
- Bir cam kabında kesme çözeltisinin 10 mL'sinde 400 mg düşük erime noktası agarose kaynatın.
DİkKAT: Yanıkları önlemek için eldiven ve güvenlik gözlüğü takın. Sıcak cam eşyaları sadece ısıyalıtımı ile takın. - 10 mL'lik bir şırıngayı sıcak, çözünmüş agarose jelle doldurun. Şırıngayı kapatın ve agarose'un 37 °C'lik su banyosunda en az 15 dakika boyunca dengede durmasını bekleyin.
- Kesilmiş kardiyak numuneyi veya biyopsiyi epikardiyum aşağı bakacak şekilde temiz bir 35 mm doku kültürü yemeğine yerleştirmek ve steril bir bezle fazla sıvıyı çıkarmak için terlikler kullanın.
- Şırıngayı boşaltarak doku üzerine dengede olan agarose'u (adım 3.2.2) dökün. Agarose dökülürken forceps ile hareket karşı doku güvenli. Doku tamamen agarose batırılmış olduğundan emin olun.
- Hemen buz üzerine çanak yerleştirin ve agarose 10 dakika boyunca katılaşmak sağlar.
- Bir cam kabında kesme çözeltisinin 10 mL'sinde 400 mg düşük erime noktası agarose kaynatın.
- Miyokardisini dilimleme
- Vibratomun bıçak tutucuya yeni bir jilet takın ve mümkünse bıçağın z-sapmasını ayarlayarak vibratomu kalibre edin.
NOT: Bu protokol, bıçağı yatay bir pozisyonda en az z-sapma (ölçülen sapma <0,1 μm) hizalamak için kızılötesi destekli kalibrasyon cihazı ile bir vibratom kullanır. - Vibratom numune sahibi neşter bir agarose-doku bloğu çıkarmak için bir neşter kullanın. İstikrar sağlamak için, dokunun hala yeterince agarose (agarose marjları ≥ 8 mm) batırılmış olduğundan emin olun.
- Agarose bloğunu ince bir siyanoakrilat tutkal ve hafif basınç tabakası ile numune tutucuya sabitleyin.
- Numune tutucuyu dokuile birlikte vibratom banyosuna yerleştirin. Banyoyu kesme çözeltisi ile doldurun ve vibratomun dış soğutma tankına doldurulmuş ezilmiş buzla işleme boyunca 4-6 °C'de tutun.
- ≤0,1 mm/s ilerleyen hıza, 80 Hz'lik salınım frekansına, yanal genlik 1,5 mm'ye ve 15°'lik bıçak açısına sahip 300 μm kalınlığında dilimler oluşturun. Dilimleri tutarken, doku hasarı önlemek için doku kendisi yerine agarose tutun. Dilimleri kesme çözeltisindeki 4 °C'de gerekirse en fazla 2 saat saklayın.
NOT: Kardiyomiyositler epikardiyuma paralel olarak yönlendirilir. Bu nedenle aşırı miyosit hasarından kaçınmak için epikardyuma paralel olarak kesilmesi önemlidir. Yalıtım için yalnızca tek tip sabit kalınlıkta dilimler kullanılması gerektiğinden, ilk 1-3 dilimin atılması önerilir. Küçük doku biyopsileri için, ancak, sadece ilk dilim atın. - 40-100x büyütme ile standart bir ışık mikroskobu altında kardiyomiyosit hizalama kontrol edin.
- Vibratomun bıçak tutucuya yeni bir jilet takın ve mümkünse bıçağın z-sapmasını ayarlayarak vibratomu kalibre edin.
4. Doku sindirimi
- Isı plakasını laboratuvar çalkalayıcısının üzerine yerleştirin ve 37 °C'ye ısıtın. Laboratuvar çalkalayıcısını 65 rpm'de başlatın.
- Proteinazı (adım 1.3'te hazırlanmış) çözelti 1'in 2 mL'sinde (adım 1.1 ve 1.2) eritin ve kullanıma kadar 37 °C'de kuluçkaya yatırın. Proteinaz ve kollajenaz karışımı etmeyin.
- Kollajenazi (adım 1.4'te hazırlanmış) çözelti 1'in 2 mL'sinde (adım 1.1 ve 1.2) eritin ve kullanıma kadar 37 °C'de kuluçkaya yatırın. Proteinaz ve kollajenaz karışımı etmeyin.
DİkKAT: Koruyucu gözlük ve eldiven giyin, çünkü çözünmüş enzimler cilt ve göz yaralanmalarına neden olabilir. - 5 μM'lik son konsantrasyona kalsiyum klorür (CaCl2)içeren çözeltiye (adım 4.3'te hazırlanmış) ekleyin.
- Vibratom banyosundan bir doku dilimini 5 mL önceden soğutulmuş kesme çözeltisi (adım 1.1 ve 1.2) ile dolu temiz 60 mm doku kültürü kabına aktarmak için forseps kullanın ve buzüzerinde tutun.
- Dikkatle bıçak veya forceps ile miyokardiyal dokudan agarose çıkarın.
NOT: Kardiyomiyositlere zarar verebileceğinden miyokard idilimlerinde aşırı gerginlikten ve kesme stresinden kaçının. - İlk yıkamayı gerçekleştirmek için, ısı plakasına temiz bir 35 mm doku kültürü çanak yerleştirin ve önceden ısıtılmış (37 °C) çözeltisi 1 2 mL ile doldurun. 1-2 miyokardiyal dilimi forceps ile hazırlanan tabağa aktarın. Çözeltiyi 1 mL pipetle aspire edin ve kesme çözeltisinin kalıntılarını gidermek için yıkama adımlarını 2 kat yapın.
NOT: Kardiyak dilimleri aspire etmeyin. Çözeltiler ve dilimler ajite ısı plakası üzerinde 35 °C sabit sıcaklıkta kalmalıdır. Gerekirse ısı levhası sıcaklığını ayarlayın. - Çözelti 1'i yemekten çıkarın ve proteinaz çözeltisinin 2 mL'sini ekleyin (adım 4.2). 65 rpm ısı plakaüzerinde 12 dakika kuluçka.
- 2 x önceden ısıtılmış çözelti 1 (37 °C) 2 mL ile yıkayın.
- Çözelti 1'i yemekten çıkarın ve 2 mL kollajenaz çözeltisi ekleyin (4.3 ve 4.4. adım). 65 rpm'de ısı plakasında en az 30 dk kuluçkaya yat.
- 30, 35, 40 dk, vb ücretsiz bireysel miyositler için kontrol edin, hafif bir mikroskop altında çanak yerleştirerek. Çözeltinin önemli ölçüde soğutulmasını önlemek için hızlı bir şekilde çalışın.
NOT: Gerekli sindirim süresi doku yapısına ve fibrozis derecesine bağlı olarak değişebilir. Doku gözle görülür şekilde yumuşadığında ve nazikçe çekildiğinde kolayca ayrıştırılır, en uygun sindirim süresine ulaşılmıştır. Yeterli doku varsa, birkaç dilim değişen sindirim süreleri paralel olarak sindirilebilir. - Doku sindirildiğinde ve bireysel miyositler görünür olduğunda (adım 4.11), önceden ısıtılmış çözelti 2 mL 2 (37 °C) ile 2 x yıkayın ve 2 mL ile tekrar doldurun.
5. Doku dissociasyonu
- Dikkatle lifleri çekerek forceps ile sindirilmiş doku dilimleri ayrıştırın.
- Tek kullanımlık Pasteur pipet (açma çapı >2 mm) ile birkaç kez incelikle.
NOT: Forceps ve pipetleme kullanımı mekanik strese neden olabilir ve kardiyomiyosit hasarına neden olabilir. Ancak, hücrelerin ayrılması için önemli bir adımdır. Hücre hasarını en aza indirmek ve dilimleri dikkatlice küçük parçalara ayırmak için ince çerkeçler kullanın. - Işık mikroskobu altında kurtarılmış çubuk şeklindekardiyositler kontrol edin.
6. Fizyolojik kalsiyum konsantrasyonunun yeniden başlatılması
- Isı plakası üzerinde 35 °C'de ajitasyon yaparken kalsiyum konsantrasyonu yavaş yavaş 5 μM'den 1,5 mM'ye yükseltin. 10 mM ve 100 mM CaCl2 stok çözeltisi kullanın. Önerilen adımlar: 20, 40, 80, 100, 150, 200, 400, 800, 1.200, 1.500 μM. Hücrelerin her adım arasında 5 dk kuluçka aralıklarında artan kalsiyum seviyelerine uyum sağlamasına izin verin.
- Sindirilmemiş doku parçalarını forceps ile dikkatlice çıkarın veya kalsiyum artışının sonunda 180 μm gözenek boyutuna sahip bir naylon kafes aracılığıyla hücre süspansiyonfiltre.
7. Mekanik ayırma maddesinin çıkarılması
- Ajitasyonu durdurun ve çözeltinin üçte birini (~700 μL) 1.000 μL'lik pipetle üstten yavaşça çıkarın. Kardiyomiyositlerin aspirasyonundan kaçının.
NOT: Sindirilmemiş doku çıkarılırsa, kardiyomiyositler kabın merkezinde birikir ve bu da hücresiz çözeltinin aspirasyonunu kolaylaştırır. Yoksa, hücre çözeltisini 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın ve hücrelerin 35 °C'de 10 dakika boyunca tortulanmasına izin verin, ardından supernatantın 700 μL'ini aspire edin ve hücreleri atın, yeniden askıya alın, 35 mm'lik doku kültürü yemeğine aktarın ve adım 7.2'ye geçin. - Hücrelere 700 μL çözelti 3 ekleyin, ısı plakasında ajitasyon devam ve 10 dakika kuluçka.
- 7.1 ve 7.2 adımlarını tekrarlayın.
- Çözeltiyi 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın ve kardiyomiyositlerin en az 10 dakika ve en fazla 30 dk oda sıcaklığında tortulanmasına izin verin veya 1 dk boyunca 50 x g'da döndürün. Supernatant'ı tamamen çıkarın ve modifiye Tyrode'un çözeltisinde veya istenen deneme arabelleğinde yeniden askıya alın.
NOT: Kardiyomiyositler kullanılmadan önce modifiye Tyrode çözeltisinde(Tablo 1)37 °C'de birkaç saat ve %5 CO2'de saklanabilir. - 40x ve 200x büyütme standart bir ışık mikroskobu ile hücre kalitesini doğrulayın.
NOT: Kardiyomiyositlerin yaklaşık %30-50'si çubuk şeklinde, membran blebs olmadan pürüzsüz olmalı ve açık çapraz striations gösterilmelidir. Canlı hücrelerin sadece %5-10'u spontan kasılmalar göstermelidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
İzolasyon verimliliğini doğrulamak için protokol fare miyokardiyumile kullanıldı ve elde edilen canlı miyosit sayısı koroner perfüzyon yoluyla izolasyon ve küçük doku parçalarından izolasyon (parça izolasyonu, Şekil 2). Aynı kalplerden öbek izolasyonu ve doku dilimlerinden izolasyon yapıldı. Ancak koroner perfüzyon yoluyla izolasyon için tüm kalp kullanılmıştır. Koroner perfüzyon ağırlıklı olarak çubuk şeklinde ve çapraz striated kardiyomiyositler verdi. Miyokardiyal dilimlerden izolasyonlarla çubuk şeklinde ki hücrelerin daha düşük bir oranı gözlenmiştir, ancak toplam sayı hala yüksekti. Buna karşılık, doku parçalarından izolasyon dan sonra, sadece birkaç çubuk şeklinde hücreler kurtarıldı (Şekil 2A). Sonuçları nicel olarak karşılaştırmak için akış sitometrisi kullanılmıştır. Göreceli olarak büyük boyutları ve çapraz striasyonu nedeniyle, kardiyomiyositler genellikle hem ileri hem de yan dağılım için büyük değerler gösterirler. Bu özellikler, akış sitometrik hücre analizörü ile çubuk şeklindeki miyositleri saymak için kullanıldı, hipersözleşmeli ve yuvarlak kardiyomiyositlerden çubuk şeklinde ayrım yapan basit bir gating şeması uygulandı. (Ek Şekil 1). Temsili nokta arsalar tasvir edilir Şekil 2B. İstatistiksel analizler, dilimlerden izolasyon için kardiyomiyosit kapısı CM1'de doku parçalarından (sırasıyla 41,5 ± 11,9 vs. %7,89 ± %3,6; n =3 izolasyonlar; p < 0.05, paired two-tailed t-test). As expected from visual inspection, coronary perfusion yielded the highest counts, with 71.0 ± 9.4% (n = 3 isolations; p < 0.05, unpaired two-tailed t-test) (Şekil 2C). Böylece, doku dilimlerinden kardiyomiyosit izolasyonu koroner perfüzyon ile elde edilen verim ulaşmaz, ancak doku parçalarından izolasyon daha çubuk şeklinde miyosit çok daha fazla sayıda sonuç, sonraki deneyler için yeterli hücre sağlayan. Hücre sayısına ek olarak sıçan kardiyomiyositlerinin yapısal parametreleri de ölçüldü. Hücre uzunluğu, hücre genişliği ve sarcomere uzunluğu perfüzyon veya doku dilimlerinden izole edilen hücrelerde farklı değildi (uzunluk = 110.0 ± 5.4 μm vs. 99.4 ± 3.2 m, p > 0,05; genişlik = 33.9 ± 1.9 μm vs. 30.6 ± 1.2 μm, p > 0.05, sırasıyla n = 19 ve n = 21 hücreler için; sarcomere uzunluğu = 1.62 ± 0.04 μm vs. 1.68 ± 0.04 μm, p = 0.28, n = 24 ve n = 23 hücreleri (Ek Şekil 2A–C). Elektriksel alan stimülasyonuna maruz kalan Fluo-4 yüklü miyositlerin kullanılması17 fonksiyonel parametreler de değerlendirildi (Ek Şekil 2D–F). Ortalama aktivasyon süresi (27.5 ± 1.5 vs. 23.6 ± 2.5 ms, n = 100 vs. n = 31 hücre; perfüzyon vs. dilim, p > 0.05) (Ek Şekil 2D) ve bağıl kısaltma (12.2 ± 1.1 vs. 11.3 ± %2.5, n = 42 vs. n= 7 hücre, perfüzyon vs. dilim, p > 0.05) (Ek Şekil 2F) stimülasyona yanıt veren kardiyomiyositlerin iki grup arasında anlamlı farklılık yoktu. Kalsiyum geçici genlik (maksimal normalleştirilmiş Ca2+, F/F0) (Ek Şekil 2E) perfüzyon la izole edilen kardiyomiyositlere göre dilimlerden izole edilen kardiyomiyositlerde biraz artırıldı (4.9 ± 0.2 vs. 5.7 ± 0.3, n = 104 vs. n = 25 hücre, perfüzyon vs dilim, p < 0.05). Although the fraction of rod-shaped cardiomyocytes responding to electrical stimulation was approximately 15% higher in preparations obtained by perfusion, the majority of cells was also excitable in preparations from tissue slices (74.3 ± 4.2% vs. 62.1 ± 2.9%, perfusion vs. slice, p < 0.05, ten fields of view, 452 vs. 276 counted cells, respectively) (Ek Şekil 2G). Ekimsonrası hücre kalitesini değerlendirmek için hücre kültüründe 48 saat sonra elektriksel alan stimülasyonuna yanıt olarak daralan miyosit yüzdesi belirlendi17. Yanıt veren hücrelerin fraksiyonu her iki grupta da yaklaşık yarı yarıya azaltıldı (41.9 ± %3.6 vs. %31.5 ± %2.3, perfüzyon vs. dilim, p < 0.05, 10 fields of view, n = 371 vs. n = 329 counted cells, respectively) (Ek Şekil 2H).
Daha sonra protokol insan miyokardiyumuna uygulandı. Doku dilimlerinden elde edilen çubuk şeklinde ve canlı izole edilmiş insan ventriküler kardiyomiyosit sayısı, aynı miyokardiyal örneklerin doku parçalarından elde edilen sayı ile eş zamanlı olarak karşılaştırıldı(Şekil 3). Miyokardiyal dilimlerden izolasyonun büyük oranda çubuk şeklinde ve yuvarlak kardiyomiyositlerin sadece küçük bir kısmını verdiğini bulduk(Şekil 3A). Geniş alan görüntülerinden çubuk şeklindeki miyositleri saydık ve izolasyon için kullanılan ıslak doku ağırlığıile sayılarını normalleştirdik. Sayısallaştırma, miyokardiyal dilimlerden izolasyonun doku parçalarından (45.0 ± 15.0 vs. 6.87 ± 5.23 hücre/mg, n = 7 izolasyon, p < 0.05, eşleştirilmiş iki kuyruklu t-testi)(Şekil 3B)daha çarpıcı derecede daha yüksek sayıda çubuk şeklinde miyosit eki olduğunu göstermiştir. Ayrıca, canlılık bir MTT canlılık test14ile değerlendirildi , hücre lisat proteininin toplam miktarı fotometrik formazan emilimini normale. Fotometrik nicelik, miyokardiyal dilimlerden izolasyon sonrası önemli ölçüde daha yüksek bir miyosit canlılığını doğruladı (4.76 ± 0.47 vs. 1.09 ± 0.18 AU, n = 3 izolasyonlar, p < 0.05, eşleştirilmiş iki kuyruklu t-testi)(Şekil 3C).
Toplamda 30 insan kalbinin miyokardiyal örneklerine uygulandı ve taşıma süreleri 36 saate kadar çıktı. Sonraki deneyler için 30 numunenin canlı hücrelerinden 23'ü elde edilmiştir (ayrıca bkz. Ek Tablo 1). Başarısız bir deneyin bir örneği (yani, <100 hücre/ çanak başına) Ek Şekil 3'tegösterilmiştir. Burada, çoğu hücreli yüksek ekstrasellüler kalsiyum ve hipercontracted tahammül etmedi. 14 izolasyondan miyositlerde kontraktiliti değerlendirdik ve iki durumda hücreler elektriksel uyarıma yanıt vermedi. Bu tekniğin sadece yetişkin kalplerden elde edilen büyük örneklerle değil, aynı zamanda çocuk kalplerinden elde edilen küçük biyopsilerle (40 mg kadar az) işe yaradığını unutmayın(Ek Şekil 4).
Tanımlanan protokol ile izole edilen insan hücrelerinin yapısal analize tabi tutulabilebileceğini göstermek için, sıçan miyosit1'de son zamanlarda açıklanan bir boyama yöntemine göre alfa-aktin, EC kaplin proteinleri L-tipi kalsiyum kanalı (LTCC) ve ryanodinreseptörü (RyR) ile hücre zarı ve çekirdekleri ile lekelenmiştir( Şekil 4). Alfa-aktinin boyamada yoğun, düzenli z-line deseni ve istirahat kardiyomiyositlerinde ortalama sarcomere uzunluğu 1.92 ± 0.06 m saptandı (n = 4, Şekil 4A). LTCC ve RyR açık kümeler gösterdi ve beklendiği gibi hücre zarı ve t-tübüllerin yakınında kolokalize edildi (Şekil 4B).
Potansiyometrik boya FluoVolt18 ve kalsiyuma duyarlı boya Fluo-417, tanımlanan protokolle izole edilen insan kardiyomiyositlerinin heyecan verici olduğunu ve hücresel elektrofizyoloji veya uyarma-kontraksiyon kaplini üzerine çalışmalarda kullanılabileceğini göstermek için kullanılmıştır(Şekil 5). Eylem potansiyeli (AP) şekli ve süresi analiz edildi (Şekil 5A,B). %50 ve %90 AP süresi (APD50: 400.6 ± 41.1 ms, APD90: 748.9 ± 56.6 ms, n = 10 hücre) değerleri, başarısız insankalplerinden4,6,7,9ventriküler kardiyomiyositler için başkaları tarafından bildirilen aralıktaydı. Fluo4 yüklü hücrelerin konfokal hat taraması ile kaydedilen kalsiyum geçici leri(Şekil 5C,D)stimülasyon sonrası net bir upstroke ve kabul edilebilir bir sinyal-gürültü oranı gösterdi. Kalsiyum geçici genliği (maksimum F/F0)2.9 ± 0.5 (n = 31 hücre) idi. Kasılsım ile kardiyomiyosit kısalması ortalama 4.6 ± 0.8% (n = 31 hücre) olan alt hücre sınırının sapması örnekte görülebilir.
Şekil 1: İzolasyon protokolünün insan kardiyak doku dilimlerinden iş akışı. İnsan miyokardisinden gelen doku blokları veya biyopsiler (sol üstte) düşük erime noktası agarose'a gömülür ve 300 μm kalınlığında dilimler vibratomun salınım lı bıçağıyla (üst orta) oluşturulur. Dilimler bir kültür yemeğine aktarılır ve çevredeki agarose 'dan (sağ üstten) çıkarılır. Doku sindirimi ~ 35 °C ve 65 rpm ısıtmalı ve ajite plaka (orta, sol) ve içerir: (adım 4.8) Nominal kalsiyum içermeyen çözelti proteinaz ile takviye kuluçka, (adım 4.10) Kollajenaz ile ekstrasellüler matriks sindirim, (adım 5) ayrı kardiyomiyositlerin çözünürasyonu ve serbest bırakılması ve pipetting. (adım 6) Hücre dışı kalsiyum konsantrasyonunun 5 dk. aralıklarla 5 μM'den 1,5 mM'ye yavaş yükselmesi (adım 7) Mekanik uncoupler 2,3-butanedione monoxime (BDM) adım adım çıkarılması. Çubuk şeklinde ve çapraz striated insan kardiyomiyositler alınır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Kardiyomiyosit miyokard idilim, perfüzyon ve parça izolasyonu verimleri. (A) Koroner perfüzyon (Perfüzyon), vibratom kesim dokudan (Miyokardiyal dilimler) veya kıymalı dokudan (Doku parçaları) izole edilen sıçan kardiyomiyositlerinin temsili ışık mikrografları. (B) A'datanımlanan kardiyomiyosit izolasyonlarından ilgili temsili akış sitometri nokta plotları . Yan dağılım alanı (SSC-Area) ve ileri dağılım alanı (FSC-Area) sırasıyla hücresel granüler ve boyut göstergesi olarak kullanılmıştır. Kardiyomiyositler için CM1 kapısının gating şeması siyah çizgi ile gösterilir ve yüzde toplam sayıların ilgili kesirleri görüntülenir. (C) Grup başına n = 3 hücre izolasyonundan B'de açıklandığı gibi akış-sitometrik analizile değerlendirilen kardiyomiyositkitlerin (CM1) fraksiyonlarının ortalama ± standart hatası. Miyokardiyal dilimlerden ve doku parçalarından izolasyon aynı kalplerden (eşleştirilmiş iki kuyruklu t-testi) yapıldı. Perfüzyon ile izolasyon farklı hayvanların tüm kalplerinden yapıldı ve eşleşmemiş iki kuyruklu t-testi ile karşılaştırıldı. *p < 0.05, çoklu karşılaştırma düzeltmesi sonra. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Miyokardiyal dilimlerden ve kıyılmış doku parçalarından izolasyon sonrası insan kardiyomiyositlerinin verimve canlılığının karşılaştırılması. (A) Doku dilimlerinden izolasyon sonrası kalsiyuma dayanıklı insan ventriküler kardiyomiyositlerin temsili görüntüsü. Çubuk şeklinde ve triated kardiyomiyositler baskın (siyah ok), sadece birkaç yuvarlak ve hipersözleşmeli hücreleri (beyaz ok) ile vardır. (B) Miyokardiyal dilimlerden veya geniş alan mikrograflarından sayılan doku parçalarından izole edilmiş kalsiyum ayarı, çubuk şeklindeki miyositlerin sayısallaştırılması ve n = 7 eşleştirilmiş izolasyondan giriş materyalinin (miligram cinsinden) ıslak ağırlığına normalleştirilmiş. (C) MTT testinden sonra formazan boya emiciliğinin fotometrik ölçümü ile kardiyomiyosit canlılığının ölçülmesi. Absorbans, n = 3 eşleştirilmiş izolasyonlardan BCA tsayı ile değerlendirilerek toplam protein miktarına normalleştirildi. *p < 0.05, **p < 0.01 (eşleştirilmiş iki kuyruklu t-testi). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: İzolasyon sonrası insan kardiyomiyositlerinin mikroyapısal karakterizasyonu. (A) 4′,6-diamidin-2-fenilindol (DAPI, mavi) ile alfa-aktinin (yeşil) ve nükleer leke immünboyama sonra temsilcisi konfokal mikroskobik görüntü. Sarcomere uzunluğu 1.92 ± 0.06 μm (n = 4 miyosit) idi ve Fourier spektrumu analiz edildi. (B) L tipi kalsiyum kanalı (LTCC) ve kardiyak ryanodin reseptörü (RyR) için sabit bir insan ventriküler kardiyomiyosit koimmünosiyonu temsil imal eden konfokal mikroskobik görüntüler. RyR ve LTCC'nin (bindirme) bindirmesi ve ekstrasellüler matriksin buğday tohumu agglutinin (WGA, macenta) ile boyanarak boyanarak da gösterilmiştir. Çekirdekler DAPI (mavi) ile boyanmıştı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: İnsan ventriküler miyositlerde etki potansiyeli ve hücre içi kalsiyum geçicidir. (A) Potentiometric boya FluoVolt (yeşil, 488 nm uyarma dalga boyu) ile yüklü izole edilmiş bir insan kardiyomiyositiki boyutlu konfokal görüntü. Kırmızı kutu, 0.5 Hz. (B) Ortalama ve bazal normalleştirilmiş FluoVolt floresansı (F/F0)de elektriksel alan stimülasyonu sırasında hızlı bir çizgi taraması ile ölçülen t-tübüler sistemin bir unsurunu gösterir. A (C) Uzunlamasına hücre ekseni boyunca kalsiyuma duyarlı boya Flor-4 (488 nm uyarma dalga boyu) ile yüklü izole edilmiş bir insan kardiyomiyositinin çizgi tonu görüntüsü. Floresan yoğunluğu gri değerlerle gösterilir [AU] ve mavi noktalar taranan çizgi boyunca her pikselin floresan yoğunluğunun (dF/dtmax)maksimum yükselişini gösterir. Örnekleme hızı 529 Hz. (D) C'deki görüntüden taranan çizgi boyunca her pikselin floresan ortalaması ve uyarmadan önce temel değerlere normalleştirme (F/F0)ile elde edilen kalsiyum geçicidir. Tüm deneyler oda sıcaklığında yapıldı... Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Adı | Mmol/L kompozisyonu | Takviye -leri | Ph | mL'de gerekli hacim |
| Çözüm 1 | 20 KCl, 10 KH2PO4,10 MgCl2,10 glikoz, 70 glutamik asit, 20 taurin, 10 beta-hidroksibüte, 30 BDM | 2 mg/ml büyükbaş serum albumin | 7.3 KOH ile | 300 |
| Çözüm 2 | 20 KCl, 10 KH2PO4,10 MgCl2,10 glikoz, 70 glutamik asit, 20 taurin, 10 beta-hidroksibülinat, 0.005 CaCl2, 30 BDM | 10 mg/ml büyükbaş serum albumin | 7.3 KOH ile | 300 |
| Çözüm 3 | 20 KCl, 10 KH2PO4,10 MgCl2,10 glikoz, 70 glutamik asit, 20 taurin, 10 beta-hidroksibüte, 1.5 CaCl2 | 10 mg/ml büyükbaş serum albumin | 7.3 KOH ile | 300 |
| Modifiye Tyrode çözümü | 130 NaCl, 0.4 NaH2PO4, 5.8 NaHCO3, 5.4 KCl, 0.5 MgCl2, 1.5 CaCl2, 25 HEPES, 22 glikoz | 2 mg/ml büyükbaş serum albumin | % 5 CO2'de NaOH ile 7,3 | 100 |
| Kesme çözeltisi | 138 NaCl, 0.33 NaH2PO4,5.4 KCl, 2 MgCl2, 0.5 CaCl2, 10 HEPES, 10 glikoz, 30 BDM | 7.3 NaOH ile | 500 |
Tablo 1: Arabellekler ve Çözümler. Gerekli arabelleklerin ve çözümlerin bileşimi.
Ek Şekil 1: Kardiyomiyosit (CM1) gating şemasının doğrulanması. Akış sitometrisinden nokta çizimleri, perfüzyon izole sıçan kardiyomiyositlerinden (CTRL) bir kontrol numunesinde tespit edilen hücrelerin boyut ve taneciklerini gösteren ileri ve yan dağılım alanının (FSC-A, SSC-A) ölçülmesi ve aynı hazırlıktan kardiyomiyositlerin inkübasyondan sonra 37 °C'de modifiye Tyrode'un 100 mM kalsiyum (kalsiyum doz aşımı) içeren çözeltisinde 15 dakika. Yüksek ekstrasellüler kalsiyum hiperkontraksiyonve çubuk şeklinde kardiyomiyosit lerin yuvarlanma neden olur, hücrelerin bir azalma ile sonuçlanan (%87.6 vs. 6.00%) tanımlanan kapıda (CM1). Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil 2: Perfüzyon veya dilimlerden izole edilen kardiyomiyosit özellikleri. Hücre uzunluğu(A) ve hücre genişliği(B),perfüzyon yoluyla izolasyon dan sonra doğrudan sabit lenmiş sıçan kardiyomiyositlerinden veya mikroskopi ile miyokardiyal dilimlerden (sırasıyla n = 19 ve n = 21 hücre) saptandı. Sarcomere uzunluğu(C),alfa-aktinin ve Fourier analizi ile immünboyama sonrası mikroskobik görüntülerden (sırasıyla n = 24 ve n = 23 hücre) saptandı. Ortalama aktivasyon süresi(D), maksimum F/F0 (E) ve bağıl kısaltma(F)Perfüzyon veya miyokard ilerlemiyon ile izole edilen ve elektriksel stimülasyona yanıt veren Fluo-4 yüklü kardiyomiyositlerden (n = 100/31 miyosit D, n = 104/25 miyosit E ve n = 42/7 miyosit fsit) değerlendirildi. Çubuk şeklindeki kardiyomiyositlerin(G)elektrik stimülasyonuna bağlı olarak basılan fraksiyonu, çubuk şekilli hücrelerin toplam sayısı ve kontraktil hücrelerin on alanda standart ışık mikroskobunda 200x büyütme de sayılması ile değerlendirildi perfüzyon ve dilim izolasyonu (sırasıyla n = 452/276 hücreleri). (H) G'de yapılan ancak 48 saat ekimden sonra yapılan analiz (sırasıyla n = 371/329 hücre). Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil 3: Düşük verim ile insan kardiyomiyosit izolasyonu. Ağırlıklı olarak hipersözleşmeli (mavi) veya yuvarlak hücreler (siyah) ve sadece birkaç çubuk şeklinde ve striated hücreleri (beyaz) ile bir izolasyon gelen miyositlerin Temsili ışık mikroskop görüntüsü. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil 4: Bebek kalp biyopsilerinden kardiyomiyosit izolasyonu. (A) Bir bebekte Fallot tetralojisi için düzeltici cerrahi sırasında elde edilen endomiyokardiyal biyopsi (ıslak ağırlık yaklaşık 40 mg) görüntüsü. (B) A'dagösterilen dokudan miyokardiyal dilim , agarose gömülü. (C) Kardiyomiyositler B'degösterildiği gibi miyokardiyal bir dilimden izole edilmiştir. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Tablo 1: İnsan hasta verileri. Bu çalışmada yer alan insan hastalardan alınan örnek sayısının bir listesi verilmiştir. Örnekler cerrahi tiplere, yaşa, hastalık etyolojisine ve nakil zamanına göre, toplam numune sayısı ve başarılı miyosit izolasyonu sayısına göre sınıflandı. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Yaşayan kardiyomiyositlerin izolasyonu 40 yıldan daha uzun bir süre önce kurulmuş ve kardiyak araştırmalarda birçok deneysel yaklaşım için ön koşul olmasına rağmen, öngörülemeyen sonuçları olan zor bir teknik olmaya devam etmektedir. Enzim çözeltisi ile koroner arterlerin perfüzyon yoluyla kardiyomiyosit izolasyon yaygın küçük hayvanların kalpleri için kullanılan ve canlı hücrelerin çok sayıda verimleri. Ancak, bu nispeten karmaşık bir sistem ve uzmanlık gerektirir. Ayrıca, çoğu insan doku örnekleri bu yöntem için uygun değildir, onların küçük boyutu veya koroner arter dallarının yokluğu nedeniyle, hangi insan kardiyomiyosit izolasyonu için yeni yöntemler arzu yapar. Burada açıklanan protokol, enzimatik sindirime tabi tutulan ince kardiyak doku dilimlerinin atravmatik nesline dayanmaktadır. Hayvan kalplerinden ve insan miyokardiyumlarından alınan miyokardiyal örneklere uygulanabilir, örneğin sol-ventriküler yardımcı cihaz implantasyonundan apikal çekirdekler, septal miektomiden endomiyokardiyal biyopsiler veya eksel kalpler (Ek Tablo 1'ebakınız), ve kardiyomiyosit ekimi17gibi sonraki deneyler için kullanılabilecek yeterli miktarda uygulanabilir, kalsiyuma dayanıklı kardiyomiyosit üretir.
Miyom kesilmiş doku dilimlerinden miyosit veriminin kıymalı doku parçalarından daha yüksek veriminin önemli bir nedeni dilimleme sırasında miyosit hasarının daha düşük bir derecesi olabilir. Koroner perfüzyon mümkün olmadığında, enzimlerin sindirilmesi için temas yüzeyini artırmak için doku örneğinin dilimlemesi veya kıyması gereklidir. Yaklaşık 8 mm x 8 mm x 0,3 mm'lik dilim boyutları, nispeten büyük yüzey-hacim oranı (~7 mm-1)nedeniyle enzimlere iyi erişim sağlar. Makas kullanılarak, benzer bir yüzey-hacim oranı (~6 mm-1)yaklaşık 1 mm x 1 mm x 1 mm küçük parçalar halinde numuneler kıyma ile elde edilebilir. Enzimatik sindirim önce dilimler ve kıyılmış parçalar miyosit hasar nicelikli olmamasına rağmen, bir vibratom dilimleme lif yönünde nazik kesim sağlar, çünkü büyük olasılıkla çok daha az hasara neden olur. Aslında, vibratom kesim dilimleri az 5% miyositler19hasarlı olduğu tahmin edilebilip tahmin edilebilip edinildi. Sonuçlar, insan kardiyomiyositlerinin sağlanan protokolle çok verimli bir şekilde izole edilebildiğini ve doku parçalarına göre canlı hücrelerin çok daha yüksek oranda izole edilebildiğini göstermektedir. Bu atriyal doku20dilimleri kullanılan bir protokol uyarınca. Yöntemimiz doku miligramı başına 200 kalsiyuma dayanıklı ventriküler miyosit verir ve izolasyondan önce 36 saate kadar kardiyak doku depolama veya taşıma olanağı sağlar. Bu, protokolü yerinde kalp ameliyatı olmayan laboratuvarlar için uygulanabilir hale getirir ve böylece işbirlikleri için olanaklarını genişletir.
Protokoldeki kritik adımlar, miyokardinin vibratom üzerindeki dilimlere doğru işlenmesi ve bunların sindirimi nin yanı sıra BDM'nin kalsiyum yeniden girişi nin ve yıkanmasıiçin son adımlardır. Diğer yöntemlerin aksine19,21, kardiyak doku dilimleme işlemi sırasında hareket önlemek için düşük erime sıcaklığı ile agarosegömülüdür 14,15. Bu doku bloğunu stabilize etmek ve tek tip dilimler oluşturmak için gerekliydi. Doku katıştırırken, agarose hala sıvı olmalıdır, ancak hipertermi ile hücre hasarı önlemek için sıcaklık 37-38 °C'yi geçmemelidir. Tersine, agarose çok soğuksa (<35 °C), doku bloğuna iyi bağlanmaz ve dilimleme sırasında kırılabilir. Vibratom işleme sonra miyosit canlılığı için test etmek için, ışık mikroskobu ile hücre canlılığının hızlı değerlendirilmesi için izin veren basit bir MTT tahlil ve aynı zamanda fotometrik analiz ile nicelleştirilmesi için14,,22önerilmektedir . Kardiyomiyosit hasarı da kalsiyumiçermeyen çözeltide kuluçka bir süre sonra ekstrasellüler kalsiyum reintroduction sırasında oluşabilir23,24. İzole hücrelerdeki bu kalsiyum paradoksu fenomeni, kardiyomiyositlerin uyum sağlaması için kalsiyum seviyelerinin yavaş ve adım adım artmasıyla azaltılabilir. Bu adım 35 °C'de sürekli ajitasyon sırasında ve 5 dk aralıklarla dikkatle yapılmalıdır. Hafif hipotermi (21 °C) sıçan kardiyomiyositlerinin kalsiyum toleransını arttırır ve daha önceki raporlara uygun olarak25. Ancak, insan kardiyomiyositleri 35 °C veya 21 °C'de kalsiyum toleransında büyük farklılıklar göstermedi. Kalsiyumun kesilmesi, sindirimi ve yeniden girişi sırasında BDM kullanımı miyosit daralmasını ve hücresel enerji harcamasını ve hiperkontrüktasyonunu önler ve bu nedenle koruyucudur. Ancak, kardiyak kontraksiyon veya uyarma-daralma kaplinini değerlendiren sonraki deneyler içinBDM'nin 26'sıçıkarılmalıdır. Spontan hiperkontraksiyonları en aza indirmek için kademeli bir yıkama uygulandı. BDM atlanabilir, ancak bu belirgin hipersözleşmeli miyosit miktarını artıracak, önceki deneylerde ve çalışmalarda gözlenen6.
Açıklanan protokol, yüksek potasyum ve sindirim için sadece sodyum izleri içeren bir çözelti kullanır. Bu çözelti çubuk şeklinde, çapraz striated kardiyomiyositlerin en yüksek verimverdi. Enzimatik sindirim için ise normal Tirrode çözeltisindeki (1.5 mg/mL) sindirime kıyasla daha yüksek kollajenaz konsantrasyonu (4 mg/mL) gerekti. Yüksek hücre dışı sodyum hücre içi sodyum aşırı yüklenmesine yol açabilir, kalsiyum paradoksunun olumsuz etkilerini şiddetlendirerek hücre verimini azaltabilir27. Bu nedenle, yüksek potasyum ve düşük sodyum ile çözeltiler kullanılması önerilmektedir. Yüksek hücre dışı magnezyum konsantrasyonu sık kardiyomiyosit izolasyon protokolleri istihdamedilir 3,28, ve iskemi-reperfüzyon yaralanması azaltmak için gösterilmiştir29,30 ve soğuk iskemi uzun süre sonra kardiyak fonksiyon geliştirmek31. Bu nedenle, burada uygulanan çözelti de magnezyum (10 mM) yüksek konsantrasyonda içerir. Ancak, bu uyarılabilirlik, daralma kuvveti ve iletim hızı yüksek magnezyum konsantrasyonları ile azaltılabilir gösterilmiştir32. Bu etkilerin geri dönüşümlü olduğu gösterilmiş olsa da, izole kardiyomiyositler üzerindeki etkileri dışlanamaz. Böylece, fizyolojik konsantrasyonlarda magnezyum kullanarak (1-2 mM), daha düşük bir genel hücre verimi neden olabilir ama uyarılabilirlik artırabilir.
Hücre dışı matriks veya fibrozis miktarı insan başarısız miyokardiyum önemli ölçüde değişebilir gibi optimal sindirim süresi oldukça değişkendir. Doku hala sıkıca dissosilasyon sırasında bağlı olması halinde, sadece birkaç uygun miyosit serbest, 5 dakika adımlarla sindirim süresini artırmak ve düzenli olarak ücretsiz miyosit ler ve dilimlerin doku kontrol önerilir. Doku uzun süre (>45 dk) sonra sindirilmemiş kalırsa, 1 mg/mL adımlarında kollajenaz konsantrasyonunun artırılması veya farklı bir enzim inkifinin test edilmesi tavsiye edilir16. Bu çalışmada sunulan ilgili değerler kardiyomiyositlerin sağlam bir izolasyon için bir astar olarak hizmet verebilir, ancak optimum verim ve canlılık için koşullar her laboratuvarda rafine edilebilir, enzim faaliyetleri ve doku anayasaları büyük değişkenlik dikkate alınarak. Yöntemin bir avantajı, gerekli doku küçük miktarlarda ve küçük gruplar halinde basit iş akışı nedeniyle, çeşitli testler paralel olarak yapılabilir olmasıdır. Böylece, en uygun protokol hızlı bir şekilde elde edilebilir.
Yüksek kaliteli miyokardiyal dilimlerin üretimi yüksek hassasiyetli vibratome gerektirir. Yüksek hassasiyetli doku dilimleyici veya vibratome ihtiyacı yöntemin olası bir dezavantajıdır, çünkü her laboratuvarda kolayca bulunamaz. Bu çalışma için kullanılan cihaz başka bir yerde daha ayrıntılı olarak açıklanmıştır14,15. Farklı cihazlar başarıyla diğer gruplar33,34,35tarafından miyokardiyal dilimler oluşturmak için kullanılmıştır. Bu nedenle, ilerleyen hız, bıçak genliği ve salınım frekansı ayarları karşılanamıyorsa ve 0,1 μm'nin altında z-sapma lı yatay bir bıçak yönlendirmesi mevcutsa, başarılı dilimleme ve izolasyon diğer vibratomlarla mümkün olmalıdır. Buna ek olarak, doku dilimleme ayrıntılı ve önemli ölçüde protokol süresini uzatır (yaklaşık 1-2 saat). Mekanik bir ayırma ajanı olarak BDM kullanımı hücresel enerji maruziyeti azaltarak koruyucu etkileri vardır, iskemik yaralanma, ve hiperkontraksiyon26,36,37. BDM negatif inotropic etkisi yıkama sonra hızlı bir şekilde geri dönüşümlü olduğu gösterilmiştir rağmen38,39, BDM kardiyomiyosit fonksiyonu üzerinde bilinmeyen sonuçları olabilir eğer açık değildir40. Bu çalışma, hücrelerin 36 saate kadar doku depolama süreleri sonra yüksek verim ile izole edilebilir ve insan kardiyomiyositler bu yöntem17ile izolasyon dan sonra üç gün kadar kültürlü olabilir gösterir. Kısa ve uzun depolama süreleri olan miyositler arasındaki fonksiyonel veya yapısal farklılıkları fark etmedik. Ancak, bu sistematik olarak değerlendirilmedi. Öte yandan, tüm tavşan kalpleri için, 30 mM BDM içeren ekstrasellüler çözeltide soğuk iskemi maruz taze kalpler ve kalpler arasındaki fonksiyonel farklılıklar ihmal edilebilir olduğu gösterilmiştir31, ve aynı durum bu durumda doğru olabilir.
Sunulan protokol izole ventriküler kardiyomiyositler ile deneyler her türlü için sağlam bir temel sağlar ve insan miyokardiyal örnekler üzerinde araştırma için özellikle değerli olabilir. Bazı adaptasyonlar ile, fibroblastlar veya endotel hücreleri gibi diğer kardiyak hücrelerin izolasyonu da mümkün görünüyor41. Diğer laboratuvarlardan soğuk hava deposu çözeltisi içinde sevk edilebilen çok az miktarda doku gerektirdiğinden, protokolün uygulanması kurban edilen laboratuvar hayvanı sayısını azaltabilir. Aslında protokol tavşan ve domuz kalp dokusuna başarıyla uygulanmıştır. Ayrıca, uzun süreli ekili miyokard doku dilimleri ile deneyler artış21,33,42 ve sürekli optimal kültür koşulları15,,43,44sağlamak için geliştirilmiş , yöntem kolayca dilim ekimi sonra uygulanabilir. Bu nedenle ekili miyokardiyumdan tek hücreli izolasyon, farmakolojik veya fiziksel müdahaleler sonrası kardiyomiyositteki değişiklikleri karakterize etmeye yardımcı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Walter-Brendel Deneysel Tıp Merkezi, LMU Münih'ten Andreas Dendorfer'e dilimleme protokolüile ilgili yardımları için teşekkür ederiz. İnsan miyokardiyal doku örnekleri sağlamak için Kalp Cerrahisi Bölümü'nden Gazali Minabari ve Christian Heim'a, Erlangen Üniversitesi Hastanesi'nden, Erlangen Üniversitesi'nden Hendrik Milting'e, Erich & Hanna Klessmann Enstitüsü'nden Hendrik Milting'e, Ruhr-Üniversitesi Bochum'a ve Erlangen Üniversitesi Hastanesi Çocuk Kardiyoloji Bölümü'nden Muhannad Alkassar'a teşekkür ederiz. Akış sitometrisi desteği için Simon Völkl'e ve Çeviri Araştırma Merkezi'nden (TRC), Erlangen Üniversitesi Hastanesi'nden meslektaşlarımıza teşekkür ederiz. Ayrıca, Hücresel ve Moleküler Fizyoloji Erlangen Enstitüsü'nden Lorenz McCargo ve Celine Grüninger'e mükemmel teknik destek için teşekkür ederiz.
Bu çalışma, Erlangen-Nürnberg Üniversitesi Üniversitesi Hastanesi'ndeki Disiplinlerarası Klinik Araştırma Merkezi (IZKF) ve Universitätsbund Erlangen-Nürnberg tarafından DZHK (Alman Kardiyovasküler Araştırma Merkezi) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| 2,3-butanedionemonoxime | Carl Roth | 3494.1 | Purity>99% |
| Bovine serum albumin | Carl Roth | 163.2 | |
| CaCl2 | Carl Roth | 5239.2 | |
| Creatine monohydrate | Alfa Aesar | B250009 | |
| Glucose | Merck | 50-99-7 | |
| HEPES | Carl Roth | 9105.3 | |
| KCl | Carl Roth | P017.1 | |
| KH2PO4 | Carl Roth | 3904.2 | |
| L-glutamic acid | Fluka Biochemica | 49450 | |
| Low melting-point agarose | Carl Roth | 6351.5 | |
| MgCl2 x 6H2O | Carl Roth | A537.1 | |
| MgSO4 | Sigma Aldrich | M-7506 | |
| NaCl | Carl Roth | 9265.1 | |
| NaHCO3 | Carl Roth | 8551.2 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Taurine | Sigma Aldrich | T8691 | |
| Dyes | |||
| Di-8-ANEPPS | Thermo Fisher Scientific | D3167 | |
| Fluo-4 AM | Thermo Fisher Scientific | F14201 | |
| FluoVolt | Thermo Fisher Scientific | F10488 | |
| Enzymes | |||
| Collagenase CLS type I | Worthington | LS004196 | Used for human tissue at 4 mg/mL (activity: 280 U/mg) |
| Collagenase CLS type II | Worthington | LS004176 | Used for rat tissue at 1.5 mg/mL (activity 330 U/mg) |
| Protease XIV | Sigma Aldrich | P8038 | Used for rat tissue at 0.5 mg/mL (activity ≥ 3.5 U/mg) |
| Proteinase XXIV | Sigma Aldrich | P5147 | Used for human tissue at 0.5 mg/mL (activity: 7-14 U/mg) |
| Material | |||
| Cell analyzer (LSR Fortessa) | BD Bioscience | 649225 | |
| Centrifuge tube, 15 mL | Corning | 430790 | |
| Centrifuge tube, 50 mL | Corning | 430829 | |
| Compact shaker | Edmund Bühler | KS-15 B control | Agitation direction: horizontal |
| Disposable plastic pasteur-pipettes | Carl Roth | EA65.1 | For cell trituration use only pipettes with an inner tip diameter ≥2 mm |
| Forceps | FST | 11271-30 | |
| Heatblock | VWR | BARN88880030 | |
| Nylon net filter, 180 µm | Merck | NY8H04700 | |
| TC Dish 100, Standard | Sarstedt | 83.3902 | |
| TC Dish 35, Standard | Sarstedt | 83.3900 | |
| TC Dish 60, Standard | Sarstedt | 83.3901 | |
| Vibratome (VT1200S) | Leica | 1491200S001 | Includes VibroCheck for infrared-assisted correction of z-deflection |
References
- Powell, T., Twist, V. W. A rapid technique for the isolation and purification of adult cardiac muscle cells having respiratory control and a tolerance to calcium. Biochemical and Biophysical Research Communications. 13, 258-283 (1976).
- Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51, 288-298 (2011).
- Isenberg, G., Klockner, U. Calcium Tolerant Ventricular Myocytes Prepared by preincubation in a KB Medium. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 395, 6-18 (1982).
- Beuckelmann, D. J., Näbauer, M., Erdmann, E. Intracellular calcium handling in isolated ventricular myocytes from patients with terminal heart failure. Circulation. 85, 1046-1055 (1992).
- Brixius, K., Hoischen, S., Reuter, H., Lasek, K., Schwinger, R. H. G. Force/shortening-frequency relationship in multicellular muscle strips and single cardiomyocytes of human failing and nonfailing hearts. Journal of Cardiac Failure. 7, 335-341 (2001).
- Peeters, G. A., et al. Method for isolation of human ventricular myocytes from single endocardial and epicardial biopsies. The American Journal of Physiology. 268, 1757-1764 (1995).
- Coppini, R., et al. Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples. Journal of Visualized Experiments. (86), e51116 (2014).
- Seidel, T., et al. Sheet-Like Remodeling of the Transverse Tubular System in Human Heart Failure Impairs Excitation-Contraction Coupling and Functional Recovery by Mechanical Unloading. Circulation. 135, 1632-1645 (2017).
- Hartmann, N., et al. Antiarrhythmic effects of dantrolene in human diseased cardiomyocytes. Heart Rhythm. 14, 412-419 (2017).
- Bkaily, G., Sperelakis, N., Doane, J. A new method for preparation of isolated single adult myocytes. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 247, 1018-1026 (1984).
- Trube, G. Enzymatic Dispersion of Heart and Other Tissues. Single-Channel Recording. Sakmann, B., Neher, E. , Springer. Boston, MA. 69-76 (1983).
- Schlüter, K. D., Schreiber, D.
- Del Monte, F., et al. Restoration of contractile function in isolated cardiomyocytes from failing human hearts by gene transfer of SERCA2a. Circulation. 100, 2308-2311 (1999).
- Brandenburger, M., et al. Organotypic slice culture from human adult ventricular myocardium. Cardiovascular Research. 93, 50-59 (2012).
- Fischer, C., et al. Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro. Nature Communications. 10, (2019).
- Worthington-Biochemical. Worthington Tissue Dissociation Guide. , Available from: http://www.worthington-biochem.com/tissuedissociation/default.html (2019).
- Seidel, T., et al. Glucocorticoids preserve the t-tubular system in ventricular cardiomyocytes by upregulation of autophagic flux. Basic Research in Cardiology. 114 (6), 47 (2019).
- Lipsett, D. B., et al. Cardiomyocyte substructure reverts to an immature phenotype during heart failure. Journal of Physiology. 597, 1833-1853 (2019).
- Watson, S. A., et al. Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals. Nature Protocols. 12, 2623-2639 (2017).
- Guo, G. R., et al. A modified method for isolation of human cardiomyocytes to model cardiac diseases. Journal of Translational Medicine. 16, 1-9 (2018).
- Kang, C., et al. Human Organotypic Cultured Cardiac Slices: New Platform For High Throughput Preclinical Human Trials. Scientific Reports. 6, 1-13 (2016).
- Gomez, L. A., Alekseev, A. E., Aleksandrova, L. A., Brady, P. A., Terzic, A. Use of the MTT assay in adult ventricular cardiomyocytes to assess viability: Effects of adenosine and potassium on cellular survival. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 29, 1255-1266 (1997).
- Zimmerman, A. N. E., Hülsmann, W. C. Paradoxical influence of calcium ions on the permeability of the cell membranes of the isolated rat heart. Nature. 211, 646-647 (1966).
- Piper, H. M. The calcium paradox revisited An artefact of great heuristic value. Cardiovascular Research. 45, 123-127 (2000).
- Boink, A. B. T. J., Ruigrok, T. J. C., de Moes, D., Maas, A. H. J., Zimmerman, A. N. E. The effect of hypothermia on the occurrence of the calcium paradox. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 385, 105-109 (1980).
- Mulieri, L. A., Hasenfuss, G., Ittleman, F., Blanchard, E. M., Alpert, N. R. Protection of human left ventricular myocardium from cutting injury with 2,3-butanedione monoxime. Circulation Research. 65, 1441-1444 (1989).
- Busselen, P. Effects of sodium on the calcium paradox in rat hearts. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 408, 458-464 (1987).
- Voigt, N., Zhou, X. B., Dobrev, D. Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+Transients and Membrane Currents. Journal of Visualized Experiments. (77), e50235 (2013).
- Leor, J., Kloner, R. An Experimental Model Examining the Role of Magnesium in the Therapy of Acute Myocardial Infarction. The American Journal of Cardiology. 75, 1292-1293 (1995).
- Herzog, W. R., et al. Timing of Magnesium Therapy Affects Experimental Infarct Size. Circulation. 92, 2622-2626 (1995).
- Stringham, J. C., Paulsen, K. L., Southard, J. H., Mentzer, R. M., Belzer, F. O. Forty-hour preservation of the rabbit heart: Optimal osmolarity, [Mg2+], and pH of a modified UW solution. The Annals of Thoracic Surgery. 58, 7-13 (1994).
- Hall, S. K., Fry, C. H. Magnesium affects excitation, conduction, and contraction of isolated mammalian cardiac muscle. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 263 (2), Pt 2 622-633 (1992).
- Bussek, A., et al. Tissue Slices from Adult Mammalian Hearts as a Model for Pharmacological Drug Testing. Cellular Physiology and Biochemistry. 24, (2009).
- Wang, K., et al. Living cardiac tissue slices: An organotypic pseudo two-dimensional model for cardiac biophysics research. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 115, 314-327 (2014).
- Thomas, R. C., et al. A Myocardial Slice Culture Model Reveals Alpha-1A-Adrenergic Receptor Signaling in the Human Heart. Journal of the American College of Cardiology: Basic to Translational Science. 1, 155-167 (2016).
- Perreault, C. L., et al. Cellular basis of negative inotropic effect of 2,3-butanedione monoxime in human myocardium. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 263, 503-510 (1992).
- Vahl, C. F., Bonz, A., Hagl, C., Hagl, S. Reversible desensitization of the myocardial contractile apparatus forcalcium: A new concept for improving tolerance to cold ischemia in human myocardium. European Journal of Cardio-thoracic Surgery. 8, 370-378 (1994).
- Horiuti, K., et al. Mechanism of action of 2, 3-butanedione 2-monoxime on contraction of frog skeletal muscle fibres. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 9, 156-164 (1988).
- Li, T., Sperelakis, N., Teneick, R. E., Solaro, R. J. Effects of diacetyl monoxime on cardiac excitation-contraction coupling. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 232, 688-695 (1985).
- Sellin, L. C., Mcardle, J. J. Multiple Effects of 2,3 Butanedione Monoxime. Pharmacology and Toxicology. 74, 305-313 (1993).
- Eghbali-Webb, M., Agocha, A. E. A simple method for preparation of cultured cardiac fibroblasts from adult human ventricular tissue. Novel Methods in Molecular and Cellular Biochemistry of Muscle. Pierce, G. N., Claycomb, W. C. , Springer US. 195-198 (1997).
- Camelliti, P., et al. Adult human heart slices are a multicellular system suitable for electrophysiological and pharmacological studies. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51, 390-398 (2011).
- Watson, S. A., et al. Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro. Nature Communications. 10, 2168 (2019).
- Watson, S. A., Terracciano, C. M., Perbellini, F. Myocardial Slices: an Intermediate Complexity Platform for Translational Cardiovascular Research. Cardiovascular Drugs and Therapy. 33, 239-244 (2019).
