Summary
I denne rapport præsenterer vi en protokol, der gør det muligt for efterforskeren at generere en musemodel af intraokulær uveitis. Mere almindeligt omtalt som eksperimentel autoimmun uveitis (EAU), fanger denne etablerede model mange aspekter af menneskelig sygdom. Heri vil vi beskrive, hvordan man inducerer og overvåger sygdomsprogression ved hjælp af flere aflæsninger.
Abstract
Eksperimentel autoimmun uveitis (EAU) drives af immunceller, der reagerer på selvantigener. Mange træk ved denne ikke-infektiøse, intraokulære inflammatoriske sygdomsmodel rekapitulerer den kliniske fænotype af posterior uveitis, der påvirker mennesker. EAU er blevet brugt pålideligt til at studere effekten af nye inflammatoriske behandlinger, deres virkningsmekanisme og til yderligere at undersøge de mekanismer, der understøtter sygdomsprogression af intraokulære lidelser. Her giver vi en detaljeret protokol om EAU-induktion i C57BL/6J-musen - den mest anvendte modelorganisme med modtagelighed for denne sygdom. Klinisk vurdering af sygdommens sværhedsgrad og progression vil blive demonstreret ved hjælp af fundoskopi, histologisk undersøgelse og fluorescein angiografi. Induktionsproceduren involverer subkutan injektion af en emulsion indeholdende et peptid (IRBP1-20) fra det okulære protein interfotoreceptor retinoidbindende protein (også kendt som retinolbindende protein 3), Complete Freunds Adjuvans (CFA) og suppleret med dræbt Mycobacterium tuberculosis. Injektion af denne viskøse emulsion på bagsiden af nakken efterfølges af en enkelt intraperitoneal injektion af Bordetella pertussis-toksin . Ved symptomdebut (dag 12-14) og under generel anæstesi tages fundoskopiske billeder for at vurdere sygdomsprogression gennem klinisk undersøgelse. Disse data kan sammenlignes direkte med dem på senere tidspunkter og peak disease (dag 20-22) med forskelle analyseret. Samtidig giver denne protokol efterforskeren mulighed for at vurdere potentielle forskelle i karpermeabilitet og skade ved hjælp af fluorescein angiografi. EAU kan induceres i andre musestammer - både vildtype eller genetisk modificeret - og kombineres med nye terapier, der giver fleksibilitet til at studere lægemiddeleffektivitet og / eller sygdomsmekanismer.
Introduction
Denne protokol vil demonstrere, hvordan man inducerer eksperimentel autoimmun uveitis (EAU) i C57BL/6J-musen ved en enkelt subkutan injektion af et retinalt antigen i en emulgeret adjuvans. Metoder til overvågning og vurdering af sygdomsprogression vil blive detaljeret gennem fundoskopisk billeddannelse og histologisk undersøgelse med måleparametre skitseret indeni. Derudover vil fluorescein angiografi, en teknik til undersøgelse af retinal blodkarstruktur og permeabilitet blive diskuteret.
Denne EAU-model rekapitulerer centrale træk ved ikke-infektiøs posterior uveitis hos mennesker med hensyn til klinisk-atologiske egenskaber og de grundlæggende cellulære og molekylære mekanismer, der driver sygdom. EAU medieres af Th1- og/eller Th17-undergrupper af selvreaktive CD4+T-lymfocytter, som vist i adoptivoverførselsforsøg og med IFNγ-depleterede mus1. Meget af vores forståelse af disse cellers potentielle roller i uveitis kommer fra at studere EAU2, hvor både Th1- og Th17-celler detekteres i nethindevævet3. Ofte bruges EAU som en præklinisk model til at vurdere nytten af nye terapier til dæmpning af sygdom. Terapeutiske tilgange, der med succes har moduleret EAU-sygdom, har vist en vis effektivitet i klinikken og nået FDA-godkendt status. Eksempler på disse er grupper af immunregulerende lægemidler såsom T-cellemålretningsterapier: cyclosporin, FK-506 og rapamycin 4,5,6. For nylig er interventioner rettet mod nye veje også blevet undersøgt i denne model for at undersøge både mekanisme og effekt på sygdomsresultatet. Disse omfatter målretning transkriptionel regulering gennem kromatinlæser, Bromodomain Extra-Terminal (BET) proteiner og P-TEFb-hæmmere3. Desuden har mere konventionelle tilgange såsom en VLA-4-hæmmer for nylig vist undertrykkelse i EAU via modulering af effektor CD4 + T-celler7. Derudover har målretning af Th17-celler med TMP778, en RORγt invers agonist, også vist sig at undertrykke EAU8 betydeligt. Desuden giver denne model mulighed for at studere kronisk autoimmun inflammation i nethinden og de ledsagende underliggende mekanismer såsom lymfocytpriming.
De primære udlæsninger til EAU prækliniske undersøgelser er klinisk vurdering ved at udføre retinal fundoskopibilleddannelse og mindre hyppigt ved at vurdere retinal integritet ved optisk kohærenstomografi (OCT). Retinal histopatologisk evaluering og immunofænotypning af retinale celler ved flowcytometri udføres derefter ved afslutning. Fundoskopi er et brugervenligt levende billeddannelsessystem, der giver mulighed for hurtig og reproducerbar klinisk vurdering af hele nethinden. Til immunohistokemiske vurderinger er teknikkerne baseret på forberedelse af retinale sektioner, der giver os mulighed for at studere vævsarkitektur for graden af inflammation og strukturel skade9. Vurderingskriterierne og de konventionelle pointsystemer for alle anvendte teknikker vil blive beskrevet i denne protokol. Omfanget af skader registreret ved hjælp af fundoskopisk billeddannelse korrelerer ofte tæt med histologiske ændringer. Denne dobbelte tilgang til overvågning og vurdering af sygdommens sværhedsgrad giver større følsomhed og mere pålidelige måleresultater.
EAU er en veletableret, almindeligt anvendt model til præklinisk test og undersøgelse af immunmedieret øjensygdom. Denne model er pålidelig og reproducerbar med >95% sygdomsforekomst og genererer omfattende data, der kan bruges til at validere eller afvise nye terapier til behandling af intraokulær inflammatorisk sygdom, der repræsenterer en væsentlig årsag til blindhed i den erhvervsaktive alderpå verdensplan 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forsøg blev udført i overensstemmelse med UK Animals (Scientific Procedures) Act of 1986 og Institutional Animal Welfare and Ethical Review Body (AWERB) retningslinjer.
1. Husing af C57BL/6J-mus
- Husmus i et specifikt patogenfrit miljø på en 12 timers lys-mørk cyklus og mad og vand til rådighed ad libitum.
- Udfør alle forsøg på voksne kvindelige C57BL/6J (kvinder vælges fortrinsvis, da der er en forekomst af kvinder til mænd 1,4 til 1 hos uveitispatienter). Randomiser kvindelige C57BL/6J-mus mellem 6-8 uger gamle efter vægt og alder. Opstald musene i individuelt ventilerede bure (IVC) i grupper på 5-6 mus pr. bur.
2. Immunisering af C57BL/6 mus
- IRBP1-20 - CFA emulsion forberedelse
BEMÆRK: Emulsionspræparat er afgørende for reproducerbarhed og forekomst af sygdom; Som sådan skal der gøres alt for at opretholde konsistens gennem hele forberedelsesprocessen og på tværs af eksperimenter. Ved fremstilling af emulsionen skal tab tages i betragtning ved beregningerne af alle reagenser på forhånd. Dette tab kan være ca. 1,5x (eller 50% ekstra af det forberedte volumen), baseret på antallet af mus, der er planlagt til immunisering. Se følgende eksempel nedenfor. For at immunisere 10 mus skal du forberede 15 mus og bruge 400 μg (peptid pr. 20 g mus) x 15 mus = 6 mg. Hver mus skal have 200 μL til immunisering (3 ml i alt). Det endelige volumen består af et 1: 1-forhold mellem peptidopløsning og CFA, dermed 1,5 ml peptidopløsning og 1,5 ml CFA.- Forbered alle sterile opløsninger i et laminært flowskab ved hjælp af aseptiske teknikker.
- Den ønskede mængde (400 μg pr. 20 g mus) af humant IRBP1-20 (LAQGAYRTAVDLESLASQLT) frysetørret peptid afvejes. Opløs peptid i 100% DMSO. Opbevar lagerbeholdning i frysetørret form ved -20 °C.
BEMÆRK: For at sikre, at pulveret er helt opløst, skal hver flage først komme i kontakt med DMSO'en og ikke vise tegn på resterende fast stof. Tilsæt PBS i små portioner for at nå det endelige volumen. Bland ikke med en hvirvel, brug i stedet blid omrøring med en pipette. Den endelige koncentration af DMSO bør ikke overstige 1% af det totale peptidpræparationsvolumen. Forberedelse af emulsionen i et 20 ml plastrør med en tilspidset bund bør muliggøre bedre adgang til DMSO til det frysetørrede pulver. - Der tilsættes DMSO-PBS-peptidopløsning ved 1:1 v/v til CFA, som allerede er suppleret med 1,5 mg/ml dræbt Mycobacterium tuberculosis , for at opnå en slutkoncentration på 2,5 mg/ml. Tilsæt dråbevis, pipetter forsigtigt og ofte for at danne en tyktflydende og jævnt fordelt emulsion.
- Luft peptidopløsningen og CFA ved hjælp af en 1000 μL pipette (indstillet til 700 μL for at forhindre yderligere tab) og pipette for at generere en cremet tyk konsistens. Denne teknik indebærer at bruge pipetten til gentagne gange at aspirere op og ned, indtil den ønskede tykkelse nås. For optimale resultater skal det sikres, at antigenopløsningen og adjuvansen blandes grundigt inden injektion.
- Intraperitoneal injektion af kighostetoksin
- 1,5 μg Bordetella pertussistoksin suspenderes i 100 μl RPMI 1640-medier suppleret med 1 % museserum11.
- Udfør i.p. injektionen med en steril sprøjte og 23G kanyle.
BEMÆRK: For at undgå forstyrrelser på injektionsstedet skal kighostetoksinet administreres, før antigenet injiceres. - Hver mus overføres midlertidigt til et separat bur for at få en enkelt injektion på 100 μL i.p. af Bordetella pertussis-toksin .
- Subkutan injektion af IRBP-emulsion
- Derefter injiceres IRBP-emulsionen subkutant. Denne proces kræver to dyrehandlere, der er behørigt udstyret med beskyttelse i henhold til sundheds- og sikkerhedsbestemmelser.
- Få en trænet person til let at fastholde musen oven på buret i en skrubbelignende position med maven nedad, mens den anden trænede person klemmer huden for at danne en teltlignende struktur på bagsiden af nakken, hvor nålen kan indsættes for at skelne mellem finger og tommelfinger.
FORSIGTIG: Der er fare for nålestiksskader. - Når nålen er placeret, injiceres 200 μL af IRBP-emulsionen. Når nålen fjernes, drejes nålehovedet for at lukke huden, før du trækker den ud, og tryk derefter på injektionsstedet for at forhindre tilbagesvaling af emulsionen.
FORSIGTIG: Emulsionen må ikke komme i kontakt med musehud eller pels, da dette kan forårsage irritation og i mere alvorlige tilfælde udvikle en læsion. Hvis dette sker, skal området straks tørres grundigt af med 70% ethanol og derefter tørres.
BEMÆRK: Hvis de drænende lymfeknuder er nødvendige til undersøgelse ved afslutningen af undersøgelsen, vil injektionsstedet være anderledes. I dette tilfælde injiceres 100 μL subkutant på begge sider af flanken. Dette vil generere et stærkere respons ved de drænende lyskelymfeknuder, som kan udskæres på høsttidspunktet. Men hvis det tilsigtede resultat udelukkende er at udvikle EAU, foretrækkes en enkelt injektion på 200 μL i nakken for at undgå ubehag fra flere injektionssteder.
3. Klinisk evaluering - musefundusundersøgelse
BEMÆRK: Klinisk sygdom skal scores ved hjælp af fundusundersøgelse, via bright-field live imaging ved hjælp af et fundoskop og Discover-software, der bruges til visualisering.
- Ved sygdomsdebut (dag 12-14), rolige mus under generel anæstesi ved hjælp af en kombination af både Ketamin (50 mg / ml) og Domitor (Medetomidin; 1 mg / ml). Fortynd 1-delt Domitor; 1,5 dele Ketamin og 2,5 dele sterilt injicerbart vand, injicer derefter 100 μL pr. 30 g intraperitonealt. Brug 1 ml sterile sprøjter og 23G nåle til ovennævnte kombination af anæstesi.
- Efter dette skal du overvåge musen for at sikre, at alle reflekser går tabt, og at den ikke reagerer på stimuli.
- Umiddelbart efter at have modtaget i.p. injektionen, og mens musen stadig holdes i en scruff, påføres 1% tropicamid og 2,5% phenylephrin topisk på hvert øje for pupiludvidelse. Målet er helt at dække hornhinden med begge dilaterende opløsninger. Det kan tage et par minutter, før pupillen er fuldt udvidet.
- Derefter skal du generøst anvende på øjet viskotårer salve og opretholde hele billeddannelsesprocessen for at holde øjet fuldt smurt og hydreret.
- I mellemtiden skal du åbne softwaren (f.eks. Discover) og indstille fundoskopet (f.eks. Micron) til at tage billeder under brightfield. Tildel hver enkelt mus en mappe og mærk billeder med R eller L i henhold til hvert fotograferet øje.
- Monter musen på en specialbygget scene til live visualisering, og placer mikroskopet for fuld adgang til nethinden.
- For at få en nøjagtig repræsentation af sygdommen skal du tage billeder af hele nethinden, der dækker alle hjørner af periferien ud over den optiske disk. For at opnå dette skal du justere okularet hele vejen igennem. Det er afgørende for øjet at forblive fuldt smurt hele tiden under hele billeddannelsesprocessen; Sørg for dette ved at fylde øjensalven op med en konstant hastighed.
- Se afsnit 4 (nedenfor) på dette stadium for at udføre fluorescein angiografi.
- Når al billeddannelse er afsluttet, fortyndes anæstetisk reversering anti-sedation (5 mg / ml Antisedan) i injicerbart vand og administreres ved 0,1 mg / kg i.p. Sæt musen tilbage i et bur og læg den på en forvarmet måtte med adgang til en våd-gennemblødt kost indtil genopretning. Komplet restitution er kendetegnet ved helkropsbevægelse og gå rundt i buret med stabil gang, hvilket typisk tager et par timer.
- Ved det angivne eksperimentelle endepunkt (f.eks. dag 21-23) gentages trin 4.1-4.5, og der tages billeder af hele nethindeområdet igen, der dækker synsskiven og alle hjørner af periferien for at fange en nøjagtig repræsentation af sygdommen.
4. Fluorescein angiografi
- For at måle beholderlækage hos disse dyr, mens de er under bedøvelse, skal du give hver mus en injektion på 2% fluorescein subkutant bag på nakken og placere således, at nethinden er centraliseret midt i det levende billede.
- Indstil fundoskopet til et blåt lys excitationsfilter ved 465-490 nm. Lyset fanget fra exciteret fluorescein er mellem 520-530 nm.
- Efter 1,5 min efter injektion med fluorescein skal du tage et billede af hver nethinde og gentage det igen efter 7 minutter.
BEMÆRK: Timing er afgørende for disse begivenheder, hvis det ikke er muligt at fange begge, skal du bare afbilde det ene øje.
5. Klinisk sygdomsscoring
- Basér den kliniske vurdering på sværhedsgraden af følgende kriterier: optisk diskbetændelse, retinal karmanchet, retinal vævsinfiltrat og strukturel skade.
- Giv hver af disse parametre en score på en skala fra 0 til 5, og den samlede total er repræsentativ for klinisk sygdom for hele øjet med en maksimal score på 20 opnåelige pr. Øje. Tabel 1 kan bruges som rettesnor for scoringskriterier.
6. Histologi og histologisk scoring
- Efter aflivning af musene ved cervikal forskydning, skal du enukleere øjnene ved at lirke øjenlågene fra hinanden for nem adgang til hele øjet.
- Placer derefter buede tang bag kloden med det formål at gribe fat i orbitalt bindevæv og optisk nerve. Pas på at undgå at klemme kloden.
- Til fiksering placeres øjet i 4% glutaraldehyd i mindst 15 minutter for at minimere nethindeløsning, og overfør derefter til 10% formaldehyd i mindst 24 timer. 1-2 ml fikseringsmiddel ville give nok volumen til at dække to øjne.
- Udfør indlejring i paraffin, sektionering på et mikrotomt og farvning i henhold til standardprotokoller. 3-4 μm sektionstykkelse anbefales til enhver form for farvning.
- Udfør histologisk undersøgelse af øjne ved hjælp af standardprotokoller for hæmatoxylin og Eosin (H&E) farvning.
- Tildel score på en skala fra 0-4 i henhold til kriterierne for EAU-scoring, baseret på omfanget af immuncelleinfiltrationen i nethinden og choroid, forstyrrelsen af retinalagene, graden af granulomdannelse og omfanget af nethindeløsning, hvilket indikerer retinal skade, som tidligere beskrevet (Agarwal 2013) og opsummeret i tabel 211.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne protokol beskriver vi en trinvis metode til at inducere en model af eksperimentel autoimmun uveitis (EAU) ved at immunisere mus med et uveitogent retinalt peptid afledt af IRBP. Vurdering af sygdomme, hvor der anvendes almindeligt anvendte og let tilgængelige metoder, er omfattet, selv om disse ikke udelukker og kan suppleres med eller delvis erstattes af andre billeddiagnostiske teknikker. De første tegn på EAU hos C57BL/6J-mus kan påvises to uger efter immunisering, og maksimal sygdom nås inden for tre uger som illustreret i figur 1. Fundoskopiske ændringer klassificeres under sygdomsprogression som inflammatoriske ændringer, som omfatter retinal væv, vaskulær og optisk diskbetændelse og retinal strukturel skade (figur 2) ud over histologiske ændringer baseret på infiltrering af immunceller og strukturel skade. Disse kliniske og histopatologiske ændringer kan påvises i op til 85 dage efter immunisering, og klassificeret og scoret til evaluering foreslår at studere sygdomsprogression. For at undgå utilsigtet bias i den kvalitative visuelle scoring skal billederne evalueres af mere end én ekspert, og scorere skal blindes for behandlingsgrupperne.
Vi viser her, hvordan de kliniske og histologiske scoringssystemer (tabel 1 og tabel 2) guider forskere til at kvantificere EAU-sværhedsgraden, validere effektiviteten af behandlinger og udforske mekanismen for lægemiddelvirkning. Vaskulær lækage er også et patologisk træk ved modellen og i human uveitis. Vi viser eksempler på vaskulær lækage af fluorescein (figur 3) som en anden metode til vurdering af sygdom i denne model.
Figur 1. Skematisk tidslinje for klinisk og histologisk sygdomsprogression i IRBP1-20 induceret EAU. En tidslinje, der markerede begyndelsen af infiltration og progression af IRBP1-20 inducerede EAU mod peak sygdom. Fra immunisering falder de første tegn på klinisk sygdom, som påvist ved fundoskopisk billeddannelse og histopatologisk analyse, mellem dag 12-14. Sygdommen vil derefter fortsætte med at udvikle sig i henhold til disse parametre, indtil et højdepunkt nås omkring dag 21-23. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2. Repræsentative fundoskopiske billeder, der korrelerer med histologiske sektioner på forskellige stadier af IRBP1-20 induceret EAU-sygdom hos C57BL/6J-mus. Kliniske fundoskopiske og tilsvarende vævsbilleder af C57BL/6J fra samme dyr immuniseret med IRBP 1-20 peptid. (A og B) fundoskopiske billeder og histologiske sektioner af øjet opnået fra raske og CFA-injicerede mus. Nethinden har ingen tegn på betændelse, og tilsvarende histologisektioner viser bevarede retinale lag. (C) Fundoskopisk billede af øjet taget fra C57BL/6J-mus 14 dage efter immunisering viser klassiske tegn på EAU, der viser alvorlig optisk diskushævelse i det tidlige stadium af sygdommen, tilsvarende histologi viser infiltrering af immunceller i glaslegemet. (D) Fundoskopiske billeder af øjet taget fra C57BL/6J-musen 21 dage efter immunisering viser tegn på, at karrene lægger sig i håndjern og infiltrerer immunpopulationerne. Histologidata viser alvorlige strukturelle ændringer ved retinal foldning (gule pile). V = beholder, O = optisk disk, R = nethinden, L = linse, Vit = glaslegeme, iO = betændt optisk disk, iV = betændt kar, iR = betændt nethinden, i = infiltrerende celler i glaslegeme, RF'er = retinale folder. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3. Repræsentative billeder af fluorescerende angiografi taget ved hjælp af Micron III billeddannelsessystem ved højeste sygdom. C57BL/6J-mus blev injiceret subkutant med 2% fluorescein og billeder taget på forskellige tidspunkter efter cirkulation af sporstoffet. (A) CFA kontrollerer kun mus taget 1,5 og 7 minutter efter administration af fluorescein. (B) Repræsentative billeder af IRBP1-20 immuniserede mus taget henholdsvis 1,5 og 7 minutter efter modtagelse af fluorescein. Hvid pil angiver fartøjslækage. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Score | Optisk disk | Retinale kar | Retinal væv infiltrere | Strukturelle skader | ||||
| 1 | Minimal betændelse | 1-4 milde manchetter | 1-4 små læsioner eller 1 lineær læsion | Retinale læsioner eller retinal atrofi, der involverer 1/4 til 3/4 retina område | ||||
| 2 | Mild betændelse | >4 milde manchetter eller 1-3 moderate manchetter | 5-10 små læsioner eller 2-3 lineære læsioner | Pan retinal atrofi med flere små læsioner (ar) eller <3 lineære læsioner (ar) | ||||
| 3 | Moderat betændelse | >3 moderate manchetter | >10 små læsioner eller >3 lineære læsioner | Pan retinal atrofi med >3 lineære læsioner eller sammenflydende læsioner (ar) | ||||
| 4 | Alvorlig betændelse | >1 Svær manchetter | Lineær læsion sammenflydende | Nethindeløsning med foldning | ||||
| 5 | * Ikke synlig (hvid ud eller ekstrem løsrivelse) | * Ikke synlig (hvid ud eller ekstrem løsrivelse) | * Ikke synlig (hvid ud eller ekstrem løsrivelse) | * Ikke synlig (hvid ud eller ekstrem løsrivelse) | ||||
Tabel 1. Konventionel klinisk scoringsskala til evaluering af EAU's kliniske sygdomssværhedsgrad. Tabel, der viser kriterier anvendt til at vurdere omfanget af sygdommens sværhedsgrad hos mus immuniseret med IRBP1-20. Scores blev tildelt i henhold til de kendetegn, der er skitseret ovenfor, der var synlige på fundusbillederne, hvert øje fik en samlet score ud af tyve. * På grund af tilsløring af infiltrat og nethindeløsning inde i det bageste kammer kan ikke vurderes. Tabel tilpasset med tilladelse fra Xu H., et al., 20088.
| Grad | Kriterier |
| 0 | Ingen ændring |
| 0,5 (spor) | Mild inflammatorisk celleinfiltration. Ingen vævsskade |
| 1 | Infiltration; retinale folder og fokale retinale løsrivelser; få små granulomer i choroid og nethinden, perivaskulitis |
| 2 | Moderat infiltration; retinale folder, løsrivelser og fokal fotoreceptorcelleskade; små til mellemstore granulomer, perivaskulitis og vaskulitis |
| 3 | Medium til kraftig infiltration; omfattende retinal foldning med løsrivelser, moderat fotoreceptorcelleskade; mellemstore granulomatøse læsioner; subretinal neovaskularisering |
Tabel 2. Histologisk scoring EAU
Tabel, der viser kriterier anvendt til at vurdere sværhedsgraden af EAU baseret på histopatologiske træk ved sygdom. Scores blev tildelt i henhold til de kendetegn, der er skitseret ovenfor på H&E-farvning, hvert øje fik en samlet score ud af fire. Tabel tilpasset med tilladelse fra Agarwal et al. 201311.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Eksperimentelle dyremodeller er nødvendige værktøjer til at studere sygdomspatogenese og præklinisk afprøvning af nye terapeutiske paradigmer. I den nuværende protokol har vi diskuteret en metode til inducering, overvågning og scoring af EAU, en eksperimentel model af intraokulær inflammatorisk uveitis. Denne EAU-model har mere end 95% sygdomsforekomst, når alle procedurer udføres i henhold til protokollen beskrevet heri, og resulterer i udvikling af kronisk, monofasisk EAU. For at opnå dette incidensniveau understreger vi vigtigheden af antigenpræparation og injektion af emulsionen, som begge er beskrevet ovenfor. De vigtigste træk ved EAU hos dyr er retinal og/eller choroidal inflammation, retinal vaskulitis, ødelæggelse af fotoreceptorer og synstab, som alle repræsenterer mange væsentlige kliniskpatologiske træk ved human posterior uveitis12. Meget af forståelsen af de grundlæggende cellulære og molekylære mekanismer, der er involveret i uveitis, stammer fra den inducerede EAU-model som beskrevet heri. EAU kan induceres hos mus13 og rotter11 ved aktiv immunisering med retinale antigener, der genkendes af lymfocytter. Disse retinale antigener antager mange former; IRBP (til mus) eller retinale opløselige antigener (S-Ag) til rotter. Inducering af EAU på en C57BL / 6J-baggrund genererer en mere kronisk form af sygdommen, med toppatologi observeret tre uger efter immunisering. Til sammenligning inducerer anvendelse af retinal antigen på en B10RIII-baggrund14 en akut-monofasisk og klinisk alvorlig form for EAU, hvor toppatologi typisk præsenterer sig inden for to uger efter induktion, og sygdommen aftager i uge 3.
Forskellige IRBP-epitoper er blevet testet i C57BL/6J-mus, og IRBP1-20-peptid har vist sig at være en reproducerbar model med en høj forekomst og sværhedsgrad. For nylig er en ny uveitogen epitop af IRBP, aminosyrerester 651 til 670 af human IRBP, blevet rapporteret at inducere EAU med en højere klinisk forekomst og alvorlig sygdomsmanifestation11 og kan anvendes foretrækkes, hvis dette opfylder de videnskabelige mål. Da virkningen af tarmkommensal mikrobiota og aktiveringen af autoreaktive T-cellereceptorer (TCR'er) vides at interferere med sygdommens begyndelse ved anvendelse af forskellige antigener15, anbefaler vi begyndere på dette område at bruge enten hIRBP1-20 eller hIRBP651-670 peptider i en dosis titreret mellem 300-500 μg for at opnå en pålidelig model. Faktisk er variabilitet i denne model blevet dokumenteret andetsteds med rapporter, der fremhæver vigtigheden af forskelle mellem boligsystemer og mikrobiomet, som kan påvirke sygdommens sværhedsgrad og forekomst15. Således kan mere eller mindre peptidantigen og kighostetoksin være påkrævet.
Der er en række andre modeller, som vores beskrevne analyse kan udføres på. Disse omfatter spontan uveitis, der udvikler sig i IRBP T-cellereceptor (TCR) transgene (R161H) mus, hvor okulær inflammation udvikler sig ved 5-6 ugers alderen16. EAU kan også adoptivt induceres ved at overføre uveitogene effektor CD4 + T-celler. Aktiverede, IRBP-specifikke CD4+T-celler afledt af primede mus kan bruges som kilde til effektorceller 3,11. Denne model repræsenterer effektorfasen af sygdommen, samtidig med at man undgår kompleksiteten ved at bruge CFA i den inducerbare model.
Derudover er der mange fordele ved at bruge okulære inflammatoriske modeller som passende værktøjer til at undersøge andre inflammatoriske sygdomme, især dem med effektor Th1 og Th17 delmængdepatologi. De vigtigste fordele ved at bruge denne model er de ikke-invasive og kvantificerbare metoder til overvågning af sygdomsudvikling og progression, som er fundoskopi og angiografi. Disse ikke-invasive billeddannelsessystemer giver nem adgang til neuronalt væv, der ellers ville være skjult bag beskyttende anatomiske barrierer. Yderligere metoder til overvågning af sygdomsprogression omfatter anvendelse af OCT-billeddannelse, som er mere følsom end fundoskopisk billeddannelse til påvisning af cellulære infiltrater, især i den tidlige fase af EAU-debut. Teknikken tillader flerlags tvær- og horisontale snitvisualiseringer af nethinden i længderetningen og på en ikke-invasiv måde. In vivo OCT-billeddannelse tilføjer oplysninger om nethindetykkelse, som ikke kunne opnås ved fundoskopiske og histologiske undersøgelser17. I stigende grad vil tilgængeligheden af endnu mere sofistikerede ikke-invasive billeddannelsesteknikker, såsom adaptiv optik, scanning, laseroftalmoskopi og multimodale billeddannelsesværktøjer yderligere fremme vores kapacitet til at undersøge denne sygdom hos små gnavere. Desuden giver evnen til at dissekere og isolere residente og infiltrerende cellepopulationer til dybere analyse af immunofænotyper ved hjælp af teknikker som flowcytometri store muligheder for at levere indsigtsfuld information.
Der er et par etablerede scoringssystemer baseret på kliniske kriterier opnået fra fundoskopi 8,9,18. Mens disse adskiller sig lidt mellem oftalmologiske forskningscentre, er alle pålidelige, korrelerer med histopatologiske træk og er i stand til nøjagtigt at afspejle sygdommens sværhedsgrad. I den aktuelle undersøgelse henviser vi til scoringssystemet udviklet af Xu et al.8. Dette system tilbyder en mere detaljeret vurderingsmetode med et større antal kliniske måleparametre. Det omfatter en maksimal score på 20, hvilket introducerer et bredere vindue for scoring end alternative systemer, der er begrænset til maksimalt 5. Dette er vigtigere for yderligere udforskning inden for terapeutiske tilgange. Minimering af operatørfejl er imidlertid afgørende, når der anvendes et så raffineret og detaljeret sæt parametre, og det kan kræve omhyggelig uddannelse af operatøren og uafhængig validering af fortolkningen.
Her præsenterer vi en protokol til at inducere EAU hos kvindelige C57BL / 6-mus, da der er en øget forekomst af kvinder: mænd 1.4: 1, der præsenterer uveitis i den kliniske indstilling. Ikke desto mindre bør kønnet på de mus, der anvendes til at fremkalde autoimmun sygdom, overvejes, da dette kan påvirke cytokinmiljøet11 og også afsløre vigtige forskelle i den måde, de reagerer på terapeutisk intervention. En anden overvejelse er musenes alder ved sygdomsinduktion. For eksempel har vi undersøgt aldersafhængighed af modtagelighed hos B10RIII-mus og konkluderet, at mus over 8 ugers levetid har en lavere forekomst af EAU (upubliceret undersøgelse fra vores gruppe).
Afslutningsvis har dyremodeller for intraokulær sygdom givet et uvurderligt værktøj til at studere human posterior uveitis og har lettet udviklingen af nye terapier såsom CsA. Imidlertid reproducerer ingen dyremodel i sig selv det fulde spektrum af menneskelig uveitis, da hver har unikke egenskaber, der gør den egnet til at studere bestemte aspekter af sygdommen. Denne EAU-model induceres af autoimmunitet ved anvendelse af IRBP-peptid suppleret med adjuvanser, der udløser medfødte immunresponser. Det vides imidlertid ikke, om alle former for posterior uveitis hos mennesker er autoimmune, og om antigen efterligning er en udløsende faktor. Derudover er det ikke klart, om der er en sammenhæng med infektion i at udløse human uveitis. Ikke desto mindre er modellen beskrevet heri en nyttig og reproducerbar generisk model, der kan bruges til at indsamle nyttige oplysninger om ætiologi, patogenese og terapi af denne synstruende sygdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at erklære med dette værk.
Acknowledgments
JG blev tildelt en UCL Impact Studentship og Rosetrees Trust finansiering til støtte for CB. VC modtog et forskningssamarbejdsstipendium fra Akari Therapeutics Inc. Vi vil gerne takke UCL Institute of Ophthalmology, Biological Service Unit, især fru Alison O'Hara og hendes team for deres tekniske support.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| antisedan | ZOETIS, USA | for waking up | |
| Complete Freund’s Adjuvant; CFA | Sigma, UK | F5881 | for immunisation |
| Domitor | Orion Pharma, Finland | for anesthesia | |
| Flourescein | Sigma, UK | F2456 | for Angiography |
| IRBP1-20 | Chamberidge peptide, UK | peptide;antigen | |
| Ketamine | Orion Pharma, Finland | for anesthesia | |
| Micron III | Phoenix Research, USA | for fundoscopy | |
| Mouse Serum | Sigma, UK | M5905 | for immunisation |
| Mycobacterium terberculosis | Sigma, UK | 344289 | for immunisation |
| Pertussis Toxin | Sigma, UK | P2980 | for immunisation |
| phenylephrine hydrochloride 2.5% | Bausch & Lomb UK | PHEN25 | for dilation |
| Tropicamide 1% | SANDOZ | for dilation | |
| Viscotears | WELDRICKS Pharmacy, UK | 2082642 | for eye lubrication |
References
- Lyu, C., et al. TMP778, a selective inhibitor of RORgammat, suppresses experimental autoimmune uveitis development, but affects both Th17 and Th1 cell populations. The European Journal of Immunology. 48, 1810-1816 (2018).
- Klaska, I. P., Forrester, J. V.
- Eskandarpour, M., Alexander, R., Adamson, P., Calder, V. L. Pharmacological Inhibition of Bromodomain Proteins Suppresses Retinal Inflammatory Disease and Downregulates Retinal Th17 Cells. The Journal of Immunology. 198, 1093-1103 (2017).
- Mochizuki, M., et al. Preclinical and clinical study of FK506 in uveitis. Current Eye Research. 11, Suppl 87-95 (1992).
- Nguyen, Q. D., et al. Intravitreal Sirolimus for the Treatment of Noninfectious Uveitis: Evolution through Preclinical and Clinical Studies. Ophthalmology. 125, 1984-1993 (2018).
- Leal, I., et al. Anti-TNF Drugs for Chronic Uveitis in Adults-A Systematic Review and Meta-Analysis of Randomized Controlled Trials. Frontiers in Medicine (Lausanne). 6, 104 (2019).
- Chen, Y. H., et al. Functionally distinct IFN-?+ IL-17A+ Th cells in experimental autoimmune uveitis: T-cell heterogeneity, migration, and steroid response. European Journal of Immunology. 50 (12), 1941-1951 (2020).
- Xu, H., et al. A clinical grading system for retinal inflammation in the chronic model of experimental autoimmune uveoretinitis using digital fundus images. Experimental Eye Research. 87, 319-326 (2008).
- Copland, D. A., et al. The clinical time-course of experimental autoimmune uveoretinitis using topical endoscopic fundal imaging with histologic and cellular infiltrate correlation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49, 5458-5465 (2008).
- Dick, A. D. Doyne lecture 2016: intraocular health and the many faces of inflammation. Eye (Lond). 31, 87-96 (2017).
- Agarwal, R. K., Silver, P. B., Caspi, R. R. Rodent models of experimental autoimmune uveitis. Methods in Molecular Biology. 900, 443-469 (2012).
- Caspi, R. R. A look at autoimmunity and inflammation in the eye. Journal of Clininical Investigation. 120, 3073-3083 (2010).
- Caspi, R. R., et al. Mouse models of experimental autoimmune uveitis. Ophthalmic Research. 40, 169-174 (2008).
- Shao, H., et al. Severe chronic experimental autoimmune uveitis (EAU) of the C57BL/6 mouse induced by adoptive transfer of IRBP1-20-specific T cells. Experimental Eye Research. 82, 323-331 (2006).
- Horai, R., et al. Microbiota-Dependent Activation of an Autoreactive T Cell Receptor Provokes Autoimmunity in an Immunologically Privileged Site. Immunity. 43, 343-353 (2015).
- Chen, J., et al. Comparative analysis of induced vs. spontaneous models of autoimmune uveitis targeting the interphotoreceptor retinoid binding protein. PLoS One. 8, 72161 (2013).
- Chen, J., Qian, H., Horai, R., Chan, C. C., Caspi, R. R. Use of optical coherence tomography and electroretinography to evaluate retinal pathology in a mouse model of autoimmune uveitis. PLoS One. 8, 63904 (2013).
- Harry, R., et al. Suppression of autoimmune retinal disease by lovastatin does not require Th2 cytokine induction. Journal of Immunology. 174, 2327-2335 (2005).
