Summary
In diesem Bericht stellen wir ein Protokoll vor, das es dem Prüfarzt ermöglicht, ein Mausmodell der intraokularen Uveitis zu erstellen. Dieses etablierte Modell, das gemeinhin als experimentelle Autoimmun-Uveitis (EAU) bezeichnet wird, erfasst viele Aspekte menschlicher Erkrankungen. Im Folgenden beschreiben wir, wie das Fortschreiten der Krankheit mit mehreren Ablesungen induziert und überwacht werden kann.
Abstract
Die experimentelle Autoimmun-Uveitis (EAU) wird von Immunzellen angetrieben, die auf Selbstantigene reagieren. Viele Merkmale dieses nicht-infektiösen, intraokularen Entzündungskrankheitsmodells rekapitulieren den klinischen Phänotyp der posterioren Uveitis, die den Menschen betrifft. EAU wurde zuverlässig eingesetzt, um die Wirksamkeit neuartiger Entzündungstherapeutika und ihre Wirkungsweise zu untersuchen und die Mechanismen weiter zu untersuchen, die das Fortschreiten der Erkrankung bei intraokularen Erkrankungen unterstützen. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur EAU-Induktion in der C57BL/6J-Maus zur Verfügung - dem am weitesten verbreiteten Modellorganismus mit Anfälligkeit für diese Krankheit. Die klinische Beurteilung des Schweregrads und des Fortschreitens der Erkrankung wird mittels Fundoskopie, histologischer Untersuchung und Fluoreszenzangiographie nachgewiesen. Das Induktionsverfahren beinhaltet die subkutane Injektion einer Emulsion, die ein Peptid (IRBP1-20) aus dem okulären Protein Interphotorezeptor-Retinoid-bindendes Protein (auch bekannt als Retinol-bindendes Protein 3), Complete Freund's Adjuvans (CFA) enthält und mit abgetötetem Mycobacterium tuberculosis ergänzt wird. Auf die Injektion dieser viskosen Emulsion in den Nacken folgt eine einmalige intraperitoneale Injektion von Bordetella pertussis-Toxin . Zu Beginn der Symptome (Tag 12-14) und unter Vollnarkose werden fundoskopische Bilder gemacht, um das Fortschreiten der Krankheit durch klinische Untersuchung zu beurteilen. Diese Daten können direkt mit denen zu späteren Zeitpunkten und dem Höhepunkt der Erkrankung (Tag 20-22) verglichen werden, wobei Unterschiede analysiert werden. Gleichzeitig ermöglicht dieses Protokoll dem Forscher, mögliche Unterschiede in der Gefäßpermeabilität und -schädigung mittels Fluoreszenzangiographie zu beurteilen. EAU kann in anderen Mausstämmen - sowohl Wildtyp- als auch in gentechnisch veränderten - induziert und mit neuartigen Therapien kombiniert werden, die Flexibilität für die Untersuchung der Wirksamkeit von Medikamenten und/oder Krankheitsmechanismen bieten.
Introduction
Dieses Protokoll wird zeigen, wie die experimentelle Autoimmun-Uveitis (EAU) bei der C57BL/6J-Maus durch eine einzige subkutane Injektion eines retinalen Antigens in ein emulgiertes Adjuvans induziert werden kann. Methoden zur Überwachung und Beurteilung des Krankheitsverlaufs werden durch fundoskopische Bildgebung und histologische Untersuchung detailliert beschrieben, wobei die Messparameter darin beschrieben sind. Darüber hinaus wird die Fluoreszenzangiographie, eine Technik zur Untersuchung der Struktur und Permeabilität der retinalen Blutgefäße, diskutiert.
Dieses EAU-Modell rekapituliert zentrale Merkmale der nicht-infektiösen posterioren Uveitis beim Menschen in Bezug auf die klinisch-pathologischen Merkmale und die grundlegenden zellulären und molekularen Mechanismen, die die Krankheit antreiben. EAU wird durch Th1- und/oder Th17-Untergruppen von selbstreaktiven CD4+T-Lymphozyten vermittelt, wie in adoptiven Transferexperimenten und bei IFNγ-depletierten Mäusengezeigt wurde 1. Ein Großteil unseres Verständnisses der möglichen Rolle dieser Zellen bei Uveitis stammt aus der Untersuchung von EAU2, bei der sowohl Th1- als auch Th17-Zellen in den Netzhautgeweben nachgewiesen werden3. Häufig wird EAU als präklinisches Modell verwendet, um den Nutzen neuartiger Therapien bei der Abschwächung von Krankheiten zu bewerten. Therapeutische Ansätze, die die EAU-Krankheit erfolgreich moduliert haben, haben in der Klinik eine gewisse Wirksamkeit gezeigt und den von der FDA zugelassenen Status erreicht. Beispiele hierfür sind Gruppen von immunregulatorischen Medikamenten wie die T-Zell-Targeting-Therapien: Ciclosporin, FK-506 und Rapamycin 4,5,6. In jüngster Zeit wurden in diesem Modell auch Interventionen untersucht, die auf neuartige Signalwege abzielen, um sowohl den Mechanismus als auch die Wirkung auf den Krankheitsverlauf zu untersuchen. Dazu gehört die gezielte Transkriptionsregulation durch Chromatin-Reader, Bromodomain Extra-Terminal (BET)-Proteine und P-TEFb-Inhibitoren3. Darüber hinaus haben konventionellere Ansätze wie ein VLA-4-Inhibitor kürzlich eine Unterdrückung der EAU durch Modulation von Effektor-CD4+ T-Zellen gezeigt7. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass das Targeting von Th17-Zellen mit TMP778, einem inversen RORγt-Agonisten, auch EAU8 signifikant unterdrückt. Darüber hinaus bietet dieses Modell die Möglichkeit, chronische Autoimmunentzündungen in der Netzhaut und die damit verbundenen zugrunde liegenden Mechanismen wie das Lymphozyten-Priming zu untersuchen.
Die primären Messwerte für präklinische EAU-Studien sind die klinische Beurteilung durch die Durchführung einer retinalen Fundoskopie und seltener durch die Beurteilung der Netzhautintegrität durch optische Kohärenztomographie (OCT). Die histopathologische Beurteilung der Netzhaut und die Immunphänotypisierung der Netzhautzellen durch Durchflusszytometrie erfolgen dann am Ende der Sitzung. Die Fundoskopie ist ein einfach zu bedienendes Live-Bildgebungssystem, das eine schnelle und reproduzierbare klinische Beurteilung der gesamten Netzhaut ermöglicht. Für immunhistochemische Untersuchungen basieren die Techniken auf der Präparation von Netzhautschnitten, die es uns ermöglichen, die Gewebearchitektur auf den Grad der Entzündung und der strukturellen Schädigung zu untersuchen9. Die Bewertungskriterien und die herkömmlichen Bewertungssysteme für alle verwendeten Techniken werden in diesem Protokoll beschrieben. Das Ausmaß der Schädigung, die mittels fundoskopischer Bildgebung erfasst wird, korreliert oft eng mit histologischen Veränderungen. Dieser duale Ansatz zur Überwachung und Bewertung des Schweregrads der Erkrankung bietet eine höhere Sensitivität und zuverlässigere Messergebnisse.
EAU ist ein etabliertes, häufig verwendetes Modell für die präklinische Prüfung und Untersuchung von immunvermittelten Augenerkrankungen. Dieses Modell ist zuverlässig und reproduzierbar mit einer Inzidenz von >95% und generiert umfassende Daten, die verwendet werden können, um neue Therapien zur Behandlung von intraokularen entzündlichen Erkrankungen, die weltweit eine der Hauptursachen für Blindheit im erwerbsfähigen Alter darstellen, zu validieren oder abzulehnen10.
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Protocol
Alle Versuche wurden in Übereinstimmung mit dem UK Animals (Scientific Procedures) Act von 1986 und den Richtlinien des Animal Welfare and Ethical Review Body (AWERB) durchgeführt.
1. Gehäuse C57BL/6J Mäuse
- Hausmäuse in einer spezifischen, erregerfreien Umgebung, in einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus und Nahrung und Wasser ad libitum verfügbar.
- Führen Sie alle Experimente an erwachsenen weiblichen C57BL/6J durch (Frauen werden bevorzugt ausgewählt, da die Inzidenz von Frauen zu Männern bei Uveitis-Patienten 1,4 zu 1 beträgt). Randomisieren Sie weibliche C57BL/6J-Mäuse im Alter zwischen 6-8 Wochen nach Gewicht und Alter. Halten Sie die Mäuse in einzeln belüfteten Käfigen (IVC) in Gruppen von 5-6 Mäusen pro Käfig.
2. Immunisierung von C57BL/6-Mäusen
- IRBP1-20 - CFA-Emulsionsvorbereitung
ANMERKUNG: Die Emulsionsherstellung ist für die Reproduzierbarkeit und Häufigkeit von Krankheiten unerlässlich. Daher müssen alle Anstrengungen unternommen werden, um die Konsistenz während des gesamten Vorbereitungsprozesses und zwischen den Experimenten zu wahren. Bei der Herstellung der Emulsion sollte der Verlust in den Berechnungen aller Reagenzien im Voraus berücksichtigt werden. Dieser Verlust kann etwa das 1,5-fache (oder 50% des vorbereiteten Volumens) betragen, basierend auf der Anzahl der Mäuse, die für die Immunisierung vorgesehen sind. Bitte sehen Sie sich das folgende Beispiel unten an. Um 10 Mäuse zu immunisieren, bereiten Sie 15 Mäuse vor und verwenden Sie 400 μg (Peptid pro 20 g Maus) x 15 Mäuse = 6 mg. Jede Maus sollte 200 μl zur Immunisierung erhalten (3 ml insgesamt). Das endgültige Volumen umfasst ein Verhältnis von 1:1 von Peptidlösung und CFA, also 1,5 ml Peptidlösung und 1,5 ml CFA.- Bereiten Sie alle sterilen Lösungen in einer Laminar-Flow-Werkbank unter aseptischen Bedingungen vor.
- Die gewünschte Menge (400 μg pro 20 g Maus) des lyophilisierten Peptids IRBP1-20 (LAQGAYRTAVDLESLASQLT) wird abgewogen. Peptid in 100% DMSO auflösen. Lagerware in lyophilisierter Form bei -20 °C lagern.
HINWEIS: Um sicherzustellen, dass das Pulver vollständig aufgelöst ist, muss jede Flocke zuerst mit dem DMSO in Kontakt kommen und keine Anzeichen von Restfeststoffen aufweisen. Fügen Sie PBS in kleinen Portionen hinzu, um das endgültige Volumen zu erreichen. Mischen Sie nicht mit einem Wirbel, sondern verwenden Sie sanftes Rühren mit einer Pipette. Die Endkonzentration von DMSO sollte 1% des Gesamtvolumens der Peptidzubereitung nicht überschreiten. Die Herstellung der Emulsion in einem 20-ml-Kunststoffröhrchen mit einem konischen Boden sollte eine bessere Zugänglichkeit von DMSO zum lyophilisierten Pulver ermöglichen. - Fügen Sie DMSO-PBS-Peptidlösung im Verhältnis 1:1 v/v zu CFA hinzu, die bereits mit 1,5 mg/ml abgetötetem Mycobacterium tuberculosis ergänzt wurde, um eine Endkonzentration von 2,5 mg/ml zu erhalten. Tropfenweise zugeben und sanft und häufig pipettieren, um eine viskose und gleichmäßig verteilte Emulsion zu bilden.
- Belüften Sie die Peptidlösung und CFA mit einer 1000-μl-Pipette (auf 700 μl eingestellt, um weiteren Verlust zu verhindern) und einer Pipette, um eine cremige, dicke Konsistenz zu erzeugen. Bei dieser Technik wird die Pipette wiederholt auf und ab abgesaugt, bis die gewünschte Dicke erreicht ist. Um optimale Ergebnisse zu erzielen, stellen Sie sicher, dass die Antigenlösung und das Adjuvans vor der Injektion gründlich gemischt werden.
- Intraperitoneale Injektion von Pertussis-Toxin
- Suspendieren Sie 1,5 μg Bordetella pertussis-Toxin in 100 μl RPMI 1640-Medien, ergänzt mit 1% Mausserum11.
- Führen Sie die i.p. Injektion mit einer sterilen Spritze und einer 23G-Nadel durch.
HINWEIS: Um Störungen an der Injektionsstelle zu vermeiden, muss das Pertussis-Toxin vor der Injektion des Antigens verabreicht werden. - Jede Maus wird vorübergehend in einen separaten Käfig gebracht, um eine einzelne 100-μl-Injektion von Bordetella pertussis-Toxin zu erhalten.
- Subkutane Injektion von IRBP-Emulsion
- Als nächstes injizieren Sie die IRBP-Emulsion subkutan. Dieser Prozess erfordert zwei Tierpfleger, die entsprechend gekleidet sind und gemäß den Gesundheits- und Sicherheitsvorschriften geschützt sind.
- Lassen Sie eine geübte Person die Maus leicht auf dem Käfig in einer schmutzigen Position festhalten, wobei der Bauch nach unten zeigt, während die andere geschulte Person die Haut einklemmt, um eine zeltartige Struktur im Nacken zu bilden, wo die Nadel eingeführt werden kann, um zwischen Finger und Daumen zu schlitzen.
VORSICHT: Es besteht die Gefahr von Nadelstichverletzungen. - Sobald die Nadel positioniert ist, injizieren Sie 200 μL der IRBP-Emulsion. Wenn Sie die Nadel entfernen, drehen Sie den Nadelkopf, um die Haut vor dem Herausziehen zu schließen, und üben Sie anschließend Druck auf die Injektionsstelle aus, um einen Rückfluss der Emulsion zu verhindern.
VORSICHT: Die Emulsion darf nicht mit der Haut oder dem Fell der Maus in Berührung kommen, da dies zu Reizungen und in schwereren Fällen zu einer Läsion führen kann. In diesem Fall muss der Bereich sofort und gründlich mit 70% igem Ethanol abgewischt und anschließend getrocknet werden.
HINWEIS: Wenn die drainierenden Lymphknoten am Ende der Studie zur Untersuchung benötigt werden, ist die Injektionsstelle anders. In diesem Fall injizieren Sie 100 μL subkutan auf beide Seiten der Flanke. Dies führt zu einer stärkeren Reaktion an den entwässernden Leistenlymphknoten, die zum Zeitpunkt der Ernte herausgeschnitten werden können. Wenn das beabsichtigte Ergebnis jedoch ausschließlich darin besteht, eine EAU zu entwickeln, ist eine einzige Injektion von 200 μl in den Nacken vorzuziehen, um Beschwerden durch mehrere Injektionsstellen zu vermeiden.
3. Klinische Bewertung - Augenhintergrunduntersuchung
HINWEIS: Die klinische Erkrankung wird mittels Fundusuntersuchung, Hellfeld-Live-Bildgebung mit einem Fundoskop und der Discover-Software zur Visualisierung bewertet.
- Bei Ausbruch der Erkrankung (Tag 12-14) sedieren Mäuse unter Vollnarkose mit einer Kombination aus Ketamin (50 mg/ml) und Domitor (Medetomidin; 1 mg/ml). Verdünnen Sie 1-teiliges Domitor; 1,5 Teile Ketamin und 2,5 Teile steriles injizierbares Wasser, dann 100 μL pro 30 g intraperitoneal injizieren. Verwenden Sie 1 ml sterile Spritzen und 23G-Nadeln für die oben genannte Anästhesiekombination.
- Überwachen Sie anschließend die Maus, um sicherzustellen, dass alle Reflexe verloren gehen und sie nicht auf Reize reagiert.
- Unmittelbar nach Erhalt der IP-Injektion und während die Maus noch in einem Schrubb gehalten wird, tragen Sie 1% Tropicamid und 2,5% Phenylephrin topisch auf jedes Auge auf, um die Pupille zu erweitern. Ziel ist es, die Hornhaut mit beiden erweiternden Lösungen vollständig zu bedecken. Es kann einige Minuten dauern, bis die Pupille vollständig erweitert ist.
- Danach großzügig auf die Viscotears-Salbe des Auges auftragen und während des gesamten Bildgebungsprozesses beibehalten, um das Auge vollständig geschmiert und hydratisiert zu halten.
- Öffnen Sie in der Zwischenzeit die Software (z. B. Discover) und stellen Sie das Fundoskop (z. B. Micron) so ein, dass Bilder unter Hellfeld aufgenommen werden. Weisen Sie jeder einzelnen Maus einen Ordner zu und beschriften Sie die Bilder mit R oder L entsprechend jedem fotografierten Auge.
- Befestigen Sie die Maus auf einem speziell angefertigten Tisch für die Live-Visualisierung und positionieren Sie das Mikroskop so, dass Sie vollen Zugriff auf die Netzhaut haben.
- Um eine genaue Darstellung der Krankheit zu erhalten, machen Sie Bilder des gesamten Netzhautbereichs, die neben der Sehscheibe auch alle Ecken der Peripherie abdecken. Um dies zu erreichen, stellen Sie das Okular durchgehend ein. Es ist wichtig, dass das Auge während des gesamten Bildgebungsprozesses jederzeit vollständig geschmiert bleibt. Stellen Sie dies sicher, indem Sie die Augensalbe mit einer konstanten Rate auffüllen.
- Zur Durchführung einer Fluoreszenzangiographie ist in diesem Stadium Abschnitt 4 (unten) zu lesen.
- Sobald die Bildgebung abgeschlossen ist, verdünnen Sie die Anti-Sedierungs-Anti-Sedierung (5 mg/ml Antisedan) in injizierbarem Wasser und verabreichen Sie sie in einer Dosis von 0,1 mg/kg i.p. Bringen Sie die Maus in einen Käfig zurück und legen Sie sie auf eine vorgewärmte Matte mit Zugang zu einem nassgetränkten Futter, bis sie sich erholt hat. Die vollständige Genesung ist gekennzeichnet durch Ganzkörperbewegungen und das Gehen um den Käfig mit gleichmäßigem Gang, der in der Regel einige Stunden dauert.
- Wiederholen Sie am festgelegten experimentellen Endpunkt (z. B. Tag 21-23) die Schritte 4.1-4.5 und fotografieren Sie erneut den gesamten Netzhautbereich, der die Sehscheibe und alle Ecken der Peripherie abdeckt, um eine genaue Darstellung der Krankheit zu erfassen.
4. Fluoreszenzangiographie
- Um die Gefäßleckage bei diesen Tieren zu messen, geben Sie jeder Maus während der Narkose eine Injektion von 2% Fluorescein subkutan in den Nacken und positionieren Sie sie so, dass die Netzhaut in der Mitte des Livebildes zentriert ist.
- Stellen Sie das Fundoskop auf einen Blaulichtanregungsfilter bei 465-490 nm ein. Das von angeregtem Fluorescein eingefangene Licht liegt zwischen 520-530 nm.
- Machen Sie nach 1,5 Minuten nach der Fluoreszenzinjektion ein Foto von jeder Netzhaut und wiederholen Sie den Vorgang nach 7 Minuten.
HINWEIS: Das Timing ist für diese Ereignisse entscheidend, wenn nicht beide Ereignisse erfasst werden können, dann bilde nur ein Auge.
5. Klinisches Krankheits-Scoring
- Stützen Sie die klinische Beurteilung auf den Schweregrad der folgenden Kriterien: Bandscheibenentzündung, retinale Gefäßmanschette, Netzhautgewebeinfiltrat und strukturelle Schäden.
- Vergeben Sie für jeden dieser Parameter eine Punktzahl auf einer Skala von 0 bis 5, und die Gesamtsumme ist repräsentativ für die klinische Erkrankung für das gesamte Auge, wobei eine maximale Punktzahl von 20 pro Auge erreicht werden kann. Tabelle 1 kann als Leitfaden für die Bewertungskriterien verwendet werden.
6. Histologie und histologisches Scoring
- Nach der Einschläferung der Mäuse durch Gebärmutterhalsluxation enukleieren Sie die Augen, indem Sie die Augenlider auseinander ziehen, um einen einfachen Zugang zum gesamten Auge zu ermöglichen.
- Als nächstes platzieren Sie eine gekrümmte Pinzette hinter der Kugel mit der Absicht, das orbitale Bindegewebe und den Sehnerv zu greifen. Achten Sie darauf, dass Sie den Globus nicht zusammendrücken.
- Zur Fixierung legen Sie das Auge für mindestens 15 Minuten in 4% Glutaraldehyd, um die Netzhautablösung zu minimieren, und übertragen Sie es dann für mindestens 24 Stunden auf 10% Formaldehyd. 1-2 ml Fixiermittel würden genug Volumen geben, um zwei Augen zu bedecken.
- Führen Sie die Einbettung in Paraffin, das Schneiden auf einem Mikrotom und die Färbung gemäß den Standardprotokollen durch. Für jede Art von Färbung wird eine Querschnittsdicke von 3-4 μm empfohlen.
- Führen Sie eine histologische Untersuchung der Augen unter Verwendung von Standardprotokollen für die Hämatoxylin- und Eosinfärbung (H & E) durch.
- Vergeben Sie Scores auf einer Skala von 0-4 gemäß den Kriterien für das EAU-Scoring, basierend auf dem Ausmaß der Immunzellinfiltration in der Netzhaut und Aderhaut, der Störung der Netzhautschichten, dem Grad der Granulombildung und dem Ausmaß der Netzhautablösung, was auf eine Netzhautschädigung hinweist, wie zuvor beschrieben (Agarwal 2013) und in Tabelle 211 zusammengefasst.
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Representative Results
In diesem Protokoll beschreiben wir eine Schritt-für-Schritt-Methode zur Induktion eines Modells der experimentellen autoimmunen Uveitis (EAU) durch Immunisierung von Mäusen mit einem uveitogenen retinalen Peptid, das von IRBP abgeleitet ist. Die Beurteilung von Krankheiten unter Verwendung weit verbreiteter und leicht zugänglicher Ansätze wird abgedeckt, obwohl diese nicht exklusiv sind und durch andere bildgebende Verfahren ergänzt oder teilweise ersetzt werden können. Die ersten Anzeichen von EAU bei C57BL/6J-Mäusen können zwei Wochen nach der Immunisierung nachgewiesen werden, und der Höhepunkt der Erkrankung wird innerhalb von drei Wochen erreicht, wie in Abbildung 1 dargestellt. Fundoskopische Veränderungen werden während des Fortschreitens der Erkrankung als entzündliche Veränderungen klassifiziert, zu denen Netzhautgewebe, Gefäß- und Bandscheibenentzündungen sowie strukturelle Schäden der Netzhaut gehören (Abbildung 2) sowie histologische Veränderungen aufgrund infiltrierender Immunzellen und struktureller Schäden. Diese klinischen und histopathologischen Veränderungen können bis zu 85 Tage nach der Immunisierung nachgewiesen und für die Bewertung bewertet werden, um das Fortschreiten der Krankheit zu untersuchen. Um unbeabsichtigte Verzerrungen bei der qualitativen visuellen Bewertung zu vermeiden, sollten die Bilder von mehr als einem Experten ausgewertet werden, und die Scorer müssen für die Behandlungsgruppen verblindet werden.
Wir zeigen hier, wie die klinischen und histologischen Scoring-Systeme (Tabelle 1 und Tabelle 2) Wissenschaftler dabei unterstützen, den Schweregrad der EAU zu quantifizieren, die Wirksamkeit von Behandlungen zu validieren und den Mechanismus der Arzneimittelwirkung zu erforschen. Die vaskuläre Leckage ist auch ein pathologisches Merkmal des Modells und der menschlichen Uveitis. Wir zeigen Beispiele für die vaskuläre Leckage von Fluorescein (Abbildung 3) als eine weitere Methode zur Beurteilung von Krankheiten in diesem Modell.
Abbildung 1. Schematische Zeitleiste des klinischen und histologischen Krankheitsverlaufs bei IRBP1-20-induzierter EAU. Eine Zeitleiste, die den Beginn der Infiltration und das Fortschreiten der IRBP1-20-induzierten EAU in Richtung der Spitzenerkrankung markiert. Nach der Immunisierung treten die ersten Anzeichen einer klinischen Erkrankung, die durch fundoskopische Bildgebung und histopathologische Analyse festgestellt werden, zwischen den Tagen 12 und 14 auf. Die Krankheit schreitet dann nach diesen Parametern weiter voran, bis um den 21. bis 23. Tag ein Höhepunkt erreicht ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2. Repräsentative fundoskopische Bilder, die mit histologischen Schnitten in verschiedenen Stadien der IRBP1-20-induzierten EAU-Erkrankung bei C57BL/6J-Mäusen korrelieren. Klinische fundoskopische und korrespondierende Gewebebilder von C57BL/6J vom gleichen Tier, das mit dem Peptid IRBP 1-20 immunisiert wurde. (A und B) fundoskopische Bilder und histologische Augenschnitte von gesunden und CFA-injizierten Mäusen. Die Netzhaut weist keine Anzeichen einer Entzündung auf und entsprechende histologische Abschnitte weisen erhaltene Netzhautschichten auf. (C) Fundoskopisches Bild des Auges, das 14 Tage nach der Immunisierung von einer C57BL/6J-Maus aufgenommen wurde, zeigt klassische Anzeichen einer EAU, die im Frühstadium der Erkrankung mit schwerer Schwellung der Sehscheibe auftritt, entsprechende Histologie zeigt infiltrierende Immunzellen in den Glaskörperraum. (D) Fundoskopische Bilder des Auges, die 21 Tage nach der Immunisierung von einer C57BL/6J-Maus aufgenommen wurden, zeigen Anzeichen von Gefäßmanschetten und infiltrierenden Immunpopulationen. Histologische Daten zeigen schwere strukturelle Veränderungen durch Netzhautfaltung (gelbe Pfeile). V = Gefäß, O = Sehscheibe, R = Netzhaut, L = Linse, Vit = Glaskörper, iO = entzündete Sehscheibe, iV = entzündetes Gefäß, iR = entzündete Netzhaut, i = infiltrierende Zellen im Glaskörper, RFs = Netzhautfalten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3. Repräsentative Bilder der fluoreszierenden Angiographie, aufgenommen mit dem Micron III-Bildgebungssystem bei Peak Disease. C57BL/6J-Mäusen wurden subkutan 2% Fluorescein injiziert und Bilder wurden zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Zirkulation des Tracers aufgenommen. (A) CFA kontrolliert nur Mäuse, die 1,5 und 7 Minuten nach der Verabreichung von Fluorescein eingenommen wurden. (B) Repräsentative Bilder von IRBP1-20-immunisierten Mäusen, die 1,5 bzw. 7 Minuten nach der Verabreichung von Fluorescein aufgenommen wurden. Der weiße Pfeil zeigt die Leckage des Behälters an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| Punktzahl | Optische Scheibe | Netzhautgefäße | Netzhautgewebe infiltriert | Strukturelle Schäden | ||||
| 1 | Minimale Entzündung | 1-4 milde Manschetten | 1-4 kleine Läsionen oder 1 lineare Läsion | Netzhautläsionen oder Netzhautatrophie mit 1/4 bis 3/4 Netzhautfläche | ||||
| 2 | Leichte Entzündung | >4 leichte Manschetten oder 1-3 mäßige Manschetten | 5-10 kleine Läsionen oder 2-3 lineare Läsionen | Pan-Netzhautatrophie mit mehreren kleinen Läsionen (Narben) oder <3 linearen Läsionen (Narben) | ||||
| 3 | Moderate Entzündung | >3 mäßige Manschetten | >10 kleine Läsionen oder >3 lineare Läsionen | Panretinaatrophie mit >3 linearen Läsionen oder konfluenten Läsionen (Narben) | ||||
| 4 | Schwere Entzündung | >1 schwere Handschellen | Lineare Läsion konfluent | Netzhautablösung mit Faltung | ||||
| 5 | * Nicht sichtbar (White Out oder extreme Ablösung) | * Nicht sichtbar (White Out oder extreme Ablösung) | * Nicht sichtbar (White Out oder extreme Ablösung) | * Nicht sichtbar (White Out oder extreme Ablösung) | ||||
Tabelle 1. Konventionelle klinische Scoring-Skala zur Bewertung des Schweregrads der EAU-Erkrankung. Tabelle mit Kriterien zur Bewertung des Schweregrads der Erkrankung bei Mäusen, die mit IRBP1-20 immunisiert wurden. Die Punktzahlen wurden nach den oben beschriebenen Kennzeichen vergeben, die auf den Fundusbildern sichtbar waren, jedes Auge erhielt eine Gesamtpunktzahl von zwanzig. * Aufgrund der Verdunkelung von Infiltrat und Netzhautablösung in der Hinterkammer kann nicht beurteilt werden. Tabelle angepasst mit freundlicher Genehmigung von Xu H., et al., 20088.
| Grad | Kriterien |
| 0 | Keine Änderung |
| 0,5 (Spur) | Leichte entzündliche Zellinfiltration. Keine Gewebeschädigung |
| 1 | Infiltration; Netzhautfalten und fokale Netzhautablösungen; wenige kleine Granulome in Aderhaut und Netzhaut, Perivaskulitis |
| 2 | Moderate Infiltration; Netzhautfalten, Ablösungen und fokale Photorezeptorzellschäden; kleine bis mittelgroße Granulome, Perivaskulitis und Vaskulitis |
| 3 | Mittlere bis starke Infiltration; ausgedehnte Netzhautfaltung mit Ablösungen, moderate Schädigung der Photorezeptorzellen; mittelgroße granulomatöse Läsionen; subretinale Neovaskularisation |
Tabelle 2. Histologisches Scoring von EAU
Die Tabelle zeigt die Kriterien zur Beurteilung des Schweregrads der EAU auf der Grundlage histopathologischer Merkmale der Erkrankung. Die Scores wurden nach den oben beschriebenen Merkmalen der H&E-Färbung vergeben, wobei jedes Auge eine Gesamtpunktzahl von vier erhielt. Tabelle angepasst mit freundlicher Genehmigung von Agarwal et al. 201311.
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Discussion
Experimentelle Tiermodelle sind notwendige Werkzeuge für die Untersuchung der Krankheitspathogenese und die präklinische Erprobung neuer therapeutischer Paradigmen. Im aktuellen Protokoll haben wir eine Methodik zur Induktion, Überwachung und Bewertung der EAU, eines experimentellen Modells der intraokularen inflammatorischen Uveitis, diskutiert. Dieses EAU-Modell hat eine Inzidenz von mehr als 95%, wenn alle Verfahren gemäß dem hier beschriebenen Protokoll durchgeführt werden, und führt zur Entwicklung einer chronischen, monophasischen EAU. Um dieses Inzidenzniveau zu erreichen, betonen wir die Bedeutung der Antigenvorbereitung und der Injektion der Emulsion, die beide oben beschrieben wurden. Die Hauptmerkmale der EAU bei Tieren sind Netzhaut- und/oder Aderhautentzündungen, retinale Vaskulitis, Zerstörung von Photorezeptoren und Verlust des Sehvermögens, die alle viele wesentliche klinisch-pathologische Merkmale der menschlichen posterioren Uveitis darstellen12. Ein Großteil des Verständnisses der grundlegenden zellulären und molekularen Mechanismen, die an der Uveitis beteiligt sind, leitet sich aus dem induzierten EAU-Modell ab, wie hierin beschrieben. EAU kann bei Mäusen13 und Ratten11 durch aktive Immunisierung mit retinalen Antigenen, die von Lymphozyten erkannt werden, induziert werden. Diese retinalen Antigene nehmen viele Formen an; IRBP (für Mäuse) oder retinales lösliches Antigen (S-Ag) für Ratten. Die Induktion von EAU auf einem C57BL / 6J-Hintergrund erzeugt eine chronischere Form der Krankheit, wobei die maximale Pathologie drei Wochen nach der Immunisierung beobachtet wird. Im Vergleich dazu induziert die Anwendung eines retinalen Antigens auf einen B10RIII-Hintergrund14 eine akute-monophasische und klinisch schwere Form der EAU, bei der die Peak-Pathologie typischerweise innerhalb von zwei Wochen nach der Induktion auftritt und die Krankheit in Woche 3 abklingt.
Verschiedene IRBP-Epitope wurden an C57BL/6J-Mäusen getestet und das IRBP1-20-Peptid hat sich als reproduzierbares Modell mit hoher Inzidenz und hohem Schweregrad erwiesen. Kürzlich wurde berichtet, dass ein neues uveitogenes Epitop von IRBP, die Aminosäurereste 651 bis 670 von humanem IRBP, EAU mit einer höheren klinischen Inzidenz und schweren Krankheitsmanifestationinduzieren 11 und bevorzugt verwendet werden können, wenn dies den wissenschaftlichen Zielen entspricht. Da bekannt ist, dass der Einfluss der kommensalen Mikrobiota im Darm und die Aktivierung autoreaktiver T-Zell-Rezeptoren (TCRs) den Ausbruch der Krankheit bei der Anwendung verschiedener Antigene15 beeinträchtigen, empfehlen wir Anfängern auf diesem Gebiet, entweder hIRBP1-20 oder hIRBP651-670 Peptide in einer titrierten Dosis zwischen 300-500 μg zu verwenden, um ein zuverlässiges Modell zu erhalten. In der Tat wurde die Variabilität dieses Modells an anderer Stelle dokumentiert, wobei Berichte die Bedeutung von Unterschieden zwischen Haltungssystemen und dem Mikrobiom hervorheben, die sich auf die Schwere und Inzidenz der Erkrankung auswirken könnten15. Daher können mehr oder weniger Peptidantigen und Pertussis-Toxin erforderlich sein.
Es gibt eine Reihe weiterer Modelle, mit denen unsere beschriebene Analyse durchgeführt werden kann. Dazu gehört eine spontane Uveitis, die bei IRBP-T-Zell-Rezeptor (TCR)-transgenen (R161H) Mäusen fortschreitet, bei der sich eine Augenentzündung im Alter von 5-6 Wochen im Alter von16 Jahren entwickelt. EAU kann auch adoptiv induziert werden, indem uveitogene Effektor-CD4+T-Zellen übertragen werden. Aktivierte, IRBP-spezifische CD4+T-Zellen, die von präparierten Mäusen stammen, können als Quelle für Effektorzellenverwendet werden 3,11. Dieses Modell stellt die Effektorphase der Krankheit dar und vermeidet gleichzeitig die Komplexität der Verwendung von CFA im induzierbaren Modell.
Darüber hinaus gibt es viele Vorteile bei der Verwendung von okulären Entzündungsmodellen als geeignete Werkzeuge zur Untersuchung anderer entzündlicher Erkrankungen, insbesondere solcher mit Effektor-Th1- und Th17-Untergruppenpathologie. Die Hauptvorteile der Verwendung dieses Modells sind die nicht-invasiven und quantifizierbaren Methoden zur Überwachung der Krankheitsentwicklung und des Krankheitsverlaufs, die Fundoskopie und Angiographie. Diese nicht-invasiven Bildgebungssysteme ermöglichen einen einfachen Zugang zu neuronalem Gewebe, das sonst hinter schützenden anatomischen Barrieren verborgen wäre. Weitere Methoden zur Überwachung des Krankheitsverlaufs umfassen die Anwendung der OCT-Bildgebung, die bei der Erkennung zellulärer Infiltrate, insbesondere im Frühstadium des EAU-Beginns, empfindlicher ist als die fundoskopische Bildgebung. Die Technik ermöglicht mehrschichtige Querschnitts- und horizontale Visualisierungen der Netzhaut in Längsrichtung und nicht-invasiv. Im lebenden Organismus Die OCT-Bildgebung liefert Informationen über die Dicke der Netzhaut, die durch fundoskopische und histologische Untersuchungen nicht gewonnen werden konnten17. Die Verfügbarkeit noch ausgefeilterer nicht-invasiver Bildgebungstechniken, wie z. B. Laser-Ophthalmoskopie mit adaptiver Optik und multimodale Bildgebungsinstrumente, wird unsere Fähigkeit, diese Krankheit bei kleinen Nagetieren zu untersuchen, weiter verbessern. Darüber hinaus bietet die Fähigkeit, residente und infiltrierende Zellpopulationen für eine tiefere Analyse von Immunphänotypen unter Verwendung von Techniken wie der Durchflusszytomie zu sezieren und zu isolieren, große Möglichkeiten, aufschlussreiche Informationen zu liefern.
Es gibt einige etablierte Scoring-Systeme, die auf klinischen Kriterien basieren, die aus der Fundoskopie 8,9,18 gewonnen wurden. Während sich diese zwischen den ophthalmologischen Forschungszentren leicht unterscheiden, sind alle zuverlässig, korrelieren mit histopathologischen Merkmalen und sind in der Lage, die Schwere der Erkrankung genau widerzuspiegeln. In der aktuellen Studie beziehen wir uns auf das von Xu et al.8 entwickelte Scoring-System. Dieses System bietet einen detaillierteren Bewertungsansatz mit einer größeren Anzahl klinischer Messparameter. Es umfasst eine maximale Punktzahl von 20, was ein breiteres Zeitfenster für die Bewertung eröffnet als alternative Systeme, die auf maximal 5 begrenzt sind. Dies ist wichtiger für die weitere Erforschung im Rahmen therapeutischer Ansätze. Die Minimierung von Bedienungsfehlern ist jedoch bei der Verwendung eines so verfeinerten und detaillierten Satzes von Parametern von entscheidender Bedeutung und erfordert möglicherweise eine sorgfältige Schulung des Bedieners und eine unabhängige Validierung der Interpretation.
Hier stellen wir ein Protokoll zur Induktion von EAU bei weiblichen C57BL/6-Mäusen vor, da es eine erhöhte Inzidenz von Frauen gibt: Männer 1,4:1 mit Uveitis im klinischen Umfeld. Nichtsdestotrotz sollte das Geschlecht der Mäuse, die zur Induktion einer Autoimmunerkrankung verwendet werden, berücksichtigt werden, da dies das Zytokinmilieu11 beeinflussen kann und auch wichtige Unterschiede in der Art und Weise aufweist, wie sie auf therapeutische Interventionen ansprechen. Eine weitere Überlegung ist das Alter der Mäuse bei Krankheitseinleitung. Zum Beispiel haben wir die Altersabhängigkeit der Suszeptibilität bei B10RIII-Mäusen untersucht und sind zu dem Schluss gekommen, dass Mäuse über 8 Lebenswochen eine geringere Inzidenz von EAU haben (unveröffentlichte Studie aus unserer Gruppe).
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Tiermodelle für intraokulare Erkrankungen ein unschätzbares Werkzeug zur Untersuchung der posterioren Uveitis beim Menschen darstellen und die Entwicklung neuartiger Therapien wie CsA erleichtert haben. Kein Tiermodell allein reproduziert jedoch das gesamte Spektrum der menschlichen Uveitis, da jedes Modell einzigartige Eigenschaften aufweist, die es für die Untersuchung bestimmter Aspekte der Krankheit geeignet machen. Dieses EAU-Modell wird durch Autoimmunität durch die Anwendung von IRBP-Peptiden induziert, die mit Adjuvantien ergänzt werden, die angeborene Immunantworten auslösen. Es ist jedoch nicht bekannt, ob alle Formen der posterioren Uveitis beim Menschen autoimmun sind und ob antigene Mimikry ein auslösender Faktor ist. Darüber hinaus ist nicht klar, ob ein Zusammenhang mit einer Infektion bei der Auslösung einer menschlichen Uveitis besteht. Nichtsdestotrotz ist das hierin beschriebene Modell ein nützliches und reproduzierbares generisches Modell, das verwendet werden kann, um nützliche Informationen über Ätiologie, Pathogenese und Therapie dieser sehgefährdenden Krankheit zu erhalten.
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Disclosures
Die Autoren haben mit dieser Arbeit keine Interessenkonflikte zu erklären.
Acknowledgments
JG erhielt eine UCL Impact Studentship und Rosetrees Trust-Finanzierung, um CB zu unterstützen. VC erhielt einen Forschungskooperationszuschuss von Akari Therapeutics Inc. Wir danken dem UCL Institute of Ophthalmology, Biological Service Unit, insbesondere Frau Alison O'Hara und ihrem Team für ihre technische Unterstützung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| antisedan | ZOETIS, USA | for waking up | |
| Complete Freund’s Adjuvant; CFA | Sigma, UK | F5881 | for immunisation |
| Domitor | Orion Pharma, Finland | for anesthesia | |
| Flourescein | Sigma, UK | F2456 | for Angiography |
| IRBP1-20 | Chamberidge peptide, UK | peptide;antigen | |
| Ketamine | Orion Pharma, Finland | for anesthesia | |
| Micron III | Phoenix Research, USA | for fundoscopy | |
| Mouse Serum | Sigma, UK | M5905 | for immunisation |
| Mycobacterium terberculosis | Sigma, UK | 344289 | for immunisation |
| Pertussis Toxin | Sigma, UK | P2980 | for immunisation |
| phenylephrine hydrochloride 2.5% | Bausch & Lomb UK | PHEN25 | for dilation |
| Tropicamide 1% | SANDOZ | for dilation | |
| Viscotears | WELDRICKS Pharmacy, UK | 2082642 | for eye lubrication |
References
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