Este protocolo fornece um procedimento passo-a-passo para analisar a carga aterosclerótica em camundongos. Os investigadores podem usar este protocolo para comparar a abundância, localização e tamanho das lesões ateroscleróticas em diferentes animais.
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Artigo de método
Imagem e Análise de Lesões inteiras de aorta manchadas de óleo em um modelo de rato de hiperlipidemia aneurisma
Neste artigo
Resumo
Resumo
Apolipoproteína E (Apoe)- ou receptor de lipoproteína de baixa densidade (Ldlr)-camundongos hiperlipidêmicos deficientes são os dois modelos mais usados para pesquisa de aterosclerose. Eles são usados para estudar o impacto de vários fatores genéticos e diferentes tipos de células na formação de lesões ateroscleróticas e também testar o desenvolvimento de novas terapias. Isolamento, excisão de toda a aorta e quantificação de lesões ateroscleróticas manchadas de óleo são métodos morfométricos básicos utilizados para avaliar a carga aterosclerótica. O objetivo deste protocolo é descrever um método cirúrgico otimizado, passo a passo para dissecar, perfuse-fix, isolar, manchar, imagem e analisar lesões ateroscleróticas em aortas de camundongos com O Vermelho Óleo. Como lesões ateroscleróticas podem se formar em qualquer lugar em toda a árvore aórtica, todo este método de coloração de aorta- vermelha orta tem a vantagem de avaliar placas carregadas de lipídios em toda a aorta e todos os ramos em um único rato. Além da coloração de Óleo Vermelho O, aortas inteiras isoladas frescas podem ser usadas para variedade de experimentos in vitro e in vivo e isolamentos celulares.
Introdução
A doença arterial coronariana, uma das principais causas de mortalidade nos EUA, é geralmente causada pela aterosclerose, um processo que leva ao acúmulo de placa dentro de paredes arteriais1. Camundongos deficientes de hiperlipidemia e ldlr são centrais para as investigações de aterosclerose e suas complicações e desenvolvimento de terapias2,3,4,5. A quantificação de lesões ateroscleróticas a partir de uma aorta en face é uma importante análise de ponto final para avaliar o impacto da manipulação genética em diferentes tipos de células. Também ajuda a estudar novas terapias projetadas para afetar a iniciação, progressão e regressão da doença aterosclerótica. Lesões ateroscleróticas podem se formar em qualquer lugar da aorta e seus ramos (ou seja, braquiocefálicas, carótidas e subclávias no peito, bem como artérias renais, ilíacas comuns e femorais abaixo do diafragma)6. Uma avaliação abrangente da carga de aterosclerose e da terapia adequada requer a avaliação da carga da doença em diferentes locais, um desafio que muitas vezes é negligenciado.
Este protocolo descreve como realizar uma análise abrangente das lesões ateroscleróticas, começando com uma aorta inteira não aberta e procedendo para en preparação facial, em um único rato. A coloração inteira de aorta vermelha o óleo não aberto permite uma avaliação rápida e qualitativa de placas carregadas de lipídios em toda a aorta e seus ramos, enquanto a preparação facial fornece uma avaliação quantitativa da distribuição da lesão aterosclerótica na aorta do rato.
A técnica utiliza camundongos de 8 semanas com uma exclusão TGFβR2 específica para células musculares lisas no fundo apoe/- hiperlipidêmico (MYH11-CreERT2; Tgfbr2f/f;mT/mGf/f; Apoe/-; a partir de agora referido como ratos TGFβR2iSMC-Apoe) e controles de amuleto Apoe-/- (MYH11-CreERT2;mT/mGf/f; Apoe/-; a partir de agora referido como Apoe-/- ratos). Os animais são mantidos por 16 semanas em uma dieta rica em colesterol alto (HCHFD) como materiais de estudo7. No término do estudo, as aortas inteiras não abertas são manchadas e imagens (incluindo todos os principais ramos) com O Vermelho Óleo para avaliação qualitativa de placas carregadas de lipídios. As aortas são cortadas através da preparação do rosto, e todas as lesões ateroscleróticas são imagens e quantificadas. Este protocolo pode ser usado para estudar o desenvolvimento de lesões ateroscleróticas nos modelos de camundongos de hiperlipidemia apoe/ou Ldlr/- hiperlipidemia e estendido a aplicações gerais de biologia vascular relacionadas à aorta.
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Protocolo
mT/mG (estoque nº 007676) e camundongos Apoe-/- (estoque nº 002052) foram comprados no Laboratório Jackson. Os ratos Myh11-CreERT2 foram um presente de Stefan Offermanns (disponível no Laboratório Jackson como estoque nº 019079). Os ratos Tgfbr2fl/fl foram obtidos de Harold L. Moses (Universidade Vanderbilt). Todos os procedimentos animais foram realizados por meio de protocolos aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Yale.
1. Ratos
- Produzir MYH11-CreERT2;mT/mGf/f; Apoe-/- e MYH11-CreERT2; Tgfbr2f/f;mT/mGf/f; Apoe-/- camundongos como descrito anteriormente7. Criar cepas mutantes para o fundo C57BL/6J por mais de dez gerações.
NOTA: A linha de camundongos Myh11-CreERT2 cre fornece uma ferramenta poderosa para estudar o papel das células musculares lisas na homeostase vascular e na patologia vascular. O alelo Cre é inserido no cromossomo Y; assim, camundongos fêmeas não expressam essa construção.
2. Genotipagem de camundongos, indução de tamoxifen e alimentação de dieta rica em gordura
- Realize a genotipagem do mouse usando DNA de orelha do mouse e análise pcr. O DNA da orelha do rato deve ser isolado usando o kit de isolamento de DNA de sangue e tecido (Tabela de Materiais) de acordo com as instruções do fabricante. Os primers do PCR estão listados na Tabela 1.
- Induzir a recombinação de Cre-Lox por injeção de tamoxifen a 1 mg/dia i.p. por 5 dias em MYH11-CreERT2 de 6 semanas de idade;mT/mGf/f; Apoe-/- e MYH11-CreERT2; Tgfbr2f/f;mT/mGf/f; Apoe-/- ratos machos.
- Induzir aterosclerose colocando camundongos machos de 8 semanas de idade (2 semanas após o tratamento de tamoxifen) em uma dieta HCHF (40% de gordura kcal, 1,25% colesterol, 0% ácido cholic) por 16 semanas.
3. Reagentes e preparação da ferramenta de dissecação
- Estocagem Red O preparação da solução: dissolver 1 g de Óleo Vermelho O em 100 mL de álcool isopropílico.
- Preparação da solução De Óleo De Trabalho Vermelho O: misture 24 mL de estoque Solução Oil Red O com 16 mL de dH2O. Filtrar o óleo diluído Vermelho O com filtros de seringa estéril de 0,45 μm (a solução só é boa para 1-2 h).
- 60% de preparo isopropílico de álcool: misture 60 mL de álcool isopropílico com 40 mL de dH2O.
- 4% de formaldeído em 1x preparação de DPBS: diluir 10 mL de formaldeído de 16% em 30 mL de 1x DPBS.
- Limpe todas as ferramentas de dissecção com 70% de etanol (Figura 1).
4. Eutanásia (Figura 2A)
- Meça o peso do rato antes da eutanásia.
- Eutanize o rato por injeção intraperitoneal de cetamina e xilazina (cada mililitro contém 10 mg/mL de cetamina e 2 mg/mL de xilazina).
- Coloque o mouse em posição supina (face-up do lado da barriga).
5. Abertura da cavidade torácica e abdominal e perfusão cardíaca (Figura 2B)
- Prepare uma seringa de 10 mL com 10 mL de 1x DPBS. Boné com uma agulha de 25 G. A seringa será usada para dar descarga no coração.
- Segure a pele com pinças (Estilo 5) e corte com uma tesoura fina da base do abdômen até a parte superior do pescoço.
- Abra a parede abdominal abaixo da caixa torácica.
- Levante o esterno com pinças (Estilo 5) e corte o diafragma, depois corte a caixa torácica para expor a cavidade torácica.
- Faça uma pequena incisão no átrio direito do coração.
- Perfuse através da punção ventricular esquerda apical injetando lentamente 10 mL de 1x DPBS. Uma vez completamente perfundido, o fígado e o rim tornam-se castanhos claros na cor.
- Limpe a cavidade torácica de sangue e fluidos íntegros usando uma esponja não tecida para absorver o material.
6. Isolamento da aorta e dos ramos (Figura 2C)
- Remova órgãos (ou seja, pulmão, fígado, baço e órgãos gastrointestinais e reprodutivos) e corte a clavícula usando pinças (Estilo 5) e tesoura fina enquanto deixa o coração, rim e aorta intactos in situ.
NOTA: Certifique-se de não dilacerar o coração ou quaisquer vasos sanguíneos principais. - Coloque o mouse sob um estereótipo.
- Os ramos de aorta e aorta incluem artérias braquiocefálicas, artérias carótidas, artérias subclávias, artérias renais, artérias ilíacas comuns e artérias femorais usando pinças (Estilo 4) e tesouras de mola.
NOTA: Cubra a aorta com uma esponja molhada e não tecida para evitar a desidratação enquanto disseca os galhos de aorta. - Disseque cuidadosamente e remova o adiposo avencionário e o tecido conjuntivo ao redor dos galhos de aorta e aorta usando pinças (Estilo 4) e tesouras de mola.
NOTA: Como a inflamação é proeminente no aneurisma hiperlipidemia, é difícil remover a adventitia. Tenha cuidado para não rasgar ou cortar os galhos de aorta e aorta. Este passo requer prática e paciência.
7. Fixação de coração e aorta (Figura 2D,E)
- Prepare uma seringa de 10 mL com 10 mL de 4% de formaldeído em 1x de DPBS. Boné com uma agulha de 25 G.
ATENÇÃO: O formaldeído é perigoso. Leia o MSDS antes de trabalhar com este produto químico. Use luvas e óculos de segurança e produza as soluções de diluição dentro de um capô de fumaça.
NOTA: 4% da solução de formaldeído degrada-se ao longo do tempo. É importante usar formaldeído de 4% recém-feito para fixação. - Fixar a árvore vascular através de punção ventricular esquerda apical injetando lentamente 10 mL de formaldeído de 4%.
NOTA: A fixação do formaldeído interfere em várias aplicações a jusante, como cultura celular, análise FACS e análise de sequenciamento de RNA unicelular. Pule esta etapa se a aorta for usada para qualquer uma dessas aplicações. - Limpe a cavidade torácica de qualquer fluido íntegro com uma esponja não tecida para absorver o material.
- Separe o coração da aorta segurando o coração com pinças (Estilo 4) e usando uma tesoura de mola micro-dissecando.
NOTA: Para realizar en face Oil Red O mancha após esta etapa, recomenda-se cortar a aorta aberta in situ em vez de ex vivo e seguir para a seção 8. Isso torna mais fácil para a aorta en face para deitar plana. - Isole e extirpa a aorta e seu major de 1 mm acima da artéria carótida até o final da artéria femoral usando pinças (Estilo 4) e tesoura de mola.
- Transfira o vaso para uma placa de cera de Petri ou tubo de microcentrifutura de 1,5 mL e encha com 1x DPBS até cobrir a aorta.
NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui.
8. Manchas e imagens de aorta inteira não aberta (Figura 3)
- Coloque o recipiente em uma placa de cera de Petri usando pinos minutien (Figura 3A).
- Enxágüe o vaso uma vez com 1x DPBS.
- Despeje 25 mL de solução fresca de Óleo Vermelho O na placa de Petri (Figura 3B).
NOTA: (1) Isopropanol é perigoso e um líquido inflamável. Use equipamentos de proteção individual adequados. (2) A solução Oil Red O pode facilmente precipitar. As partículas precipitadas podem interferir com a coloração subsequente. É importante remover o precipitado filtrando a solução Oil Red O através de um filtro de 0,45 μm antes de usar. (3) É melhor preparar a solução de O Vermelho-O fresco e descartar qualquer solução nãousada. (4) Além do Óleo Vermelho O, o Sudão IV é outro composto químico usado para coloração de lipídios, triglicérides e lipoproteínas. No entanto, o O Vermelho Óleo tem gradualmente substituído o Sudão IV porque a cor vermelha produzida pelo Óleo Vermelho O é mais intensa e pode, assim, tornar a gordura muito mais fácil de ver. - Manche a aorta por 60 min em temperatura ambiente (RT). Óleo Vermelho O manchará placa rica em lipídios vermelho, deixando outras não-placas contendo áreas pálidas de cor.
- Lave uma vez por 20 min com isopropanol de 60% na RT.
NOTA: O excesso de lavagem pode desestabilizar a placa. - Enxágüe a aorta 3x com dH2O por 5 minutos para remover isopropanol.
- Sob um estereótipo, limpe suavemente todo o tecido adiposo perivascular ao redor da aorta usando pinças (Estilo 4) e tesoura de mola (Figura 3C,D).
NOTA: É importante limpar todo o tecido adiposo perivascular ao redor da aorta e seus ramos após a coloração, pois o tecido adiposo perivascular manchado de óleo pode produzir fundo falso e interferir na morfometria da placa e quantificação da área da placa. Certifique-se de não remover uma parte da parede aórtica. Encha o prato de cera com dH2O até cobrir a aorta manchada durante a limpeza. Este passo requer prática e paciência. - Transfira a nave para um escorregador de microscópio de vidro limpo.
- Adquira micrografias digitais usando uma câmera conectada a um microscópio de luz. Salvar imagens de alta resolução, de preferência em formato de arquivo de imagem marcado (TIFF) (Figura 3E).
NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui. Para evitar que a aorta seque, transfira o vaso para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e encha com 1x DPBS até cobrir a aorta. Armazenar a 4 °C.
9. En face aorta mounting (Figura 4, Figura 5)
- Transfira o recipiente para uma placa de cera de Petri e encha com 1x DPBS até cobrir a aorta.
- Corte as artérias carótidas, subclávias do arco aórtico e artérias ilíacas na aorta abdominal 1-2 mm após bifurcações. Corte as artérias renais. (Figura 4A)
- Corte longitudinalmente a preparação da aorta ao longo da curvatura interna (Figura 4B1) e sozinho artérias ilíacas (Figura 4B2) com tesoura de mola micro-dissecando.
- Abra os três ramos do arco aórtico (ou seja, innominado, carótida comum, artéria subclávia esquerda) ao longo da curvatura maior até o nível base de curvatura interna (x-mark) (Figura 4B3-B8) com tesoura de mola micro-dissecando.
- Fixar a aorta plana (face-up lado do lúmen) em um prato de cera com pinos de minutien e aplicar 1x DPBS até cobrir a aorta para evitar que ela seque (Figura 4C).
NOTA: (1) É importante deixar a aorta enrolada e fixá-la no rosto sem esticar. Esta etapa levará alguns dias dependendo da gravidade da aterosclerose. (2) Para aortas de animais Apoe//- ou Ldlr-/- recomenda-se fixar o plano de aorta por 24 h. (3) O protocolo pode ser pausado aqui. - Limpe os slides do microscópio de vidro com 70% de etanol e limpadores de tarefas delicados (Figura 5A).
- Transfira a aorta para um slide de microscópio de vidro limpo e coloque 15 gotas de composto de temperatura de corte ideal (OCT) em outro slide de microscópio de vidro limpo (Figura 5B).
- Coloque cuidadosamente o slide do microscópio de vidro com composto OCT sobre a aorta e evite prender bolhas de ar no slide (Figura 5C).
- Rotule os slides com nomes de amostra (Figura 5D).
NOTA: Os slides montados na aorta podem ser armazenados na câmara de umidade a 4 °C por vários meses.
10. Imagem e quantificação da lesão da aorta en face (Figura 6)
- Adquira micrografias digitais usando uma câmera conectada a um microscópio de luz. Salvar imagens de alta resolução, de preferência em formato de arquivo de imagem marcado (TIFF) (Figura 6A).
- Transfira imagens da aorta en manchada inteira para um computador equipado com software ImageJ.
- No ImageJ, selecione a ferramenta "Seleção à mão livre" e circule toda a placa manchada de Óleo Vermelho O manualmente (pontos vermelhos intensos) enquanto pressiona a tecla "Alt" (para PC Windows) ou "Shift" (para Mac). Em seguida, clique em "Medir" no menu "Analisar" para exibir áreas de lesão na janela de resultado (Figura 6B à esquerda).
NOTA: Existem várias armadilhas da quantificação das lesões ateroscleróticas: (1) quaisquer pequenos pedaços de gordura aventurra manchada que permaneceram presos à aorta a partir do passo 8.7 podem produzir fundo falso e interferir na quantificação da placa; (2) remover uma parte da parede aórtica ou danificar a aorta das etapas 6.4 e 8.7 pode interferir na quantificação da placa; (3) bolhas e dobras formadas na aorta após a montagem (etapa 9.8) podem interferir na quantificação da placa; e (4) a placa aterosclerótica é um fenômeno 3D, e medições realizadas em um plano 2D podem não refletir a verdadeira extensão da placa. Além da análise da área da placa en face aorta, recomenda-se analisar o tamanho da placa na raiz aórtica, artéria braquiocefálica, aorta ascendente e aorta abdominal separadamente8. - Circule a linha de borda externa da aorta e clique em "Medir" no menu "Analisar" para exibir a área de aorta na janela de resultado (Figura 6B à direita).
- Exporte todas as medidas para um arquivo Excel.
- Calcule a razão da área da placa a partir da área total da aorta e normalize o valor como a porcentagem da área total da superfície de O Vermelho-Óleo.
- Calcule a razão da área da placa em camundongos Apoe-//- e 8-10 TGFβR2iSMC-Apoe. Apresentar os dados como média ± SEM (Figura 6C).
- Realize um teste t de um aluno não verificado para análise estatística da razão de dados da área da placa em comparação com outro grupo de camundongos. Considere as diferenças nos valores médios como significativas em p < 0,05.
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Resultados
Neste protocolo, foram analisadas lesões ateroscleróticas em camundongos TGFβR2iSMC-Apoe após 4 meses em uma dieta HCHF7. Além da aterosclerose extensiva, esses camundongos desenvolveram aneurismas de aoórtica torácica e abdominal, como relatado anteriormente. Em comparação com os camundongos Apoe-/- camundongos, as paredes aórticas de camundongos TGFβR2iSMC-Apoe apresentaram aterosclerose grave, dificultando a dissecação das lesões (Figura
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Discussão
Apolipoproteína E (Apoe) e os camundongos deficientes do receptor de lipoproteína de baixa densidade (Ldlr) são úteis para estudar o desenvolvimento e o tratamento da aterosclerose. Os pesquisadores podem avaliar o impacto da genética e manipulações terapêuticas na iniciação, progressão e regressão de doenças relacionadas à aterosclerose, progressão e regressão usando a coloração de Óleo Vermelho O de toda a aorta9. A coloração de O vermelho e a quantificação da lesão é o ponto f...
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Divulgações
Os autores não declaram interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado, em parte, por um Consórcio Conjunto de Biologia Microgrant fornecido sob a concessão do NIH P30AR070253 (P.-Y.C.), e HL135582 (M.S.). Somos gratos a R. Webber e L. Coon por manter os ratos usados neste estudo.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tubo Eppendorf de 1,5 mL | DENVILLE | C2170 | |
| Seringa de 10 mL | BD | 302995 | |
| 16% Formaldeído | Polysciences | 18814-10 | |
| 70% etanol | VWR | RC2546.70-5 | Para limpar as ferramentas de dissecação |
| Cera de dissecação preta | CR Scientific | C3541 | |
| Óleo de milho | Sigma | C8267 | Solvente para Tamoxifeno |
| DNeasy Sangue & Kit de lenços | QIAGEN | 69506 | Para isolar o DNA da orelha de camundongo |
| Dulbecco' s Solução salina tamponada com fosfato (1X DPBS), pH 7,4 | Gibco | 14190-144 | |
| Tesoura fina | Ferramentas de ciência fina | 14059-11 | Para cortar a pele do rato e abrir a caixa torácica |
| Lâminas de microscópio de vidro liso Fisherbrand Economy Fisher | Scientific | 12-550-A3 | |
| Dieta rica em gordura com alto teor de colesterol | Dietas de pesquisa | D12108 | Para induzir aterosclerose |
| Imagem software | National Institutes of Health | Imagem J | Quantificação de lesões aórticas |
| Isopropanol | VWR | JT9079-5 | |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666A | Para limpar as lâminas do microscópio de vidro |
| Tesoura de mola de microdissecação McPherson-Vannas | ROBOZ | RS-5602 | Para separar o coração e a aorta e abrir a aorta e os ramos |
| da aortaSoftware de controle de microscópio | Olympus | DP Controller | Para imagem de aorta |
| Pinos Minutien | Ferramentas de Ciência Fina | 26002-10 | |
| Agulha-25G | BD | 305124 | |
| Esponja Não Tecida | McKesson | 94442000 | |
| Óleo Vermelho O | Sigma | O-0625 | Para manchar as lesões de aterosclerose |
| Seringa Estéril Pall Acrodisc Filtros com Super Membrana | VWR | 28143-312 | Para filtrar a solução de trabalho Óleo Red O |
| Tesoura de mola | Ferramentas de ciências finas | 15021-15 | Para dissecar e limpar a aorta |
| Software estatístico | GraphPad | Prism 8 | Análise estática |
| Estereomicroscópio | Nikon | SMZ1000 | Para dissecção da aorta |
| Estereomicroscópio | Olympus | SZX16 | Para imagens da aorta |
| Tamoxifeno | Sigma | T5648 | Para induzir a recombinação Cre-loxP |
| Tissue-Tek O.C.T Compound, Sakura Finetek | VWR | 25608-930 | |
| Pinça Estilo 4 | Microscopia Eletrônica Ciências | 0302-4-PO | Para cortar a pele do rato e abrir a caixa torácica |
| Pinça Estilo 5 | Microscopia Eletrônica Ciências | 0302-5-PO | Para dissecar e limpar a aorta |
Referências
- Lusis, A. J. Atherosclerosis. Nature. 407, 233-241 (2000).
- Emini Veseli, B., et al. Animal models of atherosclerosis. European Journal of Pharmacology. 816, 3-13 (2017).
- Plump, A. S., et al. Severe hypercholesterolemia and atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice created by homologous recombination in ES cells. Cell. 71, 343-353 (1992).
- Zhang, S. H., Reddick, R. L., Piedrahita, J. A., Maeda, N. Spontaneous hypercholesterolemia and arterial lesions in mice lacking apolipoprotein E. Science. 258, 468-471 (1992).
- Ishibashi, S., et al. Hypercholesterolemia in low density lipoprotein receptor knockout mice and its reversal by adenovirus-mediated gene delivery. Journal of Clinical Investigation. 92, 883-893 (1993).
- Nakashima, Y., Plump, A. S., Raines, E. W., Breslow, J. L., Ross, R. ApoE-deficient mice develop lesions of all phases of atherosclerosis throughout the arterial tree. Arteriosclerosis Thrombosis. 14, 133-140 (1994).
- Chen, P. Y., et al. Smooth muscle cell reprogramming in aortic aneurysms. Cell Stem Cell. 26, 542-557 (2020).
- Andres-Manzano, M. J., Andres, V., Dorado, B. Oil Red O and Hematoxylin and Eosin Staining for Quantification of Atherosclerosis Burden in Mouse Aorta and Aortic Root. Methods in Molecular Biology. 1339, 85-99 (2015).
- Chen, P. Y., et al. Endothelial TGF-beta signalling drives vascular inflammation and atherosclerosis. Nature Metabolism. 1, 912-926 (2019).
- Mehlem, A., Hagberg, C. E., Muhl, L., Eriksson, U., Falkevall, A. Imaging of neutral lipids by oil red O for analyzing the metabolic status in health and disease. Nature Protocols. 8, 1149-1154 (2013).
- Ferruzzi, J., Madziva, D., Caulk, A. W., Tellides, G., Humphrey, J. D. Compromised mechanical homeostasis in arterial aging and associated cardiovascular consequences. Biomechanics and Modeling Mechanobiology. 17, 1281-1295 (2018).
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Reimpressões e permissões
