Summary
Presentiamo una camera comportamentale progettata per valutare le prestazioni cognitive. Forniamo dati che dimostrano che una volta acquisiti, i pesci zebra ricordano l'attività 8 settimane dopo. Mostriamo anche che i pesci zebra iperglicemici hanno alterato le prestazioni cognitive, indicando che questo paradigma è applicabile agli studi che valutano la cognizione e la memoria.
Abstract
Le malattie neurodegenerative sono dipendenti dall'età, debilitanti e incurabili. Recenti rapporti hanno anche correlato l'iperglicemia con cambiamenti nella memoria e / o nel deterioramento cognitivo. Abbiamo modificato e sviluppato un compito cognitivo a scelta a tre camere simile a quello utilizzato con i roditori per l'uso con il pesce zebra iperglicemico. La camera di prova è composta da una camera di partenza posizionata centralmente e due scomparti scelti su entrambi i lati, con una secca di conspecifici utilizzati come ricompensa. Forniamo dati che dimostrano che una volta acquisiti, i pesci zebra ricordano l'attività almeno 8 settimane dopo. I nostri dati indicano che il pesce zebra risponde in modo robusto a questa ricompensa e abbiamo identificato deficit cognitivi nei pesci iperglicemici dopo 4 settimane di trattamento. Questo test comportamentale può anche essere applicabile ad altri studi relativi alla cognizione e alla memoria.
Introduction
Le malattie neurodegenerative sono dipendenti dall'età, debilitanti e incurabili. Queste malattie stanno aumentando in prevalenza, con conseguente urgente necessità di migliorare e sviluppare nuove strategie terapeutiche. L'insorgenza e la presentazione di ogni malattia è unica, poiché alcune influenzano le regioni del cervello del linguaggio, motorie e autonome, mentre altre causano deficit di apprendimento e perdita di memoria1. In particolare, i deficit cognitivi e / o la compromissione sono le complicanze più diffuse in tutte le malattie neurodegenerative2. Nella speranza di far luce sui meccanismi sottostanti coinvolti in queste malattie neurodegenerative, è stato impiegato l'uso di molti diversi sistemi modello (compresi organismi unicellulari a Drosophila a vertebrati di ordine superiore come roditori e umani); tuttavia, la maggior parte delle malattie neurodegenerative rimane incurabile.
L'apprendimento e la memoria sono processi altamente conservati tra gli organismi poiché i cambiamenti costanti nell'ambiente richiedono l'adattamento3. La compromissione sia della cognizione che della plasticità sinaptica è stata dimostrata in diversi modelli di roditori. In particolare, saggi comportamentali consolidati utilizzano l'apprendimento associativo per valutare i cambiamenti cognitivi a seguito di varie malattie e disturbi indotti da compromissione4. Inoltre, l'inversione della discriminazione del contrasto valuta i deficit cognitivi perché coinvolge funzioni di apprendimento e memoria di ordine superiore e l'inversione dipende dall'inibizione di un'associazione precedentemente appresa. Il compito di scelta a tre camere ampiamente utilizzato chiarisce i possibili deficit nei percorsi di apprendimento e memoria del sistema nervoso centrale5,6. Recentemente, questo campo si è ampliato per includere modelli non mammiferi, come il pesce zebra (Danio rerio), in quanto sono stati sviluppati diversi paradigmi per una gamma di età dalle larve agli adulti7,8.
Zebrafish fornisce un equilibrio di complessità e semplicità che è vantaggioso per la valutazione dei deficit cognitivi con tecniche comportamentali. In primo luogo, i pesci zebra sono suscettibili di screening comportamentale ad alto rendimento date le loro piccole dimensioni e la prolifica natura riproduttiva. In secondo luogo, il pesce zebra possiede una struttura, il pallio laterale, che è analogo all'ippocampo dei mammiferi in quanto ha marcatori neuronali e tipi di cellule simili7. I pesci zebra sono anche in grado di acquisire e ricordare informazioni spaziali9 e, come gli umani, sono diurni10. Pertanto, non sorprende che i pesci zebra vengano utilizzati come modello per le malattie neurodegenerative con frequenza crescente. Tuttavia, l'assenza di test comportamentali appropriati ha reso difficile l'applicazione del modello zebrafish per le valutazioni cognitive. Il lavoro pubblicato utilizzando saggi comportamentali specifici per zebrafish include compiti di apprendimento associativo11, comportamento ansioso12, memoria13, riconoscimento degli oggetti14e preferenza del luogo condizionato15,16,17,18,19. Sebbene ci siano stati molti sviluppi rispetto ai saggi comportamentali del pesce zebra, le controparti per alcuni test delle funzioni cognitive nei roditori devono ancora essere sviluppate per l'uso con zebrafish18.
Basandoci su studi precedenti del nostro laboratorio, abbiamo modellato / sviluppato un compito cognitivo nel pesce zebra basato sul compito di scelta a tre camere utilizzato con i roditori usando l'interazione sociale come ricompensa. Inoltre, abbiamo ampliato l'aspetto dell'apprendimento associativo del compito comportamentale e incorporato l'inversione della discriminazione del contrasto nella speranza di sviluppare ulteriormente questo compito comportamentale per valutare il deterioramento cognitivo. Questo ci ha permesso di esaminare sia l'acquisizione iniziale dell'apprendimento della discriminazione sia la successiva inibizione di tale apprendimento nella fase di inversione. Nel presente studio, dimostriamo che questa procedura ha fornito un metodo affidabile per valutare il funzionamento cognitivo nel pesce zebra dopo l'immersione in glucosio per 4 o 8 settimane.
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Protocol
Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'American University (protocollo # 1606, 19-02).
1. Animali
- Allevamento e manutenzione degli animali
- Ottenere pesci zebra selvatici adulti (Danio rerio) di età compresa tra 4 e 11 mesi come embrioni e allevarli internamente.
- Mantenere il pesce in un sistema di rack acquatico a 28-29 °C su un fotoperiodo scuro di 14 ore di luce: 10 ore di buio.
- Nutrire il pesce due volte al giorno con fiocchi commerciali e integrare con Artemiaviva .
- Scegli il pesce in modo casuale da questi serbatoi di riserva per esperimenti comportamentali.
- Al termine dell'esperimento, anestetizzare gli animali per immersione in tricaina allo 0,02% per 2 minuti o fino a quando non vi è una mancanza di coordinazione motoria e una ridotta frequenza respiratoria per successive analisi molecolari e / o neurochimiche.
2. Camera di prova a scelta a tre camere
NOTA: Questa tecnica comportamentale è stata modificata da Ruhl et al.20.
- Costruzione della camera
- Modificare la camera comportamentale26— un acquario da 40 L (50 x 30 x 30 cm3) — per avere una camera centrale o di partenza (10 x 30 x 30 cm3), separata da due camere laterali a scelta (ciascuna 20 x 30 x 30 cm3, Figura 1A).
- Costruisci i tre scomparti utilizzando un canale in alluminio "a forma di U" fissato alle pareti di vetro interne con sigillante per acquari, per separare il serbatoio in tre camere.
- Costruisci divisori opachi, alti 10 cm, in lamiera di PVC grigio che si adatta ai canali di alluminio su entrambi i lati. Realizza ogni divisore da 2 pezzi, ciascuno di dimensioni uguali: un pezzo inferiore fisso montato permanentemente all'interno del serbatoio e un pezzo superiore mobile che si muove su e giù nei binari in alluminio.
- Incolla le clip leganti extra-large sulla parte superiore dei fogli di PVC grigio per fungere da maniglie.
- Utilizzando un pennarello permanente, disegnare piccole linee orizzontali 10 cm sopra il tubo in PVC grigio aderente all'esterno del serbatoio.
NOTA: questo segno è il punto in cui verrà aperto il foglio di PVC grigio superiore per consentire l'accesso a entrambi i lati. - Aggiungere acqua di controllo (sistema) al serbatoio a un livello di 25 cm dal basso verso l'alto del serbatoio, o ~ 30 L. Posizionare i riscaldatori per acquari in vetro in ogni sezione della camera per 24 ore prima del test per portare la temperatura a 28,5 °C.
NOTA: rimuovere i riscaldatori all'inizio della sessione di comportamento ed eseguire uno scambio d'acqua completo dopo due giorni di utilizzo.
- Configurazione della discriminazione
- Per ogni attività di discriminazione, posizionare individualmente i pezzi di feltro colorati (beige, nero o bianco) sul retro esterno, sul lato e sul fondo delle camere di scelta utilizzando Velcro (Figura 1B-D).
NOTA: alla camera centrale non deve essere associato alcun colore di sfondo.
- Per ogni attività di discriminazione, posizionare individualmente i pezzi di feltro colorati (beige, nero o bianco) sul retro esterno, sul lato e sul fondo delle camere di scelta utilizzando Velcro (Figura 1B-D).
- Come ricompensa, creare un gruppo di conspecifici (shoal) posizionando 4 pesci zebra adulti, che altrimenti non saranno utilizzati nello studio, in una piccola vasca chiara nell'angolo più lontano di ogni camera di scelta (Figura 1B-D).
NOTA: Scegli il pesce branco in modo casuale dalle vasche di stoccaggio ogni giorno, con almeno un maschio e una femmina della stessa età e dimensione del pesce sperimentale in ogni vasca di branco.
3. Attività comportamentali
- Acclimatazione
NOTA: L'acclimatazione alla camera di comportamento consiste in tre giorni di allenamento; due giorni di acclimatazione di gruppo seguiti da un giorno di allenamento individuale. - Acclimatazione di gruppo
- Attaccare lo sfondo in feltro beige (neutro) all'esterno di entrambi i compartimenti scelti e immergere un serbatoio di banchi vivi in ciascuno dei compartimenti scelti (Figura 1B).
- Aggiungi cinque-sei pesci zebra alla camera di partenza centrale con entrambe le porte scorrevoli aperte e lascia che il pesce vaghi liberamente per 30 minuti.
NOTA: Il pesce zebra sperimentale dovrebbe essere in grado di interagire e socializzare con questi pesci da branco attraverso l'acquario come ricompensa dopo aver attraversato in entrambi i compartimenti di scelta durante l'acclimatazione. Si ritiene che un pesce sia entrato in una delle camere laterali quando tutto il suo corpo entra nella camera. - Ripetere questa procedura con lo stesso pesce sperimentale per un secondo giorno (2 giorni di acclimatazione di gruppo).
NOTA: Non tenere gli stessi gruppi di pesci.
- Acclimatazione individuale
- Configurazione della camera: fissare lo sfondo in feltro beige (neutro) all'esterno di entrambi i compartimenti scelti e immergere un serbatoio di banchi vivi in entrambi i compartimenti scelti, come nell'acclimatazione di gruppo (Figura 1B, E).
- Posizionare un singolo pesce zebra nella camera di partenza centrale per 2 minuti con le porte scorrevoli chiuse e, dopo il periodo di 2 minuti, aprire entrambe le porte contemporaneamente.
- Assicurati che ogni pesce nuoti dalla camera centrale attraverso una porta per un totale di 10 volte, indipendentemente da quale lato. Premia il pesce ogni volta che entra in una delle camere laterali (1 giorno di acclimatazione individuale).
NOTA: se un pesce non è in grado di completare questo compito 10 volte entro un periodo di 30 minuti o si rifiuta di lasciare la camera di partenza, escluderlo dallo studio.
- Acquisizione dati: registra il numero di volte in cui il pesce nuota su entrambi i lati e il tempo totale necessario per completare l'attività.
- Configurazione della camera: fissare lo sfondo in feltro beige (neutro) all'esterno di entrambi i compartimenti scelti e immergere un serbatoio di banchi vivi in entrambi i compartimenti scelti, come nell'acclimatazione di gruppo (Figura 1B, E).
- Acquisizione
NOTA: dopo l'acclimatazione, zebrafish ha iniziato un'attività di acquisizione di 3 giorni.- Configurazione della camera: collegare un pezzo di feltro bianco all'esterno di un compartimento di scelta e un pezzo di feltro nero all'esterno dell'altro scomparto di scelta (Figura 1C, F).
NOTA: alternare il colore di sfondo di ciascun lato ogni giorno utilizzando una pianificazione pseudocasuale37.- Per tutta la durata di questa fase di addestramento, posiziona una secca-ricompensa posizionata solo in uno dei compartimenti scelti; questo diventa il lato premiato.
- Per iniziare l'acquisizione, posizionare un singolo pesce sperimentale nella camera di partenza per un periodo di 2 minuti con i compartimenti scelti chiusi.
- Dopo l'acclimatazione di 2 minuti, apri contemporaneamente entrambe le porte, dando accesso a entrambi i compartimenti scelti, e avvia il cronometro per valutare la latenza di scelta.
- Utilizzando un design distorto, assegna in modo casuale al pesce una preferenza in bianco o nero (ad esempio, W + / B - o B + / W-), il che significa che la secca è posizionata nel compartimento di scelta nero (B +) o bianco (W +).
- Denotare la risposta della scelta
- Una volta che il pesce fa una scelta entrando in uno degli scomparti laterali, ferma il timer.
- Se il pesce sceglie correttamente il lato preferito, chiudere immediatamente la porta tra la camera centrale e quel lato per limitare il pesce al lato preferito per 1 minuto e consentirne la ricompensa interagendo con la vasca della secca (Figura 1C, F). Segna questa prova come "C" per "Corretto" (premiato).
- Se il pesce nuota attraverso la porta errata, trasferiscilo di nuovo nella camera centrale, chiudi entrambe le porte e segna la prova come "I" per "scorretto" (non ricompensato).
- Se il pesce non prende una decisione entro 2 minuti dall'apertura delle porte, sposta il pesce sul lato corretto per 1 minuto e segna la prova come "M" per "marcato" (ricompensato con la forza).
- Quando si trasferisce / sposta il pesce nella camera di partenza, guidare delicatamente il pesce nella camera centrale usando una rete da pesca come strumento di pastorizia.
NOTA: non estrarre il pesce dall'acqua e sostituirlo nella camera di partenza in quanto ciò potrebbe influire sul test comportamentale. - Una volta che il pesce ritorna nella camera centrale, attendere 1 minuto prima di eseguire nuovamente l'attività. Assicurati che ogni pesce esegua l'attività 8 volte.
- Acquisizione dati
- Per ogni pesce sperimentale, registrare il tempo alla prima decisione (o latenza di scelta) e i singoli punteggi (C, I o M) per ciascuno degli 8 studi di acquisizione (sezione 3.4.2) in ordine.
- Riportare i risultati di questi esperimenti sono stati riportati come medie di gruppo per ogni prova in ogni giorno di acquisizione.
- Una volta che un pesce ha completato una prova, classificalo come un pesce "ad alte prestazioni" o un pesce "a basse prestazioni".
NOTA: Un pesce è stato considerato "ad alte prestazioni" se ha scelto con successo il lato corretto del serbatoio in almeno 6 delle 8 prove totali per il giorno. Qualsiasi pesce che non soddisfa questo criterio è un "basso esecutore". - Una volta identificato, ospita separatamente pesci ad alte prestazioni e a basso rendimento.
- Classificare il pesce come "alto" o "basso" in ciascuno dei tre giorni di acquisizione, dopo che un pesce ha completato le prove.
NOTA: Alla fine del terzo giorno di acquisizione, i pesci rimangono come performer "alti" o "bassi" per tutta la durata dello studio.
NOTA: alcuni pesci che inizialmente erano nel gruppo "a basso rendimento" imparano il compito il giorno di acquisizione 2 o 3. Quando ciò accade, il pesce iniziale "a basse prestazioni" può essere spostato nel gruppo "ad alte prestazioni". Non spostare il pesce tra i gruppi in questo modo dopo il giorno 3 (la fine dell'acquisizione).
- Configurazione della camera: collegare un pezzo di feltro bianco all'esterno di un compartimento di scelta e un pezzo di feltro nero all'esterno dell'altro scomparto di scelta (Figura 1C, F).
4. Trattamento sperimentale
- Dopo il periodo di acquisizione, quando i pesci dimostrano la capacità di risolvere un semplice compito di discriminazione tra lo sfondo bianco e nero, iniziano il regime di trattamento per il pesce zebra sperimentale.
NOTA: per mostrare l'applicabilità di questo metodo, questo studio mostra due progetti sperimentali:- Studio longitudinale
- Restituire il pesce sperimentale ai loro serbatoi di detenzione per 8 settimane. Mantieni il pesce in vasche standard con cambi d'acqua giornalieri e nutrili due volte al giorno.
NOTA: non condurre alcun allenamento comportamentale durante queste 8 settimane nei serbatoi di detenzione. - Eseguire la valutazione dell'inversione dopo questo periodo per valutare se il pesce zebra può risolvere il compito di inversione dopo 8 settimane senza allenamento.
- Restituire il pesce sperimentale ai loro serbatoi di detenzione per 8 settimane. Mantieni il pesce in vasche standard con cambi d'acqua giornalieri e nutrili due volte al giorno.
- Iperglicemia: Esporre i gruppi sperimentali all'acqua (controllo dello stress da manipolazione), mannitolo (1%-3%, controllo osmotico) o glucosio (1%-3%) per 4 o 8 settimane22,23.
NOTA: non condurre alcun allenamento comportamentale durante queste 4 o 8 settimane.
- Studio longitudinale
5. Inversione
NOTA: A seguito di manipolazione sperimentale (come nella sezione 4.2), i pesci vengono testati nella parte finale del paradigma di scelta a 3 camere: l'inversione. Per fare questo, il lato ricompensato è invertito (rispetto all'acquisizione) in modo tale che i pesci precedentemente premiati con un branco sul lato bianco sono ora ricompensati con un branco sul lato nero e viceversa. In questo modo, l'inversione valuta se i pesci hanno imparato dove si trova la ricompensa (secca), indipendentemente dal colore dello sfondo.
- Configurazione della camera
- Attaccare il feltro nero all'esterno di una delle camere scelte e il feltro bianco all'esterno dell'altra, assicurandosi che i lati in bianco e nero siano gli stessi lati delle prove di acquisizione (sezione 3.4).
- Immergere il serbatoio della secca nell'angolo posteriore del lato che è l'opposto della camera di scelta precedentemente premiata (Figura 1D, G).
NOTA: In altre parole, i pesci precedentemente premiati sul lato bianco sono ora premiati sul lato nero e viceversa. - Testare il pesce singolarmente come al punto 3.5. Inizia posizionando un singolo pesce sperimentale nella camera di partenza per un periodo di 2 minuti e chiudi l'accesso ai compartimenti scelti.
- Aprire contemporaneamente entrambi i lati della camera.
NOTA: Completare un totale di 8 prove al giorno per tre giorni consecutivi di trattamento.
- Denotare la risposta della scelta
- Se il pesce sceglie correttamente il colore preferito, chiudere immediatamente la porta della camera centrale per 1 minuto, consentendo al pesce di interagire con la ricompensa della secca. Segna questa prova come "C" per "Corretto" (premiato).
- Se il pesce nuota attraverso la porta sbagliata, trasferiscilo di nuovo nella camera centrale, chiudi entrambe le porte e segna questa prova come "I" per "scorretto" (non ricompensato).
- Se il pesce non prende una decisione entro 2 minuti dall'apertura delle porte, sposta il pesce sul lato corretto e segna la prova come "M" per "marcato" (ricompensato con la forza).
- Acquisizione dati
- Per ogni pesce zebra sperimentale, registrare la latenza di scelta e i singoli punteggi (C, I, M), in ordine, per ogni prova.
- Riporta i risultati di questi esperimenti come medie di gruppo per ogni blocco di due prove in ciascuno dei 3 giorni di inversione.
- Tenere separati i dati per i pesci ad alte e basse prestazioni per determinare se mostrano lo stesso livello di prestazioni durante l'inversione come durante l'acquisizione.
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Representative Results
L'acclimatazione alla camera comportamentale comporta tre giorni di allenamento: 2 giorni di acclimatazione di gruppo seguiti da 1 giorno di acclimatazione individuale. Tuttavia, poiché non siamo riusciti a distinguere i singoli pesci zebra l'uno dall'altro, siamo stati in grado di raccogliere dati solo durante l'acclimatazione individuale. A quel tempo, gli animali da esperimento (n = 30), condizionati usando una ricompensa basata sulla secca, impiegavano una media di 125,11 s per raggiungere la loro prima decisione (Figura 2A) e una media di 725,34 s (12 min) per completare l'intero compito di acclimatazione individuale (Figura 2B). Non c'è stata alcuna preferenza laterale significativa durante l'acclimatazione (Figura 2C). Il numero di pesci esclusi era minimo rispetto ad altri tipi di ricompensa (cibo) che avevamo precedentemente valutato nel nostro laboratorio (Figura 2C).
Dopo l'acclimatazione, il pesce zebra ha iniziato la fase di acquisizione. Poiché i pesci sono stati testati individualmente, abbiamo raccolto dati da ciascun pesce in ciascuno dei tre giorni di acquisizione. I pesci sono stati classificati come "ad alte o basse prestazioni", con "ad alte prestazioni" che rispondono più velocemente e in modo più accurato, nonostante tutti i pesci abbiano la stessa precedente esposizione alla camera di prova. Solo i pesci che hanno selezionato il compartimento di scelta premiato in almeno 6 delle 8 prove sono stati classificati come "ad alte prestazioni". I pesci che non soddisfacevano questo criterio erano "a basso rendimento". I pesci ad alte e basse prestazioni sono stati alloggiati separatamente per distinguere le loro prestazioni in tutte le prove successive. È interessante notare che abbiamo osservato che alcuni pesci hanno cambiato categoria (cioè, inizialmente erano "a basso rendimento", ma sono diventati "ad alto rendimento") durante il corso dell'acquisizione. In effetti, il numero di animali ad alte prestazioni aumentava ogni giorno, con pesci più performanti il giorno di acquisizione 3 rispetto al giorno 1 (Figura 3A). Al giorno 3, >50% dei pesci era diventato "ad alte prestazioni". Inoltre, la latenza di scelta iniziale per tutti i pesci nei tre giorni di acquisizione (A1-A3) è diminuita, indicando un miglioramento delle prestazioni con ogni giorno di acquisizione (Figura 3B). La stessa tendenza è stata osservata anche quando è stato considerato solo il gruppo di pesci ad alte prestazioni: entro il giorno 3, il tempo per la prima decisione è migliorato (è diventato più veloce) (Figura 3C).
Un rapporto di discriminazione (prove premiate / (ricompensa + prove non premiate) è stato calcolato per ciascun blocco di prova di acquisizione (media di due prove / pesce) nei tre giorni di acquisizione (A1-A3) per tutti gli animali da esperimento (n = 30) per determinare con quale precisione il pesce stava risolvendo (acquisendo) il compito di discriminazione (cioè, andando al lato premiato del serbatoio). Questo rapporto ha rivelato che la percentuale di pesci che si spostano verso il lato premiato durante ogni prova è aumentata quotidianamente (cioè attraverso i blocchi di prova in ogni singolo giorno) e complessivamente (cioè nei tre giorni di acquisizione) con il risultato che tutti i pesci si sono esibiti al di sopra della possibilità entro la fine dell'acquisizione (linea tratteggiata rappresentata sul grafico; (Figura 4A) e indicando che il pesce aveva imparato il compito di discriminazione.
A seguito dell'acquisizione dell'apprendimento della discriminazione, abbiamo testato per quanto tempo il pesce zebra avrebbe ricordato il compito. Per fare ciò, il pesce zebra testato è rimasto in vasche di detenzione per 8 settimane. Dopo questo tempo, i pesci sono stati testati su un compito di inversione che è durato 3 giorni (R1-R3). Abbiamo scoperto che i pesci hanno dimostrato un forte comportamento di inversione e una maggiore discriminazione nei tre giorni di inversione (Figura 4B), indicando che sono stati in grado di (1) ricordare la relazione tra il colore del serbatoio e la ricompensa e (2) inibire ciò che avevano precedentemente appreso durante l'acquisizione e apprendere il paradigma di inversione / opposto. Come mostrato nella Figura 4B,il pesce zebra inizialmente è andato sul lato non ricompensato del serbatoio, come indicato dal rapporto di discriminazione inferiore al caso durante i percorsi iniziali il giorno di inversione 1. Tuttavia, alla fine di R1, le prestazioni sono aumentate a più del caso, un risultato che è stato mantenuto su R2 e R3, con i punteggi più alti del rapporto di discriminazione osservati su R3. Presi insieme, questi dati mostrano che gli animali da esperimento ingenui sono in grado di risolvere il compito di discriminazione, anche se il comportamento iniziale è stato acquisito 8 settimane prima, senza alcun addestramento aggiuntivo tra le sessioni comportamentali.
Il paradigma di scelta a 3 camere può essere applicato anche all'esame delle complicanze della malattia. Nel nostro studio con zebrafish iperglicemico, l'acclimatazione e l'acquisizione erano come descritto, e l'inversione è stata testata dopo 4 o 8 settimane di iperglicemia. L'iperglicemia è stata indotta con un protocollo di immersione alternativo (McCarthy et al., 2020 - questo problema), in modo che l'allenamento avvenisse a giorni alterni, giorni dopo che il pesce zebra era stato in soluzioni di prova per 24 ore. Durante l'acquisizione, c'è stato un effetto principale della giornata di formazione sul rapporto di discriminazione (F (2, 239) = 4.457, p = 0.012; Figura 5A), con il rapporto su A1 significativamente inferiore a quello su A3 (p = 0,010), indicando che i pesci hanno migliorato la loro precisione di scelta nel tempo. Durante l'inversione, c'è stato un significativo effetto principale del trattamento (F (2, 326) = 3.057, p = 0.048), ma nessun altro effetto o interazione principale significativa (giorno di allenamento: (F (2, 326) = 1.602, p = 0.203); giorno di allenamento x trattamento: (F (4, 326) = 0.661, p = 0.620); Figura 5A). La risposta degli animali trattati con glucosio è stata significativamente ridotta rispetto agli animali trattati con acqua (p = 0,037), ma non ci sono state altre differenze significative (controllo v. mannitolo: p = 0,387; mannitolo v. glucosio: p = 0,524), suggerendo un effetto glucosio-specifico. Dopo 8 settimane di iperglicemia, non sono state osservate differenze statistiche nei rapporti di discriminazione tra la formazione all'acquisizione (F (2.263) = 2.909, p = 0.056; Figura 5B). Tuttavia, ci sono stati effetti principali significativi sia del giorno di allenamento (F (2, 189) = 4,721, p = 0,010) che del trattamento (F (2, 189) = 7,940, p = 0,000) sull'inversione, ma nessuna interazione significativa (giorno di allenamento * trattamento = F (4, 189) = 0,869, p = 0,484). Successivi confronti a coppie con differenza minima significativa (LSD) hanno identificato differenze significative tra R1 e R3 (p = 0,022) e tra R2 e R3 (p = 0,003). I confronti a coppie di LSD hanno anche rivelato differenze significative tra il gruppo di trattamento delle acque e i gruppi di trattamento del glucosio e del mannitolo (acqua v. mannitolo: p = 0,008; acqua v. glucosio: 0,000); tuttavia, i gruppi glucosio e mannitolo non erano significativamente diversi l'uno dall'altro (p = 0,265), suggerendo che queste differenze nel rapporto di discriminazione possono essere dovute a effetti osmotici.
Figura 1: Camera di prova a scelta a tre camere e configurazione del comportamento. (A) Schema a 3 camere. Gli animali da esperimento sono stati limitati alla camera di partenza centrale per 2 minuti e poi hanno permesso l'accesso a entrambi i lati del serbatoio all'inizio di una prova. Per fare ciò, la metà superiore di ciascuna delle due partizioni è stata sollevata per creare uno spazio di 10 cm per i pesci da attraversare in entrambi i compartimenti di scelta. (B,E) L'acclimatazione è stata eseguita utilizzando uno sfondo beige e un branco di conspecifici come ricompensa. (C,F) L'acquisizione è stata eseguita utilizzando sfondi in bianco e nero sulle camere di scelta; la ricompensa si trovava solo su un lato della camera. (G) L'inversione è stata eseguita utilizzando sfondi bianchi e neri sui compartimenti scelti; la ricompensa era disponibile solo sul lato opposto della camera (rispetto all'acquisizione). (H) Immagine ravvicinata del serbatoio della secca immerso in uno dei compartimenti scelti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Latenza e numero di prove marcate durante l'acclimatazione individuale. (A) Latenza di scelta della prima decisione. (B) La quantità totale di tempo per completare l'acclimatazione individuale. (C) Il numero di voci sul lato sinistro e destro non è diverso, indicando nessuna preferenza laterale intrinseca prima dell'inizio dell'acquisizione. Riportiamo anche il numero totale di prove di marcatura durante l'acclimatazione individuale. I valori sono riportati come ± SEM. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: La percentuale di pesci ad alte prestazioni e la latenza di scelta iniziale tra tutti i pesci e i pesci ad alte prestazioni nei tre giorni di acquisizione. (A) I pesci ad alte prestazioni si sono spostati dalla camera centrale al lato premiato della camera in almeno 6 prove su 8 ogni giorno di acquisizione (A1-A3). (B) Durante tre giorni di formazione sull'acquisizione (A1-A3), la latenza complessiva della scelta iniziale è diminuita; una tendenza evidente anche nei pesci ad alte prestazioni (C). I valori sono riportati come ± SEM. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Prestazioni di discriminazione durante le prove di acquisizione e inversione. (A) Rapporto di discriminazione (prove premiate / (ricompensa + prove non premiate) dei pesci nei giorni di acquisizione (A1-A3) e (B) durante l'apprendimento di inversione 8 settimane dopo. Anche l'inversione è stata valutata per 3 giorni (R1-R3). Per entrambi i compiti, ogni pesce ha dovuto completare 8 prove e i risultati sono presentati in due blocchi di prova (2, 4, 6, 8). Le risposte corrette durante l'acquisizione e l'inversione sono aumentate con il tempo, con una risposta più rapida osservata durante l'inversione, indicando che il pesce ha imparato e ricordato il compito. I valori sono riportati come ± SEM. La linea tratteggiata rappresenta il caso. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Acquisizione e inversione di pesci zebra iperglicemici utilizzando il compito comportamentale di scelta a 3 camere. (A) Prima del trattamento, il pesce zebra naïve ha acquisito il compito comportamentale di scelta a 3 camere in tre giorni di allenamento comportamentale (acquisizione, A1-A3). C'era una differenza significativa tra i rapporti di discriminazione su A1 e A3 che indicavano che l'apprendimento ha avuto luogo (p = 0,012). Dopo 4 settimane di trattamento (simboli colorati) c'è stato un effetto significativo del trattamento (p = 0,048), con animali trattati con glucosio che hanno mostrato rapporti di discriminazione significativamente ridotti rispetto agli animali trattati con acqua (p = 0,037). (B) In un esperimento separato, è stato valutato il comportamento prima e dopo 8 settimane di iperglicemia. Nonostante il costante aumento delle prestazioni in ogni giorno di acquisizione, non ci sono state differenze significative nel rapporto di discriminazione tra A1 e A3. Tuttavia, dopo 8 settimane di trattamento (simboli colorati), c'è stato un effetto principale del trattamento (p < 0,001) e un effetto principale individuale del giorno di allenamento (p = 0,010). Le analisi post-hoc hanno rivelato una differenza significativa tra il gruppo trattato con acqua e i gruppi trattati con mannitolo e glucosio, suggerendo un effetto osmotico (acqua v. mannitolo: p = 0,008; acqua v. glucosio: p < 0,001). * denota un effetto principale significativo. I punti dati rappresentano la media di gruppo ± SEM e i punti dati con lettere diverse sono significativamente diversi l'uno dall'altro. La linea tratteggiata rappresenta il caso. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Sebbene ci sia stata un'enorme crescita della quantità e della varietà della ricerca neuroscientifica eseguita utilizzando il pesce zebra negli ultimi 15 anni24,mancano saggi comportamentali in questa specie rispetto ai sistemi modello di mammiferi11,25,26. Qui, mostriamo che un compito di scelta a tre camere sviluppato per l'uso con i roditori può essere adattato per valutare l'acquisizione e l'inversione di un apprendimento di discriminazione visiva nel pesce zebra. Usando una secca viva come ricompensa, questo compito ha fornito un test robusto che può essere applicato a una varietà di studi che esaminano malattie legate al comportamento come le complicanze iperglicemiche del diabete, dell'Alzheimer e della demenza.
È stato precedentemente stabilito che i pesci zebra sono in grado di apprendere e memorizzare informazioni in quanto sono necessarie per prendere decisioni ecologicamente rilevanti e necessarie per la sopravvivenza in natura3. I nostri dati di acquisizione e inversione in uno studio longitudinale di 8 settimane supportano prove preliminari che i pesci zebra, sebbene piccoli, sono in grado di apprendere e ricordare un semplice compito di discriminazione e che il pesce zebra può anche inibire le risposte acquisite in precedenza. Nello studio longitudinale di 8 settimane, il numero di ricompense forzate è diminuito e il rapporto di discriminazione è aumentato, indicando che i pesci migliorano nella scelta del lato corretto e ricompensato e hanno imparato il compito. Sebbene questi cambiamenti non fossero significativi, abbiamo visto una tendenza generale al ribasso nel numero di studi premiati con la forza durante l'acquisizione e un aumento del rapporto di discriminazione. Inoltre, i risultati del compito comportamentale di scelta a tre camere con pesci iperglicemici hanno rivelato l'applicabilità del test agli studi che esaminano le condizioni iperglicemiche e indicano che questo paradigma potrebbe essere utilizzato in combinazione con altre manipolazioni sperimentali, come esposizioni a farmaci o linee mutanti, per valutare i potenziali effetti sulla cognizione.
Un importante limite di questo studio è che non possiamo identificare i singoli pesci nel tempo e quindi dobbiamo fare affidamento sulle medie di gruppo per valutare i dati. Lo sviluppo di un modo per tracciare individualmente i pesci nei diversi gruppi di trattamento, come nei roditori, potrebbe affrontare questi problemi. Nel tentativo di risolvere queste differenze, abbiamo ordinato i pesci durante la fase di acquisizione in base alle loro prestazioni, che si sono rivelate un vantaggio inaspettato della nostra metodologia. I "pesci ad alte prestazioni" hanno ottenuto ≥ 6/8 in ogni giorno di allenamento, mentre i pesci con punteggi più bassi erano "pesci a basso rendimento". Se contato ogni giorno, il numero di "high performer" è aumentato nel gruppo premiato dalla secca in modo che entro il giorno 3, c'erano significativamente più pesci in questa categoria rispetto al trattamento ricompensato con i pesci. Le tendenze della latenza di scelta osservate in tutti i pesci ("high + low performers") sono simili a quelle osservate solo nel gruppo "high performing", suggerendo che le forti risposte di questo gruppo stavano guidando le risposte complessive.
In sintesi, questi risultati indicano che l'apprendimento della discriminazione basata sulla secca nel pesce zebra fornisce un modello fattibile ed economico per lo studio del funzionamento cognitivo normale e compromesso.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo Sabrina Jones per la sua assistenza nell'adattare un paradigma di scelta a tre camere dei roditori al modello di zebrafish e Jeremy Popowitz e Allison Murk per il loro aiuto nei giorni di raccolta del comportamento, l'assistenza con le prove in esecuzione, la cura degli animali e l'allestimento del serbatoio. Un ringraziamento speciale anche a James M. Forbes (Ingegnere Meccanico) per la sua assistenza nella progettazione e costruzione del serbatoio a 3 camere.
Finanziamento: VPC e TLD hanno ricevuto una sovvenzione congiunta di supporto alla ricerca della facoltà (FRSG) dall'American University College of Arts and Sciences. CJR ha ricevuto il supporto dell'American University College of Arts and Sciences Graduate Student Support.
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