Summary
認知能力を評価するために設計された行動室を提示します。ゼブラフィッシュは、一度取得すると、8週間後にタスクを覚えていることを示すデータを提供します。我々はまた、高血糖ゼブラフィッシュが認知能力を変化させたことを示し、このパラダイムが認知と記憶を評価する研究に適用されることを示す。
Abstract
神経変性疾患は、年齢依存性、衰弱性、不治の病です。最近の報告はまた、メモリや認知障害の変化と高血糖を相関しています。.私たちは、高血糖ゼブラフィッシュで使用するためにげっ歯類と同様の3チャンバー選択認知タスクを変更し、開発しました。試験室は、中央に位置する開始室と両側の2つの選択肢コンパートメントで構成され、報酬として使用される固有の浅瀬が使用されます。私たちは、取得したら、ゼブラフィッシュが少なくとも8週間後にタスクを覚えていることを示すデータを提供します。我々のデータは、ゼブラフィッシュがこの報酬に強く反応することを示し、我々は治療の4週間後に高血糖魚の認知障害を同定した。この行動アッセイは、認知および記憶に関連する他の研究にも適用可能である。
Introduction
神経変性疾患は、年齢依存性、衰弱性、不治の病です。これらの疾患は有病率の増加に伴い、新しい治療戦略を改善し、開発する緊急の必要性をもたらしている。各疾患の発症と提示は、言語、運動、自律神経脳領域に影響を与えるものもあれば、学習障害や記憶喪失を引き起こすものもあるので、ユニークです。最も顕著なのは、認知障害および/または障害は、すべての神経変性疾患2で最も一般的な合併症である。これらの神経変性疾患に関与する根本的なメカニズムに光を当てることを期待して、多くの異なるモデルシステム(げっ歯類やヒトなどの高次脊椎動物への ショウジョウバエ への単細胞生物を含む)の使用が採用されている。しかし、神経変性疾患の大半は不治のままです。
環境への一定の変化は適応を必要とするので、学習と記憶は生物の間で非常に保存されたプロセスである3.認知およびシナプス可塑性の両方の障害は、いくつかのげっ歯類モデルで実証されています。具体的には、十分に確立された行動アッセイは、様々な障害誘発性疾患および障害に続く認知変化を評価するために連想学習を使用する4。さらに, コントラスト差別の逆転は、高次学習と記憶機能を伴うので認知障害を評価します, 逆転は、以前に学習した関連の阻害に依存します.広く使用されている3部屋選択タスクは、中枢神経系5、6の学習および記憶経路における可能な赤字を解明する。近年、幼虫から7歳、8歳までの年代に対していくつかのパラダイムが開発され、ゼブラフィッシュ(Danio rerio)などの哺乳類以外のモデルが含まれるように拡大しています。
ゼブラフィッシュは、行動技術と認知障害の評価に有利である複雑さとシンプルさのバランスを提供します。第一に、ゼブラフィッシュは、その小さなサイズと多産の生殖特性を考えると、ハイスループットの行動スクリーニングに適しています。第二に、ゼブラフィッシュは、同様の神経マーカーと細胞型7を有する哺乳類海馬に類似した構造、横パリウムを有する。ゼブラフィッシュはまた、空間情報9を取得して記憶することができ、人間のように、日当り10です。したがって、ゼブラフィッシュが頻度の増加に伴い神経変性疾患のモデルとして使用されていることは驚くべきことではありません。しかし、適切な行動アッセイがないことにより、ゼブラフィッシュモデルを認知評価に適用することが困難になっています。ゼブラフィッシュ特異的行動アッセイを用いた公開された研究には、連想学習タスク11、不安行動12、記憶13、物体認識14、および条件付き場所優先15、16、17、18、19が含まれる。ゼブラフィッシュの行動アッセイに関しては多くの進展があったが、げっ歯類の認知機能のいくつかのテストの対応は、ゼブラフィッシュ18で使用するためにまだ開発されていない。
私たちの研究室からの以前の研究に基づいて、私たちは報酬として社会的相互作用を使用してげっ歯類で使用される3つの部屋の選択タスクに基づいてゼブラフィッシュの認知タスクをモデル化/開発しました。さらに、行動課題の連想学習の側面を拡大し、認知障害を評価するためのこの行動タスクをさらに発展させることを期待して、対照的な差別の逆転を取り入れた。これにより、差別学習の最初の獲得と、その後の逆転段階での学習の阻害の両方を調べることができ、現在の研究では、この手順が4〜8週間のグルコース浸漬後のゼブラフィッシュの認知機能を評価するための信頼できる方法を提供したことを実証した。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
すべての実験手順は、アメリカン大学の制度的動物のケアと使用委員会(IACUC)によって承認されました(プロトコル#1606、19-02)。
1. 動物
- 動物の飼育とメンテナンス
- 成虫の野生型ゼブラフィッシュ(ダニオ・レリオ)を4~11ヶ月齢の胚として入手し、社内で飼育する。
- 14-h 光:10-h 暗光周期で 28– 29 °C の水生ラック システムで魚を維持します。
- 商業フレークで1日2回魚を養い、生きた アルテミアを補充します。
- 行動実験のためにこれらのストックタンクからランダムに魚を選択してください。
- 実験完了時に、0.02%トリケーヌに2分間浸漬するか、運動協調が不足し、後の分子および/または神経化学的分析のための呼吸速度が低下するまで動物を麻酔します。
2. 3部屋選択試験室
注意: この行動手法は、Ruhlら20.
- チャンバー建設
- 行動室26を変更する - 40 L水槽(50 x 30 x 30 cm 3)-2つの側面選択室(それぞれ20 x 30 x 30 cm3)から分離された中央または開始室(10 x 30 x 30 cm3)を有する。
- 内ガラス壁に付着したアルミニウム「U字型」チャネルを使用して3つのコンパートメントを構築し、タンクを3つのチャンバーに分離します。
- 灰色のPVCシートの中から、両側のアルミニウムチャネルに収まる不透明な仕切り機を構築します。タンク内に永久に取り付けられた静止した底部分と、アルミトラックで上下に動く移動可能なトップピース:2つの部分から各仕切りを作ります。
- 灰色のPVCシートの上部に特大バインダークリップを接着して、ハンドルとして機能させます。
- 永久マーカーを使用して、タンクの外側に付着した灰色のPVCパイプの上に10cmの小さな水平線を描きます。
注:このマークは、上部の灰色のPVCシートがいずれかの側へのアクセスを許可するために開かれるポイントです。 - タンクの底から上へ25cmのレベルにタンクに制御(システム)水を加える、または〜30 L.24時間のチャンバの各セクションにガラスの水槽ヒーターを置き、温度を28.5°Cに持ち込みます。
注:動作セッションの開始時にヒーターを取り外し、2日間使用した後に完全な水交換を行います。
- 差別の設定
- 各識別タスクについて、ベルクロを使用して、選択室の外側の裏、側面、および底部に色付きフェルトピース(ベージュ、黒、または白)を個別に配置します(図1B–D)。
注: 中央の部屋には背景色が関連付けされていない必要があります。
- 各識別タスクについて、ベルクロを使用して、選択室の外側の裏、側面、および底部に色付きフェルトピース(ベージュ、黒、または白)を個別に配置します(図1B–D)。
- 報酬として、各選択室の遠い隅にある小さな透明なタンクに、研究で使用されない4つの成体ゼブラフィッシュを配置することによって、特定のグループ(浅瀬)を作成します(図1B-D)。
注:各浅瀬タンクの実験魚と同じ年齢と大きさの少なくとも1人の男性と1匹のメスで、毎日ストックタンクから浅瀬魚をランダムに選びます。
3. 行動タスク
- 順化
注:行動室への順応は、トレーニングの3日間で構成されています。グループ順応の2日間、続いて1日の個別トレーニング。 - グループ順応
- 両方の選択肢コンパートメントの外側にベージュ(ニュートラル)フェルト背景を取り付け、それぞれの選択コンパートメントにライブショールタンクを水没させます(図1B)。
- 両方のスライドドアを開けた中央のスタートチャンバーに5〜6匹のゼブラフィッシュを加え、魚が30分間自由に歩き回るようにします。
注:実験的なゼブラフィッシュは、順応中にどちらかの選択肢コンパートメントに入った後、報酬としてタンクを通してこれらの浅瀬魚と相互作用し、交流することができるはずです。魚は、その体全体がチャンバーに入るとき、側の部屋の1つに入ったと考えられています。 - 同じ実験魚を2日目(2日間の群順順化)に繰り返します。
注:魚の同じグループを維持しないでください。
- 個人の順応
- チャンバーのセットアップ:ベージュ(ニュートラル)フェルトの背景を両方の選択肢コンパートメントの外側に取り付け、グループ順応のように両方の選択コンパートメントにライブショールタンクを水没させます(図1B,E)。
- 中央のスタートチャンバーに個々のゼブラフィッシュを2分間スライドドアを閉めて、2分の期間の後、両方のドアを同時に開きます。
- 各魚が中央の部屋からドアを通って、どちらの側に関係なく合計10回泳ぐことを確認してください。それは側の部屋の一つに入るたびに魚に報酬を与える(個々の順応の1日)。
注:魚が30分以内にこのタスクを10回完了できない場合、または出発室を離れることをまったく拒否した場合は、調査から除外してください。
- データ取得: 魚がいずれかの側に泳いだ回数と、タスクの完了にかかる合計時間を記録します。
- チャンバーのセットアップ:ベージュ(ニュートラル)フェルトの背景を両方の選択肢コンパートメントの外側に取り付け、グループ順応のように両方の選択コンパートメントにライブショールタンクを水没させます(図1B,E)。
- 取得
注:順応後、ゼブラフィッシュは3日間の買収作業を開始しました。- チャンバーのセットアップ:一方の選択肢コンパートメントの外側に白いフェルト片を取り付け、もう一方の選択肢コンパートメントの外側に黒いフェルトピースを取り付けます(図1C,F)。
注:擬似ランダムスケジュール37を使用して、毎日それぞれの側の背景色を交互にします。- トレーニングのこの段階の間、選択コンパートメントの1つにだけ置かれた浅瀬報酬を置きます。これは報われる側になります。
- 取得を開始するには、選択コンパートメントを閉じた状態で2分間、出発室に単一の実験魚を置きます。
- 2分順応後、両方のドアを同時に開き、両方の選択肢コンパートメントにアクセスし、ストップウォッチを起動して選択待ち時間を評価します。
- 偏ったデザインを使用して、魚に黒または白の好み(W+/B-またはB+/W-)をランダムに割り当て、浅瀬が黒(B+)または白(W+)の選択コンパートメントに配置されることを意味します。
- 選択応答の示し
- 魚がサイドコンパートメントの1つを入力して選択したら、タイマーを停止します。
- 魚が正しく好ましい側を選択した場合、中央室とその側の間のドアを直ちに閉じて、魚を1分間好ましい側に制限し、浅瀬タンクと相互作用して報われるようにします(図1C,F)。このトライアルを「正しい」(報われた)の「C」としてスコアを付けます。
- 魚が間違ったドアを泳いだ場合は、中央室に戻し、両方のドアを閉め、「間違った」(報われない)の「I」として裁判を採点します。
- ドアが開いてから2分以内に魚が決まらない場合は、魚を正しい側に1分間移動し、"マーク"(強制報い)の「M」としてトライアルを獲得します。
- 魚を出発室に戻す/移動するとき、羊飼いの道具として魚網を使って中央の部屋に魚をそっと導きます。
注:これは行動アッセイに影響を与える可能性がありますので、水から魚をすくい取り、開始チャンバーに交換しないでください。 - 魚が中央の部屋に戻ったら、1分待ってからタスクを再度実行します。各魚がタスクを 8 回実行することを確認します。
- データ取得
- 各実験魚について、8 つの取得試行 (セクション 3.4.2) のそれぞれについて、最初の決定 (または選択遅延) と個々のスコア (C、I、または M) を順番に記録します。
- これらの実験の結果を報告し、各取得日の各試験のグループ平均として報告した。
- 魚が試験を完了したら、それを「高性能」魚または「パフォーマンスの低い」魚のいずれかに分類します。
注:魚は、それが成功した場合は、その日の8つの合計試験の少なくとも6でタンクの正しい側面を選択した場合、「高性能」と見なされました。この基準を満たさない魚は「低い実行者」です。 - 一度識別, ハウス高いパフォーマンスと低パフォーマンスの魚は別々に.
- 魚が試験を完了した後、獲得の3日間のそれぞれで「高い」または「低い」パフォーマーとして魚を分類します。
注:取得の3日目の終わりに、魚は研究期間中「高い」または「低い」パフォーマーのいずれかとして残ります。
注:最初は「パフォーマンスの低い」グループにあった魚の中には、買収2日目または3日目にタスクを学ぶものもあります。これが起こると、最初の「低パフォーマンス」の魚は「高性能」グループに移動することができます。3日目(取得終了)の後、この方法でグループ間で魚を移動しないでください。
- チャンバーのセットアップ:一方の選択肢コンパートメントの外側に白いフェルト片を取り付け、もう一方の選択肢コンパートメントの外側に黒いフェルトピースを取り付けます(図1C,F)。
4. 実験的な治療
- 取得期間後、魚が黒と白の背景の間の単純な差別作業を解決する能力を示すとき、実験ゼブラフィッシュの治療レジメンを開始する。
注: この方法の適用性を示すために、この研究は2つの実験計画を示しています:- 縦方向の研究
- 実験魚を8週間保持タンクに戻します。毎日の水の変化と標準的なタンクで魚を維持し、毎日2回それらを供給します。
注:保持タンクでこれらの8週間の間、任意の行動訓練を行わない。 - この期間の後に逆転評価を行い、ゼブラフィッシュがトレーニングなしで8週間後に逆転タスクを解決できるかどうかを評価します。
- 実験魚を8週間保持タンクに戻します。毎日の水の変化と標準的なタンクで魚を維持し、毎日2回それらを供給します。
- 高血糖症:実験群を水(ストレス制御の処理)、マンリトール(1%~3%、浸透圧制御)、またはグルコース(1%~3%)を4週間または8週間22、23に曝します。
注:この4週間または8週間の間、行動訓練を行わないで下してください。
- 縦方向の研究
5. 逆転
注:実験操作(セクション4.2のように)に続いて、魚は3部屋選択パラダイムの最終部分でテストされます- 逆転。これを行うには、報われた側は、以前に白い側の浅瀬で報われた魚が黒い側の浅瀬で報われるような(買収と比較して)逆転し、その逆もまた同様です。このように、逆転は、魚が報酬(浅瀬)が位置する場所を、背景の色に関係なく、学んだかどうかを評価します。
- チャンバーのセットアップ
- 選択室の外側に黒いフェルトを取り付け、もう一方の外側に白いフェルトを取り付け、黒と白の側面が取得試験と同じ側面であることを確認します(セクション3.4)。
- 以前に報われた選択室の反対である側の遠い後ろの隅に浅瀬タンクを水没する(図1D,G)。
注:言い換えれば、以前に白い側で報われた魚は今では黒い側に報われ、その逆もまた同様です。 - セクション3.5のように魚を個別にテストしてください。2分間、出発室に1つの実験魚を置くことから始め、選択肢コンパートメントへのアクセスを閉じます。
- 同時にチャンバーの両側を開きます。
注:3回連続治療日の合計8回の試験を毎日完了してください。
- 選択応答の示し
- 魚が正しく好みの色を選択した場合は、すぐに1分間中央室のドアを閉め、魚が浅瀬報酬と相互作用できるようにします。このトライアルを「正しい」(報われた)の「C」としてスコアを付けます。
- 魚が間違ったドアを泳いだ場合は、中央室に戻し、両方のドアを閉め、「間違った」(報われない)の「I」としてこの裁判を採点します。
- ドアが開いてから2分以内に魚が決定を下さない場合は、魚を正しい側に移動し、"マーク"(強制報い)の「M」としてトライアルを獲得します。
- データ取得
- 実験用ゼブラフィッシュごとに、各試験の順番に、選択待ち時間と個々のスコア(C、I、M)を記録します。
- これらの実験の結果を、3 回の逆転日の各 2 試行ブロックのグループ平均として報告します。
- 高い魚と低パフォーマンスの魚のデータを別々に保ち、取り消し時と同じレベルの性能を獲得したかどうかを判断します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
行動室への順応は、訓練の3日間を含む:グループ順応の2日間に続いて、個々の順応の1日。しかし、個々のゼブラフィッシュを区別することができなかったため、個々の順応の間しかデータを収集できませんでした。このとき、浅瀬ベースの報酬を使用して条件付けされた実験動物(n=30)は、最初の決定に達するまで平均125.11sを要し、平均725.34s(12分)を要して、個々の順応作業全体を完了した(図2B)。順応中の重要なサイドプリファレンスはありませんでした (図 2C)。除外された魚の数は、私たちの研究室で以前に評価した他の報酬タイプ(食品)と比較して最小限でした(図2C)。
順応後、ゼブラフィッシュは取得段階を開始しました。魚を個別に試験した結果、3つの獲得日の各々に各魚からデータを収集しました。魚は「高または低のパフォーマー」に分類され、すべての魚がテストチャンバーに同じ以前の暴露を持っているにもかかわらず、「高いパフォーマー」がより速く、より正確に反応しました。8回の試験のうち少なくとも6回で報われた選択コンパートメントを選択した魚だけが「高いパフォーマー」に分類されました。この基準を満たしていない魚は「低いパフォーマー」でした。高いおよび低い性能の魚は、すべてのその後の試験で彼らのパフォーマンスを区別するために別々に収容されました.興味深いことに、買収の過程で、いくつかの魚がカテゴリーを変えた(すなわち、最初は「低いパフォーマー」でしたが、「高いパフォーマー」になった)ことを観察しました。実際、高性能動物の数は日ごとに増加し、1日目に比べて3日目の魚の高性能が1日目に高い(図3A)。3日目までに、魚の50%>「高いパフォーマー」になっていました。さらに、3回の取得日(A1–A3)における全ての魚の初期選択待ち時間が減少し、取得日毎の性能が向上したことを示す(図3B)。また、高いパフォーマンスを発揮する魚群のみを考慮した場合も同じ傾向が見られました:3日目までに、最初の決定までの時間が改善(速くなりました)(図3C)。
すべての実験動物(n = 30)の3つの取得日(a1-A3)の各取得トライアルブロック(2つの試験/魚の平均)に対する差別比(報奨試験/(報われない試験)を計算し、魚が差別タスクをどれだけ正確に解決(すなわち、タンクの報われる側に行く)を決定した。この比率は、各試験中に報われた側に移動する魚の割合が毎日(すなわち、個々の日のトライアルブロックを越えて)増加し、全体的(すなわち、3つの獲得日にわたって)、すべての魚が獲得の終わりまでに偶然を上回るパフォーマンスを示すことを明らかにしました(グラフに示される点線;(図4A)と、魚が差別作業を学んだことを示す。
差別学習の習得後、ゼブラフィッシュがこのタスクをどのくらい覚えているかをテストしました。そのために、テストされたゼブラフィッシュは8週間タンクを保持したままでした。この時間の後、魚は3日間続いた逆転タスクでテストされました(R1–R3)。3日間の逆転の際に魚が強い逆転行動を示し、差別が増えていること(図4B)は、(1)タンクの色と報酬の関係を覚えることができ、(2)獲得中に以前に学んだことを阻害し、逆転/反対のパラダイムを学ぶことを発見した。 図4Bに示すように、ゼブラフィッシュは当初、逆転1日目の最初のトレイルでの識別比がチャンスを下回っている場合に示されるように、タンクの報われない側に行きました。しかし、R1の終わりまでに、性能は偶然よりも大きくなり、R2およびR3上で維持された結果、R3で最も高い判別率スコアが観察された。これらのデータをまとめると、これらのデータは、初期行動が8週間前に取得されたにもかかわらず、行動セッションの間に追加の訓練を受けずに、ナイーブな実験動物が差別タスクを解決できることを示している。
3室選択パラダイムは、疾患合併症の検査にも適用できます。高血糖ゼブラフィッシュの研究では、順応および取得が記載された通りであり、逆転は4または8週間の高血糖に続いて試験された。高血糖は、ゼブラフィッシュが24時間試験溶液に入った数日後に、1日おきにトレーニングが行われるように、代替浸漬プロトコル(McCarthy et al.、 2020 - この問題)で誘発された。取得中、トレーニング日が差別比(F(2,239)=4.457、p= 0.012;差別比に対する主な効果があった。 図5Aは、A1の比がA3(p=0.010)よりも有意に低いとともに、魚が時間の経過とともに選択精度を向上させたことを示している。逆転の間、治療の有意な主な効果があった(F(2、326)=3.057、p = 0.048)が、他の重要な主な効果または相互作用(トレーニング日:F(2、326)=1.602、p = 0.203);トレーニング日x治療:(F(4、326)= 0.661,000) 図 5A)。グルコース処理動物の応答は水処理動物(p=0.037)に比べて有意に低下したが、他の有意な差はなかった(対照対マン一方:p=0.387;マンイトール対グルコース:p=0.524)、グルコース特異的効果を示唆する。8週間の高血糖の後、取得訓練全体の差別比に統計的な違いは認められなかった(F(2,263)=2.909、p=0.056; 図5B)。しかし、トレーニング日(F(2,189)=4.721,p=0.010)と治療(F(2,189)=7.940,p=0.000)の両方の主な影響は逆転に及んだが、有意な相互作用はなかった(トレーニング日*治療=F=F(4,189)=0.48)。その後の最小有意差(LSD)対比比較により、R1とR3(p = 0.022)とR2とR3(p = 0.003)の間の有意な差が同定された。LSD対方向比較はまた、水処理群とグルコースおよびマンニトール処理群(水対マンニトール:p = 0.008;水対グルコース:0.000)の間に有意な差を明らかにした。しかしながら、グルコース群とマンニトール基は互いに有意に異なっていない(p= 0.265)、これらの差別比の差は浸透効果によるものである可能性があることを示唆している。
図1:3室選択試験室と行動設定。(A)3 室回路図。実験動物は中央の開始チャンバーに2分間制限され、試験開始時にタンクの両側へのアクセスを許可した。これを行うには、2つのパーティションの上半分は、魚がどちらかの選択肢コンパートメントに渡るための10cmのスペースを作成するために上げられました。 (B,E) 順応は、報酬としてベージュの背景と固有の浅瀬を使用して行われました。 (C,F) 取得は、選択室上の白黒背景を使用して行われました。報酬は部屋の片側にのみ配置されました。 (G) 反転は、選択コンパートメント上の黒と白の背景を使用して実行されました;報酬は、チャンバーの反対側でのみ利用可能でした(対取得)。 (H) スパールタンクのクローズアップ画像は、選択肢のコンパートメントの1つに沈水しました。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:個々の順応中のレイテンシとマークされた試験の数。(A)最初の決定の選択の待ち時間。(B)個々の順応を完了するまでの合計時間。(C)左右へのエントリ数は異ならず、取得開始前に固有のサイドプリファレンスを示さない。また、個々の順応中のマーク試験の総数も報告します。値は平均± SEM として報告されます。
図3:3回の取得日における高パフォーマンス魚の割合と、すべての魚と高いパフォーマンスの高い魚の初期選択待ち時間。(A)高い演奏魚は、各取得日(A1-A3)の少なくとも8回の試験で、中央のチャンバーから報酬を受けた側のチャンバーに移動しました。(B) 3日間の取得トレーニング (A1–A3) で、初期選択の全体的な待ち時間が減少しました。高いパフォーマンスの魚(C)にも明らかな傾向。値は平均± SEM として報告されます。
図4:取得および逆転試験中の差別パフォーマンス(A) 8週間後の逆転学習中の獲得日(A1~A3)および (B) における魚の差別比(報奨試験/(報奨+非報奨試験)逆転も3日間評価された(R1–R3)。両方のタスクでは、各魚は8試験を完了する必要があり、結果は2トライアルブロック(2、4、6、8)で提示されます。獲得と反転の両方の間に正しい応答は時間とともに増加しました, 逆転中に観察されたより速い応答で, 魚が学習し、タスクを覚えていることを示します.値は SEM ±平均として報告されます。点線は偶然を表します。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:3室選択行動タスクを用いた高血糖ゼブラフィッシュの取得と逆転(A) 治療前に、ナイーブゼブラフィッシュは3日間の行動訓練(取得、A1-A3)にわたって3室選択行動タスクを獲得しました。学習が行われたA1とA3の差別比には有意な差があった(p= 0.012)。4週間の治療(着色記号)の後に、処理(p=0.048)の有意な効果があり、グルコース処理動物は水処理動物と比較して有意に減少した差別比を示した(p=0.037)。 (B) 別の実験では、8週前後の高血糖の行動を評価した。各取得日のパフォーマンスが着実に向上したにもかかわらず、A1-A3全体で差別比が大きく異なっていません。しかし、8週間の治療(着色記号)の後、治療の主な効果(p<0.001)およびトレーニング日の個々の主な効果(p=0.010)があった。ポストホック分析は、水処理群とマンニトールとグルコース処理群の両方との間に有意な差を明らかにし、浸透効果を示唆した(水対マンニトール:p = 0.008;水対グルコース:p <0.001)。* は重要な主効果を示します。データ ポイントは SEM ±グループ平均を表し、異なる文字を持つデータ ポイントは互いに大きく異なります。点線は偶然を表します。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
過去15年間24年にゼブラフィッシュを用いて行われた神経科学研究の量と多様性は大きく伸びていますが、哺乳類モデルシステム11,25,26と比較して行動アッセイがこの種に欠けている。ここでは、げっ歯類と共に使用するために開発された3つのチャンバー選択タスクを、ゼブラフィッシュにおける視覚差別学習の取得および逆転を評価するために適応できることを示す。このタスクは、報酬として生き生きした浅瀬を使用して、糖尿病、アルツハイマー病、認知症の高血糖合併症などの行動に関連する疾患を調べる様々な研究に適用できる堅牢なアッセイを提供しました。
ゼブラフィッシュは、生態学的に関連する意思決定を行うために必要であり、野生の生存のために必要な情報を学習し、保存することができることが以前に確立されています 3 .8週間の縦断的研究における当社の取得と逆転データは、ゼブラフィッシュは小さいが、単純な差別タスクを学び、覚えることができるという以前の証拠を支持し、ゼブラフィッシュは以前に獲得した応答を阻害することもできるという以前の証拠を支持する。縦8週間の研究では、強制報酬の数が減少し、差別比が増加し、魚が正しい、報われた側を選択する上で良くなることを示し、タスクを学びました。これらの変化は重要ではありませんでしたが、買収中の強制報奨試験の数と差別率の増加は全体的に減少傾向にあります。さらに、高血糖魚を含む3室選択行動タスクの結果は、高血糖状態を調べる研究に対する試験の適用性を明らかにし、このパラダイムを薬物暴露または突然変異線などの他の実験的操作と組み合わせて使用して認知に対する潜在的な影響を評価できることを示した。
この研究の重要な制限は、時間の経過とともに個々の魚を識別できないため、データを評価するためにグループ平均に依存しなければならないということです。げっ歯類のように、異なる治療グループで魚を個別に追跡する方法を開発することは、これらの問題に対処することができます。これらの違いを解決するために、我々は彼らのパフォーマンスに基づいて獲得段階で魚を選別し、それは私たちの方法論の予想外の利点であることが判明しました。「高性能魚」はトレーニングの毎日≥6/8を獲得しましたが、スコアが低い魚は「パフォーマンスの低い魚」でした。毎日数えられると、浅瀬報奨グループの「高いパフォーマー」の数が増加し、3日目までに、このカテゴリーには魚の報酬を受けた治療と比較して有意に多くの魚がいました。すべての魚('高+低パフォーマー')で観察された選択待ち時間の傾向は、「高性能」グループでのみ観察されたものと類似しており、このグループの強い反応が全体的な反応を促進していることを示唆している。
要約すると、これらの知見は、ゼブラフィッシュにおける浅瀬ベースの差別学習が、正常および障害のある認知機能の研究のための実行可能な費用対効果の高いモデルを提供することを示している。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
私たちは、ゼブラフィッシュモデルとジェレミー・ポポウィッツとアリソン・マークにげっ歯類の3室の選択パラダイムを適応させる彼女の助け、行動収集日の支援、ランニングトライアルの支援、動物ケア、タンクのセットアップに対する彼女の支援に対するサブリナ・ジョーンズに感謝します。3室選択タンクの設計と建設に協力してくれたジェームズ・M・フォーベ(機械エンジニア)にも感謝します。
資金:VPCとTLDは、アメリカン大学芸術科学大学から共同教員研究支援助成金(FRSG)を受け取りました。CJRは、アメリカン大学芸術科学大学大学院学生支援センターの支援を受けました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Champion Sports Stopwatch Timer Set: Waterproof, Handheld Digital Clock Sport Stopwatches with Large Display for Kids or Coach - Bright Colored 6 Pack | Amazon | N/A | https://www.amazon.com/Champion-Sports-910SET-Stopwatch-Timer/dp/B001CD9LJK/ref=sr_1_17?dchild=1&keywords=stopwatch+for+sports&qid=1597081570&sr=8-17 Recommend two of different colors; one for choice latency and one for time to completion |
| Coofficer Extra Large Binder Clips 2-Inch (24 Pack), Big Paper Clamps for Office Supplies, Black | Amazon | N/A | https://www.amazon.com/Coofficer-Binder-2-Inch-Clamps-Supplies/dp/B07C94YCR5/ref=sr_1_3_sspa?dchild=1&keywords=large+binder+clips&qid=1597081521&sr=8-3-spons&psc=1&spLa=ZW5jcnlwdGVkUXVhbGlmaWVyPUExUENWUTRZVjlIWEVPJmVuY3J5cHRlZElkPUEwNDQ5NDU0MlpSREkwTFlLSThVQiZlbmNyeXB0ZWRBZElkPUEwMTg5NDI3MllRV1EzOUdWTVpSOCZ3aWRnZXROYW1lPXNwX2F0ZiZhY3Rpb249Y2xpY2tSZWRpcmVjdCZkb05vdExvZ0NsaWNrPXRydWU= |
| Marineland® Silicone Aquarium Sealant | Petsmart | Item #2431002 | |
| PVC (Polyvinyl Chloride) Sheet, Opaque Gray, Standard Tolerance, UL 94/ASTM D1784, 0.125" Thickness, 12" Width, 24" Length | Amazon | N/A | https://www.amazon.com/Polyvinyl-Chloride-Standard-Tolerance-Thickness/dp/B000MAMGEQ/ref=sr_1_2?dchild=1&keywords=grey+PVC+sheet&qid=1597081440&sr=8-2 |
| Steelworks 1/4-in W x 8-ft L Mill Finished Aluminum Weldable Trim U-shaped Channel | Lowes | Item #55979Model #11377 | https://www.lowes.com/pd/Steelworks-1-4-in-W-x-8-ft-L-Mill-Finished-Aluminum-Weldable-Trim-Channel/3058181 |
| Tetra 10 Gallon Fish tank | Petsmart | Item #5271256 | |
| Top Fin Fine Mesh Fish Net (3 in) | Petsmart | Item #5175115 |
References
- Gitler, A. D., Dhillon, P., Shorter, J. Neurodegenerative disease: models, mechanisms, and a new hope. Disease Models & Mechanisms. 10, 499-502 (2017).
- Perry, R. J., Watson, P., Hodges, J. R. The nature and staging of attention dysfunction in early (minimal and mild) Alzheimer's disease: relationship to episodic and semantic memory impairment. Neuropsychologia. 38, 252-271 (2000).
- Gerlai, R. Learning and memory in zebrafish (Danio rerio). Methods in Cell Biology. 134, Elsevier Ltd. (2016).
- Davidson, T. L., et al. The effects of a high-energy diet on hippocampal-dependent discrimination performance and blood-brain barrier integrity differ for diet-induced obese and diet-resistant rats. Physiology and Behavior. 107, 26-33 (2012).
- Yang, M., Silverman, J. L., Crawley, J. N. Automated three-chambered social approach task for mice. Current Protocols in Neuroscience. 56 (1), (2011).
- Remmelink, E., Smit, A. B., Verhage, M., Loos, M. Measuring discrimination- and reversal learning in mouse models within 4 days and without prior food deprivation. Learning and Memory. 23, 660-667 (2016).
- Salas, C., et al. Neuropsychology of learning and memory in teleost fish. Zebrafish. 3, 157-171 (2006).
- Kalueff, A. V., et al. Towards a comprehensive catalog of zebrafish behavior 1.0 and beyond. Zebrafish. 10, 70-86 (2013).
- Luchiaria, A. C., Salajanb, D. C., Gerlai, R. Acute and chronic alcohol administration: Effects on performance of zebrafish in a latent learning task. Behavior Brain Research. 282, 76-83 (2015).
- Fadool, J., Dowling, J. Zebrafish: A model system for the study of eye genetics. Progress in Retinal and Eye Research. 27, 89-110 (2008).
- Fernandes, Y. M., Rampersad, M., Luchiari, A. C., Gerlai, R. Associative learning in the multichamber tank: A new learning paradigm for zebrafish. Behavioural Brain Research. 312, 279-284 (2016).
- Reider, M., Connaughton, V. P. Developmental exposure to methimazole increases anxiety behavior in zebrafish. Behavioral Neuroscience. , (2015).
- Capiotti, K. M., et al. Hyperglycemia induces memory impairment linked to increased acetylcholinesterase activity in zebrafish (Danio rerio). Behavioural Brain Research. 274, 319-325 (2014).
- May, Z., et al.
- Mathur, P., Lau, B., Guo, S. Conditioned place preference behavior in zebrafish. Nature Protocols. 6, 338-345 (2011).
- Guo, S. Linking genes to brain, behavior and neurological diseases: What can we learn from zebrafish. Genes, Brain and Behavior. 3, 63-74 (2004).
- Kily, L. J. M., et al. Gene expression changes in a zebrafish model of drug dependency suggest conservation of neuro-adaptation pathways. Journal of Experimental Biology. 211, 1623-1634 (2008).
- Webb, K. J., et al. Zebrafish reward mutants reveal novel transcripts mediating the behavioral effects of amphetamine. Genome Biology. 10, (2009).
- Clayman, C. L., Malloy, E. J., Kearns, D. N., Connaughton, V. P. Differential behavioral effects of ethanol pre-exposure in male and female zebrafish (Danio rerio). Behavioural Brain Research. 335, 174-184 (2017).
- Ruhl, T., et al. Acute administration of THC impairs spatial but not associative memory function in zebrafish. Psychopharmacology. 231, 3829-3842 (2014).
- Gellermann, L. W. Chance orders of alternating stimuli in visual discrimination experiments. The Pedagogical Seminary and Journal of Genetic Psychology. 42, 206-208 (1933).
- Gleeson, M., Connaughton, V., Arneson, L. S. Induction of hyperglycaemia in zebrafish (Danio rerio) leads to morphological changes in the retina. Acta Diabetologica. 44, 157-163 (2007).
- Connaughton, V. P., Baker, C., Fonde, L., Gerardi, E., Slack, C. Alternate immersion in an external glucose solution differentially affects blood sugar values in older versus younger zebrafish adults. Zebrafish. 13, 87-94 (2016).
- Goldsmith, J. R., Jobin, C. Think small: Zebrafish as a model system of human pathology. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 817341 (2012).
- Kalueff, A. V., Stewart, A. M., Gerlai, R., Court, P. Zebrafish as an emerging model for studying complex brain disorders. Trends in Pharmacological Sciences. 35, 63-75 (2014).
- Gerlai, R. Associative learning in zebrafish (Danio rerio). Methods in cell biology. 101, 249-270 (2011).
