Summary
Præsenteret her er en protokol for en fluorescensbilleddannelsesmetode, multiplex i mmunofluorescerende cell-baseret detektion af DNA, RNA og protein (MICDDRP), en metode, der er istand til samtidig fluorescens enkeltcellevisualisering af viralt protein og nukleinsyrer af forskellig type og strandethed. Denne tilgang kan anvendes på en bred vifte af systemer.
Abstract
Fangst af de dynamiske replikations- og samlingsprocesser af vira er blevet forhindret af manglen på robuste in situ-hybridiseringsteknologier (ISH), der muliggør følsom og samtidig mærkning af viral nukleinsyre og protein. Konventionelle DNA-fluorescens in situ-hybridiseringsmetoder (FISH) er ofte ikke kompatible med immunfarvning. Vi har derfor udviklet en billeddannelsesmetode, MICDDRP (multiplex immunofluorescerende cell-baseret detektion af DNA, RNA og protein), som muliggør samtidig enkeltcellevisualisering af DNA, RNA og protein. Sammenlignet med konventionel DNA-FISK bruger micddrp forgrenet DNA (bDNA) ISH-teknologi, hvilket dramatisk forbedrer oligonukleotidsondefølsomhed og detektion. Små modifikationer af MICDDRP muliggør billeddannelse af virale proteiner samtidig med nukleinsyrer (RNA eller DNA) af forskellig strenghed. Vi har anvendt disse protokoller til at studere livscyklusserne for flere virale patogener, herunder human immundefektvirus (HIV)-1, human T-lymfotropisk virus (HTLV)-1, hepatitis B-virus (HBV), hepatitis C-virus (HCV), Zika-virus (ZKV) og influenza A-virus (IAV). Vi demonstrerede, at vi effektivt kan mærke virale nukleinsyrer og proteiner på tværs af en bred vifte af vira. Disse undersøgelser kan give os en forbedret mekanistisk forståelse af flere virale systemer og derudover tjene som en skabelon til anvendelse af multiplekset fluorescensbilleddannelse af DNA, RNA og protein på tværs af et bredt spektrum af cellulære systemer.
Introduction
Mens tusindvis af kommercielle antistoffer er tilgængelige til specifikt at mærke proteiner via konventionelle immunostaining-tilgange, og mens fusionsproteiner kan konstrueres med fotooptimerede fluorescerende tags til sporing af flere proteiner i en prøve1, er mikroskopisk visualisering af protein ofte ikke kompatibel med konventionel DNA-fluorescens in situ-hybridisering (FISH)2 . Tekniske begrænsninger i samtidig visualisering af DNA, RNA og protein ved hjælp af fluorescensbaserede tilgange har hindret en dybdegående forståelse af virusreplikation. Sporing af både viral nukleinsyre og protein i løbet af infektionen gør det muligt for virologer at visualisere grundlæggende processer, der ligger under virusreplikation og samling 3,4,5,6.
Vi har udviklet en billeddannelsesmetode, multiplex immunofluorescerende cell-baseret detektion af DNA, RNA og Protein (MICDDRP)3, som anvender forgrenet DNA (bDNA) in situ-teknologi til at forbedre følsomheden af nukleinsyredetektion 7,8,9 . Derudover bruger denne metode parrede sonder til forbedret specificitet. bDNA-sekvensspecifikke sonder bruger forgrenede forforstærker- og forstærker-DNA'er til at producere et intenst og lokaliseret signal, hvilket forbedrer tidligere hybridiseringsmetoder, der var afhængige af at målrette gentagne regioner i DNA9. Inficerede celler i en klinisk sammenhæng indeholder ofte ikke rigeligt viralt genetisk materiale, hvilket giver en vare til en følsom metode til påvisning af fluorescerende nukleinsyre i diagnostiske omgivelser. Kommercialiseringen af bDNA-teknologi gennem tilgange som RNAscope7 og ViewRNA10 har fyldt denne niche. Følsomheden af bDNA-fluorescensbilleddannelse har også vigtig nytteværdi i cellebiologi, hvilket muliggør påvisning af knappe nukleinsyrearter i cellekulturmodeller. Den store forbedring af følsomheden gør bDNA-baserede billeddannelsesmetoder egnede til at studere vira. En potentiel mangel er imidlertid, at disse metoder fokuserer på visualisering af RNA eller RNA og protein. Alle replikerende celler og mange vira har DNA-genomer eller danner DNA under deres replikationscyklus, hvilket gør metoder, der er i stand til at billeddanne både RNA og DNA samt protein, meget ønskelige.
I MICDDRP-protokollen udfører vi bDNA FISH til påvisning af viral nukleinsyre ved hjælp af RNAscope-metoden med modifikationer7. En af de største ændringer i denne protokol er optimering af proteasebehandling efter kemisk fiksering. Proteasebehandling letter fjernelse af proteiner bundet til nukleinsyre for at forbedre sondehybridiseringseffektiviteten. Proteasebehandling efterfølges af inkubation med forgrenet oligonukleotidprobe(r). Efter påføring af bDNA-sonde(r) vaskes prøver og inkuberes efterfølgende med signalforforstærker- og forstærker-DNA'er. Multiplexed in situ hybridisering (ISH), mærkning af flere genmål, kræver målprober med forskellige farvekanaler til spektral differentiering7. Inkubation med DNA-forstærkere efterfølges af immunfluorescens (IF).
bDNA ISH giver forbedringer i signal-til-støj ved forstærkning af målspecifikke signaler med en reduktion til baggrundsstøj fra ikke-specifikke hybridiseringshændelser 7,11. Målprober er designet ved hjælp af softwareprogrammer, der er offentligt tilgængelige, der forudsiger sandsynligheden for ikke-specifikke hybridiseringshændelser samt beregner smeltetemperaturen (Tm) for sondemålhybriden 7,11. Målprober indeholder en 18- til 25-baseregion, der supplerer mål-DNA/RNA-sekvensen, en afstandssekvens og en 14-base halesekvens. Et par målprober, hver med en særskilt halesekvens, hybridiseres til en målregion (spænder over ~ 50 baser). De to halesekvenser danner et hybridiseringssted for forforstærkersonderne, som indeholder 20 bindingssteder for forstærkersonderne, som desuden indeholder 20 bindingssteder til etiketproben. Som et eksempel er en kilobase (kb) region på nukleinsyremolekylet målrettet af 20 sondepar, hvilket skaber et molekylært stillads til sekventiel hybridisering med forforstærkeren, forstærkeren og etiketproben. Dette kan således føre til et teoretisk udbytte på 8000 fluorescerende etiketter pr. nukleinsyremolekyle, hvilket muliggør påvisning af enkeltmolekyler og store forbedringer i forhold til konventionelle FISH-tilgange7 (Se figur 1A for skematisk bDNA-signalforstærkning). For at oprette sonder til multiplekset ISH skal hver målsonde være i en anden farvekanal (C1, C2 eller C3). Disse målprober med forskellige farvekanaler har forskellige 14-base halesekvenser. Disse halesekvenser vil binde forskellige signalforstærkere med forskellige fluorescerende sonder, hvilket muliggør letkøbt spektral differentiering på tværs af flere mål. I den præsenterede protokol, tabel 4 i trin 9, gives yderligere oplysninger om fluorescerende mærkning af målsonder. Derudover giver figur 2 og figur 3 eksempler på, hvordan vi valgte den passende forstærker 4-FL (A, B eller C) (fluorescerende sonde og det endelige hybridiseringstrin) for at opnå specifik fluorescerende mærkning af multipel viral nukleinsyremål efter HIV-1- og HTLV-1-infektioner.
Vi har demonstreret flere anvendelser af samtidig fluorescensvisualisering af RNA, DNA og proteiner og observeret kritiske stadier af virusreplikation med høj spatiotemporal opløsning 3,4,5. For eksempel har samtidig enkeltcellevisualisering af viralt RNA, cytoplasmatisk og nukleært DNA og protein gjort det muligt for os at visualisere nøglehændelser under HIV-1-infektion, herunder efter RNA-holdige kerner i cytoplasmaet inden nuklear indgang og integration af proviralt DNA3. Derudover har vi anvendt MICDDRP til at karakterisere virkningerne af værtsfaktorer og lægemiddelbehandling på virusinfektion og replikation 4,5. I Ukah et al. sporede vi reaktivering af HIV-1-transkription i latenscellemodeller behandlet med forskellige latens-reverseringsmidler for at visualisere HIV-transkription og latenstidsvending4. Derudover kan MICDDRP give os mulighed for at visualisere fænotypiske ændringer forbundet med antiviral hæmning, der tilskrives behandling af små molekyler eller værtsfaktorbegrænsning. Som et bevis på robustheden og den brede anvendelighed af vores tilgang har vi demonstreret, at vi kan bruge ændringer af vores protokol til effektivt at mærke viral nukleinsyre til at følge infektion ikke kun i human immundefektvirus (HIV)-1, men også human T-lymfotropisk virus (HTLV)-1, hepatitis B-virus (HBV), hepatitis C-virus (HCV), Zikavirus (ZIKV) og influenza A-virus (IAV). Da HIV-1-livscyklussen består af både viralt DNA og RNA-arter, har vi udført størstedelen af vores optimering af MICDDRP efter HIV-1-replikationskinetik. Derudover har vi imidlertid vist, at vi kan spore syntese af forskellige virale RNA-transkripter af enten eller både sans (+) og antisense (-) strandethed i vira som ZIKV, IAV, HBV og HCV for at overvåge viral transkription og replikation 3,4,5,6. Undersøgelserne sigter mod at forbedre den mekanistiske forståelse af flere virale processer og tjene som en retningslinje for at implementere denne fluorescensbilleddannelsesteknologi til en bred vifte af cellulære modeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Frøceller (Suspension vs. Adherent Cells) på coverslips eller kammer dias (protokol præsenteret bruger coverslips).
- Såning af suspensionsceller
- Forbered poly-D-lysin (PDL) belagte dækslips (letter vedhæftning af suspensionsceller til dækslip) ved først at inkubere dækslips i ethanol (EtOH) i 5 minutter (steriliserer dækslips og fjerner eventuelle rester). Derefter vaskes 2x i fosfatbufferet saltvand (PBS), inden dækslip inkuberes i PDL (20 μg/ml) i 30 minutter (min) ved stuetemperatur (RT).
- Fjern PDL og vask 2x i PBS. Pelletceller (tidligere inficeret/behandlet baseret på ønskede billeddannelsesbetingelser) og resuspend 106celler i 50 μL PBS. Spot 50 μL celler på glas (PDL-belagt) og inkuber ved RT i 30 min.
- Såning af klæbende celler
- Kulturceller på steril coverslip placeret i 6-brønds skål og inficere celler med virale partikler eller behandle med forbindelse af interesse. Lad celler nå 50-70% sammenløb inden prøveforberedelse til billeddannelseseksperimenter.
2. Cellulær fiksering: For at bevare cellulær morfologi til fluorescensbilleddannelsesundersøgelser
BEMÆRK: Opbevar 4% PFA og PBS ved RT i mindst 30 minutter før cellulær fiksering.
- Aspirer det cellulære medie, vask celler på dækslips 3x i PBS, og fastgør celler i 4% paraformaldehyd (PFA) i 30 min. Aspirer PFA og vask celler i PBS 2x.
BEMÆRK: Celler kan nu dehydreres og opbevares, hvis eksperimentatoren ønsker at genoptage eksperimentet på en anden dato. Faste celler kan dehydreres i EtOH før opbevaring.- PBS fjernes efter vask efter cellefiksering, og erstattes med 500 μL 50% EtOH (v/v i vand). Inkuberes ved RT i 5 min.
- Fjern 50% EtOH og udskift med 500 μL 70% EtOH. Inkuberes ved RT i 5 min.
- Fjern 70% EtOH og udskift med 500 μL 100% EtOH. Inkuberes ved RT i 5 min.
- Fjern 100% EtOH og udskift med frisk 100% EtOH.
BEMÆRK: Dehydrerede celler kan opbevares ved -20 °C i 6 måneder. Forsegl plader med tape eller parafilm inden opbevaring for at forhindre fordampning af EtOH. - Rehydrere celler for at gå videre til multiplekset fluorescensmærkning af celler / virus.
- Fjern 100% EtOH og udskift med 500 μL 70% EtOH. Inkuberes ved RT i 2 min.
BEMÆRK: Lad ikke celler tørre ud på noget tidspunkt. Brug altid nok opløsning til at nedsænke alle cellerne. - Fjern 70% EtOH og udskift med 500 μL 50% EtOH. Inkuberes ved RT i 2 min.
- Fjern 50% EtOH og udskift med 1x PBS.
BEMÆRK: Forbered proteasefortynding, hybridiseringssonder og vaskebuffer forud for proteasebehandling (trin 4) og målsondeapplikation (trin 5). Specifikke instruktioner om reagensforberedelse præsenteres i begyndelsen af hvert respektive trin.
| Reagenser | Andre bemærkninger |
| Protease løsning | Forbered i 1X PBS |
| Mål oligonukleodø sonde(r) | Fortynd i hybridiseringsbuffer |
| Vask buffer | Vasker efter målhybridiseringstrin |
| Hybridiseringsbuffer | Opskrift præsenteret i tabel 3 |
Tabel 1: Nøglereagenser i MICDDRP-protokollen.
3. Cellepermeabilisering: Øger adgangen til celle- og cellulære organeller til indtræden af store molekyler (antistoffer, nukleinsyrehybridiseringssonder)
- Fjern 1x PBS efter cellulær fiksering eller rehydrering og udskift med 500 μL 0,1% (v / v) Tween-20 i 1x PBS. Inkuberes ved RT i 10 min. Udskift en efter en. Vask en gang med 500 μL 1x PBS og tilsæt frisk 1x PBS.
4. Coverslip immobilisering på glasglas og proteasebehandling for at fjerne nukleinsyrebindende proteiner fra fast viral / cellulær nukleinsyre for at forbedre hybridiseringseffektiviteten
BEMÆRK: Forbered den fortyndede Protease III (se specifikationer for reagens i materialetabellen) opløsning under cellulær permeabilisering. Lad protease nå RT i 10 minutter før permeabilisering.
- Placer en lille dråbe neglelak på et steriliseret glasglas. Tør tilbage (side uden cellelag) og læg kanten af dækslip på neglelakdråben, med siden med de klæbede celler vendt opad. Tilsæt få dråber PBS på den immobiliserede dækslip for at forhindre tørring.
- Tegn en cirkel (ca. 3 mm væk fra dækslippet) rundt om omkredsen af dækslippen, der nu klæbes til diaset ved hjælp af hydrofob barrierepen (vandafvisende pen, der holder reagenser lokaliseret på celler).
- Fortynd Protease III i 1x PBS (100 μL/dækslip).
BEMÆRK: Proteasekoncentrationen skal muligvis justeres afhængigt af forskelle i celletyper, sonder eller målnukleinsyre (r) gennem empirisk optimering (Se diskussion). For mest effektiv RNA / DNA-mærkning på tværs af forskellige virale systemer havde vi succes med følgende fortyndinger præsenteret i tabel 2 nedenfor med fortyndinger fra (1 til 2 ) -(1 til 15) (protease til 1x PBS).
| Mål for sonde | Proteasefortynding i 1X PBS (Protease III til 1X PBS) |
| HIV-1 DNA/RNA | 1 til 5 |
| HTLV-1 DNA/RNA | 1 til 5 |
| HBV pgRNA og total HBV RNA | 1 til 15 |
| IAV RNA | 1 til 15 |
| ZIKV RNA | 1 til 2 |
Tabel 2: Protease III-fortyndinger i PBS til hybridisering af viral nukleinsyre.
- Dekantér 1x PBS på dækslippen efter immobilisering, og påfør den fortyndede Protease III.
- Inkuberes i en befugtet ovn ved 40 °C i 15 min.
- Decant protease opløsning og nedsænke dias i 1x PBS. Omrør med en gyngeskål i 2 min ved RT. Gentag vask med ny 1x PBS.
- Kun til DNA-detektion vaskes prøver tre gange med nukleasefrit vand i 2 minutter hver, efterfulgt af inkubation med 5 mg/ml RNase A fortyndet i PBS i 30 minutter ved 37 °C.
- Dekanter RNase A-opløsning, og vask 3x i 2 minutter med ultrarent vand. Fortsæt med ISH af målsonde (r).
BEMÆRK: Hybridiseringsbuffer forbedrer vDNA-detektion uden at påvirke vRNA-farvningseffektiviteten for de præsenterede resultater (repræsentative resultater). Fortynd DNA Channel 1 (C1) sonder 1:1 med hybridiseringssonde. Fortynd RNA C2- og C3-sonder i hybridiseringsbuffer. C2- og C3-sonderne, der anvendes i vores billeddannelsesundersøgelser, er i 50X-opløsninger (1:50; målsonde til hybridiseringsbuffer).
- Forbered hybridiseringsbuffer i nukleasefrit vand ved at følge den trinvise procedure nedenfor:
- I et 15 ml rør tilsættes 700 μL nukleasefrit vand, 300 μL 50% (vægt / volumen (w / v)) dextransulfat, 300 μL 5 M NaCl, 125 μL 200 mM natriumcitrat (pH 6,2) og 375 mg (pulver) ethylencarbonat.
- Bland godt ved hjælp af en hvirvel for at opløse ethylencarbonat (sørg for, at alt pulver er opløst og klar opløsning).
- Tilsæt 25 μL 10% (volumen / volumen (v / v)) Tween-20 og nok nukleasefrit vand til at fuldføre 2,5 ml (2x opløsning).
BEMÆRK: Opskriften på den præsenterede hybridiseringsbuffer findes i tabel 3 nedenfor. Løsningen er stabil i en uge. Sørg for tilstrækkelig blanding af Tween-20 vaskemiddel, mens du er forsigtig med at forhindre boblende opløsning.
| Reagens | Koncentration af lagre | Yderligere bemærkninger |
| Nukleasefrit vand | NA | |
| Dextran sulfat | 50% (w/v) | Meget tyktflydende |
| Natriumchlorid | 5 mio. kr. | |
| Natriumcitrat (pH 6,2) | 200 mM | Opbevares ved 4 °C |
| Ethylencarbonat | NA | Pulver |
| Tween-20 | 10% (v/v) |
Tabel 3: Hybridiseringsbufferliste over reagenser.
5. Inkubation med DNA / RNA-målhybridiseringssonder: Måloligonukleotidprober binder til region (er) af interesse, hvilket skaber et molekylært stillads til forforstærkere, forstærkere og fluorescerende sonder til at binde.
BEMÆRK: Varm DNA/RNA-sonder ved 40 °C i 10 min (under cellepermeabilisering) og afkøles til RT i mindst 10 min, hvis der ikke er inkluderet nogen RNase-behandling. Hvis der er behov for RNase-behandling eller yderligere prøvebehandling inden målsondehybridisering, varme sonder i overensstemmelse hermed. Spin ned C2 og C3 sonder efter opvarmning og fortyndes i hybridiseringsbuffer. Efter fortynding kan C2- og C3-sonder kortvarigt opvarmes. Varm 50x vaskebuffer (se materialetabel for flere detaljer) ved 40 °C i 10-20 min og fortynd til 1x i molekylærbiologisk vand.
- 200 μL af hybridiseringsbufferen inkuberes ved 67 °C i 10 minutter før tilsætning af hybridiseringssonde(r). Fortyndet sonde i hybridiseringsbuffer (opskrift anført i tabel 2). Tilsæt 50 μL/dækslip.
- Inkuberes i befugtet ovn ved 40 °C i 2 timer (h). Decantprober og nedsænkede dias i 1x vaskebuffer. Omrør ved gyngeskål i 2 min ved RT. Gentag vask med ny 1x vaskebuffer.
6. Forstærker (Amp) 1-FL hybridisering: Tilsætning af forforstærker, der supplerer halesekvensen af mål-DNA/RNA-sonderne (Trin 5)
BEMÆRK: Forstærkere skal være ved RT før brug. Få hver enkelt forstærker ud af køleskabet 30 min før brug og lad den stå på bænken hos RT.
- Fjern dias fra 1x vaskebuffer og tryk / absorber for at fjerne overskydende væske.
- Tilsæt 1 dråbe Amp 1-FL på dækslip. Inkuberes i befugtet ovn ved 40 °C i 30 min.
- Decant Amp 1-FL og nedsænk i 1x vaskebuffer. Agiterer ved at gynge skål 2 min ved RT. Gentag vask med ny 1x vaskebuffer.
7. Amp 2-FL hybridisering: Inkubation med signalforstærker med beslægtet genkendelsessekvens til forforforstærkere (Amp 1-FL)
- Fjern dias fra 1x vaskebuffer og tryk / absorber for at fjerne overskydende væske.
- Tilsæt 1 dråbe Amp 2-FL på dækslip. Inkuberes i befugtet ovn ved 40 °C i 15 min.
- Decant Amp 2-FL og nedsænk i 1x vaskebuffer. Agiterer ved at gynge skål 2 min ved RT. Gentag vask med ny 1x vaskebuffer.
8. Amp 3-FL hybridisering: Inkubation med anden signalforstærker
- Fjern dias fra 1x vaskebuffer og tryk / absorber for at fjerne overskydende væske.
- Tilsæt 1 dråbe Amp 3-FL på dækslip. Inkuberes i befugtet ovn ved 40 °C i 30 min.
- Decant Amp 3-FL og nedsænk i 1x vaskebuffer. Agiterer ved at gynge skål 2 min ved RT. Gentag vask med ny 1x vaskebuffer.
9. Amp 4-FL hybridisering: Fluorescerende etiket og sidste hybridiseringstrin
BEMÆRK: Se først tabel 4 for at vælge den passende Amp 4 (A, B eller C) - FL baseret på kanalerne i målsonden (e). Vurder, hvad Amp 4-FL er nødvendigt for at mærke DNA / RNA af interesse. Et eksempel er angivet i nedenstående tabel:
| En | B | C | |
| DNA-kanal 1 (C1) | 488 | 550 | 550 |
| DNA/RNA-kanal 2 (C2) | 550 | 488 | 647 |
| RNA-kanal 3 (C3) | 647 | 647 | 488 |
Tabel 4: Valg af Amp 4 (A, B eller C)-FL fluorescerende sonde til multiplekset ISH.
BEMÆRK: For multiplekset FISH (flere mål) er det afgørende at vælge den korrekte Amp 4 (A, B eller C)- FL for korrekt mærkning af dit mål af interesse (er). Målprober (trin 5) har forskellige farvekanaler (C1, C2 eller C3), som dikterer deres respektive fluorescerende etiket (Alexa 488, Atto 550 eller Alexa 647), baseret på den valgte Amp 4-FL. Eksempler på valg af fluorophorkombinationer til multiplekset billeddannelse findes i legenderne i figur 2 og figur 3. Som et yderligere eksempel vil udvælgelse af Amp 4B-FL selektivt mærke DNA C1-sonder med Atto 550- og RNA C3-sonder med Alexa 647.
- Fjern dias fra 1x vaskebuffer og tryk / absorber for at fjerne overskydende væske.
- Tilsæt 1 dråbe Amp 4-FL på dækslip. Inkuberes i befugtet ovn ved 40 °C i 15 min.
BEMÆRK: Efter trin 9.2 skal du holde prøver dækket, beskyttet mod lyset. - Decant Amp 4-FL og nedsænk i 1x vaskebuffer. Omrør ved gyngeskål i 2 min ved RT. Gentag vask med ny 1x vaskebuffer. Vask med 1x PBS (2 min) og opbevar i PBS.
10. Protein immunostaining: At mærke protein (er) af interesse
- Dekanter PBS og tilsæt 200 μL blokeringsbuffer (1% w/v BSA, 10% v/v FBS i PBS med 0,1% v/v Tween-20 (PBST)) til dækslippen. Inkubere 1 time ved RT.
- Decantblokerende buffer og påfør 200 μL primært antistof fortyndet i PBST + 1% w/v BSA. Inkubere 1 time ved RT.
- Vask rutsjebanen to gange med PBST i 10 minutter ved RT med rystelser.
- Anvend sekundært antistof efter eget valg i 1 time ved RT i PBST + 1% w/v BSA.
- Vask rutsjebanen med PBST i 10 minutter ved RT med rystelser.
11. Nuklear farvning: Modpletteringskerne efter immunfarvning
- Dekanter PBST og påfør DAPI eller nuklear plet efter eget valg i 1 min ved RT.
- Vask rutsjebanen to gange med PBS i 10 minutter ved RT med rystelser.
12. Montering
- Anbring 1 dråbe antifadeopløsning (f.eks. Prolong Gold) på nyt sterilt glasglas (Rengør først dias med EtOH og lad det tørre for at sikre, at der ikke er rester på glas). Med den samme spids spredes antifadeopløsningsfaldet for at dække et område, der er omtrent på størrelse med dækslip.
BEMÆRK: Antifadeopløsningen er meget tyktflydende og kan være vanskelig at pipette. Afskæring af spidsen af en 200 μL spids før pipettering kan afhjælpe disse problemer. - Fjern dækslip med celleprøve fra diaset og nedsænk i PBS for at fjerne resterende neglelak bagpå ved hjælp af tang og PBS. Tør tang og bagsiden af dækslippet ved hjælp af en Kimwipe.
- Indlejres forsigtigt dækslip i dråben af antifadeopløsning, og prøvesiden (side med cellelag) af dækslip på dråbe).
- Lad prøverne tørre natten over.
13. Billedbehandling
- Billede med et epifluorescerende mikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et skema over MICDDRP er afbildet i figur 1. Mærkning af DNA og RNA efterfølges af immunostaining. Brugen af forgreningsforstærkere øger signalet, hvilket muliggør påvisning af enkeltnukleinsyremolekyler.
Figur 1: Skematisk over MICDDRP og trin-for-trin arbejdsgang. (A) bDNA-signal forstærkes via forgreningsforforstærker- og forstærker-DNA for at forbedre detektionen af viralt DNA (1) og RNA-arter (2). Oligonukleotidprober hybridiseres parvis (ZZ i skematisk) til mål (er) af interesse, hvilket skaber et stillads til forforstærker (Amp 1-FL, trin 6 i protokol), forstærker (Amp 2- & 3-FL) og fluorescerende sonder (Amp 4, trin 9 i protokol). Se tabel 4 for at vælge passende Amp 4 (A, B eller C)-FL for multiplekset ISH. Mærkning af nukleinsyre efterfølges af immunostaining proteiner af interesse (3). (B) Tretten hovedtrin i MICDDRP-protokollen med estimering af tidsvarighed for hvert respektive trin. Klik her for at se en større version af denne figur.
Anvendelse af MICDDRP til at studere forløbet af HIV-1-infektion har været et nyttigt værktøj til sporing af viral replikationskinetik i primære celler. Som et bevis på begrebet af denne procedure er HIV-1 DNA, RNA og protein samtidig mærket og visualiseret mikroskopisk på enkeltcelleniveau (figur 2). To HIV-1 DNA-genomer visualiseres i en enkelt celle, da de aktivt transskriberer viralt RNA (vRNA). vRNA er blevet eksporteret gennem det nukleare porekompleks, og viralt protein syntetiseres i cytoplasmaet.
Figur 2: MICDDRP af primære mononukleære blodceller (PMBC'er) inficeret med HIV-1. PMBC'er inficeret med HIV-1 (NL4.3) ved en mangfoldighed af infektion (MOI) på 2. Celler blev fikseret 48 timer efter infektion (hpi). (A) HIV-1 bDNA FISH-sonde (mærket med ATTO 550; rød i figur). Denne sonde hybridiserer til skabelonen (3'<—5') vDNA-streng for at forhindre krydstale med sense (+) vRNA. (B) Ikke-splejset HIV-1 RNA (mærket med Alexa 647; grøn i figur). HIV-1 vRNA-sonden hybridiserer til virale transkripter transskriberet i 5'->3'-orienteringen. (C) Immunostaining af HIV-1 capsid (p24) protein (sekundært antistof konjugeret til Alexa 488; hvid i figur). (D) Flettet billede. Skalabjælken repræsenterer 5 μm. Kerner blev farvet med DAPI (blå). For at mærke HIV-1 DNA (DNA C1 sonde) med henholdsvis ATTO 550 og HIV-1 RNA (RNA C3 sonde) med Alexa 647 blev prøver inkuberet med Amp 4-FL 'B' (Se tabel 4 i protokol for at vælge passende kanalfarver til hybridiseringssonder). Klik her for at se en større version af denne figur.
Derudover har vi udført dobbelt viralt DNA (vDNA) og vRNA-farvning for at følge HTLV-1-infektion. For at optimere nukleinsyremærkningen fulgte vi nøje vDNA / VRNA-farvningsproceduren udviklet til multiplekset fluorescensbilleddannelse af HIV-infektion. Vi har vist, at vi specifikt kan mærke HTLV-1 DNA og RNA samtidigt.
Figur 3: Samtidig mærkning af HTLV-1 vDNA og vRNA i MT-2-celler. (A) HTLV-1 vDNA (mærket med ATTO 550; rød i figur) (B) Uspliceret HTLV-1 sense (+) RNA (RNA C2-sonde & mærket med Alexa 488; grøn i figur)). (C) HTLV-1 HBZ antisense (-) vRNA (RNA C3-sonde & (mærket med Alexa 647; hvid i figur)). (D) Flettet billede. Skalalinjen repræsenterer 20 μm. Kerner blev farvet med DAPI (blå). Amp 4-FL 'B' blev brugt (se tabel 4 i protokollen) for at opnå multiplekset mærkning af HTLV-1 ('+' & '-') RNA. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Kontroleksperimenter for at vurdere målsondens specificitet og baggrund. Specificiteten af HIV-1- og HTLV-1-målprober blev vurderet efter infektion i lymfocytiske cellelinjer (uinficerede Jurkat T-celler, HTLV-1-inficerede celler (MT2) og HIV-1-inficerede celler (H9111B)). Skalastænger repræsenterer 10 μm. (A) Celler blev behandlet med HTLV-1 RNA-sonder. (B) Celler blev behandlet med HIV-1 (+) RNA-sonde (C-D). Yderligere påvisning af specificiteten af HTLV-1-sonder uden krydsreaktivitet med HIV-1. Hvide pile i figur 4C angiver HTLV-1 DNA (rød). (E-F). vRNA-farvning (grøn) +/- RNase-behandling. Klik her for at se en større version af denne figur.
For at verificere specificiteten af hybridiseringssonderne og for at vurdere, hvordan ISH-mærkningsmetoden påvirker proteinfarvningseffektiviteten og den samlede baggrund, udfører vi kritiske kontroller for at sikre det højeste niveau af stringens og reproducerbarhed for eksperimenterne. Som et eksempel verificerer vi i figur 4A-D specificiteten af vores HIV-1- og HTLV-1 vDNA- og vRNA-sonder, da vi viser meget lidt eller ingen krydsreaktivitet mellem sondesættene på tværs af de to vira. På trods af mærkning af to retrovirus med potentiale for sondekrydsreaktivitet er HIV-1-sonderne kun specifikke for HIV-1 genetisk materiale og ikke HTLV-1. Den samme tendens gælder for HTLV-1 sonder. Derudover viser vi i figur 4F, at vi kan eliminere vRNA-farvning, hvis vi RNase-behandler vores celler under prøveforberedelsen. For at vurdere muligheden for dæmpning af proteinfarvningseffektivitet på grund af ISH (proteasebehandling (trin 4 i protokol & figur 1B) og hybridiseringsbetingelser, som kan føre til ablation af epitopgenkendelse eller øget baggrundssignal, demonstrerer vi, at proteinfarvningseffektivitet for den nukleare specklemarkør, sc-35, er sammenlignelig på tværs af konventionelle IF-tilgange og immunostaining under MICDDRP-protokollen. I den konventionelle IF-protokol blev celler permeabiliseret med 0,1% Triton X-100 i 15 minutter i stedet for permeabilisering med 0,1% Tween-20 i 10 minutter, som bruges i MICDDRP-protokollen (trin 3 i protokol & arbejdsgang i figur 1B). Proteinfarvning på tværs af begge betingelser (IF vs. MICDDRP) producerede et signal, der var flere størrelsesordener større end kontrollen (MICDDRP uden primært antistof), hvilket yderligere demonstrerede den lave baggrund, der genereres efter denne protokol og bevarelse af proteinepitoper til effektiv immunostaining . Billedkvantificering af gennemsnitlig integreret fluorescensintensitet af sc-35-signal pr. celle (figur 5E) blev udført som tidligere beskrevet3. For alle viste billeddannelsesresultater sikrede vi sonde- og antistofspecificitet samt vurderede eventuelle forstyrrelser eller højere end normal baggrundsstøj, der tilskrives vores ISH-tilgang.
Figur 5: Sammenligning af proteinfarvningseffektivitet efter konventionel IF vs. MICDDRP . Det cellulære protein, sc-35, en biomarkør for nukleare pletter, blev immunfarvet i Jurkat T-celler. Alle skalabjælker repræsenterer 10 μm. (A) Uinficerede Jurkat T-celler gennemgik MICDDRP-protokollen og blev behandlet med HIV-1 DNA / RNA-hybridiseringssonder, der blev brugt i figur 2 og figur 4 ovenfor. Under immunostaining blev der ikke tilsat noget primært antistof. (B). Uinficerede Jurkat T-celler gennemgik konventionel IF, mærkning sc-35 (hvid). Celler blev gennemtrængt med 0,1% Triton X-100 i 15 minutter. (C). MICDDRP blev udført på HIV-inficerede Jurkat T-celler. vRNA er mærket grønt, vDNA er rødt, og sc-35 er hvidt. (D). Nærbillede af vRNA-, vDNA- og proteinmærkning (sc-35) i HIV-inficeret celle. (E) Kvantificering af gennemsnitligt integreret fluorescenssignal pr. celle af sc-35 på tværs af forskellige immunfarvningsbetingelser. Y-aksen er på en logaritmisk skala. Den stiplede linje repræsenterer baggrundssignalet fra uinficerede celler, der gennemgik MICDDRP-protokollen, hvor der ikke blev tilsat noget primært antistof. Ingen signifikant forskel i signal efter MICDDRP vs . konventionel IF. Over 500 celler blev udtaget til kvantificering for at nå respektive tilstand. Klik her for at se en større version af denne figur.
Denne metode kan også anvendes til at studere RNA-vira, der måske eller måske ikke inkluderer DNA-skabeloner til viral replikation. For eksempel kan strengspecifikke bDNA-sonder designes til at overvåge ekspression af sense (+) eller antisense (-) streng-RNA og forskellige vRNA-arter i vira som HBV, HCV, IAV og ZIKV. Visualiseringen af forskellige RNA-arter i løbet af infektionen kan give indsigt i replikationskinetikken i forskellige virale systemer.
Efter tidsforløbet af HBV-infektion kan vi se, at mængden af HBV prægenomisk RNA (pgRNA) og total HBV RNA stiger som en funktion af tiden. Derudover immuniserede vi samtidig en cellulær værtsfaktor, MOV10 (figur 6).
Figur 6: HBV. Tidsforløb af HBV-infektion af 3E8-celler. Celler blev inficeret med 300 HBV-genomer pr. Celle. Viral replikation vises på tre tidspunkter (24, 48 og 72 hpi). pgRNA (mærket med ATTO 550; rød i figur), total HBV RNA (mærket med Alexa 647; grøn i figur) og MOV10 (sekundært antistof konjugeret til Alexa 488; hvid i figur). Kerner er farvet med DAPI i blåt. Skalalinjen på flettede billeder repræsenterer 10 μm. hpi, timer efter infektion. Klik her for at se en større version af denne figur.
Billeddannelse blev udført via konfokal mikroskopi ved hjælp af et 60x olienedsænkningsmål. Excitations-/emissionsbåndpassbølgelængderne, der blev brugt til at detektere DAPI, Alexa 488, ATTO 550 og Alexa 647, blev indstillet til henholdsvis 405/420-480, 488/505-550, 550/560-610 og 647/655-705 nm (figur 7, figur 8 og figur 9).
Figur 7: Tidsforløb af HCV-infektion af Huh-7.5.1-celler. Huh-7.5.1-celler blev inficeret med hepatitis C-virus (HCV) Jc1/Gluc2A ved en MOI på 0,5. Med de angivne tidsintervaller blev cellerne fikseret og undersøgt sekventielt for sense (+) vRNA, antisense (-) vRNA og NS5A (HCV-protein). Kerner blev farvet med DAPI. Repræsentative flettede billeder fra hvert tidspunkt, der viser (+) RNA i grønt (mærket med Alexa 647) (-) RNA i rødt (mærket med Atto 555), NS5A i hvidt (sekundær ged anti-mus konjugeret til Alexa 488) og kerner i blåt. Skalabjælker repræsenterer 10 μm. De nederste billeder er forstørrede udskæringer fra det tilsvarende tidspunkt. HPI, timer efter infektion. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 8: Strandspecifik bDNA FISH og immunfarvning af A549-celler inficeret med influenza A-virus. A549-celler inficeret med PR8 Influenza A-virus blev fikseret og undersøgt for (A) IAV-nukleoprotein (NP) RNA (mærket med Alexa 488; grøn i figur) og (B) IAV-polymeraseprotein (PB1) (sekundær gede-antimus Atto 550; rød i figur) og kerner blev farvet med DAPI (blå). (C) Flettet billede. Skalabjælken repræsenterer 10 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 9: Strandspecifik bDNA FISH i zikavirus-inficerede celler (ZIKV). Vero-celler blev inficeret med ZIKV ved en MOI på 0,1. Celler blev fastsat til 48 hpi. (A) Celler blev samtidig farvet for sense (+) vRNA (mærket med Alexa 488; grøn i figur) og antisense (-) vRNA (mærket med Atto 550; rød i figur). Kerner blev farvet med DAPI. I (A) angiver den hvide boks et område med både (+) og (-) vRNA. Indsatserne præsenterer et nærbillede af (+) vRNA (grøn) og de knappe (-) vRNA-arter (rød). (B) sans (+) vRNA (grøn). (C) antisense (-) vRNA (rød). Skalabjælken i (A) repræsenterer 10 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Samtidig visualisering af RNA, DNA og protein kræver ofte omfattende optimering. To almindeligt anvendte metoder er 5-ethynyl-2-deoxyuridin (EdU) mærkning og DNA FISH. EdU-mærkning er blevet anvendt til at visualisere viralt DNA og protein samtidigt, da EdU er inkorporeret i spirende DNA og efterfølgende mærket med azidholdige fluorescerende farvestoffer via klikkemi. EdU-mærkning kan således bruges til at overvåge native virusreplikationskinetik af DNA-vira eller vira med DNA-skabeloner til replikation12. En mangel ved EdU-mærkning er imidlertid, at replikerende genom i opdeling af celler vil inkorporere EdU, generere høj baggrund og forvirrende billedanalyse. DNA FISH kan omgå disse problemer ved direkte hybridisering af en nukleinsyresonde til det respektive mål uanset cellecyklussen. Imidlertid var konventionel FISH ofte afhængig af høje temperaturer for at opnå effektiv sondehybridisering, hvilket hindrede immunfarvning eller endda samtidig RNA-farvning13. MICDDRP kan potentielt omgå disse problemer og give robust samtidig fluorescerende mærkning af DNA, RNA og protein på tværs af en række cellulære systemer.
Mens vi har demonstreret, at vi kan mærke protein og nukleinsyre samtidigt ved hjælp af vores MICDDRP-protokol, var optimering nødvendig på tværs af forskellige systemer. Det første store parameter, som vi skulle optimere, var proteasebehandling. Vi varierede protease III koncentration på tværs af betingelserne. Optimering af proteasebehandling var empirisk, da vi brugte forskellige fortyndinger til at vurdere, hvad der gav den største hybridiseringseffektivitet, uden at gå på kompromis med immunfarvningseffektiviteten. Passende kontroller blev udført side om side for at vurdere sondespecificitet og ændringer i proteinfarvningseffektivitet, der tilskrives proteasebehandling. De næste store parametre, der havde brug for optimering, var sondedesign og sondehybridisering.
Korrekt design af indfangnings- og forstærkersonder er afgørende for at opnå følsomheden og specificiteten af bDNA-teknologi. Softwarepakker, der forudsiger sandsynligheden for ikke-specifikke hybridiseringshændelser, er tilgængelige for at forbedre sondedesign 7,11. bDNA-sonder med de medfølgende forforstærker-, forstærker- og fluorescerende etiketprober kan nu købes kommercielt for at sikre kompatibilitet med bDNA-billedbehandlingssæt. Brugere kan forsyne producenter med sekvensinformation (~ 300-1000 basepar) for målregionen (e) i form af en fasta-fil (tekstbaseret format til repræsentation af nukleotidsekvens). Målprober genereres med > 90% sekvenshomologi til den leverede sekvens.
Til DNA-mærkning har vi fundet ud af, at fortynding af sonderne i hybridiseringsbufferen beskrevet i trin 5 i protokollen forbedrer DNA-hybridisering. Ved mærkning af både DNA og RNA kan RNA-sonden fortyndes i hybridiseringsbufferen. DNA-mærkning i fravær af RNase kan ikke udelukke muligheden for, at den observerede nukleinsyre inkluderer RNA af den målrettede stranding. Temperaturen skal muligvis også justeres for at forbedre hybridiseringseffektiviteten. Stigende temperatur kan påvirke proteinfarvningseffektiviteten, da øgede temperaturer kan fremme proteindenaturering, hvilket giver epitopgenkendelse af det primære antistof. I vores præsenterede repræsentative data har vi udført ISH ved 40 °C.
Sammenlignet med konventionel DNA-fisk giver micddrp en forbedret procedure til samtidig mærkning af DNA, RNA og protein for at visualisere via fluorescensmikroskopi. En potentiel begrænsning er, at udvælgelsen af sonde kan påvirke effektiviteten af hybridisering og evnen til kvantitativt at sammenligne data mellem sonder. Denne protokol har været effektiv på tværs af forskellige cellulære og virale systemer i vores hænder med kun mindre optimering, der er nødvendig på tværs af forskellige forhold. Nylige højt profilerede publikationer har brugt vores tilgang til at studere hiv-integrationsstedvalg14 og HIV-omvendt transkriptionskinetik15. Fremtidige anvendelser af MICDDRP kan omfatte visualisering af virale nukleinsyrer samtidig med nukleinsyresekvenser af specifikke cellulære gener og cellulære proteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet helt eller delvist af National Institutes of Health (R01 AI121315, R01 AI146017, R01 AI148382, R01 AI120860, R37 AI076119 og U54 AI150472). Vi takker Dr. Raymond F. Schinazi og Sadie Amichai for at levere celler inficeret med influenza A-virus.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% PFA | |||
| 50% dextran sulfate | Amreso | 198 | For DNA hybridization buffer |
| 50X wash buffer | ACD Bio | 320058 | |
| 6-well plates | |||
| Amplifier 1-FL | ACD Bio | ||
| Amplifier 2-FL | ACD Bio | ||
| Amplifier 3-FL | ACD Bio | ||
| Amplifier 4-FL | ACD Bio | Consult Amp-4 table in protocol | |
| Anti-HCV NS5a antibody | Abcam | ab13833 | Mouse monoclonal; works with HCV genotypes 1a, 1b, 3, and 4 |
| Anti-HIV-1 p24 monoclonal antibody | NIH AIDS Reagent Program | 3537 | |
| Anti-Mov10 antibody | Abcam | ab80613 | Rabbit polyclonal |
| Anti-PB1 antibody | GeneTex | GTX125923 | Antibody against flu protein |
| Bovine serum albumin | Blocking reagent for immunostaining | ||
| Cell media with supplements | Media appropriate for cell model | ||
| Coverslips | |||
| DAPI | ACD Bio | Nuclear stain (RNAscope kit from ACD Bio) | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (1X PBS) | Gibco | 14190250 | No calcium and magnesium |
| Ethylene carbonate | Sigma | E26258 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Use specific FBS based on what serum secondary antibody was raised in (e.g goat FBS) | ||
| Fisherbrand colorfrost plus microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-17/18/19 | Precleaned |
| HCV-GT2a-sense-C2 probe | ACD Bio | 441371 | HCV(+) sense RNA probe |
| HIV-gagpol-C1 | ACD Bio | 317701 | HIV-1 cDNA probe |
| HIV-nongagpol-C3 | ACD Bio | 317711-C | HIV-1 RNA probe |
| HybEZ hybridization oven | ACD Bio | 321710/321720 | |
| ImmEdge hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Nail polish | For immobolizing coverslip to slide prior to protease treatment | ||
| Nuclease free water | Ambion | AM9937 | |
| Poly-d-lysine (PDL) | Coat coverslips in 20 µg/mL of PDL for 30 minutes | ||
| Probe diluent | ACD Bio | 300041 | For diluting RNA C2 or C3 probes |
| Prolong gold antifade | Invitrogen | P36930 | |
| Protease III | ACD Bio | 322337 | |
| RNAscope® Probe- V-Influenza-H1N1-H5N1-NP | ACD Bio | 436221 | |
| RNase A | Qiagen | ||
| Secondary antibodies | |||
| Slides | |||
| Sodium chloride | For DNA hybridization buffer | ||
| Sodium citrate, pH 6.2 | For DNA hybridization buffer | ||
| Tween-20 | For DNA hybridization buffer and PBS-T | ||
| V-HBV-GTD | ACD Bio | 441351 | Total HBV RNA |
| V-HBV-GTD-01-C2 | ACD Bio | 465531-C2 | HBV pgRNA probe |
| V-HCV-GT2a probe | ACD Bio | 441361 | HCV(-) sense RNA probe |
| V-HTLV-HBZ-sense-C3 | ACD Bio | 495071-C3 | HTLV-1 (-) sense RNA probe targetting HBZ |
| V-HTLV1-GAG-C2 | ACD Bio | 495051-C2 | HTLV-1 DNA probe |
| V-HTLV1-GAG-POL-sense | ACD Bio | 495061 | HTLV-1 (+) sense RNA probe |
| V-Influenza-H1N1-H5N1-NP | ACD Bio | 436221 | IAV RNA probe |
| V-ZIKA-pp-O2 | ACD Bio | 464531 | Zika(+) sense RNA probe |
| V-ZIKA-pp-O2-sense-C2 | ACD Bio | 478731-C2 | Zika(-) sense RNA probe |
References
- Zheng, Q., Lavis, L. D. Development of photostable fluorophores for molecular imaging. Current Opinion in Chemical Biology. 39, 32-38 (2017).
- Marini, B., et al. Nuclear architecture dictates HIV-1 integration site selection. Nature. 521 (7551), 227-231 (2015).
- Puray-Chavez, M., et al. Multiplex single-cell visualization of nucleic acids and protein during HIV infection. Nature Communications. 8 (1), 1882 (2017).
- Ukah, O. B., et al. Visualization of HIV-1 RNA Transcription from Integrated HIV-1 DNA in Reactivated Latently Infected Cells. Viruses. 10 (10), (2018).
- Liu, D., et al. Visualization of Positive and Negative Sense Viral RNA for Probing the Mechanism of Direct-Acting Antivirals against Hepatitis C Virus. Viruses. 11 (11), (2019).
- Achuthan, V., et al. Capsid-CPSF6 Interaction Licenses Nuclear HIV-1 Trafficking to Sites of Viral DNA Integration. Cell Host & Microbe. 24 (3), 392-404 (2018).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).
- Xia, C., Babcock, H. P., Moffitt, J. R., Zhuang, X. Multiplexed detection of RNA using MERFISH and branched DNA amplification. Scientific Reports. 9 (1), 7721 (2019).
- Player, A. N., Shen, L. P., Kenny, D., Antao, V. P., Kolberg, J. A. Single-copy gene detection using branched DNA (bDNA) in situ hybridization. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 49 (5), 603-612 (2001).
- Battich, N., Stoeger, T., Pelkmans, L. Image-based transcriptomics in thousands of single human cells at single-molecule resolution. Nature Methods. 10 (11), 1127-1133 (2013).
- Bushnell, S., et al. ProbeDesigner: for the design of probesets for branched DNA (bDNA) signal amplification assays. Bioinformatics. 15 (5), 348-355 (1999).
- Stultz, R. D., Cenker, J. J., McDonald, D. Imaging HIV-1 Genomic DNA from Entry through Productive Infection. Journal of Virology. 91 (9), (2017).
- Brown, K. Visualizing nuclear proteins together with transcribed and inactive genes in structurally preserved cells. Methods. 26 (1), 10-18 (2002).
- Francis, A. C., et al. HIV-1 replication complexes accumulate in nuclear speckles and integrate into speckle-associated genomic domains. Nature Communications. 11 (1), 3505 (2020).
- Dharan, A., Bachmann, N., Talley, S., Zwikelmaier, V., Campbell, E. M. Nuclear pore blockade reveals that HIV-1 completes reverse transcription and uncoating in the nucleus. Nature Microbiology. 5 (9), 1088-1095 (2020).
