Summary
Målet med denne protokol er at give en detaljeret, trin-for-trin guide til samling af multi-gen konstruktioner ved hjælp af modulopbygget kloning system baseret på Golden Gate kloning. Den giver også anbefalinger til kritiske skridt for at sikre optimal montage baseret på vores erfaringer.
Abstract
Golden Gate-kloningsmetoden muliggør hurtig samling af flere gener i ethvert brugerdefineret arrangement. Det bruger type IIS-begrænsningsenzymer, der skærer uden for deres genkendelsessteder og skaber et kort udhæng. Dette modulopbyggede kloningssystem (MoClo) bruger en hierarkisk arbejdsgang, hvor forskellige DNA-dele, såsom promotorer, kodningssekvenser (CDS) og terminatorer, først klones til en indgangsvektor. Flere indgangsvektorer samles derefter i transskriberingsenheder. Flere transskriptionsenheder opretter derefter forbindelse til et multi-gen plasmid. Golden Gate kloning strategi er af enorm fordel, fordi det giver ar-mindre, retningsbestemt, og modulopbygget samling i en one-pot reaktion. Den hierarkiske arbejdsgang muliggør typisk facile kloning af en lang række multigenkonstruktioner uden behov for sekventering ud over indgangsvektorer. Brugen af fluorescerende proteinudfald gør det nemt at screene visuelt. Dette arbejde giver en detaljeret, trin-for-trin protokol til samling af multi-gen plasmider ved hjælp af gær modulopbygget kloning (MoClo) kit. Vi viser optimale og suboptimale resultater af multi-gen plasmid samling og giver en guide til screening for kolonier. Denne kloningsstrategi gælder i høj grad for metabolisk gærteknik og andre situationer, hvor multigenplasmidkloning er påkrævet.
Introduction
Syntetisk biologi har til formål at konstruere biologiske systemer med nye funktionaliteter, der er nyttige for farmaceutiske, landbrugs- og kemiske industrier. At samle et stort antal DNA-fragmenter på en høj gennemstrømningshastighed er en grundlæggende teknologi i syntetisk biologi. En sådan kompliceret proces kan opdeles i flere niveauer med faldende kompleksitet, et koncept lånt fra grundlæggende ingeniørvidenskab1,2. I syntetisk biologi samles DNA-fragmenter normalt hierarkisk baseret på funktionalitet: (i) Delniveau: "dele" refererer til DNA-fragmenter med en bestemt funktion, såsom en promotor, en kodningssekvens, en terminator, en oprindelse af replikation; ii) Transskriptionsenheder (TU): en TU består af en promotor, en kodningssekvens og en terminator, der er i stand til at transskribere et enkelt gen iii) Multigenniveau: Et multigenplasmid indeholder flere TU'er, der ofte består af en hel metabolisk vej. Denne hierarkiske samling banebrydende af BioBrick samfund er det grundlæggende koncept for samling af store sæt af DNA'er i syntetisk biologi3.
I det seneste årti4,5,6,7har Golden Gate-kloningsteknikken i høj grad lettet hierarkisk DNA-samling2. Mange andre multi-del kloning metoder, såsom Gibson kloning8, ligation-uafhængig kloning (SLIC)9, uracil excision-baseret kloning (USER)10, ligase cykling reaktion (LCR)11, og in vivo rekombination (DNA Assembler)12,13, er også blevet udviklet hidtil. Men Golden Gate kloning er en ideel DNA-samling metode, fordi det er uafhængig af gen-specifikke sekvenser, så ar-mindre, retningsbestemt, og modulopbygget samling i en one-pot reaktion. Golden Gate kloning drager fordel af type IIS-begrænsningsenzymer, der genkender en ikke-palindromisk sekvens for at skabe forskudte udhæng uden for anerkendelsesstedet2. En ligase slutter sig derefter til de udglødede DNA-fragmenter for at opnå en samling i flere dele. Anvendelse af denne kloningsstrategi på det modulære kloningssystem (MoClo) har gjort det muligt at samle op til 10 DNA-fragmenter med over 90% transformanter screenet, der indeholder den korrekt samlede konstruktion4.
MoClo-systemet tilbyder enorme fordele, der har fremskyndet design-build-testcyklussen for syntetisk biologi. For det første gør de udskiftelige dele det muligt for kombinatorisk kloning hurtigt at teste et stort rum af parametre. For eksempel kræver optimering af en metabolisk vej normalt cykling gennem mange initiativtagere for hvert gen for at afbalancere stien flux. MoClo-systemet kan nemt håndtere sådanne krævende kloningsopgaver. For det andet er man nødt til at sekvensere den del plasmid, men typisk ikke TU eller multi-gen plasmider. I de fleste tilfælde er screening ved koloni PCR eller begrænsning fordøjelse tilstrækkelig til verifikation på TU og multi-gen plasmid niveau. Dette skyldes, at kloning af del plasmid er det eneste skridt, der kræver PCR, som ofte introducerer mutationer. For det tredje er MoClo-systemet ideelt til opbygning af multigenkomplekse metaboliske veje. Endelig, på grund af den universelle udhæng, kan den del plasmids genbruges og deles med hele bioengineering samfund. I øjeblikket MoClo kits er tilgængelige for planter14,15,5,16,17, svampe6,18,19,20,21,22, bakterier7,23,24,25,26,27, og dyr28,29. En multi-kongerige MoClo platform er også blevet indført for nylig30.
For Saccharomyces cerevisiae, Lee et al.6 har udviklet en alsidig MoClo værktøjskasse, en glimrende ressource for gær syntetisk biologi samfund. Dette sæt leveres i et praktisk 96-brønds format og definerer otte typer udskiftelige DNA-dele med en forskelligartet samling af velkaraktererede promotorer, fluorescerende proteiner, terminatorer, peptidmærker, markeringsmarkører, replikations oprindelse og genomredigeringsværktøjer. Denne værktøjskasse gør det muligt at samle op til fem transskriberingsenheder i et multigenplasmid. Disse funktioner er værdifulde for gær metabolisk teknik, hvor delvis eller hele veje er over-udtrykt til at producere målrettede kemikalier. Ved hjælp af dette kit, forskere har optimeret produktionen af geraniol, linalool31, penicillin32, muconic syre33, indigo34, og betalain35 i gær.
Her leverer vi en detaljeret, trin-for-trin protokol til at guide brugen af MoClo værktøjskassen til at generere multi-gen veje til enten episomal eller genomisk udtryk. Gennem omfattende brug af dette sæt har vi fundet ud af, at nøjagtig måling af DNA-koncentrationer er nøglen til at sikre equimolarfordelingen af hver del i Golden Gate-reaktionen. Vi anbefaler også T4 DNA ligase over T7 DNA ligase, fordi førstnævnte fungerer bedre med et større antal udhæng36. Endelig skal alle interne anerkendelsessteder for BsmBI og BsaI fjernes eller tæmmes inden montering. Alternativt kan man overveje at syntetisere dele for at fjerne flere interne websteder og for at opnå samtidig codon-optimering. Vi demonstrerer, hvordan man bruger dette værktøjssæt ved at udtrykke en fem-gen vej til β-caroten og lycopen produktion i S. cerevisiae. Vi viser endvidere, hvordan man slår ADE2-locus ud ved hjælp af genomredigeringsværktøjerne fra dette sæt. Disse farvebaserede eksperimenter blev valgt for nem visualisering. Vi demonstrerer også, hvordan man genererer fusionsproteiner og skaber aminosyremutationer ved hjælp af Golden Gate-kloning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Den hierarkiske kloningsprotokol, der tilbydes i dette værktøjssæt, kan opdeles i tre hovedtrin: 1. Kloning af delplasmider; 2. Kloning af transskriptionsenheder 3. Kloning af plasmider med flere gener (figur 1). Denne protokol starter fra primer design og slutter med anvendelser af den klonede multi-gen plasmid.
1. Primer design til kloning af del plasmid (pYTK001):
- Design de forreste og omvendte primere, der indeholder flankerende nukleotider TTT ved 5' enden, et BsmBI-genkendelsessted med et ekstra nukleotid (CGTCTCN), et 4-nukleotider (nt) udhæng (TCGG), der supplerer indgangsvektorens (TCGG) ud over indgangsvektoren et BsaI-genkendelsessted med en ekstra nukleotid (GGTCTCN) og et 4-nt delspecifikt udhæng ud over den skabelonspecifikke sekvens (Figur 2A). GoldenBraid 4,037 og GoldenMutagenesis38 er nogle af de online software, der kan bruges til Golden Gate specifikke primer design.
- Hvis BsaI- eller BsmBI-genkendelsessteder er til stede i nogen del, skal du bruge et domesticeringstrin til at mutere disse websteder før Golden Gate-samling39. For integrative plasmider (se trin 4), domesticere enhver NotI anerkendelse site. For at tæmme en del med et uønsket anerkendelsessted skal delen opdeles i to underdele nær det uønskede sted (figur 2A):
- Design den forreste primer af den første subpart på samme måde som i trin 1.1. men design den omvendte primer med BsmBI site og en 4-nt gen-specifikke udhæng alene.
- Design den anden sub-del fremad primer med BsmBI site og 4-nt gen-specifikke udhæng kun, der overlapper med den omvendte primer af den første del. Design den omvendte primer for den anden del på samme måde som i trin 1.1.
- Indfør de ønskede mutationer i enten det modsatte (for trin 1.2.1) eller fremad primer (trin 1.2.2) i den genspecifikke region primeren.
BEMÆRK: Alternativt kan en BsmBI- og BsaI-fri og codon-optimeret del syntetiseres kommercielt. Til kodningssekvenser (CDS) kan en synonym mutation let indarbejdes ved den tredje nukleotid af en aminosyrekodon. For initiativtagere og terminatorer anbefales det dog at kontrollere den muterede promotor- eller terminatoraktivitet ved hjælp af en reporteranalyse39. Hvis der er et uønsket begrænsningssted mod slutningen af sekvensen, kan det muteres ved hjælp af en længere omvendt primer. Hvis flere uønskede steder er til stede, site-rettet mutagenesis tillader muterende flere steder kan udføres40.
- Lejlighedsvis er det ønskeligt at smelte to proteiner som en enkelt del med en linker derimellem (Figur 2A). Linkeren er med til at sikre de to individuelle proteiners strukturelle integritet41.
- Den forreste primer for det første gen er den samme som i trin 1.1. I den omvendte primer, omfatter en BsmBI site, en 4-nt gen-specifikke udhæng, og en linker sekvens. Den 4-nt udhæng kan enten linker eller andet gen første par nukleotider.
- For det andet gen, designe den forreste primer sådan, at det har en BsmBI anerkendelse site og en 4-nt udhæng supplerer den omvendte primer af det første gen. Design den omvendte primer af det andet gen som i trin 1.1.
- For at forstærke delene ved polymerase kædereaktion (PCR)42, skal du bruge en high-fidelity DNA polymerase til at forstærke delene fra enten et genomisk DNA, en cDNA eller et plasmid. Kontroller PCR-produktet på en 1% agarosegel efterfulgt af gelrensning. Brug af renset DNA anbefales kraftigt, hvis gelrensning er besværlig, skal du bruge mindst en spinkolonne til at rense PCR-produktet.
2. Kloning af dele i indgangsvektoren (pYTK001) for at skabe delplasmider (figur 2B)
- For at opsætte Golden Gate-reaktionsblandingen tilsættes 20 fmol af hvert PCR-produkt og indgangsvektoren (pYTK001), 1 μL 10X T4 ligasebuffer, 0,5 μL Esp3I (en meget effektiv isoschizomer af BsmBI) og 0,5 μL T4 ligase. Der tilsættes ddH2O for at bringe det samlede volumen op på 10 μL.
- For at opsætte kloningsreaktionen skal følgende program køres i en termocykel: 25-35 cyklusser på 37 °C i 5 min ( fordøjelse) og 16 °C i 5 min ( ligation), efterfulgt af en endelig fordøjelse ved 50 °C i 10 min. og enzyminaktivering ved 80 °C i 10 min.
BEMÆRK: 35 fordøjelsescyklusser/ligation anbefales ved kloning af flere DNA-stykker i indgangsvektoren samtidig, f.eks. under kloning af fusionsgener eller domesticering af et gen. - Omdan hele reaktionsblandingen til DH5α-stammen eller tilsvarende Escherichia coli kemisk kompetente celler ved varmechok. Det anbefales at omdanne hele det klonede produkt på 10 μL til 35 μL kemisk kompetente E. coli-celler (2 X10 5 cfu/mL, cfu beregnes ved at omdanne 5 ng pYTK001 til 100 μL af de kompetente celler). Spred på en lysogi bouillon (LB) plade med 35 μg/mL chloramphenicol (Cm). Inkuber ved 37 °C natten over.
- Efter 16-18 timer skal du tage pladen ud af inkubatoren og holde pladen ved 4 °C i ca. 5 timer for at lade supermappen grønt fluorescerende protein (sfGFP) udvikle sig til en mere intens grøn farve.
- For lettere screening skal pladen placeres på en ultraviolet (UV) eller en blå lystransilluminator. Den sfGFP indeholder kolonier vil fluorescere under UV-lys.
- De grønne kolonier er negative, fordi de indeholder den uslebne pYTK001. De hvide kolonier er sandsynligvis positive. Kloning er normalt en succes, hvis der er ~ 30-100% hvide kolonier. Udfør yderligere screening af et par hvide kolonier ved enten koloni PCR eller begrænsning fordøjelser (foreslået enzym: BsaI-HFv2).
- Rense plasmider fra et par af de potentielt korrekte kolonier og bekræfte sekvenser af Sanger sekventering.
3. Samling af del plasmider i "kassette" plasmider
BEMÆRK: En kassetteplasmid indeholder en brugerdefineret transskriberingsenhed (TU), der består af en promotor, en CDS og en terminator. En kassetteplasmid giver mulighed for at udtrykke et enkelt gen. Hvis kassetteplasmiderne samles i et multigenplasmid, er det første skridt at bestemme antallet og rækkefølgen af TU'er i multigenplasmid. Disse vil afgøre, hvilke stik der skal bruges i kassetteplasmiderne, da stik forbinder TU'er i multigenplasmid. Den første TU's venstre stik skal være ConLS, og den højre forbindelse til den sidste TU skal være ConRE. De vil overlappe ConLS ' og ConRE 'af multi-gen plasmider. Resten af stikkene skal være i stigende numerisk rækkefølge. Hvis multigenplasmidet f.eks. indeholder fire TU'er, vil forbindelseskombinationerne være ConLS-TU1-ConR1, ConL1-TU2-ConR2, ConL2-TU3-ConR3 og ConL3-TU4-ConRE (Figur 1).
- Før transskriptionsenheder samles, anbefales det at samle en mellemliggende vektor med følgende seks dele: det venstre stik, sfGFP-dropoutet (pYTK047), det rigtige stik, en gærmarkør, en gæroprindelse af replikation og delplasmid med en mRFP1, en E. coli-oprindelse og det ampicillinresistente gen (pYTK083) (Figur 3).
- Rense de ovennævnte seks plasmider. Koncentrationerne registreres ved hjælp af et UV-Vis-spektrofotometer eller en fluorescensbaseret analyse, og hver plasmid fortyndes med ddH2O, således at 1 μL har 20 fmol DNA. Beregn DNA-molarkoncentrationen ved hjælp af en online regnemaskine.
BEMÆRK: Det er meget vigtigt at måle DNA-koncentrationerne nøjagtigt og at pipere præcist, så samlingen fungerer, især for samlinger med fem til syv del plasmider. Små fejl i DNA-koncentrationen af hver plasmid kan forårsage et betydeligt fald i kloningseffektiviteten. - Der tilsættes 1 μL af hver plasmid, 1 μL 10X T4 ligasebuffer, 0,5 μL BsaI-HFv2 (en yderst effektiv version af BsaI) og 0,5 μL T4 ligase. Volumenet fyldes op til 10 μL ved at tilsætte ddH2O.
- For at indstille kloningsreaktionen skal følgende program køres i termocyklen: 25-35 cyklusser på 37 °C i 5 min (fordøjelse) og 16 °C i 5 min ( ligation). Udelad de sidste fordøjelses- og varmeinaktiveringstrin, da BsaI-stederne skal bevares i den mellemliggende vektor (figur 3).
- Omdan hele reaktionsblandingen til DH5α-stammen eller andre E. coli-kompetente celler. Spred på en LB plade med 50 μg/mL carbenicillin (Cb) eller ampicillin. Inkuber ved 37 °C natten over.
BEMÆRK: Carbenicillin er en stabil analog af ampicillin. - Efter 16-18 timer skal du tage pladen ud af inkubatoren. Pladen vil indeholde både lyserøde og lysegrønne kolonier (Figur 6C og 6D). Pladen skal opbevares ved 4 °C i ca. 5 timer for at lade mRFP1 og sfGFP modnes. Brug en UV- eller en blå lystransilluminator til at identificere de grønne kolonier, som indeholder den potentielt korrekte mellemliggende vektor.
- Stribe de grønne kolonier ud på en LB + Cb plade og inkuber ved 37 °C natten over. Den næste dag, stribe ud igen på en LB + Cm plade og inkubere ved 37 °C natten over. Kolonierne, der vokser på LB + Cm plader, indeholder forkert sammensatte plasmider, fordi cm-resistente delvektorer bevares.
- Vælg de kolonier, der ikke vokser på LB + Cm-pladen, og udfør begrænsnings fordøjelser (foreslåede enzymer: BsaI-HFv2, Esp3I) for at bekræfte den korrekt samlede plasmid. Alternativt kan du bruge koloni PCR til screening.
- Rense de ovennævnte seks plasmider. Koncentrationerne registreres ved hjælp af et UV-Vis-spektrofotometer eller en fluorescensbaseret analyse, og hver plasmid fortyndes med ddH2O, således at 1 μL har 20 fmol DNA. Beregn DNA-molarkoncentrationen ved hjælp af en online regnemaskine.
- Når den mellemliggende vektor er blevet samlet med succes, er det næste skridt at samle transskriberingsenheder. Dette er en 4-delt samling med følgende dele: den mellemliggende vektor, en promotor, en CDS og en terminator.
- Rense de fire del plasmider. Registrer deres koncentrationer og fortynd hver af plasmid, således at 1 μL har 20 fmol DNA.
- Følg trin 3.1.2 for at konfigurere reaktionsmikset.
- Følg trin 2.2 for at indstille kloningsreaktionen.
- Hele kloningsreaktionen omdannes til DH5α- eller tilsvarende E. coli-kompetente celler og -plader på LB + Cb. Inkubat ved 37 °C natten over.
- Efter 16-18 timer skal du tage pladen ud fra inkubatoren. Hvide og lysegrønne kolonier vises (Figur 6E og 6F). Opbevar pladen ved 4 °C i ca. 5 timer for at lade sfGFP modnes. Brug en UV eller en blå lys transilluminator til at identificere de ikke-fluorescerende hvide kolonier. Disse indeholder de potentielt korrekte transskriberingsenheder.
- Streak ud og vokse 8-10 hvide kolonier og udføre en koloni PCR. Rense plasmider fra kolonierne, der tester positive fra koloni PCR. Udfør begrænsnings fordøjelse (foreslået enzym: Esp3I) for yderligere at bekræfte samlingen.
BEMÆRK: Sekventering transskribering enheder er typisk ikke nødvendigt, fordi kloning indebærer kun begrænsning fordøjelsen og ligation. Alle sekvenser af interesse er blevet bekræftet på del plasmid niveau.
4. Samling af kassetteplasmider i "multi-gen" plasmider:
BEMÆRK: Multi-gen plasmider tillader ekspression af mere end ét gen. Afhængigt af downstream-applikationen kan multigenplasmider være repliktive eller integrative. Repliktive plasmider har gær oprindelse replikation; derfor kan det holdes stabilt, når gærcelle deler sig. Integrative plasmider har ikke gær oprindelse replikation. I stedet har de 5' og 3' homologiarme, der gør det muligt at integrere flere gener i genomets specifikke loci gennem homolog rekombination.
- For multi-gen plasmider, samle en mellemliggende vektor først.
- Hvis du vil samle replikive mellemliggende vektorer (Figur 4A), skal du samle følgende seks dele: det venstre stik (ConLS'-pYTK008), sfGFP-frafaldet (pYTK047), det højre stik (ConRE'-pYTK072), en markør for gærmarkering, en gær oprindelse replikation, og den del plasmid med mRFP1, en E. coli oprindelse replikation, og kanamycin-resistente gen (pYTK084).
- Til montering skal du følge trinnene fra 3.1.1 til 3.1.3.
- Hele kloningsreaktionsblandingen omdannes til DH5α- eller tilsvarende E. coli-kompetente celler og plade på LB plus 50 μg/mL kanamycin (km). Inkuber ved 37 °C natten over.
- For rød/grøn farvebaseret screening skal du følge trin 3.1.5.
- Til screening af misassemblies, streak og vokse de grønne kolonier på en LB + Km plade. Følg derefter trin 3.1.6.
- For integrative multigenvektorer (Figur 4B) bestemmes først det genomiske locus af interesse, og design derefter ca. 500 basepar på 5' og 3' homologiarme til integration på det pågældende locus.
- Klon de 5' og 3' homologiske arme fra gærgenomisk DNA ind i indgangsvektoren-pYTK001. Følg trin 1 og 2.
- Saml følgende syv plasmider: det venstre stik (ConLS'-pYTK008), sfGFP-dropout (pYTK047), det højre stik (ConRE'-pYTK072), en gærmarkør, 3' homologiarmen, delen plasmid med mRFP1, E. coli oprindelsen af replikationen og det kanamycinresistente gen (pYTK090) og 5' homologiarmen.
- Ved montering og screening skal du følge trin 4.1.1.
- Hvis du vil samle replikive mellemliggende vektorer (Figur 4A), skal du samle følgende seks dele: det venstre stik (ConLS'-pYTK008), sfGFP-frafaldet (pYTK047), det højre stik (ConRE'-pYTK072), en markør for gærmarkering, en gær oprindelse replikation, og den del plasmid med mRFP1, en E. coli oprindelse replikation, og kanamycin-resistente gen (pYTK084).
- Samling af multi-gen plasmid
- Rensning af plasmider af den mellemliggende vektor opnået i trin 4.1 og kassetteplasmiderne fra trin 3. Registrer deres koncentrationer ved hjælp af et UV-Vis-spektrofotometer eller en fluorescensbaseret analyse. Fortynd hver i ddH2O, så 1 μL har 20 fmol DNA.
- Der tilsættes 1 μL mellemvektor, 1 μL af hver transskriberingsenhed, 1 μL 10x T4 ligasebuffer, 0,5 μL Esp3I og 0,5 μL T4 ligase. Volumenet bringes op på 10 μL ved anvendelse af ddH2O.
- Følg trin 2.2 for at indstille kloningsreaktionen.
- Hele kloningsreaktionsblandingen omdannes til DH5α- eller tilsvarende E. coli-kompetente celler og plade på LB + Km. Inkuber ved 37 °C natten over.
- Udfør den grønne/hvide screening som i trin 3.2.5.
- Rense plasmider fra et par hvide kolonier og udføre begrænsning fordøjelser. Det anbefales at anvende NotI-HF-enzymet, fordi der er to NotI-steder ved henholdsvis E. coli-oprindelses- og km-markeringsmarkørdelen (Figur 4B). Hvis den samlede plasmid er meget stor, kan der vælges et andet begrænsningssted til yderligere bekræftelse. Alternativt kan du screene med koloni-PCR, før du fortsætter med at begrænse fordøjelsen.
5. Anvendelse af multigenplasmider til kromosom- eller plasmidbaseret genekspression
- Integrering af multigenplasmid i gærgenomet for kromosomalt genekspression (figur 5)
- Design en guide RNA (gRNA) for den ønskede locus. Det anbefales at bruge flere onlineressourcer,f.eks.
- Klon den syntetiserede 20-nt gRNA i pCAS plasmid45 af Gibson kloning. Linearisere pCAS plasmid af PCR ved hjælp af en omvendt primer par bindende til 3 'af HDV ribozym og 5' af tracrRNA henholdsvis (Figur 5). Alternativt kan du klone gRNA'et i sgRNA dropout plasmid (pYTK050) og samle frafaldsplasmidet i en kassetteplasmid med linkere. Derefter samles Cas9 TU med Cas9 del plasmid (pYTK036). Endelig samles Cas9 TU og sgRNA TU i en replikativ multi-gen plasmid.
- Linearisere 5-15 μg integrativ multigenplasmid med 1 μL NotI-HF-enzym natten over. 1 μg pCAS-gRNA og den lineariserede integrative multigenplasmid omdannes til S. cerevisiae. Forbered kompetente celler ved hjælp af enten en kommercielt tilgængelig gær transformation kit eller efter protokollen af Geitz og Schiestl, 200746.
BEMÆRK: Det er unødvendigt at rense den lineariserede multigenplasmid efter NotI-fordøjelsen. - Pellet cellerne efter genopretning, kassér supernatanten, vask med en lige stor mængde vand. Plade gærceller på den komplette syntetiske medium (CSM) dropout plade eller gær ekstrakt peptone dextrose medium (YPD) plade med antibiotika, afhængigt af gær selektiv markør. Inkuber ved 37 °C i to dage, for at kolonierne kan dannes. Hvis der ikke observeres nogen koloni, inkuberes i yderligere en til to dage ved 30 °C.
- Screen gær kolonier til integration af koloni PCR47.
- For at helbrede pCAS, stribe ud kolonien med den korrekte integration på en ikke-selektiv YPD plade. Vokse ved 30 °C natten over. Streak en koloni fra YPD plade på en frisk YPD plade. Igen vokse ved 30 °C natten over. Streak en koloni fra den anden YPD plade til en YPD plus 100 μg/mL nourseothricin, udvælgelse markør for pCAS. Vellykket hærdning opstår, når gærceller undlader at vokse på den selektive plade.
BEMÆRK: Hvis pCAS plasmid ikke er helbredt i to runder af ikke-selektiv YPD, streak igen på en frisk YPD for en anden 1-2 runder.
- Transformering af replikativ multigenplasmid til plasmidbaseret genekspression
- 100 ng-1 μg ren multigenplasmid omdannes til S. cerevisiae-kompetente celler.
- Pladegærceller umiddelbart efter omdannelse til CSM-frafaldspladen eller YPD plus antibiotikumpladen, afhængigt af den anvendte gærmarkør. Inkuber ved 30 °C i 2-3 dage for kolonier at danne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her resultaterne af fire repliktive multi-gen plasmider til β-caroten (gul) og lycopen (rød) produktion. En integrativ multi-gen plasmid for at forstyrre ADE2 locus blev bygget, hvis kolonier er røde.
Kloning af CDS'er i indgangsvektoren (pYTK001)
ERG20 blev forstærket fra gær genom og de tre carotenoid gener crtE, crtYB, crtI fra plasmid pLM49448 i indrejse vektor pYTK001 som beskrevet. Gær promotorer pENO2, pTIP1, pPYK1 og pPDC1 og terminatorer tTDH2, tHSP26, tADH2, tACS2 blev klonet som en del plasmider. En punktmutation blev introduceret i CrtYB (G247A) til fremstilling af lycopen, og der blev skabt en BTS1-ERG20 fusionskonstruktion for bedre at kanalisere prenylmellemprodukterne til carotenoider. Figur 6A og 6B viser en repræsentativ plade af den vellykkede kloning af en del plasmid og giver et eksempel på den grønne / hvide screening med 90,35 ± 4,22% samlede kolonier er potentielt korrekte (hvid).
Samling af transskriberingsenheder (kassetteplasmider)
Før montering af kassetteplasmid blev designet af multigenplasmid afsluttet. For de fire carotenoider blev fire mellemliggende vektorer med forskellige stik klonet først efter trin 3.1. Figur 6C og 6D viser en repræsentativ plade fra en vellykket samling af den mellemliggende vektor og giver et eksempel på den rød/grønne screening, hvor 17,56 ± 3,32% samlede kolonier er positive (grønne). Selv om dette forhold er relativt lavt, er screeningen i høj grad lettet af den grønne fluorescens.
Dernæst blev TU'erne for BTS1-ERG20, ERG20, crtE, crtYB, crtYB(G247A)og CRTI samlet efter trin 3.2 (tabel 1). Figur 6E og 6F viser en repræsentativ plade af en vellykket samling af TU'er og giver et eksempel på en grøn / hvid screening metode, med 65,02 ± 4,99% samlede kolonier er positive (hvid).
Samling af multi-gen plasmider
Fire repliktive og en integrativ multi-gen plasmider blev samlet. For replikive multigenplasmider blev ERG20, BTS1-ERG20, crtE, crtYB, crtYB (G247A) og crtI samlet i fire forskellige kombinationer, hvilket skabte fire plasmider: to til β-caroten og to til lycopenproduktion(tabel 2). Forholdet mellem potentielt korrekte kolonier (grøn) for den mellemliggende vektorkloning var 1,83 ± 0,15%(Figur 7A og 7B). Selv om dette antal synes lavt, blev screeningen gjort let ved at opdage den grønne fluorescens (Figur 7B). Når den mellemliggende plasmid blev klonet, succesraten for at samle multi-gen plasmider (hvid) fra mellemliggende var 93,77± 1,65% (Figur 7C og 7D). Figur 7E og 7F viser en suboptimal samling af multigenplasmider, da antallet af positive kolonier (hvid) var ubetydeligt. Efter at være omdannet til gær voksede kolonier, der producerede β-caroten (gul) og lycopen (rød) på dag tre. Fire kolonier fra hver plade blev stribet ud på friske plader og dyrket i yderligere to dage. Figur 8A og 8B viser, at sammensmeltningen af BTS1-ERG20 dirigerer mere geranylgeranyl-pyrophosphat mod carotenoidproduktionen, som det ses af mørkere farver end at bruge ERG20 alene. Ved ekstraktion49 og kvantificering af carotenoider ved UV-Vis-spektrofotometri med autentiske standarder det ses, at sammensmeltningen af BTS1-ERG20 fører til produktion af 0,729 μg/mg β-caroten, hvilket er ~35 gange højere end 0,021 μg/mg β-caroten produceret af stammen med ERG20 alene. På samme måde er produktionen af lycopen ~16,5 gange højere i stammen med BTS1-ERG20 (1,126 μg/mg) sammenlignet med ERG20 (0,068 μg/mg) alene (figur 8C).
Repliktive multigenplasmider omdannet til gær med (A) BTS1-ERG20 fusion TU og (B) ERG20 TU. På hver plade har gær på venstre side plasmider, der indeholder crtE TU, crtYB TU og crtI TU til fremstilling af β-caroten og gær på højre side har plasmider indeholdende crtE TU, crtYB (G247A)TU og crtI TU til fremstilling af lycopen.
For den integrative plasmid blev ConLS', sfGFP dropout, ConRE', HIS3 (gærudvælgelsesmarkør), ADE2 5' og 3' homologiarme samlet efter trin 4.1.2. De 5 ' og 3 'homologi arme var 500 bp fra hinanden, slette ~ 180 aminosyrer efter integration. Derudover havde de 5 'homologi arm seks stop codons mod sin 3 'ende. Den muterede ADE2 resulterede i røde kolonier50. ADE2 gRNA 5'-ATTGGGAC GTATGATTGTTGAGG-3'51 blev anvendt og fulgt trin 5.1 for genomisk integration. Efter 3-4 dage blev der observeret røde kolonier på YPD-pladen + 100 μg/mL nourseothricin, hvilket indikerer, at ADE2 var blevet forstyrret med succes (Figur 8D og 8E).
Figur 1: Oversigt over samling af flere gener. Samling finder sted i tre niveauer. In0 niveau 1 forstærkes CDS eller enhver anden del fra genomet eller syntetiseres og klones derefter til pYTK001-indgangsvektoren ved hjælp af BsmBI (eller Esp3I) enzymet. KolE1: E. coli oprindelsen af replikation; CmR: Chloramphenicolresistent gen. På niveau 2 samles transskriberingsenheden (TU), der indeholder en promotor, en CDS og en terminator, ved hjælp af BsaI-enzymet. På niveau 3 samles op til fem transskriptionsenheder i et multigenplasmid ved hjælp af BsmBI (eller Esp3I) enzymet. Multi-gen plasmid kan være enten replikativ eller integrativ. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Primerdesign og kloning af delplasmider. (A) Primer-design til forstærkning af enkelte dele, domesticering af gener eller skabelse af punktmutationer og samling af fusionsproteiner. Primere omfatter BsmBI og BsaI anerkendelse og skære steder og MoClo udhæng for korrekt samling. MoClo udhæng er repræsenteret som 1, 2, 3, 4 og 5, 6, 7, 8. Interne primere til domesticering eller skabelse af fusionsprotein indeholder BsmBI, men ikke BsaI-stederne. Udhængene til disse er tilpassede interne sekvenser (NNNN og N'N'N'N' i lilla). Terminal "ttt" er inkluderet for optimal enzym fordøjelse. Goi: gen af interesse. (B) Kloning forstærkede dele i pYTK001-indgangsvektoren ved hjælp af BsmBI (eller Esp3I). Supplerende udhæng fører til integration af delen og fjernelse af BsmBI-anerkendelsesstedet. KolE1: E. coli oprindelsen af replikation; CmR: Chloramphenicolresistent gen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Samling af transskriberingsenhed. For at samle TU plasmiderne anbefales det at samle en mellemliggende vektor for at lette kombinatorisk TU-samling. For at samle den mellemliggende vektor skal du klone Con LX (X: et af de fem venstre stik), sfGFP-dropoutet, Con RY (Y: et af de fem højre stik), en gær ORI (replikations oprindelse) og en gærmarkørdel i mRFP1-frafaldsvektoren ved hjælp af BsaI-enzymet. Den mellemliggende plasmid er modstandsdygtig over for ampicillin. BsaI-anerkendelsesstederne bevares til TU plasmid kloning. For at klone TU plasmid, en promotor, en CDS, og en terminator er samlet i den mellemliggende vektor ved hjælp af BsaI. Den klonede TU vil have BsmBI steder på ConLX og ConRY regioner for det næste skridt multi-gen samling. Den klonede TU er også modstandsdygtig over for ampicillin. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Navn | ConLX (venstre forbindelse) | Promotor | Cd'er | Terminator | ConRY (højre forbindelse) |
| BTS/ERG20 Tu | Ls | pENO2 | 7226 Politisk geografi 7236 politisk geografi 7236 politisk geografi 7236 | tTDH2 | R1 |
| ERG20 Tu | Ls | pENO2 | ERG20 | tTDH2 | R1 |
| crtE Tu | L1 | pTIP1 | crtE | tHSP26 | R2 |
| crtYB Tu | L2 | pPDC1 | crtYB | tADH2 | R3 |
| crtYBG247A Tu | L2 | pPDC1 | crtYBG247A | tADH2 | R3 |
| crtI Tu | L3 | pPYK1 | crtI | tACS2 | Re |
Tabel 1: Transskriberingsenheder, der anvendes i denne undersøgelse. Promotorer og terminatorer blev forstærket fra S. cerevisiae. BTS1 (geranylgeranyl diphosphatsyntese) og ERG20 (farnesyl pyrophosphatsyntese) blev forstærket fra S. cerevisiae. Generne crtE (geranylgeranyl diphosphat synthase), crtYB (bifunctional lycopen cyclase/phytoene synthase), og crtI (fytoen desaturase) var fra Xanthophyllomyces dendrorhous.
Figur 4:Plasmid-samling med flere gener. (A)Replikativ plasmidassembly. Samling af den repliktive mellemliggende vektor omfatter kloning af Con LS', sfGFP dropout, Con RE', en gær ORI, en gær markør, og en E. coli oprindelse og markør på mRFP1 dropout vektor ved hjælp af BsaI enzym. ConLS' og ConRE's websteder introducerer BsmBI-genkendelsessteder for vektoren. Potentielt korrekte samlinger kan screenes ved at lede efter grønne kolonier på en selektiv plade med kanamycin. De tidligere samlede TU'er kan derefter klones til den mellemliggende vektor ved hjælp af BsmBI-enzymet. Denne plasmid indeholder en gær ORI gør det muligt at kopiere i en gær vært. (B) Integrativ plasmidsamling. Samling af den integrative mellemliggende vektor omfatter kloning af Con LS', sfGFP-frafaldet, Con RE', en 5' homologiarm, en 3' homologiarm, en gærmarkør og E. coli-oprindelsen og markøren i RFP-frafaldsvektoren ved hjælp af BsaI-enzymet. Korrekte samlinger skal fremstå grønne på en selektiv plade med kanamycin. Transskriptionsenheder, der tidligere er foretaget, kan klones til den repliktive mellemliggende vektor ved hjælp af BsmBI-enzymet. Denne vektor har ikke en gær ORI og vil blive integreret i målet locus gennem CRISPR og homolog rekombination. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Navn | TU1 | TU2 | TU3 | TU4 | Produkt |
| B/E-β-Caroten | 7226 Politisk geografi 7236 politisk geografi 7236 politisk geografi 7236 | crtE | crtYB | crtI | β-caroten |
| B/E-Lycopen | 7226 Politisk geografi 7236 politisk geografi 7236 politisk geografi 7236 | crtE | crtYBG247A | crtI | Lycopen |
| E-β-Caroten | ERG20 | crtE | crtYB | crtI | β-caroten |
| E-Lycopen | ERG20 | crtE | crtYBG247A | crtI | Lycopen |
Tabel 2: Plasmider med flere gener, der anvendes i denne undersøgelse.
Figur 5: CRISPR-integration. (A) CRISPR og hjælper plasmid kloning. PCAS plasmid indeholder Cas9 endonuclease og komponenter (tRNA promotor, SNR52 terminator, HDV ribozyme, og tracrRNA) for optimalt udtryk for et gRNA. Klon pCAS+gRNA plasmid ved at samle det syntetiske gRNA med den lineariserede pCAS ved hjælp af Gibson-kloning. b)CRISPR har fremmet den genetiske integration. Trin 1: Cotransformation: pCAS +gRNA blev omdannet til gær med det integrative plasmid, der indeholder det eller de slægter, der er af interesse (GOI), en gærselektiv markør og 5' og 3' homologiregion rettet mod det genomiske locus. For optimal integration skal du linearisere det integrative plasmid med NotI. Trin 2: Integration på mål locus: Voksende forvandlet gær på en plade selektiv for gær markør, enten antibiotika eller auxotrophic. Udfør genotyping for at bekræfte integrationen. Trin 3: Cure pCAS + gRNA plasmid ved striber gær på en ikke-selektiv plade. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Repræsentative plader af indgangsvektor- og transskriptionsenhedsniveau kloning i E. coli. Repræsentative plader af vellykket kloning af et gen i indgangsvektoren pYTK001 under (A) synligt lys og (B) UV-lys. Positive kolonier er hvide og negative kolonier er grønne. Forholdet mellem positive kolonier samlede kolonier er 90,35 ± 4,22 %. Vellykket samling af den mellemliggende vektor til enhedsniveaumontering og grøn/rød udvælgelse under (C) synligt lys og (D) UV-lys. Positive kolonier er grønne. Forholdet mellem positive kolonier samlede kolonier er 17,56 ± 3,32 %. Vellykket samling af transskriberingsenheden fra den mellemliggende vektor og grøn/hvid screening under (E) synligt lys og (F) UV-lys. Positive kolonier er hvide og negative kolonier er grønne. Forholdet mellem positive kolonier samlede kolonier er: 65,02 ± 3,32 %. Data er fra tre biologiske replikater. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: Repræsentative plader af plasmidkloning med flere gener i E. coli. Samling af den mellemliggende vektor til samling på multigenniveau og rød/grøn udvælgelse under (A) synligt lys og (B) UV-lys. Positive kolonier er grønne og negative kolonier er røde. Forholdet mellem positive kolonier samlede kolonier er 1,83 ± 0,15%. Vellykket samling af flere TU'er fra den mellemliggende vektor og grøn/hvid udvælgelse (C) under synligt lys og (D) UV-lys. Positive kolonier er hvide. Forholdet mellem positive kolonier samlede kolonier er 93,77 ± 1,65%. Suboptimal samling af multigenplasmid under (E) synligt lys og (F) UV-lys. Antallet af positive kolonier er ubetydeligt. Data er fra tre biologiske replikater. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8:Repræsentative plader af integrative og replikative plasmider i gær. Repliktive multigenplasmider omdannet til gær med (A) BTS1-ERG20 fusion TU og (B) ERG20 TU. På hver plade har gær på venstre side plasmider, der indeholder crtE TU, crtYB TU og crtI TU til fremstilling af β-caroten og gær på højre side har plasmider indeholdende crtE TU, crtYB (G247A)TU og crtI TU til fremstilling af lycopen. (C) kvantificering af β-caroten og lycopen fra gærekstrakt med fire multigenplasmider ved hjælp af et UV-vis-spektrometer. Den maksimale absorbans blev registreret ved henholdsvis 450 nm og 470 nm for β-caroten og lycopen. Den absolutte kvantificering blev udført ved hjælp af autentiske standarder(supplerende figur S3). Fusion af BTS1-ERG20 fører til produktion af ~35 gange højere β-caroten og ~16,5 gange højere lycopen sammenlignet med ERG20 alene. Repræsentative plader til forstyrrelse af ADE2-locus ved integration af et multigenintegrerende plasmid med et gRNA og ingen hjælper DNA (D) og med gRNA og et multigenintegragrerende plasmid som hjælper DNA (E). Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende materialer. Klik her for at hente denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den MoClo baseret kloning kit udviklet af Lee et al. giver en glimrende ressource for hurtig samling af en til fem transskription enheder i en multi-gen plasmid enten for replikation eller integration i gær genom. Brugen af dette kit eliminerer den tidskrævende kloning flaskehals, der ofte eksisterer for at udtrykke flere gener i gær.
Vi testede fem forskellige betingelser for fordøjelsen / ligation cyklusser af Golden Gate kloning med T4 DNA ligase. Vi konstaterede, at 30 fordøjelsescyklusser ved 37 °C i 5 min. og ligation ved 16 °C i 5 minutter efterfulgt af et sidste fordøjelsestrin ved 50 °C i 10 minutter og et proteininaktiveringstrin ved 80 °C i 10 minutter resulterede i 99,5% kolonier, der potentielt var korrekte i en 4-delt samling(supplerende figur S1 og tabel S3). Ligation ved 16 °C sikrer optimal ligaseaktivitet og udhæng annealing. Endelig fordøjelse ved 50 °C forhindrer fordøjede produkter i at blive omlagt. Denne cyklus blev fulgt for alle samlingsreaktioner, medmindre andet er angivet.
Vi har også fundet nogle kritiske trin, der kræver særlig opmærksomhed for at opnå optimale resultater. Vi anbefaler på det kraftigste at samle mellemliggende vektorer med sfGFP-dropoutet, før du samler transskriberingsenheder. I teorien kan alle syv dele klones ind i E. coli vektoren med mRFP1, efterfulgt af rød /hvid screening. Men i praksis udvikler mRFP1 farve meget langsomt, og det er udfordrende at skelne mellem lyserøde og lysegule E. coli-kolonier under synligt lys. Som sfGFP absorberer på UV-området52, ved hjælp af en UV eller en blåt lys transilluminator letter screening for lyse grønne kolonier. Kloning af en mellemliggende vektor giver også mulighed for mere letmontering af de forskellige promotor-, CDS- og terminatorkombinationer, hvilket muliggør en lettere kombinatorisk biblioteksoprettelse, da en samling med fire dele normalt resulterer i mere positive kolonier end en samling med flere dele. Supplerende figur S2 viser et gradvist fald i forholdet mellem potentielt korrekte kolonier fra en 6-delt til en 8-delt samling.
Koncentrationerne af alle dele skal måles omhyggeligt for at sikre equimolar koncentrationen af hver del. Kvantificering af dele ved hjælp af et UV-Vis-spektrometer er normalt tilstrækkelige, men mere følsomme metoder, såsom fluorescensbaserede assays, kan give bedre resultater. Manglende præcist at kvantificere alle dele resulterer ofte i en lav samlingseffektivitet. Man bør vælge henholdsvis den meget effektive Esp3I og BsaI-HFv2. Vi har observeret, at T4 fungerer godt til begge udhæng i sættet, og tilpassede udhæng er nødvendige for at sammensmelte to dele, hvilket er i overensstemmelse med litteratur36, selvom det oprindelige papir anbefalede T7 ligase6. Forøgelse af antallet af cyklusser kan øge antallet af potentielt korrekte kolonier til en vis grad. For eksempel er 25 cyklusser af fordøjelse og ligation nok til at samle tre til fire dele, men 30-35 cyklusser giver bedre resultater for flere dele.
MolClo-strategien er fordelagtig i forhold til alternative flerdelte samlingsmetoder8,9,10,11,12, fordi den tillader modulær og meget alsidig kloning. Den primære begrænsning er dog domesticeringstrinnet, da dele nogle gange har flere BsmBI-, BsaI- eller NotI-websteder. Mutering af alle dele kan være tidskrævende. I dette tilfælde kan man overveje at syntetisere CDS uden disse begrænsningssteder. Men for promotorer og terminatorer kan mutering af selv en enkelt nukleotid ændre deres funktionalitet. Derfor anbefales det at validere aktiviteten af disse dele ved hjælp af en reporteranalyse39. En anden begrænsning er, at dette sæt kun tillader op til fem transskriberingsenheder i en multi-gen plasmid. Hvis der ønskes flere transskriberingsenheder, kan der konstrueres yderligere stik ved at vælge et sæt meget kompatible udhæng36.
Sættet giver 27 initiativtagere, seks terminatorer, syv gær udvælgelse markører, og to gær oprindelse replikationer. Tilpassede dele, f.eks. Gæren MoClo kit er blevet brugt primært til overekspresserende multi-gen metaboliske veje til at producere høj værdi kemikalier i gær. Denne protokol kan også bruges, når forskellige kontakter til biologiske kredsløb ønskes i gær. Der er også et enormt potentiale for at anvende dette sæt til undersøgelse af grundlæggende biologiske spørgsmål om proteinproteininteraktioner, proteinlokalisering og enzymaktiviteter. Samlet set er denne protokol ekstremt fleksibel og pålidelig og kan understøtte enhver krævende kloning i gærbiologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af Research Foundation for State University of New York (Award #: 71272) og IMPACT Award of University i Buffalo (Award #: 000077).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mm Glass beads | RPI research products | 9831 | For lysing yeast cells |
| Bacto Agar | BD & Company | 214010 | Component of the yeast complete synthetic medium (CSM) |
| Bacto Peptone | BD& Company | 211677 | Component of the yeast extract peptone dextrose medium (YPD) |
| BsaI-HFv2 | New England Biolabs | R3733S | a highly efficient version of BsaI restriction enzyme |
| Carbenicillin | Fisher Bioreagents | 4800-94-6 | Antibiotic for screening at the transcription unit level |
| Chloramphenicol | Fisher Bioreagents | 56-75-7 | Antibiotic for screening at the entry vector level |
| CSM-His | Sunrise Sciences | 1006-010 | Amino acid supplement of the yeast complete synthetic medium (CSM) |
| Dextrose | Fisher Chemical | D16-500 | Carbon source of the yeast complete synthetic medium (CSM) |
| Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids | BD & Company | 291940 | Nitrogen source of the yeast complete synthetic medium (CSM) |
| dNTP mix | Promega | U1515 | dNTPs for PCR |
| Esp3I | New England Biolabs | R0734S | a highly efficient isoschizomer of BsmBI |
| Frozen-EZ Yeast Trasformation II Kit | Zymo Research | T2001 | For yeast transformation |
| Hexanes | Fisher Chemical | H302-1 | For carotenoid extraction from yeast cells |
| Kanamycin | Fisher Bioreagents | 25389-94-0 | Antibiotic for screening at the multigene plasmid level |
| LB Agar, Miller | Fisher Bioreagents | BP1425-2 | Lysogenic agar medium for E. coli culturing |
| LB Broth, Miller | Fisher Bioreagents | BP1426-2 | Lysogenic liquid medium for E. coli culturing |
| Lycopene | Cayman chemicals | NC1142173 | For lycopene quantification |
| MoClo YTK | Addgene | 1000000061 | Depositing Lab: John Deuber |
| Monarch Plasmid Miniprep Kit | New England Biolabs | T1010L | For plasmid purification from E.coli |
| Nanodrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND2000c | For measuring accurate DNA concentrations |
| NotI-HF | New England Biolabs | R3189S | Restriction enzyme for integrative multigene plasmid linearization |
| Nourseothricin Sulphate | Goldbio | N-500-100 | Antibiotic Selection marker for the pCAS plasmid used in this study |
| Phusion HF reaction Buffer (5X) | New England Biolabs | B0518S | Buffer for PCR using Phusion polymerase |
| Phusion High Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530S | High fidelity polymerase for all the PCR reactions |
| pLM494 | Addgene | 100539 | Plasmid used to amplify crtI, crtYB and crtE used in this study |
| Quartz Cuvette | Thermo Electron | 10050801 | For quantifing carotenoids |
| T4 ligase | New England Biolabs | M0202S | Ligase for Golden Gate cloning |
| Thermocycler | BIO-RAD | 1851148 | For performing all the PCR and cloning reactions |
| Tissue Homogenizer | Bullet Blender | Model: BBX24 | For homogenization of yeast cells |
| UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | Genesys 150 | For quantifing carotenoids |
| Yeast Extract | Fisher Bioreagents | BP1422-500 | Component of the yeast extract peptone dextrose medium (YPD) |
| β-carotene | Alfa Aesar | AAH6010603 | For β-carotene quantification |
References
- Endy, D.
- Engler, C., Gruetzner, R., Kandzia, R., Marillonnet, S. Golden gate shuffling: a one-pot DNA shuffling method based on type IIs restriction enzymes. PLoS One. 4 (5), 5553 (2009).
- Shetty, R. P., Endy, D., Knight, T. F. Engineering BioBrick vectors from BioBrick parts. Journal of Biological Engineering. 2, 5 (2008).
- Peccoud, J., et al. A Modular cloning system for standardized assembly of multigene constructs. PLoS ONE. 6 (2), (2011).
- Sarrion-Perdigones, A., et al. GoldenBraid: an iterative cloning system for standardized assembly of reusable genetic modules. PLoS One. 6 (7), 21622 (2011).
- Lee, M. E., DeLoache, W. C., Cervantes, B., Dueber, J. E. A Highly characterized yeast toolkit for modular, multipart assembly. ACS Synthetic Biology. 4 (9), 975-986 (2015).
- Andreou, A. I., Nakayama, N. Mobius assembly: A versatile Golden-Gate framework towards universal DNA assembly. PLoS One. 13 (1), 0189892 (2018).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Li, M. Z., Elledge, S. J. Harnessing homologous recombination in vitro to generate recombinant DNA via SLIC. Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).
- Geu-Flores, F., Nour-Eldin, H. H., Nielsen, M. T., Halkier, B. A. USER fusion: a rapid and efficient method for simultaneous fusion and cloning of multiple PCR products. Nucleic Acids Research. 35 (7), 55 (2007).
- de Kok, S., et al. Rapid and reliable DNA assembly via ligase cycling reaction. ACS Synthetic Biology. 3 (2), 97-106 (2014).
- Shao, Z., Zhao, H., Zhao, H. DNA assembler, an in vivo genetic method for rapid construction of biochemical pathways. Nucleic Acids Research. 37 (2), 16 (2009).
- Gibson, D. G. Synthesis of DNA fragments in yeast by one-step assembly of overlapping oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 37 (20), 6984-6990 (2009).
- Engler, C., et al. A golden gate modular cloning toolbox for plants. ACS Synthetic Biology. 3 (11), 839-843 (2014).
- Gantner, J., et al. Peripheral infrastructure vectors and an extended set of plant parts for the Modular Cloning system. PLoS One. 13 (5), 0197185 (2018).
- Ordon, J., et al. Generation of chromosomal deletions in dicotyledonous plants employing a user-friendly genome editing toolkit. Plant Journal. 89 (1), 155-168 (2017).
- Sarrion-Perdigones, A., et al. GoldenBraid 2.0: a comprehensive DNA assembly framework for plant synthetic biology. Plant Physiology. 162 (3), 1618-1631 (2013).
- Agmon, N., et al. Yeast Golden Gate (yGG) for the efficient assembly of S. cerevisiae transcription units. ACS Synthetic Biology. 4 (7), 853-859 (2015).
- Hernanz-Koers, M., et al. FungalBraid: A GoldenBraid-based modular cloning platform for the assembly and exchange of DNA elements tailored to fungal synthetic biology. Fungal Genetics and Biology. 116, 51-61 (2018).
- Prielhofer, R., et al. GoldenPiCS: a Golden Gate-derived modular cloning system for applied synthetic biology in the yeast Pichia pastoris. BMC Systems Biology. 11 (1), 123 (2017).
- Celinska, E., et al. Gate Assembly system dedicated to complex pathway manipulation in Yarrowia lipolytica. Microbial Biotechnology. 10 (2), 450-455 (2017).
- Pullmann, P. K., et al. A modular two yeast species secretion system for the production and preparative application of fungal peroxygenases. bioRxiv. , (2020).
- Wu, D., Schandry, N., Lahaye, T. A modular toolbox for Golden-Gate-based plasmid assembly streamlines the generation of Ralstonia solanacearum species complex knockout strains and multi-cassette complementation constructs. Molecular Plant Pathology. 19 (6), 1511-1522 (2018).
- Moore, S. J., et al. EcoFlex: A multifunctional MoClo kit for E. coli synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 5 (10), 1059-1069 (2016).
- Iverson, S. V., Haddock, T. L., Beal, J., Densmore, D. M. CIDAR MoClo: Improved MoClo assembly standard and new E. coli part library enable rapid combinatorial design for synthetic and traditional biology. ACS Synthetic Biology. 5 (1), 99-103 (2016).
- Vasudevan, R., et al. CyanoGate: A modular cloning suite for engineering cyanobacteria based on the plant MoClo syntax. Plant Physiology. 180 (1), 39-55 (2019).
- Leonard, S. P., et al. Genetic Engineering of bee gut microbiome acteria with a Ttoolkit for modular assembly of broad-host-range plasmids. ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1279-1290 (2018).
- Schwartz, M. L., Jorgensen, E. M. SapTrap, a toolkit for high-throughput CRISPR/Cas9 gene modification in Caenorhabditis elegans. Genetics. 202 (4), 1277-1288 (2016).
- Martella, A., Matjusaitis, M., Auxillos, J., Pollard, S. M., Cai, Y. EMMA: An extensible mammalian modular assembly toolkit for the rapid design and production of diverse expression vectors. ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1380-1392 (2017).
- Chiasson, D., et al. A unified multi-kingdom Golden Gate cloning platform. Scientific Reports. 9 (1), 10131 (2019).
- Denby, C. M., et al. Industrial brewing yeast engineered for the production of primary flavor determinants in hopped beer. Nature Communications. 9 (1), 965 (2018).
- Awan, A. R., et al. Biosynthesis of the antibiotic nonribosomal peptide penicillin in baker's yeast. Nature Communications. 8, 15202 (2017).
- Leavitt, J. M., et al. Biosensor-Enabled Directed evolution to improve muconic acid production in Saccharomyces cerevisiae. Biotechnology Journal. 12 (10), (2017).
- Hsu, T. M., et al. Employing a biochemical protecting group for a sustainable indigo dyeing strategy. Nature Chemical Biology. 14 (3), 256-261 (2018).
- Grewal, P. S., Modavi, C., Russ, Z. N., Harris, N. C., Dueber, J. E. Bioproduction of a betalain color palette in Saccharomyces cerevisiae. Metabolic Engineering. 45, 180-188 (2018).
- Potapov, V., et al. Comprehensive profiling of four base overhang ligation fidelity by T4 DNA ligase and application to DNA assembly. ACS Synthetic Biology. 7 (11), 2665-2674 (2018).
- Vazquez-Vilar, M., et al. Software-assisted stacking of gene modules using GoldenBraid 2.0 DNA-assembly framework. Methods in Molecular Biology. 1284, 399-420 (2015).
- Pullmann, P., et al. Mutagenesis: An efficient multi-site-saturation mutagenesis approach by Golden Gate cloning with automated primer design. Scientific Reports. 9 (1), 10932 (2019).
- Engler, C., Sylvestre, M. DNA Cloning and Assembly Methods. Valla, S., Lale, R. 1116, Humana Press. Ch. 9 119-131 (2014).
- Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC Biotechnology. 8, 91 (2008).
- Chen, X., Zaro, J. L., Shen, W. C. Fusion protein linkers: property, design and functionality. Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (10), 1357-1369 (2013).
- Mullis, K., et al. Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 51, Pt 1 263-273 (1986).
- Naito, Y., Hino, K., Bono, H., Ui-Tei, K. CRISPRdirect: software for designing CRISPR/Cas guide RNA with reduced off-target sites. Bioinformatics. 31 (7), 1120-1123 (2015).
- Labun, K., et al. CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Research. 47 (1), 171-174 (2019).
- Ryan, O. W., et al. Selection of chromosomal DNA libraries using a multiplex CRISPR system. Elife. 3, (2014).
- Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nature Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).
- Heintz, N., Gong, S. Small-scale preparations of yeast DNA. Cold Spring Harbor Protocols. 2020 (10), (2020).
- Hochrein, L., Mitchell, L. A., Schulz, K., Messerschmidt, K., Mueller-Roeber, B. L-SCRaMbLE as a tool for light-controlled Cre-mediated recombination in yeast. Nature Communications. 9 (1), 1931 (2018).
- Verwaal, R., et al. High-level production of beta-carotene in Saccharomyces cerevisiae by successive transformation with carotenogenic genes from Xanthophyllomyces dendrorhous. Applied and Environmental Microbiology. 73 (13), 4342-4350 (2007).
- Jones, E., et al. The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Metabolism and Gene Expression. Strathern, J. N., Jones, E. W., Broach, J. R. 11, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Ch. Regulation of amino acid and nucleotide biosynthesis in yeast 181 (1982).
- Sehgal, N., et al. CRISPR gene editing in yeast: an experimental protocol for an upper-division undergraduate laboratory course. Biochemistry and Molecular Biology Education. 46 (6), 592-601 (2018).
- Stepanenko, O. V., Stepanenko, O. V., Kuznetsova, I. M., Verkhusha, V. V., Turoverov, K. K. Sensitivity of superfolder GFP to ionic agents. PLoS One. 9 (10), 110750 (2014).
