Imagem de fluorescência multiplexada de célula única para visualizar ácidos nucleicos virais e proteínas e monitorar HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika Virus e Influenza Infection

Nossa abordagem de detecção multiplex baseada em células imunofluorescentes de DNA, RNA e proteína nos permite visualizar simultaneamente proteínas e ácidos nucléicos de diferentes tipos e encalhe dentro de células individuais. Antes da semeadura, incubar lamínulas em etanol por cinco minutos, seguido de duas lavagens de dois minutos em PBS. Após a segunda lavagem, submergir completamente a lamínula em 20 microgramas por mililitro de poli-D-lisina por 30 minutos em temperatura ambiente.

No final da incubação, remova o excesso de solução da matriz com duas lavagens em PBS e dilua as células de interesse a 1 x 10 até as sextas células por 50 microlitros de PBS por concentração de lamínula. Em seguida, semeie 50 microlitros das células de interesse em cada lamínula revestida com poli-D-lisina para uma incubação de 30 minutos em temperatura ambiente. No final da incubação, lave as células três vezes em PBS antes de fixá-las em paraformaldeído a 4% por 30 minutos.

No final da incubação, lave as células duas vezes em PBS antes de permeabilizar as células com 500 microlitros de 0,1%Tween 20 em PBS por 10 minutos em temperatura ambiente. No final da incubação, lave cada lamínula duas vezes com 500 microlitros de PBS fresco por lavagem. Para imobilizar a lamínula em uma lâmina de vidro, coloque uma pequena gota de esmalte transparente em uma lâmina de vidro esterilizado e coloque uma borda do lado sem células da lamínula na gota de esmalte e abaixe a lamínula no lado da célula da corrediça voltado para cima.

Adicione algumas gotas de PBS na lamínula imobilizada para evitar que as células desidratem e use uma caneta de barreira hidrofóbica para desenhar um círculo ao redor da parte externa da lamínula. Quando a barreira tiver sido desenhada, substitua o PBS por 100 microlitros de protease III e coloque a lâmina em uma incubadora de 40 graus Celsius por 15 minutos. No final da incubação, lavar as lâminas duas vezes em PBS fresco durante dois minutos por lavagem com balanço.

Após a segunda lavagem, dilua a sonda de interesse em 200 microlitros de tampão de hibridização a 67 graus Celsius por 10 minutos. No final da incubação, adicione 50 microlitros da solução da sonda a cada lamínula e coloque as lâminas em um forno umidificado a 40 graus Celsius por duas horas. No final da incubação, lavar as lâminas duas vezes com tampão de lavagem fresco e balançar durante dois minutos por lavagem.

Após a segunda lavagem, bata nas lâminas para remover o excesso de tampão e trate sequencialmente as lamínulas com uma gota dos amplificadores para os canais fluorescentes 1, 2 e 3 por uma incubação de 30 minutos e 40 graus Celsius por amplificador com duas lavagens de dois minutos em tampão de lavagem fresco com balanço por lavagem entre os tratamentos. Após a última lavagem, adicione uma gota do canal fluorescente 4 amplifier à lamínula para uma incubação de 15 minutos no forno a 40 graus Celsius e lave a lâmina duas vezes com tampão de lavagem e uma vez com PBS conforme demonstrado. Para imunocoloração das proteínas de interesse, após a última lavagem, trate cada lamínula com 200 microlitros de tampão bloqueador por uma hora de incubação em temperatura ambiente.

Ao final da incubação, decantar o tampão bloqueador e adicionar 200 microlitros do anticorpo primário de interesse diluído em PBS mais Tween 20 suplementado com albumina sérica bovina a 1%. Após uma incubação de uma hora à temperatura ambiente, lave as lâminas com duas lavagens de 10 minutos em PBS fresco mais Tween 20 com agitação por lavagem antes de rotular as amostras com um anticorpo secundário apropriado por uma hora em temperatura ambiente. No final da incubação, lave as lâminas duas vezes com PBS fresco mais Tween 20 por 10 minutos com agitação por lavagem.

Após a segunda lavagem, contra-corar os núcleos com um corante nuclear apropriado por um minuto à temperatura ambiente, seguido de duas lavagens em PBS por 10 minutos em temperatura ambiente com agitação. Para montar as amostras para imagem, coloque uma gota de solução antidesbotante em uma nova lâmina de vidro estéril por amostra e espalhe a solução para cobrir uma área aproximadamente do tamanho das lamínulas. Retire as lamínulas de seus slides e mergulhe as lamínulas em PBS.

Use uma pinça para remover qualquer resíduo de esmalte e seque a parte de trás da lamínula com um lenço umedecido. Em seguida, coloque delicadamente cada amostra de lamínula voltada para baixo na solução antidesbotamento e deixe as amostras secarem durante a noite. Como prova de conceito desse procedimento, o DNA, o RNA e a proteína do HIV-1 foram simultaneamente marcados e visualizados microscopicamente no nível de uma única célula.

Neste exemplo, dois genomas de DNA do HIV-1 podem ser visualizados dentro de uma única célula, pois estão transcrevendo ativamente o RNA viral. O RNA viral foi exportado através do complexo de poros nucleares e a proteína viral foi sintetizada no citoplasma. Conforme observado, muito pouca ou nenhuma reatividade cruzada é observada entre os conjuntos de sondagem entre os dois vírus, apesar da marcação com dois retrovírus com potencial para reatividade cruzada da sonda.

Além disso, a coloração do RNA viral pode ser eliminada se as células forem tratadas com RNase durante a preparação da amostra. A intensidade média de fluorescência integrada do sinal de anticorpo por célula em cada imagem pode então ser quantificada. Como observado, a quantidade de RNA pré-genômico do HBV e RNA total do HBV aumenta ao longo da infecção pelo HBV.

A imagem da infecção por HCV também pode ser realizada por meio de microscopia confocal usando uma objetiva de imersão em óleo de 60X para detectar os fluoróforos de interesse. Essa abordagem altamente específica também permite o rastreamento de processos virais ou celulares com alta resolução temporal espacial. Além disso, esta técnica pode ser usada para estudar vários vírus e outros patógenos.