Method Article

Estabilidade e Estrutura do Complexo de Histocompatibilidade Maior do Morcego Classe I com β Heterologous2-Microglobulina

DOI:

10.3791/61462

⸱

March 10th, 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Laboratory Medicine and Life Sciences, Wenzhou Medical University, 2NHC Key Laboratory of Biosafety, National Institute for Viral Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, 3Faculty of Health Sciences, University of Macau, 4CAS Key Laboratory of Pathogenic Microbiology and Immunology, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, 5Savaid Medical School, University of Chinese Academy of Sciences

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O protocolo descreve métodos experimentais para obter substituições estáveis do complexo de histocompatibilidade principal (MHC) classe I através de substituições potenciais β 2-microglobulina (β2m) de diferentes espécies. A comparação estrutural do MHC I estabilizada por homólogos e heteromaníacos β2m foram investigadas.

Abstract

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O maior complexo de histocompatibilidade (MHC) desempenha um papel fundamental na apresentação de peptídeos de antígeno e respostas imunes de células T contra doenças infecciosas e desenvolvimento de tumores. O MHC híbrido I complexo com β substituição heterologous β 2-microglobulina (β2m) de diferentes espécies pode ser estabilizado in vitro. Este é um meio viável para estudar MHC I de mamíferos, quando o homólogo β2m não está disponível. Enquanto isso, é indicado que a substituição de mamíferos β2m não afeta significativamente a apresentação de peptídeos. No entanto, há uma resumida limitada em relação à metodologia e à tecnologia para o MHC híbrido I complexizado com heterologos β 2-microglobulina (β2m). Nesse meio, são apresentados métodos para avaliar a viabilidade da β substituição de2m no estudo MHC I. Esses métodos incluem a preparação de construtos de expressão; purificação de corpos de inclusão e redobramento do complexo mhc; determinação da termoestabilidade proteica; triagem de cristal e determinação da estrutura. Este estudo fornece uma recomendação para a compreensão da função e estrutura do MHC I, e também é significativo para avaliação de resposta celular T durante doenças infecciosas e imunoterapia tumoral.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O maior complexo de histocompatibilidade (MHC) existe em todos os vertebrados e é um conjunto de genes que determina a imunidade mediada por células a patógenos infecciosos. A classe I do MHC apresenta peptídeos endógenos, como componentes virais produzidos após a infecção por vírus, aos receptores de células T (TCR) na superfície das células CD8+ T para mediar a imunidade celular e participar da regulação imunológica1. Um estudo estrutural de MHC I vinculando-se aos peptídeos fornece informações sobre motivos de ligação de peptídeos e características de apresentação por moléculas de MHC I, que desempenha papéis vitais na avaliação das respostas imunes de células CD8+ T e desenvolvimento de vacinas.

Desde a primeira cristalização e determinação estrutural do MHC I molecular por Bjorkman et al.2, a análise da estrutura cristalina das moléculas de MHC I promoveu muito a compreensão de como os peptídeos se ligam às moléculas de MHC I, e ajuda a entender a interação das cadeias leves com correntes pesadas e peptídeos. Uma série de estudos de acompanhamento indicaram que, embora os genes que codificam a cadeia de luz não esteja associados ao MHC, a cadeia de luz é uma proteína chave para o montagem de moléculas de MHC I3,4. Ele interage com os três domínios das moléculas da classe I do MHC em múltiplas superfícies. Quando a cadeia de luz está ausente, as moléculas classe I do MHC não podem ser corretamente expressas na superfície das células que apresentam antígenos e não podem interagir com o TCR para exercer suas funções imunológicas.

MHC I é composto por uma corrente pesada (cadeia H) e cadeia leve (ou seja, β 2-microglobulina (β2m)), e é montado através de ligação a um peptídeo adequado5. O segmento extracelular da cadeia H consiste nos domínios α1, α2 e α36. Os domínios α1 e α2 formam o sulco de ligação de peptídeo (PBG). A cadeia βde 2m atua como subunidade estrutural do complexo conjunto em MHC I, estabilizando a conformação do complexo, e é uma acompanhante molecular para a cadeia MHC I H dobrando7,8,9. Uma série de estudos mostraram que cadeias MHC I H de vários mamíferos, como morcego (Chiroptera) (Ptal-N*01:01)10, rhesus macaque (Primatas) (Mamu-B*17)11 (Mamu-A*01)12 (Mamu-A*02)13, mouse (Rodentia) (H-2Kd)14,15, cão (Carnivora) (DLA-88 * 50801)16, gado (Artiodactyla) (BoLA-A11)17 e equino (Periss eodactyla) (Eqca-N*00602 e Eqca-N*00601)18 podem combinar com heterologos β2m(Tabela 1). Essas moléculas híbridas são frequentemente usadas em estudos estruturais e funcionais. No entanto, ainda não está resumida a metodologia para o estudo funcional e estrutural do HÍBRIDO MHC I com β heterologos de2m. Enquanto isso, a base estrutural para o intercambio β2m entre diferentes taxas permanece incerta.

Aqui, o procedimento para expressão de MHC I, redobramento, cristalização, coleta de dados de cristal e determinação da estrutura são resumidos. Além disso, são analisadas substituições potenciais de β2m de diferentes espécies através da comparação da conformação estrutural do MHC I estabilizada por β homônomo e heteróloga de2m. Esses métodos serão úteis para mais estudo estrutural MHC I e avaliação de resposta imune de células CD8+ T em câncer e doenças infecciosas.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Preparação de construções de expressão

  1. Recuperar as sequências de genes classe I do MHC (incluindo genes previstos) de morcegos do banco de dados NCBI.
  2. Recuperar maiores sequências de cadeia pesada mhc i do Banco de Dados de Polimorfismo de Imuno (IPD) (www.ebi.ac.uk/ipd/mhc) e do banco de dados UniProt (www.uniprot.org).
  3. Para obter complexos solúveis de MHC, mutagenize as sequências para remover as regiões citosolicas e transmembranas.
  4. Clone os genes que codificam os ectodomínios do morcego Ptal-N*01:01 (GenBank no. KT98792919) (resíduos 1-277) e bat β2m (GenBank no. XP_006920478.1) (resíduos 1-98) em vetores pET-28a (Novagen, Pequim, China), respectivamente.
  5. Inserir as sequências otimizadas (para Escherichia coli) foram inseridas entre os locais NcoI e EcoR1 de um vetor pET-28a modificado.
  6. Construa β plasmídeos de expressão de2m de expressão humanos como descrito anteriormente20.

2. Síntese de peptídeos

  1. Previsão de peptídeos
    1. Como descrito anteriormente10, para tela para peptídeos que podem se ligar a Ptal-N*01:01, prever peptídeos candidatos usando os corpos proteicos de vírus relacionados com morcegos hendra vírus (HeV). Para obter peptídeos de alta afinidade com base no modelo estrutural do servidor online, o servidor NetMHCpan 4.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan/)21 e o Rosetta FlexPepDock22 previram potencial de ligação na fração de peptídeo selecionado. Além disso, outros softwares e bancos de dados, incluindo BIMAS, o Immune Epitope Database (IEDB), NetCTL 1.2 e SYFPEITHI também podem ser usados, todos eles integrando a previsão de afinidade de ligação peptídeo-MHC, transportador associado à eficiência de transporte de antígenos (TAP), decote terminal C proteasomal e meio tempo de dissociação de moléculas classe I peptídeo-HLA em suas leituras.
    2. Para prever peptídeos de alta vinculação, use tanto o servidor NetMHCpan quanto o Rosetta FlexPepDock.
      NOTA: Infelizmente, nem as previsões produzidas coincidiram com os dados experimentais. Isso pode indicar que as previsões atuais de peptídeos de ligação do MHC não eram adequadas para mamíferos não humanos e não-camundongos, como morcegos, que podem ter uma maneira diferente de ligação de peptídeos. Portanto, precisamos combinar vários softwares de predição e resultados experimentais para análise abrangente para obter peptídeos de alta afinidade.
  2. Preparação e preservação de peptídeos
    1. Em vez de gerar peptídeos personalizados, use prestadores de serviços especializados. Compre todos os peptídeos comercialmente seguindo as ferramentas de previsão de peptídeos, que têm uma pontuação de ligação mais alta. A pureza do peptídeo foi determinada a ser >95% pelo HPLC e espectrometria de massa.
    2. Armazene todos os peptídeos adquiridos como pó congelado a −80 °C e dissolva em sulfóxido de dimetila (DMSO) antes de usar.

3. Purificação de corpos de inclusão

  1. Transformação de E. coli
    1. Transforme 10 ng de plasmid contendo morcego MHC I Ptal-N*01:01 H cadeia, ou humano β2m ou morcego β2m em 100 μL de BL21(DE3) E. coli. Tome banho no gelo por 30 minutos.
    2. Choque térmico a 42 °C para 90 s, seguido de banho no gelo por 2 min.
    3. Adicione 800 μL de caldo de lise (LB: extrato de levedura, tripona e NaCl; consulte a Tabela de Materiais) para pisar 3.1.2 e agitar a 200 rotações por minuto (rpm) em uma plataforma de balanço a 37 °C por 20 min.
    4. Aplique 100 μL de suspensão bacteriana na placa contendo a resistência a antibióticos correspondente (ampicilina: 100 ng/mL), que são iguais às construções anteriores.
  2. Culturas inoculadas
    1. Escolha um único clone bacteriano recentemente transformado em 3 mL de LB com meio antibiótico (ampicillina: 100 ng/mL) e cultura a 37 °C, enquanto treme a 200 rpm em uma plataforma de balanço para ativar a bactéria. Culturas podem ser inoculadas tarde da noite, para estarem prontas para indução na manhã seguinte.
    2. Uma noite antes, transfira 500 μL do estoque bacteriano ativado para 50 mL de LB com meio antibiótico (ampicillina: 100 ng/mL) e incubar durante a noite a 37 °C, tremendo a 200 rpm. Para conveniência ao preparar o próximo inoculado, congele o estoque bacteriano ativado restante em alíquotas de 1 mL (500 μL de cultura com 500 μL de 40% de glicerol) a −80 °C até que a próxima preparação seja necessária.
    3. Para gerar grandes quantidades de proteína recombinante, transfira a preparação bacteriana para 2 L de LB com meio antibiótico (ampicillina: 100 ng/mL) a uma proporção de 1:100, incubar a 37 °C enquanto treme a 200 rpm. Cultura até que uma absorção de 0,6 a 600 nm seja alcançada. Adicionar 1 mM isopropílico-1-thio-β-D-galactopyranoside (IPTG) (variar a concentração de IPTG para diferentes MHCs, principalmente entre 0,1 mM-1 mM) ao frasco para indução de expressão proteica.
  3. Bactérias de colheita
    1. Transfira a bactéria para garrafas centrífugas e centrífuga a 5000 x g por 20 min a 4 °C. Todos os passos a partir de agora devem ser realizados a 4 °C.
    2. Resuspenque as bactérias em 60 mL de soro fisiológico tampão de fosfato (PBS) e liblua a proteína recombinante expressa por disruptor de células ultrassônicas.
      NOTA: Em geral, o programa que definimos nesta máquina é ultrassônico 6S, intervalo 12S, 300 W, 99 vezes).
  4. Purificação de corpos de inclusão
    1. Centrifugar a suspensão bacteriana sônica a 12.000 x g por 30 min. Descarte o supernasciente e resuspenque a pelota em um volume apropriado de tampão de lavagem (0,5% Triton-100, 50 mM Tris pH 8.0, 300 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mM DTT). Repita este processo mais uma vez.
    2. Centrifugar a 12.000 x g por 10-20 min. Descarte o supernasciente e resuspense os corpos de inclusão no tampão de resuspensão (50 mM Tris pH 8.0, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mM DTT). Remova uma amostra de 20 μL (corpos de inclusão no buffer de ressuspensão) para SDS-PAGE para testar a pureza dos corpos de inclusão.
    3. Centrifugar a preparação restante em 12.000 x g para 10-20 min. Descarte o supernaspeso. Pesar a pelota contendo os corpos de inclusão e adicionar tampão de dissolução (6 M Gua-HCl, 10% glicerina, 50 mM Tris pH 8.0, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA) a uma concentração final de 30 mg/mL. Mexa lentamente usando um agitador magnético a 4 °C até que os corpos de inclusão sejam dissolvidos no tampão de dissolução.
    4. Centrífuga 12.000 x g por 10-20 min. Descarte os precipitados. Armazene os corpos de inclusão a −20 °C ou −80 °C.
      NOTA: Antes de prosseguir com a purificação dos corpos de inclusão, confirme que a indução e a expressão da proteína recombinante foram bem sucedidas. Executar amostras de cada cultura (colhida antes e depois da indução do IPTG) em um gel de proteína; 15% SDS-PAGE (goma concentrada SDS-PAGE: H2O, 30% acrilamida, 1 M Tris-HCl pH 6.8, 10% SDS, 10% APS e TEMED; Gel de separação SDS-PAGE: H2O, 30% acrilamida, 1,5 M Tris-HCl pH 8,8, 10% SDS, 10% APS e TEMED; consulte a Tabela de Materiais ) para o β2m, 10% SDS-PAGE para a cadeia H.

4. Redobramento do complexo MHC

NOTA: A eficiência dos corpos de inclusão reamoscados afetará o rendimento da proteína obtida. O dobrável compete com a polimerização, por isso é geralmente aceito que re dobrar em baixas concentrações proteicas é o método mais bem sucedido. Neste artigo, a concentração dos corpos de inclusão é de 30 mg/mL.

  1. Prepare o tampão de re dobramento.
    1. Varie a composição do tampão de repato, dependendo da proteína. Por exemplo, o pH, a força iônica, as condições de redox e a presença de ligantes afetarão os resultados de re dobramento. O mais comum é usar buffers à base de Tris ou HEPES em um pH neutro com a concentração de NaCl de 50-500 mM, mas isso também depende da proteína alvo. A seguir, a fórmula tampão de redobramento usada neste artigo.
    2. Prepare o buffer dobrável com 100 mM Tris-HCl pH 8.0, 400 mM L-arginine, 2 mM EDTA-2Na.
    3. Esfrie o tampão a 4 °C em um frasco de 250-300 mL e, em seguida, adicione 5 mM de glutationa reduzida (GSH) e 0,5 mM glutationa oxidada (GSSG). Mexa lentamente usando um agitador magnético a 4 °C por mais 10-20 minutos antes de adicionar os corpos de inclusão e peptídeos.
  2. Injeção e diluição da cadeia H MHC e β2m
    NOTA: A temperatura em que o recadamento é realizado pode variar, embora geralmente, para minimizar a agregação, 4 °C é melhor. Usamos diluição para redobrar as proteínas.
    1. Utilizando uma agulha de uma seringa de 1 mL, injete 1 mL de corpos de inclusão hβ2m ou corpos de inclusão bβ2m em dois buffers de repato (1 litro cada), respectivamente. Injete perto da haste de agitação vigorosamente rotativa para obter diluição rápida e eficiente. β2m se reamtobra relativamente fácil e permanece estável mesmo na ausência da cadeia H.
    2. Após a β2m foi dissolvido em solução de redobramento, dissolver peptídeos (5 mg/mL) em DMSO e injetar rapidamente 200 μL na solução de repato. Mexa lentamente por 10-20 min antes de adicionar a corrente H.
    3. Injete a corrente H com o mesmo procedimento descrito acima para β2m. A cadeia H é muito instável; portanto, a ordem da injeção é bastante importante. Injete 3 mL de corpos de inclusão da cadeia H em dois buffers de repato diferentes (1 litro cada) com hβ2m ou bβ2m, respectivamente. A injeção consecutiva de pequenas alíquotas em vez da aplicação única de toda a quantidade de proteína aumenta o rendimento do MHC reutado. Deixe a redobramento a 4 °C para 8-10 h.
  3. Concentração de proteína reu dobrada
    1. Use ultrafiltração em uma câmara pressurizada com membrana MMCO de 10 kDa para concentração das proteínas de reabastece. Este método é conveniente e pode ser combinado com troca de buffer. Adicione buffer de troca (20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl pH 8.0) à câmara e concentre-se em um volume final de 30-50 mL.
    2. Transfira a solução de reabascamento para um tubo de centrífuga, gire a 12.000 x g por 15 min a 4 °C para remover precipitados.
    3. Transfira cuidadosamente o supernaste e concentre-se ainda mais em um volume final de ~1 mL.
    4. Centrifugar a 12.000 xg por 10-20 min. Transfira o supernante para um tubo estéril e purifique as proteínas usando uma coluna de exclusão de tamanho de GL de 10/300.
    5. Colete as amostras no pico e analise-as usando SDS-PAGE (gel de poliacrilamida de 15%).
    6. Colete o pico complexo de MHC e concentre-se em uma concentração final de 15 mg/mL.
    7. Diluir o complexo para 7,5 mg/mL e 15 mg/mL para cristalização.

5. Cristalização, coleta de dados e processamento

  1. Realize a cristalização de MHC complexo e peptídeo usando a técnica de difusão de vapor de gota sentada.
  2. Tela os complexos Ptal-N*01:01/peptídeos com kits de cristal comercial (por exemplo, kit crystal screen I/II, Index Screen kit, PEGIon kit I/II, e o kit PEGRx).
  3. Selar a solução resultante e equilibrar-se contra 100 μL de solução de reservatório a 4 ou 18 °C.
  4. Observe o crescimento cristalino da cultura por 3 dias, 1 semana, 2 semanas, 1 mês, 3 meses e 6 meses. Use um microscópio para ver se cada gota na placa de cristal tem cristais.
    NOTA: Os cristais Ptal-N*01:01/HeV1(bβ2m) foram observados em 0,2 M NaCl, 0,1 M Bis-Tris (pH 5,5) e 25% (w/v) glicol de polietileno 3.350 a uma concentração de 7,5 mg/mL. Os cristais ptal-N*01:01/HeV1(hβ2m) foram observados em 0,1 M HEPES, pH 7.0, 2% w/v polietileno glicol 3.350 em uma concentração de 7,5 mg/mL.
  5. Para proteção criogênica, transfira os cristais para uma solução de armazenamento contendo 20% de glicerol e depois esfrie rapidamente em um fluxo de nitrogênio gasoso de 100 K.
  6. Colete dados de difração de raios-X da linha de luz BL19U da instalação de radiação síncrotron de Xangai (Xangai, China).

6. Determinação e análises estruturais

  1. Com dados estruturais de alta resolução, processe e dimensione a força da coleta utilizando o programa Denzo e o pacote de software HKL2000 (https://hkl-xray.com/)23.
  2. Após a escolha de um modelo inicial melhor no Protein Data Bank (PDB), determine as estruturas utilizando substituição molecular com o programa Phaser MR em CCP424 (http://www.ccp4.ac.uk/). O modelo utilizado foi a estrutura coordenadas com o código 5F1I do Protein Data Bank (Banco de Dados de Proteínas).
  3. Use o modelo de raio-X refinado para o refinamento inicial da articulação. Use os modos de refino Phenix e articulação apenas para o raio-X e o refinamento de nêutrons e raios-X, respectivamente.
  4. Após cada rodada de refinamento, verifique manualmente o modelo contra Fo − Fc e 2Fo − Mapas de densidade nuclear positiva em Coot25 (https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/). Isso facilita a colocação adequada de águas e certos átomos D. Todas as figuras de estruturas foram criadas pelo PyMOL (http://www.pymol.org/).

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Results

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Trabalhos anteriores relataram que o peptídeo HeV-derivado do HeV (DFANTFLP) foi apresentado por Ptal-N*01:0110,19. Aqui, foi avaliada a capacidade de ligação deste peptídeo para Ptal-N*01:01 com morcego homólogo β2m (bβ2m) e

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A construção de um complexo proteico híbrido por meio de substituição heteróloga de diferentes taxas é uma estratégia comum para investigações funcionais e estruturais quando o complexo homólogo não está disponível, como no MHC I e seus ligantes. No entanto, há uma resumida limitada em relação à metodologia e à tecnologia. Aqui, foi analisada a estrutura do morcego MHC I, Ptal-N*01:01, estabilizada por bβ2m ou hβ2m. Os principais aminoácidos de β ligação de2m ao Ptal-N*01:01 foram encontr...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada a declarar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este estudo foi apoiado pelo fundo aberto do laboratório de biotecnologia farmacêutica da Universidade de Nan-jing, China (Grant no. KF-GN-201905), a Fundação Nacional de Ciência Natural da China (concede 81971501). William J. Liu é apoiado pelo Excelente Programa de Jovens Cientistas do NSFC (81822040) e pelo Plano de Ciência e Tecnologia de Pequim (Z181100006218080).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
milipore de Merck do kDa membrana de Merck miliporePLGC07610
30% de acrilamidaA3291-500ml*5
5× Carregamento de proteínaSDS NovoproteínaPM099-01A
AMICON ULTRA-15 15ML-10 KDa corteMerck milliporeUFC901096
AmpicilinaInalco1758-9314
APSSigmaA3678-100G
BL21 (DE3) cepaTIANGENCB105-02
DMSO MP219605580Use luvas adequadas e proteção para os olhos/rosto. Em caso de contato com os olhos, enxágue imediatamente com água em abundância e procure orientação médica.
TDTSolarbioD1070Luvas e óculos de proteção devem ser usados e operados em uma cozinha ventilada. Em caso de contato com os olhos, enxágue imediatamente com água em abundância e procure orientação médica.
EDTA-2NaKeyGEN BioTECHKGT515500
GlicerinaHUSHI10010618
GSHAmresco0399-250G
GSSGAmresco0524-100G
Cloridrato de guanidinaAmrescoE424-5KG
h & beta; 2mnosso laboratórioZhang, S. et al. Base estrutural da apresentação de alelos cruzados por HLA-A * 0301 e HLA-A * 1101 revelada por dois complexos peptídicos derivados do HIV. Mol Immunol. 49 (1-2), 395-401, (2011).
IPTGInalco1758-1400
Cloridrato de L-ArgininaAmresco0877-5KG
NaClSolarbioS8210
Marcador de ProteínaFermentas26614
SDSBoao Rui JingA112130
Superdex Aumento 200 10/300 GLGE Healthcare28990944
TEMEDThermo17919Luvas e óculos de proteção devem ser usados e operados em uma cozinha ventilada.
Tris-HClAmresco0497-5KG
Triton X-100BiorulerRH30056-100mL
TriptonaOxóideLP0042
Extrato de leveduraOxóideLP0021
10

References

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