Summary
Presentato qui un protocollo per un approccio di imaging a fluorescenza, multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA, and protein (MICDDRP), un metodo in grado di visualizzare simultaneamente fluorescenza singola cellula di proteine virali e acidi nucleici di diverso tipo e filamento. Questo approccio può essere applicato a una vasta gamma di sistemi.
Abstract
L'acquisizione dei processi di replicazione dinamica e assemblaggio dei virus è stata ostacolata dalla mancanza di robuste tecnologie di ibridazione in situ (ISH) che consentano la marcatura sensibile e simultanea dell'acido nucleico virale e delle proteine. I metodi convenzionali di ibridazione in situ a fluorescenza del DNA (FISH) spesso non sono compatibili con l'immunocolorazione. Abbiamo quindi sviluppato un approccio di imaging, MICDDRP (multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA and protein), che consente la visualizzazione simultanea di DNA, RNA e proteine. Rispetto al DNA FISH convenzionale, MICDDRP utilizza la tecnologia ISH del DNA ramificato (bDNA), che migliora notevolmente la sensibilità e il rilevamento della sonda oligonucleotidica. Piccole modifiche di MICDDRP consentono l'imaging di proteine virali in concomitanza con acidi nucleici (RNA o DNA) di diversa filamento. Abbiamo applicato questi protocolli per studiare i cicli di vita di più patogeni virali, tra cui il virus dell'immunodeficienza umana (HIV)-1, il virus T-linfotropico umano (HTLV)-1, il virus dell'epatite B (HBV), il virus dell'epatite C (HCV), il virus Zika (ZKV) e il virus dell'influenza A (IAV). Abbiamo dimostrato che possiamo etichettare in modo efficiente gli acidi nucleici virali e le proteine in una vasta gamma di virus. Questi studi possono fornirci una migliore comprensione meccanicistica di più sistemi virali e, inoltre, servire come modello per l'applicazione dell'imaging a fluorescenza multipla di DNA, RNA e proteine in un ampio spettro di sistemi cellulari.
Introduction
Mentre migliaia di anticorpi commerciali sono disponibili per marcare specificamente le proteine tramite approcci convenzionali di immunocolorazione, e mentre le proteine di fusione possono essere progettate con tag fluorescenti foto-ottimizzati per tracciare più proteine in un campione1, la visualizzazione microscopica delle proteine spesso non è compatibile con l'ibridazione convenzionale della fluorescenza del DNA in situ (FISH)2 . Le limitazioni tecniche nella visualizzazione simultanea di DNA, RNA e proteine utilizzando approcci basati sulla fluorescenza hanno ostacolato una comprensione approfondita della replicazione del virus. Il monitoraggio sia dell'acido nucleico virale che delle proteine durante il corso dell'infezione consente ai virologi di visualizzare i processi fondamentali che sono alla base della replicazione e dell'assemblaggio del virus 3,4,5,6.
Abbiamo sviluppato un approccio di imaging, multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA, and Protein (MICDDRP)3, che utilizza la tecnologia in situ del DNA ramificato (bDNA) per migliorare la sensibilità del rilevamento degli acidi nucleici 7,8,9 . Inoltre, questo metodo utilizza sonde accoppiate per una maggiore specificità. Le sonde specifiche per la sequenza di bDNA utilizzano DNA di preamplificatori ramificati e amplificatori per produrre un segnale intenso e localizzato, migliorando i precedenti metodi di ibridazione che si basavano sul targeting di regioni ripetute nel DNA9. Le cellule infette in un contesto clinico spesso non contengono abbondante materiale genetico virale, fornendo una merce per un metodo sensibile per il rilevamento di acidi nucleici fluorescenti in contesti diagnostici. La commercializzazione della tecnologia del bDNA attraverso approcci come RNAscope7 e ViewRNA10 ha riempito questa nicchia. La sensibilità dell'imaging a fluorescenza del bDNA ha anche un'importante utilità nella biologia cellulare, consentendo il rilevamento di scarse specie di acidi nucleici in modelli di coltura cellulare. Il grande miglioramento della sensibilità rende i metodi di imaging basati sul bDNA adatti allo studio dei virus. Una potenziale carenza, tuttavia, è che questi metodi si concentrano sulla visualizzazione di RNA o RNA e proteine. Tutte le cellule replicanti e molti virus hanno genomi di DNA o formano DNA durante il loro ciclo di replicazione, rendendo altamente desiderabili metodi in grado di visualizzare sia l'RNA e il DNA, sia le proteine.
Nel protocollo MICDDRP, eseguiamo bDNA FISH per la rilevazione di acido nucleico virale utilizzando il metodo RNAscope, con modifiche7. Una delle principali modifiche a questo protocollo è l'ottimizzazione del trattamento della proteasi dopo la fissazione chimica. Il trattamento con proteasi facilita la rimozione delle proteine legate all'acido nucleico per migliorare l'efficienza di ibridazione della sonda. Il trattamento con proteasi è seguito dall'incubazione con sonde oligonucleotidiche ramificate. Dopo l'applicazione di sonde bDNA, i campioni vengono lavati e successivamente incubati con DNA di preamplificatore di segnale e amplificatore. L'ibridazione multiplexata in situ (ISH), marcatura di bersagli genici multipli, richiede sonde bersaglio con diversi canali di colore per la differenziazione spettrale7. L'incubazione con amplificatori del DNA è seguita da immunofluorescenza (IF).
bDNA ISH impartisce miglioramenti nel rapporto segnale-rumore mediante amplificazione di segnali target-specifici, con una riduzione del rumore di fondo da eventi di ibridazione non specifici 7,11. Le sonde target sono progettate utilizzando programmi software disponibili pubblicamente che prevedono la probabilità di eventi di ibridazione non specifici, oltre a calcolare la temperatura di fusione (Tm) dell'ibrido sonda-bersaglio 7,11. Le sonde bersaglio contengono una regione da 18 a 25 basi complementare alla sequenza DNA/RNA bersaglio, una sequenza distanziatrice e una sequenza di coda a 14 basi. Una coppia di sonde bersaglio, ciascuna con una sequenza di coda distinta, si ibridano in una regione bersaglio (che copre ~ 50 basi). Le due sequenze di coda formano un sito di ibridazione per le sonde preamplificatore, che contengono 20 siti di legame per le sonde amplificatore, che contengono inoltre 20 siti di legame per la sonda di etichetta. Ad esempio, una regione di una kilobase (kb) sulla molecola di acido nucleico è presa di mira da 20 coppie di sonde, creando un'impalcatura molecolare per l'ibridazione sequenziale con il preamplificatore, l'amplificatore e la sonda di etichetta. Ciò può quindi portare a una resa teorica di 8000 etichette fluorescenti per molecola di acido nucleico, consentendo il rilevamento di singole molecole e grandi miglioramenti rispetto agli approcci convenzionali FISH7 (vedi Figura 1A per lo schema dell'amplificazione del segnale bDNA). Per impostare le sonde per ISH multiplexato, ogni sonda target deve trovarsi in un canale di colore diverso (C1, C2 o C3). Queste sonde target con diversi canali di colore possiedono distinte sequenze di coda a 14 basi. Queste sequenze di coda collegheranno amplificatori di segnale distinti con diverse sonde fluorescenti, consentendo così una facile differenziazione spettrale su più bersagli. Nel protocollo presentato, la tabella 4 nella fase 9, fornisce ulteriori informazioni sull'etichettatura fluorescente delle sonde target. Inoltre, la Figura 2 e la Figura 3 forniscono esempi di come abbiamo scelto l'amplificatore 4-FL appropriato (A, B o C) (sonda fluorescente e fase finale di ibridazione) per ottenere una marcatura fluorescente specifica di più bersagli virali di acidi nucleici dopo infezioni da HIV-1 e HTLV-1.
Abbiamo dimostrato diverse applicazioni della visualizzazione simultanea della fluorescenza di RNA, DNA e proteine, osservando le fasi critiche della replicazione del virus con alta risoluzione spaziotemporale 3,4,5. Ad esempio, la visualizzazione simultanea di RNA virale, DNA citoplasmatico e nucleare e proteine ci ha permesso di visualizzare eventi chiave durante l'infezione da HIV-1, incluso il seguito di nuclei contenenti RNA nel citoplasma prima dell'ingresso nucleare e dell'integrazione del DNA provirale3. Inoltre, abbiamo applicato MICDDRP per caratterizzare gli effetti dei fattori dell'ospite e del trattamento farmacologico sull'infezione virale e sulla replicazione 4,5. In Ukah et al., abbiamo monitorato la riattivazione della trascrizione dell'HIV-1 in modelli cellulari di latenza trattati con diversi agenti di inversione della latenza per visualizzare la trascrizione dell'HIV e l'inversione della latenza4. Inoltre, MICDDRP può permetterci di visualizzare i cambiamenti fenotipici associati all'inibizione antivirale attribuita al trattamento con piccole molecole o alla restrizione del fattore ospite. Come prova di concetto per la robustezza e l'ampia applicabilità del nostro approccio, abbiamo dimostrato che possiamo utilizzare le modifiche del nostro protocollo per etichettare in modo efficiente l'acido nucleico virale per seguire l'infezione non solo nel virus dell'immunodeficienza umana (HIV)-1, ma anche nel virus T-linfotropico umano (HTLV)-1, nel virus dell'epatite B (HBV), nel virus dell'epatite C (HCV), Virus Zika (ZIKV) e virus dell'influenza A (IAV). Poiché il ciclo di vita dell'HIV-1 è costituito sia da DNA virale che da specie di RNA, abbiamo eseguito la maggior parte della nostra ottimizzazione di MICDDRP seguendo la cinetica di replicazione dell'HIV-1. Tuttavia, in aggiunta, abbiamo dimostrato che possiamo tracciare la sintesi di diversi trascritti di RNA virale di uno o entrambi i filamenti senso (+) e antisenso (-) in virus come ZIKV, IAV, HBV e HCV per monitorare la trascrizione virale e la replicazione 3,4,5,6. Gli studi mirano a migliorare la comprensione meccanicistica di diversi processi virali e servono come linea guida per implementare questa tecnologia di imaging a fluorescenza in una vasta gamma di modelli cellulari.
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Protocol
1. Cellule seme (Suspension vs. Adherent Cells) su coverslip o vetrini da camera (il protocollo presentato utilizza coverslips).
- Semina di celle di sospensione
- Preparare i coprivetrini rivestiti in poli-D-lisina (PDL) (facilita l'aderenza delle celle di sospensione al coverslip) incubando prima i coprivetrini in etanolo (EtOH) per 5 minuti (sterilizza i vetrini di copertura e rimuove eventuali residui). Quindi lavare 2 volte in soluzione salina tamponata fosfato (PBS) prima di incubare i vetrini di copertura in PDL (20 μg/ml) per 30 minuti (min) a temperatura ambiente (RT).
- Rimuovere PDL e lavare 2 volte in PBS. Celle pellet (precedentemente infettate/trattate in base alle condizioni di imaging desiderate) e risospendere 106cellule in 50 μL di PBS. Spot 50 μL di cellule su vetro (rivestito PDL) e incubare a RT per 30 minuti.
- Semina di cellule aderenti
- Cellule di coltura su coprislip sterile posto in 6 pozzetti piatto e infettare le cellule con particelle virali o trattare con composto di interesse. Consentire alle cellule di raggiungere il 50-70% di confluenza prima della preparazione del campione per gli esperimenti di imaging.
2. Fissazione cellulare: preservare la morfologia cellulare per gli studi di imaging a fluorescenza
NOTA: Mantenere il 4% di PFA e PBS a RT per almeno 30 minuti prima della fissazione cellulare.
- Aspirare il supporto cellulare, lavare le cellule su coprivetrini 3 volte in PBS e fissare le cellule in paraformaldeide (PFA) al 4% per 30 minuti. Aspirare PFA e lavare le celle in PBS 2x.
NOTA: Le cellule possono ora essere disidratate e conservate, se lo sperimentatore desidera riprendere l'esperimento in un'altra data. Le cellule fisse possono essere disidratate in EtOH prima dello stoccaggio.- Rimuovere il PBS dopo il lavaggio dopo la fissazione cellulare e sostituirlo con 500 μL di EtOH al 50% (v/v in acqua). Incubare a RT per 5 min.
- Rimuovere il 50% di EtOH e sostituirlo con 500 μL di 70% di EtOH. Incubare a RT per 5 min.
- Rimuovere il 70% di EtOH e sostituirlo con 500 μL di 100% di EtOH. Incubare a RT per 5 min.
- Rimuovere 100% EtOH e sostituirlo con fresco 100% EtOH.
NOTA: Le cellule disidratate possono essere conservate a -20 °C per 6 mesi. Sigillare le piastre con nastro adesivo o parafilm prima dello stoccaggio per evitare l'evaporazione di EtOH. - Reidratare le cellule per passare all'etichettatura a fluorescenza multipla di cellule/virus.
- Rimuovere il 100% EtOH e sostituirlo con 500 μL di 70% di EtOH. Incubare a RT per 2 min.
NOTA: Non lasciare asciugare le cellule in qualsiasi momento. Utilizzare sempre una soluzione sufficiente per immergere tutte le celle. - Rimuovere il 70% di EtOH e sostituirlo con 500 μL di 50% di EtOH. Incubare a RT per 2 min.
- Rimuovere il 50% di EtOH e sostituirlo con 1x PBS.
NOTA: Preparare la diluizione della proteasi, le sonde di ibridazione e il tampone di lavaggio prima del trattamento con proteasi (Fase 4) e dell'applicazione della sonda target (Fase 5). Istruzioni specifiche sulla preparazione del reagente sono presentate all'inizio di ogni rispettiva fase.
| Reagenti | Altre note |
| Soluzione di proteasi | Preparazione in 1X PBS |
| Sonda(e) oligonucletodie bersaglio | Diluire in tampone di ibridazione |
| Tampone di lavaggio | Lavaggi seguendo le fasi di ibridazione target |
| Buffer di ibridazione | Ricetta presentata nella tabella 3 |
Tabella 1: Reagenti chiave nel protocollo MICDDDRP.
3. Permeabilizzazione cellulare: aumenta l'accesso alla cellula e agli organelli cellulari per l'ingresso di grandi molecole (anticorpi, sonde di ibridazione degli acidi nucleici)
- Rimuovere 1x PBS dopo la fissazione cellulare o la reidratazione e sostituirlo con 500 μL di 0,1% (v/v) Tween-20 in 1x PBS. Incubare a RT per 10 min. Sostituisci uno per uno. Lavare una volta con 500 μL di 1x PBS e aggiungere 1x PBS fresco.
4. Immobilizzazione del coverslip su vetrino e trattamento con proteasi per rimuovere le proteine leganti gli acidi nucleici dall'acido nucleico virale/cellulare fisso per migliorare l'efficienza di ibridazione
NOTA: Preparare la soluzione diluita di Proteasi III (vedere le specifiche del reagente nella Tabella dei materiali) durante la permeabilizzazione cellulare. Lasciare che la proteasi raggiunga RT per 10 minuti prima della permeabilizzazione.
- Metti una piccola goccia di smalto su un vetrino sterilizzato. Asciugare la schiena (lato senza strato cellulare) e posizionare il bordo della copertina sulla goccia di smalto, con il lato con le cellule aderenti rivolte verso l'alto. Aggiungere alcune gocce di PBS sul coprislip immobilizzato per evitare l'essiccazione.
- Disegnare un cerchio (a circa 3 mm di distanza dal coprivetrino) attorno al perimetro del coprivetrino ora aderente al vetrino utilizzando una penna barriera idrofobica (penna idrorepellente che mantiene i reagenti localizzati sulle cellule).
- Diluire Proteasi III in 1x PBS (100 μL/coverslip).
NOTA: Potrebbe essere necessario regolare la concentrazione della proteasi in base alle differenze nei tipi di cellule, nelle sonde o negli acidi nucleici bersaglio attraverso l'ottimizzazione empirica (vedi discussione). Per una marcatura più efficiente di RNA / DNA in diversi sistemi virali, abbiamo avuto successo con le seguenti diluizioni presentate nella Tabella 2 di seguito con diluizioni che vanno da (1 a 2 ) - (da 1 a 15) (proteasi a 1x PBS).
| Target della sonda | Diluizione della proteasi in 1X PBS (da Proteasi III a 1X PBS) |
| HIV-1 DNA/RNA | 1 a 5 |
| HTLV-1 DNA/RNA | 1 a 5 |
| pgRNA HBV e RNA HBV totale | 1 a 15 |
| IAV RNA | 1 a 15 |
| ZIKV RNA | 1 a 2 |
Tabella 2: Diluizioni della proteasi III nella PBS per l'ibridazione dell'acido nucleico virale.
- Decantare il PBS 1x sul vetrino dopo l'immobilizzazione e applicare la Proteasi III diluita.
- Incubare in forno umidificato a 40 °C per 15 min.
- Decantare la soluzione di proteasi e immergere i vetrini in 1x PBS. Agitare con un piatto a dondolo per 2 minuti a RT. Ripetere il lavaggio con il nuovo 1x PBS.
- Per il solo rilevamento del DNA, lavare i campioni tre volte con acqua priva di nucleasi per 2 minuti ciascuno, seguita da incubazione con 5 mg/ml di RNasi A diluita in PBS per 30 minuti a 37 °C.
- Decantare la soluzione RNase A e lavare 3 volte per 2 minuti con acqua ultrapura. Continuare con ISH della/e sonda/e target/e.
NOTA: Il buffer di ibridazione migliora il rilevamento del vDNA senza influire sull'efficienza di colorazione del vRNA per i risultati presentati (Risultati rappresentativi). Sonde diluite DNA Channel 1 (C1) 1:1 con sonda di ibridazione. Sonde di RNA C2 e C3 diluite in tampone di ibridazione. Le sonde C2 e C3 utilizzate nei nostri studi di imaging sono in soluzioni 50X (1:50; sonda target al buffer di ibridazione).
- Preparare il tampone di ibridazione in acqua priva di nucleasi seguendo la procedura passo-passo riportata di seguito:
- In una provetta da 15 ml, aggiungere 700 μL di acqua esente da nucleasi, 300 μL del 50% (peso/volume (p/v)) di destrano solfato, 300 μL di 5 M NaCl, 125 μL di 200 mM di citrato di sodio (pH 6,2) e 375 mg (polvere) di carbonato di etilene.
- Mescolare bene usando un vortice per sciogliere il carbonato di etilene (assicurarsi che tutta la polvere sia disciolta e la soluzione limpida).
- Aggiungere 25 μL del 10% (volume/volume (v/v)) Tween-20 e abbastanza acqua priva di nucleasi per completare 2,5 mL (2x soluzione).
NOTA: La ricetta per il buffer di ibridazione presentata può essere trovata nella tabella 3 di seguito. La soluzione è stabile per una settimana. Garantire una miscelazione sufficiente del detergente Tween-20, facendo attenzione a prevenire il gorgogliamento della soluzione.
| Reagente | Concentrazione delle scorte | Note aggiuntive |
| Acqua esente da nucleasi | NA | |
| Destrano solfato | 50% (w/v) | Molto viscoso |
| Cloruro di sodio | 5 metri | |
| Citrato di sodio (pH 6,2) | 200 mM | Conservare a 4 °C |
| Carbonato di etilene | NA | Polvere |
| Tween-20 | 10% (v/v) |
Tabella 3: Elenco dei reagenti del buffer di ibridazione.
5. Incubazione con sonde di ibridazione bersaglio DNA/RNA: le sonde oligonucleotidiche target si legano alle regioni di interesse, creando un'impalcatura molecolare per preamplificatori, amplificatori e sonde fluorescenti da legare.
NOTA: Sonde DNA/RNA calde a 40 °C per 10 minuti (durante la permeabilizzazione cellulare) e raffreddare a RT per almeno 10 minuti, se non è incluso alcun trattamento con RNasi. Se è necessario un trattamento con RNasi o un ulteriore trattamento del campione prima dell'ibridazione della sonda bersaglio, riscaldare le sonde di conseguenza. Ruotare le sonde C2 e C3 dopo il riscaldamento e diluirle in tampone di ibridazione. Dopo la diluizione, le sonde C2 e C3 possono essere brevemente riscaldate. Tampone di lavaggio caldo 50x (vedere la tabella dei materiali per maggiori dettagli) a 40 °C per 10-20 minuti e diluire a 1x in acqua di biologia molecolare.
- Incubare 200 μL del tampone di ibridazione a 67 °C per 10 minuti prima dell'aggiunta della o delle sonde di ibridazione. Sonda diluita in tampone di ibridazione (ricetta elencata nella Tabella 2). Aggiungere 50 μL/coprifoglio.
- Incubare in forno umidificato a 40 °C per 2 ore (h). Decantare le sonde e immergere i vetrini in 1x tampone di lavaggio. Agitare dondolando per 2 minuti a RT. Ripetere il lavaggio con il nuovo tampone di lavaggio 1x.
6. Ibridazione amplificatore (amp) 1-FL: aggiunta di preamplificatore complementare alla sequenza di coda delle sonde DNA/RNA bersaglio (Fase 5)
NOTA: Gli amplificatori devono essere a RT prima dell'uso. Estrarre ogni singolo amplificatore dal frigo 30 minuti prima dell'uso e lasciare sul banco a RT.
- Rimuovere i vetrini dal tampone di lavaggio 1x e toccare/assorbire per rimuovere il liquido in eccesso.
- Aggiungere 1 goccia di Amp 1-FL sul foglietto. Incubare in forno umidificato a 40 °C per 30 min.
- Decantare Amp 1-FL e immergere in 1x tampone di lavaggio. Agitare con un piatto a dondolo 2 minuti a RT. Ripetere il lavaggio con il nuovo tampone di lavaggio 1x.
7. Ibridazione Amp 2-FL: Incubazione con amplificatore di segnale con sequenza di riconoscimento affine ai preamplificatori (Amp 1-FL)
- Rimuovere i vetrini dal tampone di lavaggio 1x e toccare/assorbire per rimuovere il liquido in eccesso.
- Aggiungere 1 goccia di Amp 2-FL sulla copertina. Incubare in forno umidificato a 40 °C per 15 min.
- Decantare Amp 2-FL e immergere in 1x tampone di lavaggio. Agitare con un piatto a dondolo 2 minuti a RT. Ripetere il lavaggio con il nuovo tampone di lavaggio 1x.
8. Ibridazione Amp 3-FL: Incubazione con secondo amplificatore di segnale
- Rimuovere i vetrini dal tampone di lavaggio 1x e toccare/assorbire per rimuovere il liquido in eccesso.
- Aggiungere 1 goccia di Amp 3-FL sul coprifoglio. Incubare in forno umidificato a 40 °C per 30 min.
- Decantare Amp 3-FL e immergere in 1x tampone di lavaggio. Agitare con un piatto a dondolo 2 minuti a RT. Ripetere il lavaggio con il nuovo tampone di lavaggio 1x.
9. Ibridazione Amp 4-FL: etichetta fluorescente e fase finale di ibridazione
NOTA: Per prima cosa, vedere la Tabella 4 per scegliere l'amplificatore 4 (A, B o C)- FL adatto in base ai canali della sonda o delle sonde target. Valutare quale Amp 4-FL è necessario per etichettare DNA / RNA di interesse. Un esempio è fornito dalla tabella seguente:
| Un | B | C | |
| Canale del DNA 1 (C1) | 488 | 550 | 550 |
| DNA/RNA Canale 2 (C2) | 550 | 488 | 647 |
| RNA Canale 3 (C3) | 647 | 647 | 488 |
Tabella 4: Selezione della sonda fluorescente Amp 4 (A, B o C)-FL per ISH multiplexato.
NOTA: Per FISH multiplexati (target multipli), la scelta dell'Amp 4 corretto (A, B o C)- FL è fondamentale per etichettare correttamente il target di interesse. Le sonde target (Step 5) hanno canali di colore diversi (C1, C2 o C3), che dettano la rispettiva etichetta fluorescente (Alexa 488, Atto 550 o Alexa 647), in base all'amplificatore 4-FL scelto. Esempi di scelta di combinazioni di fluorofori per l'imaging multiplex sono forniti nelle legende della Figura 2 e della Figura 3. Come ulteriore esempio, la selezione di Amp 4B-FL etichetterà selettivamente le sonde DNA C1 con Atto 550 e le sonde RNA C3 con Alexa 647.
- Rimuovere i vetrini dal tampone di lavaggio 1x e toccare/assorbire per rimuovere il liquido in eccesso.
- Aggiungere 1 goccia di Amp 4-FL sulla copertina. Incubare in forno umidificato a 40 °C per 15 min.
NOTA: dopo il passaggio 9.2, tenere i campioni coperti, al riparo dalla luce. - Decantare Amp 4-FL e immergere in 1x tampone di lavaggio. Agitare dondolando per 2 minuti a RT. Ripetere il lavaggio con il nuovo tampone di lavaggio 1x. Lavare con 1x PBS (2 min) e conservare in PBS.
10. Immunocolorazione proteica: per etichettare le proteine di interesse
- Decantare PBS e aggiungere 200 μL di tampone bloccante (1% p/v BSA, 10% v/v FBS in PBS con 0,1% v/v Tween-20 (PBST)) al coprifoglio. Incubare 1 ora a RT.
- Decantare tampone bloccante e applicare 200 μL di anticorpo primario diluito in PBST + 1% p/v BSA. Incubare 1 ora a RT.
- Lavare il vetrino due volte con PBST per 10 minuti a RT agitando.
- Applicare l'anticorpo secondario di scelta per 1 ora a RT in PBST + 1% w/v BSA.
- Lavare il vetrino con PBST per 10 minuti a RT agitando.
11. Colorazione nucleare: nuclei contro-colorazione dopo immunocolorazione
- Decantare PBST e applicare DAPI o colorazione nucleare di scelta per 1 minuto a RT.
- Lavare il vetrino due volte con PBS per 10 minuti a RT agitando.
12. Montaggio
- Posizionare 1 goccia di soluzione antisbiadimento (ad esempio, Prolong Gold) su un nuovo vetrino sterile (in primo luogo, pulire il vetrino con EtOH e lasciare asciugare per assicurarsi che non ci siano residui sul vetro). Con la stessa punta, distribuire la goccia di soluzione antisbiadimento per coprire un'area approssimativamente delle dimensioni del vetrino.
NOTA: la soluzione antisbiadimento è molto viscosa e può essere difficile da pipettare. Tagliare la punta di una punta da 200 μL prima del pipettaggio può mitigare questi problemi. - Rimuovere il coprislip con il campione di cellule dal vetrino e immergerlo in PBS per rimuovere lo smalto residuo sul retro usando la pinza e il PBS. Pinza asciutta e retro della copertina usando un Kimwipe.
- Incorporare delicatamente il coprislip nella goccia della soluzione antisbiadimento, posizionando il lato del campione (lato con lo strato cellulare) del coprislip sulla goccia).
- Lasciare asciugare i campioni durante la notte.
13. Imaging
- Immagine con un microscopio epifluorescente.
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Representative Results
Uno schema di MICDDRP è illustrato nella Figura 1. L'etichettatura del DNA e dell'RNA è seguita dall'immunocolorazione. L'uso di amplificatori ramificati aumenta il segnale, consentendo la rilevazione di singole molecole di acido nucleico.
Figura 1: Schema di MICDDRP e flusso di lavoro passo-passo. (A) Il segnale bDNA viene amplificato tramite DNA preamplificatore ramificato, amplificatore e amplificatore per migliorare la rilevazione del DNA virale (1) e delle specie di RNA (2). Le sonde oligonucleotidiche sono ibridate in coppie (ZZ in schema) a target di interesse, creando un'impalcatura per preamplificatore (Amp 1-FL, Step 6 in Protocol), amplificatore (Amp 2- & 3-FL) e sonde fluorescenti (Amp 4, Step 9 in Protocol). Consultare la Tabella 4 per la scelta dell'Amp 4 (A, B o C)-FL appropriato per ISH multiplexato. La marcatura dell'acido nucleico è seguita da proteine immunocoloranti di interesse (3). (B) Tredici fasi principali del protocollo MICDDRP con stima della durata temporale per ciascuna rispettiva fase. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
L'applicazione di MICDDRP per studiare il decorso dell'infezione da HIV-1 è stato uno strumento utile per tracciare la cinetica di replicazione virale nelle cellule primarie. Come prova del concetto di questa procedura, il DNA, l'RNA e la proteina dell'HIV-1 sono simultaneamente marcati e visualizzati al microscopio a livello di singola cellula (Figura 2). Due genomi del DNA dell'HIV-1 sono visualizzati in una singola cellula, poiché trascrivono attivamente l'RNA virale (vRNA). Il vRNA è stato esportato attraverso il complesso dei pori nucleari e la proteina virale è sintetizzata nel citoplasma.
Figura 2: MICDDRP delle cellule mononucleate primarie del sangue (PMBC) infettate da HIV-1. PMBC infettati da HIV-1 (NL4.3) con una molteplicità di infezione (MOI) di 2. Le cellule sono state fissate 48 ore dopo l'infezione (hpi). (A) Sonda HIV-1 bDNA FISH (etichettata con ATTO 550; rosso in figura). Questa sonda si ibrida al filamento di vDNA modello (3'<-5') per prevenire la diafonia con il vRNA di senso (+). (B) Unspliced HIV-1 RNA (etichettato con Alexa 647; verde in figura). La sonda vRNA HIV-1 si ibrida con trascritti virali trascritti nell'orientamento 5'->3'. (C) Immunocolorazione della proteina capside HIV-1 (p24) (anticorpo secondario coniugato ad Alexa 488; bianco in figura). (D) Immagine unita. La barra della scala rappresenta 5 μm. I nuclei sono stati colorati con DAPI (blu). Per marcare il DNA dell'HIV-1 (sonda DNA C1) con ATTO 550 e l'RNA HIV-1 (sonda RNA C3) con Alexa 647, rispettivamente, i campioni sono stati incubati con Amp 4-FL 'B' (consultare la Tabella 4 nel protocollo per scegliere i colori dei canali appropriati per le sonde di ibridazione). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Inoltre, abbiamo eseguito la doppia colorazione del DNA virale (vDNA) e del vRNA per seguire l'infezione da HTLV-1. Per ottimizzare la marcatura degli acidi nucleici, abbiamo aderito strettamente alla procedura di colorazione vDNA/VRNA sviluppata per l'imaging a fluorescenza multipla dell'infezione da HIV. Abbiamo dimostrato che possiamo marcare specificamente HTLV-1 DNA e RNA contemporaneamente.
Figura 3: Marcatura simultanea di vDNA HTLV-1 e vRNA in cellule MT-2. (A) HTLV-1 vDNA (marcato con ATTO 550; rosso in figura) (B) Senso HTLV-1 non giuntato (+) RNA (sonda RNA C2 ed etichettato con Alexa 488; verde in figura)). (C) HTLV-1 HBZ antisenso (-) vRNA (sonda RNA C3 & (marcato con Alexa 647; bianco in figura)). (D) Immagine unita. La barra della scala rappresenta 20 μm. I nuclei sono stati colorati con DAPI (blu). L'amplificatore 4-FL 'B' è stato utilizzato (consultare la tabella 4 nel protocollo) per ottenere l'etichettatura multiplex dell'RNA HTLV-1 ('+' & '-'). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Esperimenti di controllo per valutare la specificità e il background della sonda bersaglio. La specificità delle sonde bersaglio HIV-1 e HTLV-1 è stata valutata a seguito dell'infezione in linee cellulari linfocitarie (cellule T Jurkat non infette, cellule infette da HTLV-1 (MT2) e cellule infette da HIV-1 (H9111B)). Le barre della scala rappresentano 10 μm. (A) Le cellule sono state trattate con sonde di RNA HTLV-1. (B) Le cellule sono state trattate con sonda RNA HIV-1 (+) (C-D). Ulteriore dimostrazione della specificità delle sonde HTLV-1 senza cross-reattività con HIV-1. Le frecce bianche nella Figura 4C indicano HTLV-1 DNA (rosso). (E-F). Colorazione vRNA (verde) +/- trattamento con RNasi. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Per verificare la specificità delle sonde di ibridazione e per valutare come il metodo di etichettatura ISH influisce sull'efficienza della colorazione delle proteine e sul background generale, eseguiamo controlli critici per garantire il massimo livello di rigore e riproducibilità per gli esperimenti. Ad esempio, nella Figura 4A-D, verifichiamo la specificità delle nostre sonde vDNA e vRNA HIV-1 e HTLV-1, poiché mostriamo pochissima o nessuna reattività crociata tra i set di sonde tra i due virus. Nonostante la marcatura di due retrovirus con il potenziale di cross-reattività della sonda, le sonde HIV-1 sono specifiche solo per il materiale genetico HIV-1 e non HTLV-1. La stessa tendenza vale per le sonde HTLV-1. Inoltre, nella Figura 4F, mostriamo che possiamo eliminare la colorazione del vRNA se trattiamo le nostre cellule con RNasi durante la preparazione del campione. Per valutare la possibilità di attenuazione dell'efficienza di colorazione delle proteine dovuta all'ISH (trattamento con proteasi (Fase 4 nel protocollo e Figura 1B) e alle condizioni di ibridazione, che possono portare all'ablazione del riconoscimento dell'epitopo o all'aumento del segnale di fondo, dimostriamo che l'efficienza di colorazione delle proteine per il marcatore di speckle nucleare, sc-35, è paragonabile tra gli approcci IF convenzionali e l'immunocolorazione durante il protocollo MICDDDRP. Nel protocollo IF convenzionale, le cellule sono state permeabilizzate con lo 0,1% di Triton X-100 per 15 minuti, piuttosto che la permeabilizzazione con lo 0,1% di Tween-20 per 10 minuti, che viene utilizzato nel protocollo MICDDRP (Fase 3 in Protocollo e flusso di lavoro in Figura 1B). La colorazione delle proteine in entrambe le condizioni (IF vs. MICDDRP) ha prodotto un segnale di diversi ordini di grandezza maggiore rispetto al controllo (MICDDRP senza anticorpo primario), dimostrando ulteriormente il basso background generato seguendo questo protocollo e la conservazione degli epitopi proteici per un'immunocolorazione efficiente . La quantificazione dell'immagine dell'intensità media di fluorescenza integrata del segnale sc-35 per cella (Figura 5E) è stata eseguita come descritto in precedenza3. Per tutti i risultati di imaging mostrati, abbiamo assicurato la specificità della sonda e degli anticorpi, oltre a valutare eventuali perturbazioni o rumore di fondo superiore al normale attribuito al nostro approccio ISH.
Figura 5: Confronto dell'efficienza di colorazione delle proteine dopo IF convenzionale rispetto a MICDDRP. La proteina cellulare, sc-35, un biomarcatore per le macchie nucleari, è stata immunocolorata nelle cellule T di Jurkat. Tutte le barre della scala rappresentano 10 μm. (A) Le cellule T Jurkat non infette sono state sottoposte al protocollo MICDDRP e sono state trattate con sonde di ibridazione DNA/RNA HIV-1 utilizzate nella Figura 2 e nella Figura 4 sopra. Durante l'immunocolorazione, non è stato aggiunto alcun anticorpo primario. (B). Le cellule T Jurkat non infette sono state sottoposte a IF convenzionale, etichettando sc-35 (bianco). Le cellule sono state permeabilizzate con Triton X-100 allo 0,1% per 15 minuti. (C). MICDDRP è stato eseguito su cellule T Jurkat infette da HIV. Il vRNA è etichettato in verde, il vDNA è rosso e sc-35 è bianco. (D). Primo piano di vRNA, vDNA e marcatura proteica (sc-35) in cellule infette da HIV. (E) Quantificazione del segnale medio di fluorescenza integrata per cellula di sc-35 in diverse condizioni di immunocolorazione. L'asse y è su una scala logaritmica. La linea tratteggiata rappresenta il segnale di fondo delle cellule non infette che hanno subito il protocollo MICDDRP in cui non è stato aggiunto alcun anticorpo primario. Nessuna differenza significativa nel segnale dopo MICDDRP rispetto all'IF convenzionale. Oltre 500 cellule sono state campionate per la quantificazione per raggiungere la rispettiva condizione. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Questo metodo può anche essere applicato per studiare i virus a RNA che possono includere o meno modelli di DNA per la replicazione virale. Ad esempio, le sonde bDNA specifiche del filamento possono essere progettate per monitorare l'espressione dell'RNA del filamento senso (+) o antisenso (-) e diverse specie di vRNA in virus come HBV, HCV, IAV e ZIKV. La visualizzazione di diverse specie di RNA durante il corso dell'infezione può fornire informazioni sulla cinetica di replicazione di vari sistemi virali.
Seguendo il decorso temporale dell'infezione da HBV, possiamo vedere che la quantità di RNA pre-genomico HBV (pgRNA) e di RNA HBV totale aumenta in funzione del tempo. Inoltre, abbiamo simultaneamente immunocolorato un fattore ospite cellulare, MOV10 (Figura 6).
Figura 6: HBV. Decorso temporale dell'infezione da HBV delle cellule 3E8. Le cellule sono state infettate con 300 genomi HBV per cellula. La replicazione virale viene mostrata in tre punti temporali (24, 48 e 72 hpi). pgRNA (marcato con ATTO 550; rosso in figura), HBV RNA totale (marcato con Alexa 647; verde in figura) e MOV10 (anticorpo secondario coniugato ad Alexa 488; bianco in figura). I nuclei sono colorati con DAPI in blu. La barra di scala sulle immagini unite rappresenta 10 μm. hpi, ore dopo l'infezione. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
L'imaging è stato eseguito tramite microscopia confocale utilizzando un obiettivo ad immersione in olio 60x. Le lunghezze d'onda passa-banda di eccitazione/emissione utilizzate per rilevare DAPI, Alexa 488, ATTO 550 e Alexa 647 sono state impostate rispettivamente su 405/420-480, 488/505-550, 550/560-610 e 647/655-705 nm (Figura 7, Figura 8 e Figura 9).
Figura 7: Decorso temporale dell'infezione da HCV delle cellule Huh-7.5.1. Le cellule Huh-7.5.1 sono state infettate con il virus dell'epatite C (HCV) Jc1 / Gluc2A con un MOI di 0,5. Agli intervalli di tempo indicati, le cellule sono state fissate e sondate sequenzialmente per vRNA senso-), vRNA antisenso (-) e NS5A (proteina HCV). I nuclei sono stati colorati con DAPI. Immagini rappresentative unite da ciascun punto temporale, che mostrano (+) RNA in verde (etichettato con Alexa 647) (-) RNA in rosso (etichettato con Atto 555), NS5A in bianco (anti-topo di capra secondario coniugato ad Alexa 488) e nuclei in blu. Le barre della scala rappresentano 10 μm. Le immagini inferiori sono ritagli ingranditi dal punto temporale corrispondente. HPI, ore dopo l'infezione. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 8: FISH bDNA specifico del filamento e immunocolorazione delle cellule A549 infettate dal virus dell'influenza A. Le cellule A549 infettate dal virus PR8 Flu A sono state fissate e sondate per (A) IAV nucleoprotein (NP) RNA (etichettato con Alexa 488; verde in Figura) e (B) proteina IAV polimerasi (PB1) (capra secondaria anti-topo Atto 550; rosso in Figura) e nuclei sono stati colorati con DAPI (blu). (C) Immagine unita. La barra della scala rappresenta 10 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 9: Strand-specific bDNA FISH in Zika virus-infected cells (ZIKV)-infected cells. Le cellule Vero sono state infettate da ZIKV con un MOI di 0,1. Le celle sono state fissate a 48 hpi. (A) Le cellule sono state simultaneamente colorate per vRNA senso (+) (etichettato con Alexa 488; verde in Figura) e vRNA antisenso (-) (etichettato con Atto 550; rosso in Figura). I nuclei sono stati colorati con DAPI. In (A), la casella bianca indica una regione con vRNA (+) e (-). Gli inserti presentano un primo piano di (+) vRNA (verde) e le specie di vRNA più scarse (-) (rosso). (B) senso (+) vRNA (verde). (C) vRNA antisenso (-) (rosso). La barra di scala in (A) rappresenta 10 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
La visualizzazione simultanea di RNA, DNA e proteine richiede spesso un'ampia ottimizzazione. Due metodi comunemente usati sono l'etichettatura con 5-etinil-2-deossiuridina (EdU) e DNA FISH. L'etichettatura EdU è stata applicata per visualizzare simultaneamente DNA virale e proteine, poiché l'EdU è incorporato nel DNA nascente e successivamente etichettato con coloranti fluorescenti contenenti azoturo tramite chimica a clic. L'etichettatura EdU può quindi essere utilizzata per monitorare la cinetica di replicazione virale nativa di virus a DNA o virus con modelli di DNA per la replicazione12. Un difetto dell'etichettatura EdU, tuttavia, è che nelle cellule in divisione, il genoma replicante incorporerà EdU, generando un elevato background e confondendo l'analisi delle immagini. DNA FISH può aggirare questi problemi ibridando direttamente una sonda di acido nucleico al rispettivo bersaglio indipendentemente dal ciclo cellulare. Tuttavia, la FISH convenzionale spesso si basava su alte temperature per ottenere un'ibridazione efficiente della sonda, ostacolando l'immunocolorazione o persino la colorazione simultanea dell'RNA13. MICDDRP può potenzialmente aggirare questi problemi fornendo una robusta marcatura fluorescente simultanea di DNA, RNA e proteine attraverso una varietà di sistemi cellulari.
Mentre abbiamo dimostrato che possiamo etichettare proteine e acidi nucleici contemporaneamente utilizzando il nostro protocollo MICDDRP, era necessaria l'ottimizzazione su diversi sistemi. Il primo parametro importante che abbiamo dovuto ottimizzare è stato il trattamento con proteasi. Abbiamo variato la concentrazione di proteasi III in tutte le condizioni. L'ottimizzazione del trattamento con proteasi è stata empirica, poiché abbiamo utilizzato diverse diluizioni per valutare ciò che ha prodotto la massima efficienza di ibridazione, senza compromettere l'efficienza dell'immunocolorazione. Sono stati eseguiti controlli appropriati fianco a fianco per valutare la specificità della sonda e le modifiche all'efficienza della colorazione delle proteine attribuite al trattamento con proteasi. I successivi parametri principali che necessitavano di ottimizzazione erano la progettazione della sonda e l'ibridazione della sonda.
La corretta progettazione delle sonde di acquisizione e dell'amplificatore è fondamentale per ottenere la sensibilità e la specificità della tecnologia bDNA. Sono disponibili pacchetti software che prevedono la probabilità di eventi di ibridazione non specifici per migliorare la progettazione della sonda 7,11. Le sonde bDNA con il preamplificatore, l'amplificatore e le sonde fluorescenti per etichette in dotazione possono ora essere acquistate commercialmente per garantire la compatibilità con i kit di imaging bDNA. Gli utenti possono fornire ai produttori informazioni sulla sequenza (~ 300-1000 coppie di basi) per le regioni target sotto forma di un file fasta (formato basato su testo per la rappresentazione della sequenza nucleotidica). Le sonde target vengono generate con > omologia di sequenza del 90% rispetto alla sequenza fornita.
Per la marcatura del DNA, abbiamo scoperto che la diluizione delle sonde nel tampone di ibridazione descritto nella fase 5 del protocollo migliora l'ibridazione del DNA. Quando si marcano sia il DNA che l'RNA, la sonda RNA può essere diluita nel tampone di ibridazione. La marcatura del DNA in assenza di RNasi non può escludere la possibilità che l'acido nucleico osservato includa RNA dello strandedness mirato. Potrebbe anche essere necessario regolare la temperatura per migliorare l'efficienza di ibridazione. L'aumento della temperatura può influire sull'efficienza della colorazione delle proteine, poiché l'aumento delle temperature può promuovere la denaturazione delle proteine, ablando il riconoscimento epitopico dell'anticorpo primario. Nei dati rappresentativi che abbiamo presentato, abbiamo eseguito ISH a 40 °C.
Rispetto al DNA FISH convenzionale, MICDDRP fornisce una procedura migliorata per la marcatura simultanea di DNA, RNA e proteine da visualizzare tramite microscopia a fluorescenza. Una potenziale limitazione è che la selezione della sonda può influenzare l'efficienza dell'ibridazione e la capacità di confrontare quantitativamente i dati tra le sonde. Questo protocollo è stato efficace su diversi sistemi cellulari e virali nelle nostre mani con solo una piccola ottimizzazione necessaria in condizioni variabili. Recenti pubblicazioni di alto profilo hanno utilizzato il nostro approccio per studiare la selezione del sito di integrazione dell'HIV14 e la cinetica di trascrizione inversa dell'HIV15. Le future applicazioni di MICDDRP potrebbero includere la visualizzazione di acidi nucleici virali in concomitanza con sequenze di acidi nucleici di specifici geni cellulari e proteine cellulari.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto in tutto o in parte dal National Institutes of Health (R01 AI121315, R01 AI146017, R01 AI148382, R01 AI120860, R37 AI076119 e U54 AI150472). Ringraziamo il Dr. Raymond F. Schinazi e Sadie Amichai per aver fornito cellule infette dal virus dell'influenza A.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% PFA | |||
| 50% dextran sulfate | Amreso | 198 | For DNA hybridization buffer |
| 50X wash buffer | ACD Bio | 320058 | |
| 6-well plates | |||
| Amplifier 1-FL | ACD Bio | ||
| Amplifier 2-FL | ACD Bio | ||
| Amplifier 3-FL | ACD Bio | ||
| Amplifier 4-FL | ACD Bio | Consult Amp-4 table in protocol | |
| Anti-HCV NS5a antibody | Abcam | ab13833 | Mouse monoclonal; works with HCV genotypes 1a, 1b, 3, and 4 |
| Anti-HIV-1 p24 monoclonal antibody | NIH AIDS Reagent Program | 3537 | |
| Anti-Mov10 antibody | Abcam | ab80613 | Rabbit polyclonal |
| Anti-PB1 antibody | GeneTex | GTX125923 | Antibody against flu protein |
| Bovine serum albumin | Blocking reagent for immunostaining | ||
| Cell media with supplements | Media appropriate for cell model | ||
| Coverslips | |||
| DAPI | ACD Bio | Nuclear stain (RNAscope kit from ACD Bio) | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (1X PBS) | Gibco | 14190250 | No calcium and magnesium |
| Ethylene carbonate | Sigma | E26258 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Use specific FBS based on what serum secondary antibody was raised in (e.g goat FBS) | ||
| Fisherbrand colorfrost plus microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-17/18/19 | Precleaned |
| HCV-GT2a-sense-C2 probe | ACD Bio | 441371 | HCV(+) sense RNA probe |
| HIV-gagpol-C1 | ACD Bio | 317701 | HIV-1 cDNA probe |
| HIV-nongagpol-C3 | ACD Bio | 317711-C | HIV-1 RNA probe |
| HybEZ hybridization oven | ACD Bio | 321710/321720 | |
| ImmEdge hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Nail polish | For immobolizing coverslip to slide prior to protease treatment | ||
| Nuclease free water | Ambion | AM9937 | |
| Poly-d-lysine (PDL) | Coat coverslips in 20 µg/mL of PDL for 30 minutes | ||
| Probe diluent | ACD Bio | 300041 | For diluting RNA C2 or C3 probes |
| Prolong gold antifade | Invitrogen | P36930 | |
| Protease III | ACD Bio | 322337 | |
| RNAscope® Probe- V-Influenza-H1N1-H5N1-NP | ACD Bio | 436221 | |
| RNase A | Qiagen | ||
| Secondary antibodies | |||
| Slides | |||
| Sodium chloride | For DNA hybridization buffer | ||
| Sodium citrate, pH 6.2 | For DNA hybridization buffer | ||
| Tween-20 | For DNA hybridization buffer and PBS-T | ||
| V-HBV-GTD | ACD Bio | 441351 | Total HBV RNA |
| V-HBV-GTD-01-C2 | ACD Bio | 465531-C2 | HBV pgRNA probe |
| V-HCV-GT2a probe | ACD Bio | 441361 | HCV(-) sense RNA probe |
| V-HTLV-HBZ-sense-C3 | ACD Bio | 495071-C3 | HTLV-1 (-) sense RNA probe targetting HBZ |
| V-HTLV1-GAG-C2 | ACD Bio | 495051-C2 | HTLV-1 DNA probe |
| V-HTLV1-GAG-POL-sense | ACD Bio | 495061 | HTLV-1 (+) sense RNA probe |
| V-Influenza-H1N1-H5N1-NP | ACD Bio | 436221 | IAV RNA probe |
| V-ZIKA-pp-O2 | ACD Bio | 464531 | Zika(+) sense RNA probe |
| V-ZIKA-pp-O2-sense-C2 | ACD Bio | 478731-C2 | Zika(-) sense RNA probe |
References
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