Behavior

De tre-kammer choice adfærdsmæssige opgave ved hjælp af zebrafisk som modelsystem

Published: April 14, 2021 doi: 10.3791/61934

Cassie J. Rowe^1,2, Mikayla Crowley-Perry^1,3, Elizabeth McCarthy¹, Terry L. Davidson^2,4, Victoria P. Connaughton^1,2

¹Department of Biology, American University, ²Center for Behavioral Neuroscience, American University, ³Department of Chemistry, American University, ⁴Department of Neuroscience, American University

Summary

Vi præsenterer et adfærdskammer designet til at vurdere kognitiv præstation. Vi leverer data, der viser, at når de først er erhvervet, husker zebrafisk opgaven 8 uger senere. Vi viser også, at hyperglykæmiske zebrafisk har ændret kognitiv ydeevne, hvilket indikerer, at dette paradigme gælder for undersøgelser, der vurderer kognition og hukommelse.

Abstract

Neurodegenerative sygdomme er aldersafhængige, invaliderende og uhelbredelige. Nylige rapporter har også korreleret hyperglykæmi med ændringer i hukommelse og / eller kognitiv svækkelse. Vi har ændret og udviklet en tre-kammer valg kognitiv opgave svarende til den, der anvendes med gnavere til brug med hyperglykæmiske zebrafisk. Testkammeret består af et centralt placeret startkammer og to valgrum på hver side med en stime af artsspecifikke, der bruges som belønning. Vi leverer data, der viser, at når de først er erhvervet, husker zebrafisk opgaven mindst 8 uger senere. Vores data viser, at zebrafisk reagerer robust på denne belønning, og vi har identificeret kognitive underskud hos hyperglykæmiske fisk efter 4 ugers behandling. Denne adfærdsmæssige analyse kan også være gældende for andre undersøgelser relateret til kognition og hukommelse.

Introduction

Neurodegenerative sygdomme er aldersafhængige, invaliderende og uhelbredelige. Disse sygdomme er stigende i forekomsten, hvilket resulterer i et presserende behov for at forbedre og udvikle nye terapeutiske strategier. Starten og præsentationen af hver sygdom er unik, da nogle påvirker sprog-, motor- og autonome hjerneregioner, mens andre forårsager læringsunderskud og hukommelsestab¹. Mest bemærkelsesværdigt, kognitive underskud og / eller svækkelse er de mest udbredte komplikationer på tværs af alle neurodegenerative sygdomme². I håb om at kaste lys over de underliggende mekanismer, der er involveret i disse neurodegenerative sygdomme, er brugen af mange forskellige modelsystemer (herunder encellede organismer til Drosophila til højere ordens hvirveldyr som gnavere og mennesker) blevet anvendt; De fleste neurodegenerative sygdomme er dog stadig uhelbredelige.

Læring og hukommelse er stærkt bevarede processer blandt organismer, da konstante ændringer i miljøet kræver tilpasning³. Svækkelse i både kognition og synaptisk plasticitet er blevet påvist i flere gnavermodeller. Specifikt bruger veletablerede adfærdsmæssige assays associativ læring til at vurdere kognitive ændringer efter forskellige svækkelsesfremkaldte sygdomme og lidelser⁴. Derudover vurderer vending af kontrastdiskrimination kognitive underskud, fordi det involverer højere ordens lærings- og hukommelsesfunktioner, og tilbageførsel afhænger af hæmning af en tidligere lært forening. Den udbredte trekammervalgsopgave belyser mulige underskud i indlærings- og hukommelsesveje i centralnervesystemet⁵^,⁶. For nylig har dette felt udvidet til at omfatte ikke-pattedyrsmodeller, såsom zebrafisk (Danio rerio), da flere paradigmer er blevet udviklet i en række aldre fra larver til voksne⁷^,⁸.

Zebrafisk giver en balance mellem kompleksitet og enkelhed, der er fordelagtig for vurderingen af kognitive svækkelser med adfærdsteknikker. For det første er zebrafisk modtagelige for adfærdsscreening med høj gennemløb i betragtning af deres lille størrelse og frodige reproduktive natur. For det andet har zebrafisk en struktur, den laterale pallium, som svarer til pattedyret hippocampus, da det har lignende neuronale markører og celletyper⁷. Zebrafisk er også i stand til at erhverve og huske rumlig information⁹ og er ligesom mennesker døgn¹⁰. Derfor er det ikke overraskende, at zebrafisk bruges som model for neurodegenerative sygdomme med stigende hyppighed. Imidlertid har fraværet af passende adfærdsmæssige assays gjort det vanskeligt at anvende zebrafiskmodellen til kognitive vurderinger. Udgivet arbejde ved hjælp af zebrafisk-specifikke adfærdsmæssige assays omfatter associative læringsopgaver¹¹, angstadfærd¹², hukommelse¹³, objektgenkendelse¹⁴og konditioneret-sted-præference¹⁵^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹. Selvom der har været mange udviklinger med hensyn til zebrafisk adfærdsmæssige assays, modstykker til nogle tests af kognitive funktioner hos gnavere er endnu ikke udviklet til brug med zebrafisk¹⁸.

Med udgangspunkt i tidligere undersøgelser fra vores laboratorium modellerede/udviklede vi en kognitiv opgave i zebrafisk baseret på den trekammervalgsopgave, der blev brugt med gnavere ved hjælp af social interaktion som belønning. Derudover har vi udvidet på associative læring aspekt af adfærdsmæssige opgave og indarbejdet kontrast diskrimination vending i håb om yderligere at udvikle denne adfærdsmæssige opgave at vurdere kognitiv svækkelse. Dette gjorde det muligt for os at undersøge både den første erhvervelse af diskrimination læring og den efterfølgende hæmning af denne læring i tilbageførsel fase. I den aktuelle undersøgelse viser vi, at denne procedure gav en pålidelig metode til vurdering af kognitiv funktion hos zebrafisk efter glukosedysning i 4 eller 8 uger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle forsøgsprocedurer blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved American University (protokol nr. 1606, 19-02).

1. Dyr

Opdræt og vedligeholdelse af dyr
1. Få voksne zebrafisk af vildtype (Danio rerio) i alderen 4-11 måneder som embryoner og bag dem internt.
2. Fiskene skal opbevares i et vandstativsystem ved 28-29 °C på en 14-timers lys:10-timers mørk fotoperiod.
3. Foder fisken to gange om dagen med kommercielle flager og supplere med levende Artemia.
4. Vælg fisk tilfældigt fra disse bestand tanke til adfærdsmæssige eksperimenter.
Når forsøget er afsluttet, bedøve dyrene ved nedsænkning i 0,02% tricain i 2 min eller indtil der er mangel på motorisk koordinering og reduceret åndedrætshastighed for senere molekylære og / eller neurokemiske analyser.

2. Testkammer med trekammervalg

BEMÆRK: Denne adfærdsteknik blev ændret fra Ruhl et al.²⁰.

Kammerkonstruktion
1. Rediger adfærdskammeret²⁶– et 40 L akvarium (50 x 30 x 30 cm^3)–for at have et centralt kammer eller udgangskammer (10 x 30 x 30 cm³), adskilt fra to sidevalgskamre (hver 20 x 30 x 30 cm³, Figur 1A).
2. Konstruere de tre rum ved hjælp af en aluminium "U-formet" kanal fastgjort til de indvendige glasvægge med akvarium fugemasse, at adskille tanken i tre kamre.
3. Konstruere uigennemsigtige skillevægge, 10 cm høj, ud af grå PVC ark passer ind i aluminium kanaler på hver side. Gør hver skillevæg ud af 2 stykker, hver lige i størrelse: en stationær bund stykke permanent monteret i tanken og en bevægelig top stykke, der bevæger sig op og ned i aluminium spor.
4. Lim ekstra store bindemiddelklemmer fast til toppen af de grå PVC-ark for at fungere som håndtag.
5. Ved hjælp af en permanent markør tegnes små vandrette linjer 10 cm over det klæbende grå PVC-rør på ydersiden af tanken.
  BEMÆRK: Dette mærke er det punkt, hvor det øverste grå PVC-ark åbnes for at give adgang til begge sider.
6. Tilsæt kontrol (system) vand til tanken til et niveau på 25 cm fra bund til top af tanken, eller ~ 30 L. Placer glas akvariumvarmere i hver sektion af kammeret i 24 timer før test for at bringe temperaturen til 28,5 °C.
  BEMÆRK: Fjern varmeapparaterne ved starten af adfærdssessionen og udfør en fuld vandudveksling efter to dages brug.
Opsætning af diskrimination
1. For hver diskriminationsopgave skal du placere farvede filtstykker (beige, sort eller hvid) på ydersiden, siden og bunden af valgkamrene ved hjælp af velcro (Figur 1B-D).
  BEMÆRK: Det centrale kammer må ikke have nogen baggrundsfarve tilknyttet.
Som belønning skal du oprette en gruppe artsfæller (stime) ved at placere 4 voksne zebrafisk, som ellers ikke vil blive brugt i undersøgelsen, i en lille, klar tank i det bageste hjørne af hvert valgkammer (figur 1B-D).
BEMÆRK: Vælg stimefisk tilfældigt fra bestand tanke hver dag, med mindst én mand og en kvinde af samme alder og størrelse som den eksperimentelle fisk i hver stime tank.

3. Adfærdsmæssige opgaver

Akklimatisering
BEMÆRK: Akklimatisering til adfærdskammeret består af tre dages træning; to dages gruppeakklimatisering efterfulgt af en dags individuel træning.
Akklimatisering af grupper
1. Fastgør beige (neutral) filt baggrund på ydersiden af begge valg rum, og nedsænke en levende stime tank i hver af de valg rum(Figur 1B).
2. Tilsæt fem-seks zebrafisk til midterstartkammeret med begge skydedøre åbne, og lad fisken strejfe frit i 30 minutter.
  BEMÆRK: Den eksperimentelle zebrafisk skal være i stand til at interagere og socialisere med disse stimefisk gennem tanken som belønning efter at have krydset ind i begge valgrum under akklimatisering. En fisk anses for at være kommet ind i et af sidekamrene, når hele kroppen kommer ind i kammeret.
3. Gentag denne procedure med den samme eksperimentelle fisk for en anden dag (2 dages gruppe akklimatisering).
  BEMÆRK: Hold ikke de samme grupper af fisk.
Individuel akklimatisering
1. Kammeropsætning: Fastgør beige (neutral) filtbaggrunden på ydersiden af begge valgrum, og nedsænk en levende stimetank i begge valgrum, som i gruppeakklimatisering (Figur 1B, E).
  1. Placer en individuel zebrafisk i det centrale startkammer i 2 minutter med skydedørene lukket, og efter 2-minutters perioden skal begge døre åbnes samtidigt.
  2. Sørg for, at hver fisk svømmer fra det centrale kammer gennem en dør i alt 10 gange, uanset hvilken side. Beløn fisken, hver gang den kommer ind i et af sidekamrene (1 dag med individuel akklimatisering).
    BEMÆRK: Hvis en fisk ikke er i stand til at udføre denne opgave 10 gange inden for en 30-minutters periode eller nægter at forlade startkammeret overhovedet, skal du udelukke den fra undersøgelsen.
2. Dataopsamling: Registrer det antal gange, fisken svømmer ind i begge sider, og den samlede tid, det tager at fuldføre opgaven.
Erhvervelse
BEMÆRK: Efter akklimatisering begyndte zebrafisk en 3-dages erhvervelsesopgave.
1. Kammeropsætning: Fastgør et hvidt filtstykke på ydersiden af et valgrum og et sort filtstykke på ydersiden af det andet valgrum(figur 1C, F).
  BEMÆRK: Skift baggrundsfarve på hver side dagligt ved hjælp af en pseudorandom tidsplan³⁷.
  1. I løbet af denne fase af uddannelsen skal du placere en stime-belønning, der kun placeres i et af valgrummene; dette bliver den belønnede side.
  2. For at begynde erhvervelsen skal du placere en enkelt eksperimentel fisk i startkammeret i en 2-minutters periode med valgrummene lukket.
  3. Efter 2-minutters akklimatisering skal du samtidig åbne begge døre, give adgang til begge valgrum og starte stopuret for at vurdere valgventetiden.
  4. Ved hjælp af et partisk design tildeles fisken enten en sort eller hvid præference (dvs. enten W+/B- eller B+/W-), hvilket betyder, at stime er placeret i enten det sorte (B+) eller hvide (W+) valgrum.
2. Betegner valgsvaret
  1. Når fisken træffer et valg ved at indtaste et af siderummene, skal du stoppe timeren.
  2. Hvis fisken vælger den foretrukne side korrekt, skal du straks lukke døren mellem det centrale kammer og den side for at begrænse fisken til den foretrukne side i 1 minut og lade den blive belønnet ved at interagere med stimetanken (Figur 1C, F). Score denne retssag som "C" for "Korrekt" (belønnet).
  3. Hvis fisken svømmer gennem den forkerte dør, skal du overføre den tilbage til det centrale kammer, lukke begge døre og score retssagen som "jeg" for "forkert" (ikke-belønnet).
  4. Hvis fisken ikke træffer en beslutning inden for 2 minutter efter dørene åbnes, skal du flytte fisken til den rigtige side i 1 minut og score forsøget som "M" for "mærket" (tvangsbelønet).
  5. Når du overfører/flytter fisk tilbage til startkammeret, skal du forsigtigt føre fisken ind i det centrale kammer ved hjælp af et fiskenet som hyrdeværktøj.
    BEMÆRK: Du må ikke skovle fisken op af vandet og udskifte den i startkammeret, da dette kan påvirke den adfærdsmæssige analyse.
  6. Når fisken vender tilbage til det centrale kammer, skal du vente i 1 minut, før du udfører opgaven igen. Sørg for, at hver fisk udfører opgaven 8 gange.
3. Hent data
  1. For hver forsøgsfisk skal du registrere tidspunktet for første beslutning (eller valgventetid) og de enkelte scorer (C, I eller M) for hver af de 8 erhvervelsesforsøg (afsnit 3.4.2) i rækkefølge.
  2. Rapporter resultaterne for disse eksperimenter blev rapporteret som gruppegennemsnit for hvert forsøg på hver anskaffelsesdag.
  3. Når en fisk har afsluttet et forsøg, kategorisere det som enten en "højtydende" fisk eller en "lavtydende" fisk.
    BEMÆRK: En fisk blev betragtet som "højtydende", hvis det lykkedes at vælge den rigtige side af tanken i mindst 6 af de 8 samlede forsøg for dagen. Enhver fisk, der ikke opfylder dette kriterium, er en "lav performer".
  4. Når det er identificeret, hus højtydende og lavtydende fisk separat.
  5. Kategoriser fisken som "høj" eller "lav" kunstnere på hver af de tre dage for erhvervelse, efter at en fisk har afsluttet forsøgene.
    BEMÆRK: Ved udgangen af den tredje erhvervelsesdag forbliver fisk som enten "høje" eller "lave" kunstnere i undersøgelsens varighed.
    BEMÆRK: Nogle fisk, der oprindeligt var i gruppen med "lavtydende", lærer opgaven på erhvervelsesdagen 2 eller 3. Når dette sker, kan den oprindelige "lavtydende" fisk flyttes ind i gruppen med "højtydende". Flyt ikke fisken mellem grupper på denne måde efter dag 3 (afslutningen af erhvervelsen).

4. Eksperimentel behandling

Efter anskaffelsesperioden, når fisken demonstrerer evnen til at løse en simpel diskriminationsopgave mellem den sorte og hvide baggrund, skal du starte behandlingsregimet for den eksperimentelle zebrafisk.
BEMÆRK: For at vise anvendeligheden af denne metode viser denne undersøgelse to eksperimentelle designs:
1. Longitudinal undersøgelse
  1. Returner forsøgsfiskene til deres holdetanke i 8 uger. Vedligehold fisken i standardtanke med daglige vandforandringer, og fodre dem to gange dagligt.
    BEMÆRK: Udfør ikke nogen adfærdstræning i løbet af disse 8 uger i holdetankene.
  2. Udfør tilbageførselsvurdering efter denne periode for at vurdere, om zebrafisken kan løse tilbageførselsopgaven efter 8 uger uden træning.
2. Hyperglykæmi: Udsæt forsøgsgrupperne for vand (håndtering af stresskontrol), mannitol (1%-3%, osmotisk kontrol) eller glukose (1%-3%) i 4 eller 8 uger²²^,²³.
  BEMÆRK: Udfør ikke nogen adfærdstræning i løbet af disse 4 eller 8 uger.

5. Tilbageførsel

BEMÆRK: Efter eksperimentel manipulation (som i afsnit 4.2) testes fisken i den sidste del af 3-kammervalgsparadigmet - vending. For at gøre dette vendes den belønnede side (sammenlignet med erhvervelse), således at fisk, der tidligere blev belønnet med en stime på den hvide side, nu belønnes med en stime på den sorte side og omvendt. På denne måde vurderer vendingen, om fisken har lært, hvor belønningen (stime) er placeret, uanset baggrundens farve.

Opsætning af kammer
1. Fastgør sort filt på ydersiden af et af valgkamrene og hvid filt på ydersiden af det andet, og sørg for, at de sorte og hvide sider er de samme sider som i erhvervelsesforsøgene (afsnit 3.4).
2. Stimetanken nedsænkes i det bageste hjørne af siden, hvilket er det modsatte af det tidligere belønnede valgkammer(Figur 1D, G).
  BEMÆRK: Med andre ord belønnes fisk, der tidligere er blevet belønnet på den hvide side, nu på den sorte side og omvendt.
3. Fisken testes individuelt som i punkt 3.5. Begynd med at placere en enkelt eksperimentel fisk i startkammeret i en 2-minutters periode, og luk adgangen til valgrummene.
4. Åbn samtidig begge sider af kammeret.
  BEMÆRK: Fuldfør i alt 8 forsøg hver dag i tre på hinanden følgende behandlingsdage.
Betegner valgsvaret
1. Hvis fisken korrekt vælger den foretrukne farve, skal du straks lukke døren til det centrale kammer i 1 minut, så fisken kan interagere med stimebelønning. Score denne retssag som "C" for "Korrekt" (belønnet).
2. Hvis fisken svømmer gennem den forkerte dør, skal du overføre den tilbage til det centrale kammer, lukke begge døre og score dette forsøg som "jeg" for "forkert" (ikke belønnet).
3. Hvis fisken ikke træffer en beslutning inden for 2 minutter efter dørene åbnes, skal du flytte fisken til den rigtige side og score forsøget som "M" for "mærket" (tvangsbelønet).
Hent data
1. For hver eksperimentel zebrafisk skal du registrere valgventetiden og de enkelte scorer (C, I, M) i rækkefølge for hvert forsøg.
2. Rapporter resultaterne for disse eksperimenter som gruppegennemsnit for hver to-forsøgsblok på hver af de 3 tilbageførselsdage.
3. Hold dataene for højtydende fisk med et lavt niveau adskilt for at afgøre, om de udviser samme ydeevne under tilbageførsel, som de gjorde under erhvervelsen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Akklimatisering til adfærdskammeret involverer tre dages træning: 2 dages gruppeakklimatisering efterfulgt af 1 dag med individuel akklimatisering. Men fordi vi ikke kunne skelne individuelle zebrafisk fra hinanden, var vi kun i stand til at indsamle data under individuel akklimatisering. På dette tidspunkt tog forsøgsdyr (n = 30), konditioneret ved hjælp af en stimebaseret belønning, i gennemsnit 125,11 s for at nå deres første beslutning (figur 2A) og et gennemsnit på 725,34 s (12 min) for at fuldføre hele den individuelle akklimatiseringsopgave (Figur 2B). Der var ingen væsentlig sidepræference under akklimatisering(figur 2C). Antallet af ekskluderede fisk var minimalt sammenlignet med andre belønningstyper (fødevarer), som vi tidligere havde vurderet i vores laboratorium(figur 2C).

Efter akklimatisering begyndte zebrafisk erhvervelsesfasen. Da fisk blev testet individuelt, indsamlede vi data fra hver fisk på hver af de tre anskaffelsesdage. Fiskene blev klassificeret som enten "højtydende eller lavtydende", idet "højtydende" reagerede hurtigere og mere præcist, selv om alle fisk tidligere havde samme eksponering for testkammeret. Kun fisk, der valgte det belønnede valgrum i mindst 6 af de 8 forsøg, blev klassificeret som 'højtydende'. Fisk, der ikke opfyldte dette kriterium, var "lavtydende". Højtydende og lavtydende fisk blev opstaldet separat for at skelne deres præstationer i alle efterfølgende forsøg. Interessant nok bemærkede vi, at nogle fisk ændrede kategori (dvs. var oprindeligt 'lavt præsterende', men blev 'højtydende') i løbet af erhvervelsen. Faktisk steg antallet af højtydende dyr hver dag, med mere højtydende fisk på erhvervelse dag 3 sammenlignet med dag 1(Figur 3A). På dag 3 var >50% af fisken blevet 'højtydende'. Desuden faldt den oprindelige ventetid for alle fisk i løbet af de tre anskaffelsesdage (A1-A3), hvilket indikerer en forbedret ydeevne med hver anskaffelsesdag (figur 3B). Den samme tendens blev også set, da kun den højtydende fiskegruppe blev taget i betragtning: på dag 3 blev tiden til første beslutning forbedret (blev hurtigere) (figur 3C).

Der blev beregnet et forskelsbehandlingsforhold (belønnede forsøg/(belønning + ikke-forsinkede forsøg) for hver anskaffelsesforsøgsblok (gennemsnit på to forsøg/fisk) i løbet af de tre anskaffelsesdage (A1-A3) for alle forsøgsdyr (n = 30) for at bestemme, hvor præcist fiskene løste (erhvervede) diskriminationsopgaven (dvs. gik til den belønnede side af tanken). Dette forhold viste, at procentdelen af fisk, der flyttede til den belønnede side under hvert forsøg, steg dagligt (dvs. på tværs af forsøgsblokke på hver enkelt dag) og samlet (dvs. i løbet af de tre anskaffelsesdage), hvilket resulterede i, at alle fisk klarede sig over tilfældighederne ved afslutningen af erhvervelsen (den punkterede linje, der er repræsenteret på grafen; (Figur 4A) og angivelse af, at fiskene havde lært forskelsbehandlingsopgaven at gøre.

Efter erhvervelsen af diskrimination læring, testede vi, hvor længe zebrafisk ville huske opgaven. For at gøre det forblev testede zebrafisk i holdetanke i 8 uger. Efter denne tid blev fisk testet på en omvendt opgave, der varede 3 dage (R1-R3). Vi fandt, at fiskene demonstrerede stærk vendingsadfærd og øget diskrimination i løbet af de tre dage med tilbageførsel (Figur 4B), hvilket indikerer, at de var i stand til (1) at huske forholdet mellem tankens farve og belønningen og (2) hæmme det, de tidligere havde lært under erhvervelsen og lære det modsatte paradigme. Som det fremgår af figur 4B, gik zebrafisk i første omgang til den ikke-belønnede side af tanken, som det fremgår af, at diskriminationsforholdet var under tilfældighederne under de første spor på omvendt dag 1. Ved udgangen af R1 steg resultaterne imidlertid til større end tilfældighederne, et resultat, der blev fastholdt på R2 og R3, med de højeste forskelsbehandlingsforholdsscores observeret på R3. Samlet set viser disse data, at naive forsøgsdyr er i stand til at løse diskriminationsopgaven, selvom den oprindelige adfærd blev erhvervet 8 uger tidligere uden yderligere træning i mellem adfærdsmæssige sessioner.

Den 3-kammer valg paradigme kan også anvendes til undersøgelse af sygdomskomplikationer. I vores undersøgelse med hyperglykæmisk zebrafisk var akklimatisering og erhvervelse som beskrevet, og tilbageførsel blev testet efter enten 4 eller 8 ugers hyperglykæmi. Hyperglykæmi blev induceret med en alternativ nedsænkningsprotokol (McCarthy et al., 2020 - dette problem), så træningen fandt sted hver anden dag, på dage efter zebrafisk havde været i testløsninger i 24 timer. Under erhvervelsen var der en hovedvirkning af uddannelsesdagen på forskelsbehandlingsforholdet (F (2, 239) = 4,457, p = 0,012; Figur 5A), hvor forholdet på A1 er betydeligt lavere end på A3 (p = 0,010), hvilket indikerer, at fisken forbedrede deres valgnøjagtighed over tid. Under tilbageførsel var der en betydelig hovedvirkning af behandlingen (F (2, 326) = 3,057, p = 0,048), men ingen andre væsentlige hovedvirkninger eller interaktioner (træningsdag: (F (2, 326) = 1,602, p = 0,203); Figur 5A). Reaktionen fra glukosebehandlede dyr blev reduceret betydeligt sammenlignet med de vandbehandlede dyr (p = 0,037), men der var ingen andre væsentlige forskelle (kontrol v. mannitol: p = 0,387; mannitol v. glukose: p = 0,524), hvilket tyder på en glukosespecifik effekt. Efter 8 ugers hyperglykæmi blev der ikke konstateret statistiske forskelle i forskelsbehandlingsprocenter på tværs af erhvervelsesuddannelse (F (2.263) = 2.909, p = 0,056; Figur 5B). Der var dog betydelige hovedvirkninger af både uddannelsesdagen (F (2, 189) = 4,721, p = 0,010) og behandling (F (2, 189) = 7,940, p = 0,000) ved tilbageførsel, men ingen signifikant interaktion (træningsdag * behandling = F (4, 189) = 0,869, p = 0,484). Efterfølgende mindst signifikante sammenligninger af forskelle (LSD) identificerede signifikante forskelle mellem R1 og R3 (p = 0,022) og mellem R2 og R3 (p = 0,003). Sammenligninger på parvis LSD afslørede også betydelige forskelle mellem vandbehandlingsgruppen og både glukose- og mannitolbehandlingsgrupper (vand v. mannitol: p = 0,008; vand v. glukose: 0,000); imidlertid var glukose- og mannitolgrupperne ikke væsentligt forskellige fra hinanden (p = 0,265), hvilket tyder på, at disse forskelle i diskriminationsforholdet kan skyldes osmotiske virkninger.

Figur 1: Testkammer og adfærdsopsætning med trekammervalg. (A) 3-kammer skematisk. Forsøgsdyr var begrænset til det centrale udgangskammer i 2 minutter og tillod derefter adgang til begge sider af tanken ved starten af et forsøg. For at gøre dette blev den øverste halvdel af hver af de to skillevægge hævet for at skabe en plads på 10 cm til, at fisk kunne krydse ind i begge valgrum. (B,E) Akklimatisering blev udført ved hjælp af en beige baggrund og stime af artsfæller som belønning. (C,F) Erhvervelsen blev udført med sort/hvid baggrund på valgkamrene; belønning var kun placeret på den ene side af kammeret. (G) Tilbageførsel blev udført med sort-hvid baggrund på valgrummene. belønning var kun tilgængelig på den modsatte side af kammeret (vs erhvervelse). (H) Up-close billede af stime tank nedsænket i en af de valg rum. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: Latenstid og antal markerede forsøg under individuel akklimatisering. (A) Valg latenstid for første beslutning. (B) Den samlede tid til at gennemføre individuel akklimatisering. (C) Antallet af indgange til venstre og højre side er ikke anderledes, hvilket ikke angiver nogen iboende side præference forud for starten af erhvervelsen. Vi rapporterer også det samlede antal markforsøg under individuel akklimatisering. Værdier rapporteres som Middel ± SEM. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3: Procentdelen af højtydende fisk og den oprindelige ventetid blandt alle fisk og højtydende fisk i løbet af de tre anskaffelsesdage. (A) Højtydende fisk flyttede fra det centrale kammer til den belønnede side af kammeret i mindst 6 ud af 8 forsøg hver erhvervelse dag (A1-A3). (B) I løbet af tre dages erhvervelsesuddannelse (A1-A3) faldt den samlede ventetid for startvalg; en tendens, der også er tydelig inden for højtydende fisk (C). Værdier rapporteres som Middel ± SEM. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4: Forskelsbehandling under erhvervelses- og tilbageførselsforsøg. (A) Forskelsbehandling (belønnede forsøg/(belønning + ikke-indvendte forsøg) med fisk på tværs af anskaffelsesdage (A1-A3) og (B) under tilbageførselslæring 8 uger senere. Tilbageførsel blev også vurderet i 3 dage (R1-R3). Til begge opgaver skulle hver fisk gennemføre 8 forsøg, og resultaterne præsenteres i to forsøgsblokke (2, 4, 6, 8). Korrekte svar under både erhvervelse og vending steg med tiden, med en hurtigere reaktion observeret under vending, hvilket indikerer, at fisken lærte og huskede opgaven. Værdier rapporteres som Middel ± SEM. Den syede linje repræsenterer en chance. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5: Erhvervelse og vending af hyperglykæmisk zebrafisk ved hjælp af 3-kammervalgsadfærdsopgaven. (A) Forud for behandlingen, naive zebrafisk erhvervet 3-kammer valg adfærdsmæssige opgave på tværs af tre dages adfærdsmæssige uddannelse (erhvervelse, A1-A3). Der var en betydelig forskel mellem forskelsbehandlingsforholdet på A1 og A3, hvilket indikerede, at læring fandt sted (p = 0,012). Efter 4 ugers behandling (farvede symboler) var der en signifikant effekt af behandlingen (p = 0,048), hvor glukosebehandlede dyr udviste betydeligt reducerede diskriminationsforhold sammenlignet med vandbehandlede dyr (p = 0,037). (B) I et separat eksperiment blev adfærd før og efter 8 ugers hyperglykæmi vurderet. På trods af den konstante stigning i resultaterne på tværs af hver anskaffelsesdag var der ingen væsentlige forskelle i forskelsbehandling på tværs af A1-A3. Men efter 8 ugers behandling (farvede symboler) var der en hovedvirkning af behandlingen (p < 0,001) og en individuel hovedeffekt af træningsdag (p = 0,010). Post-hoc-analyser afslørede en betydelig forskel mellem den vandbehandlede gruppe og både mannitol- og glukosebehandlede grupper, hvilket tyder på en osmotisk effekt (vand v. mannitol: p = 0,008; vand v. glukose: p < 0,001). * betegner en betydelig hovedeffekt. Datapunkter repræsenterer gruppe middelværdi ± SEM, og datapunkter med forskellige bogstaver er væsentligt forskellige fra hinanden. Den syede linje repræsenterer en chance. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Selv om der har været enorm vækst i mængden og variationen af neurovidenskab forskning udført ved hjælp af zebrafisk i de sidste 15 år²⁴, adfærdsmæssige assays mangler i denne art i forhold til pattedyr modelsystemer¹¹^,²⁵^,²⁶. Her viser vi, at en tre-kammer valg opgave udviklet til brug med gnavere kan tilpasses til at vurdere erhvervelse og vending af en visuel diskrimination læring i zebrafisk. Ved hjælp af en levende stime som belønning, denne opgave gav en robust analyse, der kan anvendes til en række undersøgelser undersøge adfærdsmæssigt forbundne sygdomme såsom hyperglykæmiske komplikationer af diabetes, Alzheimers, og demens.

Det er tidligere blevet fastslået, at zebrafisk er i stand til at lære og lagre information, da det er nødvendigt at træffe økologisk relevante beslutninger og nødvendige for overlevelse i naturen³. Vores anskaffelses- og tilbageførselsdata på tværs af en 8-ugers langsgående undersøgelse understøtter forudgående dokumentation for, at zebrafisk, selvom de er små, er i stand til at lære og huske en simpel diskriminationsopgave, og at zebrafisk også kan hæmme tidligere erhvervede reaktioner. I den langsgående 8-ugers undersøgelse faldt antallet af tvungne belønninger, og diskriminationsforholdet steg, hvilket indikerer, at fisken bliver bedre til at vælge den rigtige, belønnede side og har lært opgaven. Selv om disse ændringer ikke var væsentlige, så vi en generel nedadgående tendens i antallet af tvangsbelønnede forsøg under erhvervelsen og en stigning i forskelsbehandlingsgraden. Desuden viste resultaterne af den trekammervalg adfærdsmæssige opgave med hyperglykæmisk fisk, at testen fandt anvendelse på undersøgelser, der undersøgte hyperglykæmiske tilstande og indikerer, at dette paradigme kunne bruges i kombination med andre eksperimentelle manipulationer, såsom lægemiddeleksponering eller mutantlinjer, til at vurdere potentielle virkninger på kognition.

En vigtig begrænsning af denne undersøgelse er, at vi ikke kan identificere individuelle fisk over tid og derfor må stole på gruppegennemsnit til at vurdere dataene. Udvikling af en måde at individuelt spore fisk i de forskellige behandlingsgrupper, som hos gnavere, kunne løse disse problemer. I et forsøg på at løse disse forskelle sorterede vi fisken i erhvervelsesfasen baseret på deres præstationer, hvilket viste sig at være en uventet fordel ved vores metode. »Højtydende fisk« scorede ≥ 6/8 på hver træningsdag, mens fisk med lavere score var "lavtydende fisk". Når det tælles hver dag, steg antallet af "højtydende" i den stimebelønnede gruppe, således at der på dag 3 var betydeligt flere fisk i denne kategori sammenlignet med den fiskebelønnede behandling. De tendenser for ventetid, der observeres på tværs af alle (»højtydende + lavtydende«), svarer til dem, der kun observeres i gruppen med »højtydende« og tyder på, at denne gruppes stærke reaktioner var drivkraften bag de samlede reaktioner.

Sammenfattende tyder disse resultater på, at stimebaseret diskriminationslæring hos zebrafisk giver en gennemførlig omkostningseffektiv model til undersøgelse af normal og nedsat kognitiv funktion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi takker Sabrina Jones for hendes hjælp med at tilpasse en gnaver tre-kammer valg paradigme til zebrafisk model og Jeremy Popowitz og Allison Murk for deres hjælp på adfærd indsamling dage, bistand med at køre forsøg, dyrepleje, og tank set-up. En særlig tak også til James M. Forbes (Maskiningeniør) for hans hjælp med 3-kammer valg tank design og konstruktion.

Finansiering: VPC og TLD modtog et fælles faculty research support-tilskud (FRSG) fra American University College of Arts and Sciences. CJR modtaget støtte fra American University College of Arts and Sciences Graduate Student Support.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Champion Sports Stopwatch Timer Set: Waterproof, Handheld Digital Clock Sport Stopwatches with Large Display for Kids or Coach - Bright Colored 6 Pack	Amazon	N/A	https://www.amazon.com/Champion-Sports-910SET-Stopwatch-Timer/dp/B001CD9LJK/ref=sr_1_17?dchild=1&keywords=stopwatch+for+sports&qid=1597081570&sr=8-17 Recommend two of different colors; one for choice latency and one for time to completion
Coofficer Extra Large Binder Clips 2-Inch (24 Pack), Big Paper Clamps for Office Supplies, Black	Amazon	N/A	https://www.amazon.com/Coofficer-Binder-2-Inch-Clamps-Supplies/dp/B07C94YCR5/ref=sr_1_3_sspa?dchild=1&keywords=large+binder+clips&qid=1597081521&sr=8-3-spons&psc=1&spLa=ZW5jcnlwdGVkUXVhbGlmaWVyPUExUENWUTRZVjlIWEVPJmVuY3J5cHRlZElkPUEwNDQ5NDU0MlpSREkwTFlLSThVQiZlbmNyeXB0ZWRBZElkPUEwMTg5NDI3MllRV1EzOUdWTVpSOCZ3aWRnZXROYW1lPXNwX2F0ZiZhY3Rpb249Y2xpY2tSZWRpcmVjdCZkb05vdExvZ0NsaWNrPXRydWU=
Marineland® Silicone Aquarium Sealant	Petsmart	Item #2431002
PVC (Polyvinyl Chloride) Sheet, Opaque Gray, Standard Tolerance, UL 94/ASTM D1784, 0.125" Thickness, 12" Width, 24" Length	Amazon	N/A	https://www.amazon.com/Polyvinyl-Chloride-Standard-Tolerance-Thickness/dp/B000MAMGEQ/ref=sr_1_2?dchild=1&keywords=grey+PVC+sheet&qid=1597081440&sr=8-2
Steelworks 1/4-in W x 8-ft L Mill Finished Aluminum Weldable Trim U-shaped Channel	Lowes	Item #55979Model #11377	https://www.lowes.com/pd/Steelworks-1-4-in-W-x-8-ft-L-Mill-Finished-Aluminum-Weldable-Trim-Channel/3058181
Tetra 10 Gallon Fish tank	Petsmart	Item #5271256
Top Fin Fine Mesh Fish Net (3 in)	Petsmart	Item #5175115

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

Gitler, A. D., Dhillon, P., Shorter, J. Neurodegenerative disease: models, mechanisms, and a new hope. Disease Models & Mechanisms. 10, 499-502 (2017).
Perry, R. J., Watson, P., Hodges, J. R. The nature and staging of attention dysfunction in early (minimal and mild) Alzheimer's disease: relationship to episodic and semantic memory impairment. Neuropsychologia. 38, 252-271 (2000).
Gerlai, R. Learning and memory in zebrafish (Danio rerio). Methods in Cell Biology. 134, Elsevier Ltd. (2016).
Davidson, T. L., et al. The effects of a high-energy diet on hippocampal-dependent discrimination performance and blood-brain barrier integrity differ for diet-induced obese and diet-resistant rats. Physiology and Behavior. 107, 26-33 (2012).
Yang, M., Silverman, J. L., Crawley, J. N. Automated three-chambered social approach task for mice. Current Protocols in Neuroscience. 56 (1), (2011).
Remmelink, E., Smit, A. B., Verhage, M., Loos, M. Measuring discrimination- and reversal learning in mouse models within 4 days and without prior food deprivation. Learning and Memory. 23, 660-667 (2016).
Salas, C., et al. Neuropsychology of learning and memory in teleost fish. Zebrafish. 3, 157-171 (2006).
Kalueff, A. V., et al. Towards a comprehensive catalog of zebrafish behavior 1.0 and beyond. Zebrafish. 10, 70-86 (2013).
Luchiaria, A. C., Salajanb, D. C., Gerlai, R. Acute and chronic alcohol administration: Effects on performance of zebrafish in a latent learning task. Behavior Brain Research. 282, 76-83 (2015).
Fadool, J., Dowling, J. Zebrafish: A model system for the study of eye genetics. Progress in Retinal and Eye Research. 27, 89-110 (2008).
Fernandes, Y. M., Rampersad, M., Luchiari, A. C., Gerlai, R. Associative learning in the multichamber tank: A new learning paradigm for zebrafish. Behavioural Brain Research. 312, 279-284 (2016).
Reider, M., Connaughton, V. P. Developmental exposure to methimazole increases anxiety behavior in zebrafish. Behavioral Neuroscience. , (2015).
Capiotti, K. M., et al. Hyperglycemia induces memory impairment linked to increased acetylcholinesterase activity in zebrafish (Danio rerio). Behavioural Brain Research. 274, 319-325 (2014).
May, Z., et al. Object recognition memory in zebrafish. Behavioural Brain Research. 296, 199-210 (2016).
Mathur, P., Lau, B., Guo, S. Conditioned place preference behavior in zebrafish. Nature Protocols. 6, 338-345 (2011).
Guo, S. Linking genes to brain, behavior and neurological diseases: What can we learn from zebrafish. Genes, Brain and Behavior. 3, 63-74 (2004).
Kily, L. J. M., et al. Gene expression changes in a zebrafish model of drug dependency suggest conservation of neuro-adaptation pathways. Journal of Experimental Biology. 211, 1623-1634 (2008).
Webb, K. J., et al. Zebrafish reward mutants reveal novel transcripts mediating the behavioral effects of amphetamine. Genome Biology. 10, (2009).
Clayman, C. L., Malloy, E. J., Kearns, D. N., Connaughton, V. P. Differential behavioral effects of ethanol pre-exposure in male and female zebrafish (Danio rerio). Behavioural Brain Research. 335, 174-184 (2017).
Ruhl, T., et al. Acute administration of THC impairs spatial but not associative memory function in zebrafish. Psychopharmacology. 231, 3829-3842 (2014).
Gellermann, L. W. Chance orders of alternating stimuli in visual discrimination experiments. The Pedagogical Seminary and Journal of Genetic Psychology. 42, 206-208 (1933).
Gleeson, M., Connaughton, V., Arneson, L. S. Induction of hyperglycaemia in zebrafish (Danio rerio) leads to morphological changes in the retina. Acta Diabetologica. 44, 157-163 (2007).
Connaughton, V. P., Baker, C., Fonde, L., Gerardi, E., Slack, C. Alternate immersion in an external glucose solution differentially affects blood sugar values in older versus younger zebrafish adults. Zebrafish. 13, 87-94 (2016).
Goldsmith, J. R., Jobin, C. Think small: Zebrafish as a model system of human pathology. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 817341 (2012).
Kalueff, A. V., Stewart, A. M., Gerlai, R., Court, P. Zebrafish as an emerging model for studying complex brain disorders. Trends in Pharmacological Sciences. 35, 63-75 (2014).
Gerlai, R. Associative learning in zebrafish (Danio rerio). Methods in cell biology. 101, 249-270 (2011).

Behavior

De tre-kammer choice adfærdsmæssige opgave ved hjælp af zebrafisk som modelsystem

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.