Behavior

המשימה ההתנהגותית של בחירה תלת-תאית באמצעות דג זברה כמערכת מודל

Published: April 14, 2021 doi: 10.3791/61934

Cassie J. Rowe^1,2, Mikayla Crowley-Perry^1,3, Elizabeth McCarthy¹, Terry L. Davidson^2,4, Victoria P. Connaughton^1,2

¹Department of Biology, American University, ²Center for Behavioral Neuroscience, American University, ³Department of Chemistry, American University, ⁴Department of Neuroscience, American University

Summary

אנו מציגים תא התנהגותי שנועד להעריך את הביצועים הקוגניטיביים. אנו מספקים נתונים המראים כי לאחר שנרכשו, דגי זברה זוכרים את המשימה 8 שבועות לאחר מכן. אנו גם מראים כי דגי זברה היפרגליקמיים שינו את הביצועים הקוגניטיביים, מה שמצביע על כך שפרדיגמה זו חלה על מחקרים המעריכים קוגניציה וזיכרון.

Abstract

מחלות ניווניות הן תלויות גיל, מתישות וחשוכות מרפא. דיווחים אחרונים יש גם בקורלציה היפרגליקמיה עם שינויים בזיכרון ו/או פגיעה קוגניטיבית. שינינו ופיתחנו משימה קוגניטיבית של בחירה תלת-תאית דומה לזו ששימשה עם מכרסמים לשימוש עם דגי זברה היפרגליקמיים. תא הבדיקה מורכב מתא התחלה במיקום מרכזי ושני תאי בחירה משני הצדדים, עם להקת קונסולים המשמשת כפרס. אנו מספקים נתונים המראים כי לאחר שנרכשו, דגי זברה זוכרים את המשימה לפחות 8 שבועות לאחר מכן. הנתונים שלנו מצביעים על כך שדגי זברה מגיבים בחוזקה לתגמול זה, וזיהינו ליקויים קוגניטיביים בדגים היפרגליקמיים לאחר 4 שבועות של טיפול. בדיקת התנהגות זו עשויה להיות ישימה גם למחקרים אחרים הקשורים לקוגניציה וזיכרון.

Introduction

מחלות ניווניות הן תלויות גיל, מתישות וחשוכות מרפא. מחלות אלה גדלות בשכיחות, וכתוצאה מכך צורך דחוף לשפר ולפתח אסטרטגיות טיפוליות חדשות. הפעלה והצגה של כל מחלה היא ייחודית, שכן חלק משפיעים על אזורים של שפה, מוטורית ואוטונומית במוח, בעוד שאחרים גורמים לגירעונות למידה ואובדן זיכרון¹. בעיקר, ליקויים קוגניטיביים ו /או ליקוי הם הסיבוכים הנפוצים ביותר על פני כל המחלות הנוירודגנרטיביות². בתקווה לשפוך אור על המנגנונים הבסיסיים המעורבים במחלות ניווניות אלה, הועסק השימוש במערכות מודלים רבות ושונות (כולל אורגניזמים חד-תאיים לדרוזופילה לחולייתנים בעלי סדר גבוה יותר כגון מכרסמים ובני אדם); עם זאת, רוב המחלות הנוירודגנרטיביות נשארות חשוכות מרפא.

למידה וזיכרון הם תהליכים שמורים מאוד בקרב אורגניזמים כמו שינויים מתמידים בסביבה דורשים הסתגלות³. ליקוי הן בקוגניציה והן בפלסטיות סינפטית הוכח במספר דגמי מכרסמים. באופן ספציפי, בדיקות התנהגותיות מבוססות היטב להשתמש בלמידה אסוציאטיבית כדי להעריך שינויים קוגניטיביים בעקבות מחלות והפרעות שונות הנגרמות על ידי ליקויים⁴. בנוסף, היפוך אפליה מנוגדת מעריך ליקויים קוגניטיביים מכיוון שהוא כרוך בתפקודי למידה וזיכרון מסדר גבוה יותר, וההיפוך תלוי בעיכוב של אסוציאציה שנלמדה בעבר. משימת הבחירה בת שלושת התאים הנפוצה מרחיבה ליקויים אפשריים במסלולי הלמידה והזיכרון של מערכת העצבים המרכזית^5,⁶. לאחרונה, תחום זה התרחב וכלל מודלים שאינם יונקים, כגון דגיזברה (דניו ריו),שכן מספר פרדיגמות פותחו במשך מגוון גילאים מזחלים למבוגרים^7,^8.

דגי זברה מספקים איזון בין מורכבות ופשטות היתרון להערכת ליקויים קוגניטיביים בטכניקות התנהגותיות. ראשית, דגי זברה מקובלים על סינון התנהגותי בעל תפוקה גבוהה בהתחשב בגודלם הקטן ובאופי הרבייה הפורה שלהם. שנית, דגי זברה מחזיקים במבנה, הפליום לרוחב, אשר מקביל להיפוקמפוס היונקים מכיוון שיש לו סמנים עצביים דומים וסוגי תאים⁷. דגי זברה מסוגלים גם לרכוש ולזכור מידע מרחבי^9, וכמו בני אדם, הם יומי¹⁰. לכן, אין זה מפתיע כי דגי זברה משמשים כמודל למחלות ניווניות בתדירות הולכת וגוברת. עם זאת, היעדר בדיקות התנהגותיות מתאימות הקשה על יישום מודל דגי הזברה להערכות קוגניטיביות. עבודה שפורסמה באמצעות בדיקות התנהגותיות ספציפיות לזברה כוללות משימות למידה אסוציאטיביות¹¹, התנהגות חרדה^12,זיכרון¹³, זיהוי אובייקט^14,והעדפת מקום מותנית¹⁵^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹. למרות שהיו התפתחויות רבות ביחס לבדיקות התנהגותיות של דגי זברה, עמיתים לכמה מבחנים של תפקודים קוגניטיביים במכרסמים טרם פותחו לשימוש עם דג זברה¹⁸.

בהתבסס על מחקרים קודמים מהמעבדה שלנו, דגמנו/פיתחנו משימה קוגניטיבית בדגי זברה המבוססת על משימת הבחירה בת שלושת התאים המשמשת מכרסמים המשתמשים באינטראקציה חברתית כפרס. בנוסף, הרחבנו על היבט הלמידה אסוציאטיבית של המשימה ההתנהגותית ושילבנו היפוך אפליה ניגודיות בתקווה להמשיך ולפתח משימה התנהגותית זו להערכת פגיעה קוגניטיבית. זה איפשר לנו לבחון הן את הרכישה הראשונית של למידת האפליה והן את העיכוב הבא של למידה זו בשלב ההיפוך. במחקר הנוכחי, אנו מדגימים כי הליך זה סיפק שיטה אמינה להערכת התפקוד הקוגניטיבי בדגי זברה לאחר טבילת גלוקוז במשך 4 או 8 שבועות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל ההליכים הניסיוניים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC) באוניברסיטה האמריקאית (פרוטוקול # 1606, 19-02).

1. בעלי חיים

גידול ותחזוקה של בעלי חיים
1. להשיג דגי זברה מסוג בר למבוגרים(דניו rerio) בגילאי 4-11 חודשים כעוברים ולגידול אותם בתוך הבית.
2. שמרו על הדגים במערכת מתלים ימית בגובה 28-29 מעלות צלזיוס על אור של 14 שעות: 10 שעות צילום כהה.
3. להאכיל את הדגים פעמיים ביום עם פתיתים מסחריים להשלים עם ארטמיהחיה .
4. בחר דגים באופן אקראי ממיכלי מלאי אלה לניסויים התנהגותיים.
עם השלמת הניסוי, למרדים את בעלי החיים על ידי טבילה 0.02% tricaine במשך 2 דקות או עד שיש חוסר קואורדינציה מוטורית וקצב נשימה מופחת עבור ניתוחים מולקולריים ו / או נוירוכימיים מאוחרים יותר.

2. תא בדיקה של בחירה תלת-תאית

הערה: טכניקה התנהגותית זו שונתה מרוהל ואח^'20.

בנייה קאמרית
1. שנה את התא ההתנהגותי²⁶- אקווריום 40 ליטר (50 x 30 x 30 ס"מ^3)-כך שיהיה תא מרכזי או התחלתי (10 x 30 x 30 ס"מ^3),מופרד משני תאי בחירה צדדיים (כל אחד 20 x 30 x 30 ס"מ³, איור 1A).
2. לבנות את שלושת התאים באמצעות ערוץ אלומיניום "בצורת U" המודבק על קירות הזכוכית הפנימיים עם איטום אקווריום, כדי להפריד את הטנק לשלושה תאים.
3. בנו מחיצות אטומות, בגובה 10 ס"מ, מתוך יריעת PVC אפורה שמתאימות לערוצי האלומיניום משני הצדדים. הפוך כל מחיצה מתוך 2 חתיכות, כל אחד שווה בגודל: חתיכה תחתונה נייחת רכוב לצמיתות בתוך הטנק וחתיכה עליונה הניתנת להזזה שנעה למעלה ולמטה במסילות האלומיניום.
4. הדבק קליפים גדולים במיוחד של קלסר לחלק העליון של גליונות PVC אפורים כדי לשמש נקודות אחיזה.
5. באמצעות סמן קבוע, לצייר קווים אופקיים קטנים 10 ס"מ מעל צינור PVC אפור דבק בצד החיצוני של המיכל.
  הערה: סימן זה הוא הנקודה שאליה ייפתח גיליון PVC האפור העליון כדי לאפשר גישה לכל צד.
6. הוסף מים בקרה (מערכת) למיכל לרמה של 25 ס"מ מהתחתית לחלק העליון של הטנק, או ~ 30 L. מניח תנורי אקווריום זכוכית לתוך כל קטע של התא במשך 24 שעות לפני הבדיקה כדי להביא את הטמפרטורה ל 28 °C (5 °F).
  הערה: הסר את התנורים בתחילת הפעלת ההתנהגות ובצע החלפת מים מלאה לאחר יומיים של שימוש.
הגדרת אפליה
1. עבור כל משימת אפליה, הניחו בנפרד חלקי לבד צבעוניים (בז', שחור או לבן) בגב החיצוני, בצד ובתחתית של תאי הבחירה באמצעות סקוטש(איור 1B-D).
  הערה: לתא המרכזי לא אמור להיות צבע רקע המשויך אליו.
כפרס, צור קבוצה של קונספיקים (להקה) על ידי הצבת 4 דגי זברה בוגרים, שאחרת לא ישמשו במחקר, במיכל קטן וברור בפינה האחורית הרחוקה של כל תא בחירה (איור 1B–D).
הערה: בחר דגי להקה באופן אקראי ממיכלי מלאי מדי יום, עם לפחות זכר אחד ונקבה אחת באותו גיל וגודל כמו הדג הניסיוני בכל מיכל להקה.

3. משימות התנהגותיות

התאקלות
הערה: התאקלמות לחדר ההתנהגות מורכבת משלושה ימי אימון; יומיים של התאקלות קבוצתית ואחריו יום אחד של אימונים אישיים.
התאקלמה קבוצתית
1. חברו את הרקע הנוצץ (הניטרלי) לחלק החיצוני של שני תאי הבחירה, והטביעו מיכל להקה חי בכל אחד מתאי הבחירה(איור 1B).
2. הוסיפו 5-6 דגי זברה לתא ההתחלה המרכזי כששתי דלתות ההזזה פתוחות, ואפשרו לדגים לשוטט בחופשיות במשך 30 דקות.
  הערה: דגי הזברה הניסיוניים אמורים להיות מסוגלים לקיים אינטראקציה ולרועע עם דגי הלהקה האלה דרך המיכל כפרס לאחר שחצו לתא בחירה במהלך הסתגלות. דג נחשב כמי שנכנס לאחד התאים הצדדיים כאשר כל גופו נכנס לתא.
3. חזור על הליך זה עם אותו דג ניסיוני ליום שני (2 ימים של התאקלמה קבוצתית).
  הערה: אין לשמור את אותן קבוצות דגים.
התאקלמה אישית
1. התקנה קאמרית: חברו את הרקע המצומצם בצבע בז' (ניטרלי) לחלק החיצוני של שני תאי הבחירה, והטביעו מיכל להקה חי בשני תאי הבחירה, כמו בהתאקלמות קבוצתית(איור 1B,E).
  1. מניחים דג זברה בודד בחדר ההתחלה המרכזי למשך 2 דקות כאשר דלתות ההזזה סגורות, ולאחר 2 דקות, פתחו את שתי הדלתות בו זמנית.
  2. ודא כי כל דג שוחה מהתא המרכזי דרך דלת בסך הכל 10 פעמים, ללא קשר לאיזה צד. לתגמל את הדג בכל פעם שהוא נכנס לאחד התאים הצדדיים (1 יום של התאקלמות אישית).
    הערה: אם דג אינו מסוגל להשלים משימה זו 10 פעמים בתוך תקופה של 30 דקות או מסרב לעזוב את חדר ההתחלה בכלל, להוציא אותו מהמחקר.
2. רכישת נתונים: תעד את מספר הפעמים שהדגים שוחים לשני הצדדים ואת הזמן הכולל שלוקח להשלים את המשימה.
רכישה
הערה: לאחר הסתגלות, דגי זברה החלו במשימת רכישה של 3 ימים.
1. התקנה קאמרית: חברו חתיכת לבד לבן לחלק החיצוני של תא בחירה אחד וחתיכה שחורה בצד החיצוני של תא הבחירה האחר(איור 1C,F).
  הערה: החליפו את צבע הרקע של כל צד מדי יום באמצעות לוח זמנים פסאודו-אדום³⁷.
  1. למשך שלב זה של ההכשרה, הניחו תגמול להקות רק באחד מתאי הבחירה; זה הופך להיות הצד המתוגמל.
  2. כדי להתחיל ברכישה, הניחו דג ניסיוני אחד בתא ההתחלה לתקופה של 2 דקות כאשר תאי הבחירה סגורים.
  3. לאחר ההסתגלות של 2 דקות, פתחו בו זמנית את שתי הדלתות, העניקו גישה לשני תאי הבחירה, והפעלו את שעון העצר כדי להעריך את השהיית הבחירה.
  4. באמצעות עיצוב מוטה, הקצה באופן אקראי את הדגים להעדפה בשחור או בלבן (כלומר, W+/B- או B+/W-), כלומר הלהקה ממוקמת בתא הבחירה השחור (B+) או הלבן (W+).
2. ציון תגובת הבחירה
  1. ברגע שהדגים בוחרים על ידי כניסה לאחד התאים הצדדיים, עצרו את מד הזמן.
  2. אם הדג בוחר נכון את הצד המועדף, סגור מיד את הדלת בין התא המרכזי לצד זה כדי להגביל את הדג לצד המועדף למשך דקה אחת, ולאפשר לו להיות מתוגמל על ידי אינטראקציה עם מיכלהלהקה (איור 1C, F). ציון משפט זה כ- "C" עבור "נכון" (מתוגמל).
  3. אם הדג שוחה דרך הדלת השגויה, העבר אותו בחזרה לתא המרכזי, סגור את שתי הדלתות והבקיע את המשפט כ"אני "על "לא נכון" (לא מתוגמל).
  4. אם הדג לא מקבל החלטה תוך 2 דקות לאחר פתיחת הדלתות, הזז את הדג לצד הנכון למשך דקה אחת, והבקיע את המשפט כ- "M" עבור "מסומן" (תגמול בכוח).
  5. בעת העברה/ הזזת דגים בחזרה לתא ההתחלה, מנחים בעדינות את הדגים לתוך התא המרכזי באמצעות רשת דגים ככלי רעייה.
    הערה: אין לגרוף את הדגים מהמים ולהחליף אותו בתא ההתחלה מכיוון שהדבר עלול להשפיע על ההסתה ההתנהגותית.
  6. ברגע שהדגים חוזרים לתא המרכזי, המתינו דקה אחת לפני ביצוע המשימה שוב. ודא שכל דג מבצע את המשימה 8 פעמים.
3. רכישת נתונים
  1. עבור כל דג ניסיוני, תעד את הזמן להחלטה ראשונה (או השהיית בחירה) ואת הציונים הבודדים (C, I או M) עבור כל אחד מ-8 ניסויי הרכישה (סעיף 3.4.2) לפי הסדר.
  2. דווח על התוצאות עבור ניסויים אלה דווחו כממוצעים קבוצתיים עבור כל ניסוי בכל יום רכישה.
  3. לאחר שדג השלים ניסוי, לסווג אותו כדג "בעל ביצועים גבוהים" או כדג "בעל ביצועים נמוכים".
    הערה: דג נחשב "ביצועים גבוהים" אם הוא הצליח בחר את הצד הנכון של הטנק לפחות 6 מתוך 8 הניסויים הכוללים ליום. כל דג שאינו עומד בקריטריון זה הוא "שחקן נמוך".
  4. לאחר זיהוי, בית ביצועים גבוהים וביצועים נמוכים דגים בנפרד.
  5. לסווג את הדגים כמבצעים "גבוהים" או "נמוכים" בכל אחד משלושת ימי הרכישה, לאחר שדג השלים את הניסויים.
    הערה: בסוף היום השלישי של הרכישה, דגים נשארים כמבצעים "גבוהים" או "נמוכים" למשך המחקר.
    הערה: כמה דגים שהיו בתחילה בקבוצה 'ביצועים נמוכים' ללמוד את המשימה ביום הרכישה 2 או 3. כאשר זה קורה, הדגים הראשוניים 'בעלי ביצועים נמוכים' עשויים להיות מועברים לקבוצה 'בעל ביצועים גבוהים'. אין להזיז את הדגים בין קבוצות באופן זה לאחר יום 3 (סוף הרכישה).

4. טיפול ניסיוני

לאחר תקופת הרכישה, כאשר הדגים מדגימים את היכולת לפתור משימת אפליה פשוטה בין הרקע השחור ללבן, התחל את משטר הטיפול בדגי הזברה הניסיוניים.
הערה: כדי להראות את הישימות של שיטה זו, מחקר זה מראה שני עיצובים ניסיוניים:
1. מחקר אורך
  1. החזירו את הדגים הניסיוניים למיכלי המעצר שלהם למשך 8 שבועות. לשמור על הדגים במיכלים סטנדרטיים עם שינויי מים יומיים, ולהאכיל אותם פעמיים ביום.
    הערה: אין לבצע כל אימון התנהגותי במהלך 8 שבועות אלה במיכלי ההחזקה.
  2. בצע הערכה הפוכה לאחר תקופה זו כדי להעריך אם דג הזברה יכול לפתור את משימת ההיפוך לאחר 8 שבועות ללא הכשרה.
2. היפרגליקמיה: לחשוף את קבוצות הניסוי למים (טיפול בבקרת מתח), מניטול (1%-3%, שליטה אוסמוטית), או גלוקוז (1%-3%) במשך 4 או 8 שבועות²²^,²³.
  הערה: אין לבצע כל אימון התנהגותי במהלך 4 או 8 שבועות אלה.

5. היפוך

הערה: לאחר מניפולציה ניסיונית (כמו בסעיף 4.2), הדגים נבדקים בחלק האחרון של פרדיגמת הבחירה בת 3 התאים – היפוך. לשם כך, הצד המתוגמל מתהפך (בהשוואה לרכישה) כך שדגים שזכו בעבר בלהקת להקה בצד הלבן מתוגמלים כעת בלהקת להקה בצד השחור ולהיפך. בדרך זו, היפוך מעריך אם הדגים למדו היכן נמצא הפרס (להקה), ללא קשר לצבע הרקע.

הגדרת תא
1. צרף שחור הרגיש לחלק החיצוני של אחד מתאי הבחירה והלבן הרגיש לחלק החיצוני של השני, לוודא שהצדדים השחורים-לבנים הם אותם צדדים כמו במשפטי הרכישה (סעיף 3.4).
2. הטביעו את מיכל הלהקה בפינה האחורית הרחוקה של הצד ההפוך מתא הבחירה שזכה בעבר(איור 1ד', ז).
  הערה: במילים אחרות, דגים שזכו בעבר בצד הלבן מתוגמלים כעת בצד השחור ולהיפך.
3. בדוק את הדגים בנפרד כמו בסעיף 3.5. התחילו בהצבת דג ניסיוני אחד בתא ההתחלה למשך 2 דקות, וסגור את הגישה לתאי הבחירה.
4. בו זמנית לפתוח את שני צידי התא.
  הערה: השלם בסך הכל 8 ניסויים בכל יום במשך שלושה ימי טיפול רצופים.
ציון תגובת הבחירה
1. אם הדג בוחר נכון את הצבע המועדף, מיד לסגור את הדלת לתא המרכזי במשך 1 דקות, ומאפשר לדגים לקיים אינטראקציה עם גמול הלהקה. ציון משפט זה כ- "C" עבור "נכון" (מתוגמל).
2. אם הדג שוחה דרך הדלת השגויה, העבר אותו בחזרה לחדר המרכזי, סגור את שתי הדלתות והבקיע את המשפט הזה כ"אני "על "לא נכון" (לא מתוגמל).
3. אם הדג לא מקבל החלטה תוך 2 דקות לאחר פתיחת הדלתות, הזז את הדג לצד הנכון, והבקיע את המשפט כ-"M" עבור "מסומן" (מתוגמל בכוח).
רכישת נתונים
1. עבור כל דג זברה ניסיוני, להקליט את השהיית הבחירה ואת הציונים האישיים (C, I, M), לפי הסדר, עבור כל ניסוי.
2. דווח על התוצאות עבור ניסויים אלה כממוצעים קבוצתיים עבור כל בלוק של שני ניסויים בכל אחד מ- 3 ימי ההיפוך.
3. שמור את הנתונים עבור דגים בעלי ביצועים גבוהים ונמוכים בנפרד כדי לקבוע אם הם מציגים את אותה רמת ביצועים במהלך היפוך כפי שעשו במהלך הרכישה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

התאקלמות לחדר ההתנהגות כרוכה בשלושה ימי אימון: יומיים של התאקלמות קבוצתית ואחריה יום אחד של התאקלמות אישית. עם זאת, מכיוון שלא יכולנו להבחין בין דגי זברה בודדים זה לזה, הצלחנו לאסוף נתונים רק במהלך התאקלות אישית. בשלב זה, בעלי חיים ניסיוניים (n = 30), המותנים באמצעות תגמול מבוסס להקה, נדרשו בממוצע 125.11 s כדי להגיע להחלטה הראשונה שלהם (איור 2A) וממוצע של 725.34 s (12 דקות) כדי להשלים את משימת ההתאקלמות האישית כולה (איור 2B). לא הייתה העדפת צד משמעותית במהלך ההתאקלמות(איור 2C). מספר הדגים המוחרגים היה מינימלי בהשוואה לסוגי תגמול אחרים (מזון) שהערכנו בעבר במעבדה שלנו(איור 2C).

לאחר הסתגלות, דגי זברה החלו בשלב הרכישה. כאשר הדגים נבדקו בנפרד, אספנו נתונים מכל דג בכל אחד משלושת ימי הרכישה. הדגים סווגו כ"שחקנים גבוהים או נמוכים", כאשר "שחקנים גבוהים" הגיבו מהר יותר ומדויק יותר, למרות שלכל הדגים הייתה אותה חשיפה קודמת לתא הבדיקות. רק דגים שבחרו את תא הבחירה המתוגמל בלפחות 6 מתוך 8 הניסויים סווגו כ"שחקנים גבוהים". דגים שלא עמדו בקריטריון זה היו "שחקנים נמוכים". דגים בעלי ביצועים גבוהים ונמוכים שוכנו בנפרד כדי להבחין בביצועיהם בכל הניסויים הבאים. מעניין, ראינו כי כמה דגים השתנו קטגוריה (כלומר, היו בתחילה "שחקנים נמוכים", אבל הפכו "שחקנים גבוהים") במהלך הרכישה. למעשה, מספר בעלי החיים בעלי הביצועים הגבוהים גדל מדי יום, עם ביצועים גבוהים יותר של דגים ביום הרכישה 3 בהשוואה ליום הראשון (איור 3A). ביום השלישי, >50% מהדגים הפכו ל"שחקנים גבוהים". יתר על כן, השהיית הבחירה הראשונית עבור כל הדגים בשלושת ימי הרכישה (A1-A3) ירדה, מה שמצביע על ביצועים משופרים עם כל יום רכישה(איור 3B). אותה מגמה נראתה גם כאשר רק קבוצת הדגים בעלת הביצועים הגבוהים נחשבה: ביום השלישי, הזמן להחלטה ראשונה השתפר (הפך למהיר יותר) (איור 3C).

יחס אפליה (ניסויים מתוגמלים/(פרס + ניסויים לא-רציפים) חושב עבור כל בלוק ניסוי רכישה (ממוצע של שני ניסויים/דגים) בשלושת ימי הרכישה (A1-A3) עבור כל בעלי החיים הניסיוניים (n = 30) כדי לקבוע באיזו מידה הדגים פותרים (רוכשים) את משימת האפליה (כלומר, הולכים לצד המתוגמל של המיכל). יחס זה גילה כי אחוז הדגים העוברים לצד המתוגמל במהלך כל ניסוי גדל מדי יום (כלומר, על פני בלוקי ניסיון בכל יום בנפרד) ובסך הכל (כלומר, בשלושת ימי הרכישה) וכתוצאה מכך כל הדגים מבצעים מעל לכל סיכוי עד סוף הרכישה (קו מנוקד המיוצג בגרף; (איור 4א)ומציין שהדגים למדו את משימת האפליה.

לאחר רכישת למידת האפליה, בדקנו כמה זמן דגי זברה יזכרו את המשימה. כדי לעשות זאת, דגי זברה שנבדקו נשארו במיכלים במשך 8 שבועות. לאחר זמן זה, דגים נבדקו על משימת היפוך שנמשכה 3 ימים (R1–R3). גילינו שהדגים הפגינו התנהגות הפוכה חזקה ואפליה מוגברת בשלושת ימי ההיפוך (איור 4B),מה שמצביע על כך שהם הצליחו (1) לזכור את הקשר בין צבע הטנק לתגמול ו-(2) לעכב את מה שלמדו בעבר במהלך הרכישה וללמוד את הפרדיגמה ההיפוכה/הפוכה. כפי שניתן לראות באיור 4B,דגי הזברה הלכו בתחילה לצד הלא מתוגמל של הטנק, כפי שעולה מיחס האפליה שנמצא מתחת להזדמנות במהלך השבילים הראשונים ביום היפוך 1. עם זאת, עד סוף R1, הביצועים גדלו ליותר מהסיכוי, תוצאה שנשמרה ב- R2 וב- R3, עם ציוני יחס האפליה הגבוהים ביותר שנצפו ב- R3. יחד, נתונים אלה מראים כי בעלי חיים ניסיוניים נאיביים מסוגלים לפתור את משימת האפליה, למרות שההתנהגות הראשונית נרכשה 8 שבועות קודם לכן, ללא כל הכשרה נוספת בין מפגשים התנהגותיים.

פרדיגמת הבחירה בת 3 התאים יכולה להיות מיושמת גם לבדיקת סיבוכים במחלה. במחקר שלנו עם דגי זברה היפרגליקמיים, התאקלמות ורכישה היו כמתואר, והיפוך נבדק לאחר 4 או 8 שבועות של היפרגליקמיה. היפרגליקמיה הושרה עם פרוטוקול טבילה חלופי (מקארתי ואח ', 2020 - בעיה זו), כך האימון התרחש כל יומיים, בימים לאחר דגי זברה היה בפתרונות בדיקה במשך 24 שעות. במהלך הרכישה, הייתה השפעה עיקרית של יום האימונים על יחס האפליה (F (2, 239) = 4.457, p = 0.012; איור 5A, כאשר היחס ב-A1 נמוך משמעותית מאשר ב-A3 (p = 0.010), מה שמצביע על כך שהדגים שיפרו את דיוק הבחירה שלהם לאורך זמן. במהלך היפוך, הייתה השפעה עיקרית משמעותית של טיפול (F (2, 326) = 3.057, p = 0.048), אך לא היו השפעות עיקריות או אינטראקציות משמעותיות אחרות (יום אימון: (F (2, 326) = 1.602, p = 0.203); יום אימון x טיפול: (F (4, 326) = 0.661, p = 0.620); איור 5א). התגובה של בעלי חיים שטופלו בגלוקוז צומצמה באופן משמעותי בהשוואה לבעלי החיים שטופלו במים (p = 0.037), אך לא היו הבדלים משמעותיים אחרים (בקרה נגד מניטול: p = 0.387; מניטול v. גלוקוז: p = 0.524), מה שמרמז על אפקט ספציפי לגלוקוז. לאחר 8 שבועות של היפרגליקמיה, לא צוינו הבדלים סטטיסטיים ביחסי אפליה על פני אימוני רכישה (F (2,263) = 2.909, p = 0.056; איור 5ב. עם זאת, היו השפעות עיקריות משמעותיות של יום האימונים (F (2, 189) = 4.721, p = 0.010) וטיפול (F (F (2, 189) = 7.940, p = 0.000) על היפוך, אך ללא אינטראקציה משמעותית (יום אימון * טיפול = F (4, 189) = 0.869, p = 0.484). השוואות ההפרשים הפחות משמעותיות (LSD) זיהו הבדלים משמעותיים בין R1 ל- R3 (p = 0.022) ובין R2 ל- R3 (p = 0.003). השוואות זוג LSD גם חשפו הבדלים משמעותיים בין קבוצת הטיפול במים לבין קבוצות טיפול גלוקוז ומניטול (מים v. מניטול: p = 0.008; מים v. גלוקוז: 0.000); עם זאת, קבוצות הגלוקוז והמניטול לא היו שונות באופן משמעותי זו מזו (p = 0.265), דבר המצביע על כך שההבדלים האלה ביחס האפליה עשויים להיות בגלל השפעות אוסמוטיות.

איור 1: תא בדיקה של שלושה תאים והגדרת התנהגות. (א) סכמטי תלת-תאי. בעלי חיים ניסיוניים הוגבלו לתא ההתחלה המרכזי למשך 2 דקות ואז אפשרו גישה לשני צדי המיכל בתחילת ניסוי. כדי לעשות זאת, החצי העליון של כל אחת משתי המחיצות הועלו כדי ליצור מרחב של 10 ס"מ לדגים לחצות לתוך תא בחירה. (ב,ה) ההתאקלמות בוצעה באמצעות רקע בז' ולהקת חסרונות כפרס. (ג, ו) הרכישה בוצעה באמצעות רקעים בשחור לבן בתאי הבחירה; הפרס היה ממוקם רק בצד אחד של החדר. (ז) היפוך בוצע באמצעות רקעים בשחור לבן בתאי הבחירה; הפרס היה זמין רק בצד הנגדי של החדר (לעומת רכישה). (ח) תמונה מקרוב של מיכל להקה שקוע באחד מתאי הבחירה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: השהיה ומספר ניסויים מסומנים במהלך התאקלות אישית. (א) השהיית בחירה של החלטה ראשונה. (ב) משך הזמן הכולל להשלמת התאקלמות אישית. (ג) מספר הערכים בצד שמאל וימין אינם שונים, מה שמצביע על העדפת צד אינהרנטית לפני תחילת הרכישה. אנו מדווחים גם על המספר הכולל של ניסויי סימן במהלך התאקלמה אישית. ערכים מדווחים כ- Mean ± SEM. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: אחוז הדגים בעלי הביצועים הגבוהים וההשהיה הראשונית בין כל הדגים והדגים בעלי הביצועים הגבוהים בשלושת ימי הרכישה. (א) דגים בעלי ביצועים גבוהים עברו מהתא המרכזי לצד המתוגמל של התא בלפחות 6 מתוך 8 ניסויים בכל יום רכישה (A1-A3). (ב) במהלך שלושה ימים של הכשרת רכש (A1-A3), ההשהיה הראשונית הכוללת ירדה; מגמה ניכרת גם בדגים בעלי ביצועים גבוהים (C). ערכים מדווחים כ- Mean ± SEM. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: ביצועי אפליה במהלך ניסויי רכישה והיפוך. (א) יחס אפליה (ניסויים מתוגמלים/(תגמול + ניסויים לא סחיר) של דגים לאורך ימי הרכישה (A1-A3) ו-(B) במהלך למידה הפוכה 8 שבועות לאחר מכן. היפוך הוערך גם במשך 3 ימים (R1–R3). בשתי המשימות, כל דג היה צריך להשלים 8 ניסויים, והתוצאות מוצגות בשני בלוקים של שני ניסויים (2, 4, 6, 8). תגובות נכונות במהלך הרכישה וההיפוך גדלו עם הזמן, עם תגובה מהירה יותר שנצפתה במהלך היפוך, מה שמצביע על הדגים למדו ונזכרו במשימה. ערכים מדווחים כ- SEM ± ממוצע. הקו המקווקו מייצג סיכוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: רכישה והיפוך של דגי זברה היפרגליקמיים באמצעות המשימה ההתנהגותית של בחירה תלת-תאית. (א) לפני הטיפול, דגי זברה נאיביים רכשו את המשימה ההתנהגותית של בחירה תלת-תאית על פני שלושה ימים של אימון התנהגותי (רכישה, A1–A3). היה הבדל משמעותי בין יחסי אפליה ב- A1 ו- A3 המצביעים על למידה שהתרחשה (p = 0.012). לאחר 4 שבועות של טיפול (סמלים צבעוניים) הייתה השפעה משמעותית של טיפול (p = 0.048), עם בעלי חיים שטופלו בגלוקוז והפגינו יחסי אפליה מופחתים באופן משמעותי בהשוואה לבעלי חיים שטופלו במים (p = 0.037). (ב) בניסוי נפרד, התנהגות לפני ואחרי 8 שבועות של היפרגליקמיה הוערכה. למרות העלייה המתמדת בביצועים בכל יום רכישה, לא היו הבדלים משמעותיים ביחס האפליה בין A1-A3. עם זאת, לאחר 8 שבועות של טיפול (סמלים צבעוניים), הייתה השפעה עיקרית של טיפול (p < 0.001) והשפעה עיקרית אישית של יום האימון (p = 0.010). ניתוחים שלאחר ההוקי חשפו הבדל משמעותי בין הקבוצה שטופלו במים לבין קבוצות שטופלו במניטול ובגלוקוז, דבר המצביע על אפקט אוסמוטי (מים v. mannitol: p = 0.008; מים v. גלוקוז: p < 0.001). * מציין השפעה עיקרית משמעותית. נקודות נתונים מייצגות קבוצה פירושה ± SEM, ונקודות נתונים עם אותיות שונות שונות באופן משמעותי זו מזו. הקו המקווקו מייצג סיכוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

למרות שחלה צמיחה עצומה בכמות ובמגוון המחקרים במדעי המוח שבוצעו באמצעות דגי זברה ב -15 השנים האחרונות²⁴, התקפות התנהגותיות חסרות במין זה בהשוואה למערכות מודל יונקים¹¹^,²⁵^,²⁶. כאן, אנו מראים כי משימת בחירה של שלושה תאים שפותחה לשימוש עם מכרסמים יכולה להיות מותאמת כדי להעריך את הרכישה וההיפוך של למידה אפליה חזותית בדגי זברה. באמצעות להקה חיה כפרס, משימה זו סיפקה בדיקה חזקה שניתן ליישם על מגוון מחקרים הבוחנים מחלות הקשורות התנהגותית כגון סיבוכים היפרגליקמיים של סוכרת, אלצהיימר ודמנציה.

בעבר נקבע כי דגי זברה מסוגלים ללמוד ולאחסן מידע כפי שהוא נדרש לקבל החלטות רלוונטיות אקולוגית הכרחי להישרדות בטבע³. נתוני הרכישה וההיפוך שלנו על פני מחקר אורך של 8 שבועות תומכים בראיות מוקדמות לכך שדגי זברה, בעודם קטנים, מסוגלים ללמוד ולזכור משימת אפליה פשוטה, וכי דגי זברה יכולים גם לעכב תגובות שנרכשו בעבר. במחקר האורך שנמשך 8 שבועות, מספר התגמולים הכפויים ירד, ויחס האפליה גדל, מה שמצביע על כך שהדגים משתפרים בבחירת הצד הנכון והמתוגמל ולמדו את המשימה. בעוד ששינויים אלה לא היו משמעותיים, ראינו מגמת ירידה כוללת במספר הניסויים המתוגמלים בכוח במהלך הרכישה ועלייה ביחס האפליה. יתר על כן, התוצאות של המשימה ההתנהגותית של בחירה תלת-תאית עם דגים היפרגליקמיים חשפו את תחולת הבדיקה למחקרים הבוחנים תנאים היפרגליקמיים ומצביעות על כך שניתן להשתמש בפרדיגמה זו בשילוב עם מניפולציות ניסיוניות אחרות, כגון חשיפות לסמים או קווים מוטנטיים, כדי להעריך השפעות פוטנציאליות על קוגניציה.

מגבלה חשובה של מחקר זה היא כי אנחנו לא יכולים לזהות דגים בודדים לאורך זמן ולכן חייב להסתמך על ממוצעים קבוצתיים כדי להעריך את הנתונים. פיתוח דרך לעקוב אחר דגים בנפרד בקבוצות הטיפול השונות, כמו במכרסמים, יכול לטפל בבעיות אלה. בניסיון לפתור את ההבדלים הללו, מיינו את הדגים במהלך שלב הרכישה בהתבסס על הביצועים שלהם, מה שהתברר כיתרון בלתי צפוי של המתודולוגיה שלנו. 'דגים בעלי ביצועים גבוהים' קיבלו ציון ≥ 6/8 בכל יום של אימון, בעוד דגים עם ציונים נמוכים יותר היו 'דגים בעלי ביצועים נמוכים'. כאשר נספרים בכל יום, מספר 'מבצעים גבוהים' גדל בקבוצה המתוגמלת על ידי הלהקה, כך שבסופו של יום 3, היו הרבה יותר דגים בקטגוריה זו בהשוואה לטיפול המתוגמל בדגים. מגמות השהיית בחירה שנצפו בכל הדגים ('גבוהים + בעלי ביצועים נמוכים') דומות לאלה שנצפו רק בקבוצת 'ביצועים גבוהים', דבר המצביע על כך שהתגובות החזקות של קבוצה זו הניבו תגובות כלליות.

לסיכום, ממצאים אלה מצביעים על כך שלמידת אפליה מבוססת להקה בדגי זברה מספקת מודל משתיל לחקר תפקוד קוגניטיבי תקין ופגום.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

אנו מודים לסברינה ג'ונס על עזרתה בהתאמת פרדיגמת בחירה תלת-תאית של מכרסם לדוגמנית דגי הזברה ולג'רמי פופוביץ ואליסון מורק על עזרתם בימי איסוף התנהגות, סיוע בניסויי ריצה, טיפול בבעלי חיים והגדרת טנקים. תודה מיוחדת גם לג'יימס מ. פורבס (מהנדס מכונות) על עזרתו בתכנון ובנייה של טנק בחירה תלת-תאית.

מימון: VPC ו-TLD קיבלו מענק תמיכה מחקרי בפקולטה (FRSG) מהמכללה האמריקאית לאמנויות ולמדעים. CJR קיבל תמיכה מהקולג' האמריקאי לאמנויות ומדעים תמיכה בסטודנטים לתארים מתקדמים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Champion Sports Stopwatch Timer Set: Waterproof, Handheld Digital Clock Sport Stopwatches with Large Display for Kids or Coach - Bright Colored 6 Pack	Amazon	N/A	https://www.amazon.com/Champion-Sports-910SET-Stopwatch-Timer/dp/B001CD9LJK/ref=sr_1_17?dchild=1&keywords=stopwatch+for+sports&qid=1597081570&sr=8-17 Recommend two of different colors; one for choice latency and one for time to completion
Coofficer Extra Large Binder Clips 2-Inch (24 Pack), Big Paper Clamps for Office Supplies, Black	Amazon	N/A	https://www.amazon.com/Coofficer-Binder-2-Inch-Clamps-Supplies/dp/B07C94YCR5/ref=sr_1_3_sspa?dchild=1&keywords=large+binder+clips&qid=1597081521&sr=8-3-spons&psc=1&spLa=ZW5jcnlwdGVkUXVhbGlmaWVyPUExUENWUTRZVjlIWEVPJmVuY3J5cHRlZElkPUEwNDQ5NDU0MlpSREkwTFlLSThVQiZlbmNyeXB0ZWRBZElkPUEwMTg5NDI3MllRV1EzOUdWTVpSOCZ3aWRnZXROYW1lPXNwX2F0ZiZhY3Rpb249Y2xpY2tSZWRpcmVjdCZkb05vdExvZ0NsaWNrPXRydWU=
Marineland® Silicone Aquarium Sealant	Petsmart	Item #2431002
PVC (Polyvinyl Chloride) Sheet, Opaque Gray, Standard Tolerance, UL 94/ASTM D1784, 0.125" Thickness, 12" Width, 24" Length	Amazon	N/A	https://www.amazon.com/Polyvinyl-Chloride-Standard-Tolerance-Thickness/dp/B000MAMGEQ/ref=sr_1_2?dchild=1&keywords=grey+PVC+sheet&qid=1597081440&sr=8-2
Steelworks 1/4-in W x 8-ft L Mill Finished Aluminum Weldable Trim U-shaped Channel	Lowes	Item #55979Model #11377	https://www.lowes.com/pd/Steelworks-1-4-in-W-x-8-ft-L-Mill-Finished-Aluminum-Weldable-Trim-Channel/3058181
Tetra 10 Gallon Fish tank	Petsmart	Item #5271256
Top Fin Fine Mesh Fish Net (3 in)	Petsmart	Item #5175115

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

Gitler, A. D., Dhillon, P., Shorter, J. Neurodegenerative disease: models, mechanisms, and a new hope. Disease Models & Mechanisms. 10, 499-502 (2017).
Perry, R. J., Watson, P., Hodges, J. R. The nature and staging of attention dysfunction in early (minimal and mild) Alzheimer's disease: relationship to episodic and semantic memory impairment. Neuropsychologia. 38, 252-271 (2000).
Gerlai, R. Learning and memory in zebrafish (Danio rerio). Methods in Cell Biology. 134, Elsevier Ltd. (2016).
Davidson, T. L., et al. The effects of a high-energy diet on hippocampal-dependent discrimination performance and blood-brain barrier integrity differ for diet-induced obese and diet-resistant rats. Physiology and Behavior. 107, 26-33 (2012).
Yang, M., Silverman, J. L., Crawley, J. N. Automated three-chambered social approach task for mice. Current Protocols in Neuroscience. 56 (1), (2011).
Remmelink, E., Smit, A. B., Verhage, M., Loos, M. Measuring discrimination- and reversal learning in mouse models within 4 days and without prior food deprivation. Learning and Memory. 23, 660-667 (2016).
Salas, C., et al. Neuropsychology of learning and memory in teleost fish. Zebrafish. 3, 157-171 (2006).
Kalueff, A. V., et al. Towards a comprehensive catalog of zebrafish behavior 1.0 and beyond. Zebrafish. 10, 70-86 (2013).
Luchiaria, A. C., Salajanb, D. C., Gerlai, R. Acute and chronic alcohol administration: Effects on performance of zebrafish in a latent learning task. Behavior Brain Research. 282, 76-83 (2015).
Fadool, J., Dowling, J. Zebrafish: A model system for the study of eye genetics. Progress in Retinal and Eye Research. 27, 89-110 (2008).
Fernandes, Y. M., Rampersad, M., Luchiari, A. C., Gerlai, R. Associative learning in the multichamber tank: A new learning paradigm for zebrafish. Behavioural Brain Research. 312, 279-284 (2016).
Reider, M., Connaughton, V. P. Developmental exposure to methimazole increases anxiety behavior in zebrafish. Behavioral Neuroscience. , (2015).
Capiotti, K. M., et al. Hyperglycemia induces memory impairment linked to increased acetylcholinesterase activity in zebrafish (Danio rerio). Behavioural Brain Research. 274, 319-325 (2014).
May, Z., et al. Object recognition memory in zebrafish. Behavioural Brain Research. 296, 199-210 (2016).
Mathur, P., Lau, B., Guo, S. Conditioned place preference behavior in zebrafish. Nature Protocols. 6, 338-345 (2011).
Guo, S. Linking genes to brain, behavior and neurological diseases: What can we learn from zebrafish. Genes, Brain and Behavior. 3, 63-74 (2004).
Kily, L. J. M., et al. Gene expression changes in a zebrafish model of drug dependency suggest conservation of neuro-adaptation pathways. Journal of Experimental Biology. 211, 1623-1634 (2008).
Webb, K. J., et al. Zebrafish reward mutants reveal novel transcripts mediating the behavioral effects of amphetamine. Genome Biology. 10, (2009).
Clayman, C. L., Malloy, E. J., Kearns, D. N., Connaughton, V. P. Differential behavioral effects of ethanol pre-exposure in male and female zebrafish (Danio rerio). Behavioural Brain Research. 335, 174-184 (2017).
Ruhl, T., et al. Acute administration of THC impairs spatial but not associative memory function in zebrafish. Psychopharmacology. 231, 3829-3842 (2014).
Gellermann, L. W. Chance orders of alternating stimuli in visual discrimination experiments. The Pedagogical Seminary and Journal of Genetic Psychology. 42, 206-208 (1933).
Gleeson, M., Connaughton, V., Arneson, L. S. Induction of hyperglycaemia in zebrafish (Danio rerio) leads to morphological changes in the retina. Acta Diabetologica. 44, 157-163 (2007).
Connaughton, V. P., Baker, C., Fonde, L., Gerardi, E., Slack, C. Alternate immersion in an external glucose solution differentially affects blood sugar values in older versus younger zebrafish adults. Zebrafish. 13, 87-94 (2016).
Goldsmith, J. R., Jobin, C. Think small: Zebrafish as a model system of human pathology. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 817341 (2012).
Kalueff, A. V., Stewart, A. M., Gerlai, R., Court, P. Zebrafish as an emerging model for studying complex brain disorders. Trends in Pharmacological Sciences. 35, 63-75 (2014).
Gerlai, R. Associative learning in zebrafish (Danio rerio). Methods in cell biology. 101, 249-270 (2011).

Behavior

המשימה ההתנהגותית של בחירה תלת-תאית באמצעות דג זברה כמערכת מודל

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.