Summary
Bu protokolün amacı, Golden Gate klonlamaya dayalı modüler klonlama sistemini kullanarak çok genli yapıların montajı için ayrıntılı, adım adım bir kılavuz sağlamaktır. Ayrıca, deneyimlerimize göre en iyi montajı sağlamak için kritik adımlar hakkında önerilerde bulunmaktadır.
Abstract
Golden Gate klonlama yöntemi, kullanıcı tanımlı herhangi bir düzenlemede birden fazla genin hızlı bir şekilde bire birliğini sağlar. Tanıma alanlarının dışında kesilen ve kısa bir çıkıntı oluşturan tip IIS kısıtlama enzimlerini kullanır. Bu modüler klonlama (MoClo) sistemi, organizatörler, kodlama dizileri (CDS) ve sonlandırıcılar gibi farklı DNA parçalarının ilk olarak bir giriş vektörüne klonlandırıldığı hiyerarşik bir iş akışı kullanır. Birden çok giriş vektörü daha sonra transkripsiyon birimlerine monte edilir. Birkaç transkripsiyon ünitesi daha sonra çok genli bir plazmid içine bağlanır. Golden Gate klonlama stratejisi, tek pota reaksiyonunda skarsız, yönlü ve modüler montaja izin verdiği için muazzam bir avantaja sahip. Hiyerarşik iş akışı genellikle giriş vektörlerinin ötesinde sıralamaya gerek kalmadan çok çeşitli çok genli yapıların facile klonlasını sağlar. Floresan protein bırakmalarının kullanımı kolay görsel tarama sağlar. Bu çalışma, maya modüler klonlama (MoClo) kitini kullanarak çok genli plazmidlerin montajı için ayrıntılı, adım adım bir protokol sağlar. Çok genli plazmid montajının optimal ve yetersiz sonuçlarını gösteriyoruz ve koloniler için tarama için bir kılavuz sağlıyoruz. Bu klonlama stratejisi maya metabolik mühendisliği ve çok genli plazmid klonlamanın gerekli olduğu diğer durumlar için oldukça geçerlidir.
Introduction
Sentetik biyoloji, farmasötik, tarım ve kimya endüstrileri için yararlı yeni işlevlere sahip biyolojik sistemler tasarlamayı amaçlamaktadır. Çok sayıda DNA parçasını yüksek verimli bir şekilde birleştirmek sentetik biyolojide temel bir teknolojidir. Böyle karmaşık bir süreç, temel mühendislik bilimlerinden ödünç alınan bir kavram olan azalan karmaşıklık ile birden fazla seviyeye ayrılabilir1,2. Sentetik biyolojide, DNA parçaları genellikle işlevselliğe göre hiyerarşik olarak bir araya gelir: (i) Parça düzeyi: "parçalar", organizatör, kodlama dizisi, sonlandırıcı, çoğaltmanın kaynağı gibi belirli bir işleve sahip DNA parçalarını ifade eder; (ii) Transkripsiyon üniteleri (TU) seviyesi: TU, bir organizatör, bir kodlama dizisi ve tek bir geni aktarabilen bir sonlandırıcıdan oluşur; (iii) Çok genli seviye: çok genli plazmid, sıklıkla tüm metabolik yoldan oluşan birden fazla TUs içerir. BioBrick topluluğunun öncülük ettiği bu hiyerarşik derleme, sentetik biyoloji3'tebüyük DNA setlerinin montajı için temel kavramdır.
Son on yılda4,5,6,7, Golden Gate klonlama tekniği hiyerarşik DNA derlemesini önemli ölçüde kolaylaştırmıştır2. Gibson klonlama8, ligasyondan bağımsız klonlama (SLIC)9, urasil eksizyon tabanlı klonlama (KULLANICI)10, ligase cycling reaksiyon (LCR)11ve in vivo rekombinasyon (DNA Assembler)12,13gibi diğer birçok çok parçalı klonlama yöntemi de şimdiye kadar geliştirilmiştir. Ancak Golden Gate klonlama ideal bir DNA montaj yöntemidir, çünkü genlere özgü dizilerden bağımsızdır ve tek pota reaksiyonunda skarsız, yönlü ve modüler montaja izin verir. Golden Gate klonlama, tanıma alanı2dışında kademeli çıkıntılar oluşturmak için palindromi olmayan bir diziyi tanıyan tip IIS kısıtlama enzimlerinden yararlanır. Bir ligase daha sonra çok parçalı bir montaj elde etmek için tavlanmış DNA parçalarını birleştirir. Bu klonlama stratejisini modüler klonlama (MoClo) sistemine uygulamak, doğru monte edilmiş yapı4'ü içeren% 90'dan fazla dönüştürücü ile 10'a kadar DNA parçasının bir araya alınmasını sağlamıştır.
MoClo sistemi, sentetik biyolojinin tasarım-inşa-test döngüsünü hızlandıran muazzam avantajlar sunar. İlk olarak, değiştirilebilir parçalar, büyük bir parametre alanını hızlı bir şekilde test etmek için kombinatoryal klonlamayı etkinleştirir. Örneğin, metabolik bir yolu optimize etmek genellikle yol akısını dengelemek için her gen için birçok promotör arasında bisiklet sürmeyi gerektirir. MoClo sistemi bu tür zorlu klonlama görevlerini kolayca halledebilir. İkincisi, plazmid kısmını sıralamak gerekir, ancak tipik olarak TU veya çok genli plazmidleri sıralamaz. Çoğu durumda, koloni PCR veya kısıtlama sindirimi ile tarama TU ve çok genli plazmid düzeyinde doğrulama için yeterlidir. Bunun nedeni, parça plazmidi klonlamanın, sık sık mutasyonları tanıtan PCR gerektiren tek adım olmasıdır. Üçüncü olarak, MoClo sistemi çok genli karmaşık metabolik yollar oluşturmak için idealdir. Son olarak, evrensel çıkıntılar nedeniyle, parça plazmidleri yeniden kullanılabilir ve tüm biyomühendislik topluluğu ile paylaşılabilir. Şu anda, MoClo kitleri bitkiler için mevcuttur14,15,5,16,17, mantar6,18,19,20,21,22, bakteri7,23,24,25,26,27vehayvanlar28,29. Çok krallıklı bir MoClo platformu da yakın zamanda tanıtıldı30.
Saccharomyces cerevisiaeiçin Lee ve ark.6, maya sentetik biyoloji topluluğu için mükemmel bir kaynak olan çok yönlü bir MoClo araç seti geliştirdi. Bu kit uygun bir 96 kuyu formatında gelir ve iyi karakterize edilmiş organizatörler, floresan proteinler, terminatörler, peptit etiketleri, seçim belirteçleri, replikasyon kaynağı ve genom düzenleme araçlarından oluşan çeşitli bir koleksiyona sahip sekiz tür değiştirilebilir DNA parçası tanımlar. Bu araç seti, beş adede kadar transkripsiyon ünitesinin çok genli bir plazmid içine birleştirilmiş olmasını sağlar. Bu özellikler, kısmi veya tüm yolların hedeflenen kimyasalları üretmek için aşırı ifade edildiği maya metabolik mühendisliği için değerlidir. Bu kiti kullanarak, araştırmacılar geraniol, linalool31, penisilin32, mukonik asit33, indigo34ve mayada betalain35 üretimini optimize etmişlerdir.
Burada, epizomal veya genomik ekspresyon için çok genli yollar oluşturmak için MoClo araç setinin kullanımına rehberlik etmek için ayrıntılı, adım adım bir protokol sunuyoruz. Bu kitin kapsamlı kullanımıyla, DNA konsantrasyonlarının doğru ölçümünün, Golden Gate reaksiyonundaki her parçanın eşitlikçi dağılımını sağlamanın anahtarı olduğunu bulduk. Ayrıca T7 DNA ligaz üzerinde T4 DNA ligazını öneririz, çünkü ilki daha fazla sayıda çıkıntla daha iyi çalışır36. Son olarak, BsmBI ve BsaI'nin tüm iç tanıma siteleri montajdan önce kaldırılmalı veya evcillendirilmelidir. Alternatif olarak, birden fazla dahili siteyi kaldırmak ve eşzamanlı kodon optimizasyonu elde etmek için parçaları sentezlemeyi düşünebilirsiniz. S. cerevisiae'de β karoten ve likopen üretimi için beş genlik bir yol ifade ederek bu araç setin nasıl kullanılacağını gösteriyoruz. Ayrıca, bu kitin genom düzenleme araçlarını kullanarak ADE2 locus'un nasıl nakavt olduğunu gösteriyoruz. Bu renk tabanlı deneyler kolay görselleştirme için seçildi. Ayrıca Golden Gate klonlama kullanarak füzyon proteinlerinin nasıl üretilip amino asit mutasyonlarının nasıl oluşturulacağı da göstermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Bu araç setinde sunulan hiyerarşik klonlama protokolü üç ana adıma ayrılabilir: 1. Parça plazmidlerini klonlama; 2. Klonlama transkripsiyon üniteleri (TUs); 3. Çok genli plazmidlerin klonlama (Şekil 1). Bu protokol astar tasarımından başlar ve klonlanmış çok genli plazmid uygulamaları ile sona erer.
1. Parça plazmid klonlama için astar tasarımı (pYTK001):
- 5' ucunda TTT yan nükleotitleri içeren ileri ve ters astarları, giriş vektörün tamamlayıcısı olan 4 nükleotidli (nt) çıkıntılı (TCGG) ek nükleotidli (CGTCTCN) bir BsmBI tanıma alanını tasarlayın, şablona özgü sıraya ek olarak ek nükleotid (GGTCTCN) ve 4 nt parçaya özgü kullanma çıkıntlı BsaI tanıma sitesi (Şekil 2A). GoldenBraid 4.037 ve GoldenMutagenesis38, Golden Gate'e özgü astar tasarımı için kullanılabilecek çevrimiçi yazılımlardan bazılarıdır.
- BsaI veya BsmBI tanıma siteleri herhangi bir bölümde varsa, Golden Gatederlemesi 39'danönce bu siteleri mutasyona uğratmak için bir evcillaştırma adımı kullanın. Bütünleştirici plazmidler için (bkz. adım 4), herhangi bir NotI tanıma sitesini evcilleştirme. Bir parçayı istenmeyen bir tanıma sitesiyle evcillaştırmak için, parçayı istenmeyen sitenin yakınındaki iki alt bölüme bölün (Şekil 2A):
- İlk alt bölümün ileri astarını adım 1.1 ile aynı şekilde tasarlayın. ancak ters astarı BsmBI bölgesi ve sadece 4 nt gene özgü bir çıkıntı ile tasarlayın.
- İkinci alt parça ileri astarı BsmBI bölgesi ve 4 nt gene özgü çıkıntı ile yalnızca ilk alt parçanın ters astarı ile çakışan şekilde tasarlayın. İkinci alt parçanın ters astarını adım 1.1 ile aynı şekilde tasarlayın.
- Astarın genlere özgü bölgesinde istenen mutasyonları ters (adım 1.2.1 için) veya ileri astarda (adım 1.2.2) tanıtın.
NOT: Alternatif olarak, BsmBI ve BsaI içermeyen ve kodon için optimize edilmiş bir parça ticari olarak sentezlenebilir. Kodlama dizileri (CDS) için, eşanlamlı bir mutasyon, bir amino asit kodonunun üçüncü nükleotidinde kolayca dahil edilebilir. Ancak, organizatörler ve sonlandırıcılar için, mutasyona uğramış promotörü veya sonlandırıcı etkinliğini bir muhabir tahlili kullanarak kontrol etmekönerilir 39. Sıranın sonuna doğru istenmeyen bir kısıtlama sitesi varsa, daha uzun bir ters astar kullanılarak mutasyona uğratılabilir. Birden fazla istenmeyen site varsa, birden fazla sitenin mutasyona uğramasına izin verilen siteye yönelik mutajensisyapılabilir 40.
- Bazen, iki proteinin arada bir bağlayıcı ile tek bir parça olarak kaynaştırilmesi arzu edilir (Şekil 2A). Bağlayıcı, iki ayrı proteinin yapısal bütünlüğünü sağlamaya yardımcı olur41.
- İlk genin ileri astarı adım 1.1 ile aynıdır. Ters astarda, bir BsmBI sitesi, 4 nt gene özgü çıkıntı ve bir bağlayıcı dizisi ekleyin. 4-nt çıkınti, bağlayıcı veya ikinci genin ilk birkaç nükleotid olabilir.
- İkinci gen için, ileri astarı bir BsmBI tanıma bölgesine ve ilk genin ters astarının tamamlayıcısı olan 4 nt çıkıntıya sahip olacak şekilde tasarlayın. İkinci genin ters astarını adım 1.1'de olduğu gibi tasarlayın.
- Parçaları polimeraz zincir reaksiyonu (PCR)42ile yükseltmek için, genomik DNA, cDNA veya plazmidden parçaları yükseltmek için yüksek kaliteli bir DNA polimeraz kullanın. PCR ürününü% 1 agarose jel üzerinde kontrol edin ve ardından jel saflaştırma. Saflaştırılmış DNA kullanılması şiddetle tavsiye edilir, jel saflaştırma zahmetliyse, PCR ürününü saflaştırmak için en azından bir spin sütunu kullanın.
2. Parça plazmidleri oluşturmak için parçaları giriş vektörüne klonlama (pYTK001) (Şekil 2B)
- Golden Gate reaksiyon karışımını ayarlamak için, her PCR ürününün 20 fmol'unu ve giriş vektörü (pYTK001), 1 μL 10X T4 ligaz tamponu, 0,5 μL Esp3I (BsmBI'nin yüksek verimli bir izoskizomer) ve 0,5 μL T4 ligase ekleyin. Toplam hacmi 10 μL'ye getirmek için ddH2O ekleyin.
- Klonlama reaksiyonunu ayarlamak için, aşağıdaki programı bir termosikler içinde çalıştırın: 5 dakika (sindirim) için 37 °C'nin 25-35 döngüsü ve 5 dakika (ligasyon) için 16 °C, ardından 10 dakika boyunca 50 °C'de son sindirim ve 10 dakika boyunca 80 °C'de enzim inaktivasyonu.
NOT: Birden fazla DNA parçasını giriş vektörüne aynı anda klonlarken, örneğin füzyon genlerinin klonlanması sırasında veya bir geni evcilleştirirken 35 sindirme/ligasyon döngüsü önerilir. - Tüm reaksiyon karışımını ısı şoku ile DH5α suşuna veya eşdeğer Escherichia coli kimyasal olarak yetkin hücrelere dönüştürün. 10 μL klonlanmış ürünün tamamının 35 μL kimyasal olarak yetkin E. coli hücrelerine dönüştürülmesi önerilir (2 X 105 cfu/mL, cfu 5 ng pYTK001'in yetkili hücrelerin 100 μL'sine dönüştürülmesinden hesaplanır). 35 μg/mL kloramfenikol (Cm) ile lysogeny Broth (LB) plakasına yayın. Gece boyunca 37 °C'de kuluçkaya yaslanın.
- 16-18 saat sonra, plakayı inkübatörden alın ve süper klasör yeşil floresan proteinin (sfGFP) daha yoğun bir yeşil renk için gelişmesine izin vermek için plakayı yaklaşık 5 saat boyunca 4 °C'de tutun.
- Daha kolay tarama için plakayı ultraviyole (UV) veya mavi ışık transilluminator üzerine yerleştirin. Kolonileri içeren sfGFP, UV ışığı altında floresan yapacaktır.
- Yeşil koloniler kesilmemiş pYTK001 içerdiğinden negatiftir. Beyaz koloniler muhtemelen olumlu. Klonlama genellikle ~ 30-100% beyaz koloniler varsa başarılıdır. Koloni PCR veya kısıtlama sindirimi (önerilen enzim: BsaI-HFv2) ile birkaç beyaz koloninin daha fazla taranmasını gerçekleştirin.
- Plazmidleri potansiyel olarak doğru kolonilerden birkaçından arındırın ve Sanger dizileriyle dizileri onaylayın.
3. Parça plazmidlerinin "kaset" plazmidlerine montajı
NOT: Kaset plazmidi, bir organizatör, CDS ve bir sonlandırıcıdan oluşan kullanıcı tanımlı bir transkripsiyon ünitesi (TU) içerir. Kaset plazmidi tek bir genin ifadesini sağlar. Kaset plazmidleri çok genli bir plazmid halinde birleştirilecekse, ilk adım çok genli plazmiddeki TU'ların sayısını ve sırasını belirlemektir. Konnektörler çok genli plazmiddeki TU'ları bağladığından, bunlar kaset plazmidlerinde hangi konektörlerin kullanılacağını belirleyecektir. İlk TU'nun sol konektörü ConLS ve son TU'nun sağ konektörü ConRE olmalıdır. Çok genli plazmidlerin ConLS' ve ConRE'si ile çakışacaklardır. Bağlayıcıların geri kalanı artan sayısal sırada olmalıdır. Örneğin, çok genli plazmid dört TUs içeriyorsa, konektör kombinasyonları ConLS-TU1-ConR1, ConL1-TU2-ConR2, ConL2-TU3-ConR3 ve ConL3-TU4-ConRE (Şekil 1)olacaktır.
- Transkripsiyon ünitelerini monte etmeden önce, aşağıdaki altı parçaya sahip bir ara vektörün montajı önerilir: sol konektör, sfGFP bırakma (pYTK047), sağ konektör, maya seçim işaretleyicisi, replikasyon mayası kaynağı ve mRFP1, E. coli orijini ve ampisiline dayanıklı gen (pYTK083) ile parça plazmidi (pYTK083) (Şekil 3).
- Yukarıdaki altı plazmidi arındırın. Konsantrasyonlarını bir UV-Vis spektrofotometresi veya floresan bazlı bir test kullanarak kaydedin ve her plazmidi ddH2O ile seyreltin, böylece 1 μL 20 fmol DNA'ya sahiptir. Çevrimiçi bir hesap makinesi kullanarak DNA azı dişi konsantrasyonu hesaplayın.
NOT: DNA konsantrasyonlarını doğru bir şekilde ölçmek ve montajın çalışması için, özellikle beş ila yedi parçalı plazmidlere sahip montajlar için tam olarak borulamak çok önemlidir. Her plazmidin DNA konsantrasyonundaki küçük hatalar klonlama verimliliğinde önemli bir düşüşe neden olabilir. - Her plazmidden 1 μL, 10X T4 ligaz tamponunun 1 μL'si, BsaI-HFv2'nin 0,5 μL'si (BsaI'nin son derece verimli bir versiyonu) ve 0,5 μL T4 ligase ekleyin. DDH 2 O ekleyerek hacmi 10μL'yekadar yükseltin.
- Klonlama reaksiyonunu ayarlamak için termosikler içinde aşağıdaki programı çalıştırın: 5 dakika (sindirim) için 37 °C'nin 25-35 döngüsü ve 5 dakika (ligasyon) için 16 °C. BsaI alanlarının ara vektörde tutulması gerektiğinden son sindirim ve ısı inaktivasyon adımlarını atla(Şekil 3).
- Tüm reaksiyon karışımını DH5α suşuna veya diğer E. coli yetkin hücrelerine dönüştürün. 50 μg/mL karbenisilin (Cb) veya ampisilin içeren bir LB plakasına yayın. Gece boyunca 37 °C'de kuluçkaya yaslanın.
NOT: Karbenisilin ampisilin kararlı bir analogdur. - 16-18 saat sonra plakayı inkübatörden çıkar. Plaka hem soluk kırmızı hem de soluk yeşil koloniler içerecektir (Şekil 6C ve 6D). mRFP1 ve sfGFP'nin olgunlaşması için plakayı yaklaşık 5 saat boyunca 4 °C'de tutun. Potansiyel olarak doğru ara vektörü içeren yeşil kolonileri tanımlamak için bir UV veya mavi ışık transilluminator kullanın.
- Yeşil kolonileri LB + Cb plakasında çizin ve bir gecede 37 °C'de kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, lb + cm plaka üzerinde tekrar çizgi ve gece boyunca 37 °C'de kuluçkaya yaslanın. LB + Cm plakalarda büyüyen koloniler, Cm'ye dayanıklı parça vektörleri tutulduğu için yanlış monte edilmiş plazmidler içerir.
- LB + Cm plakasında büyümeyen kolonileri seçin ve doğru monte edilen plazmidi doğrulamak için kısıtlama sindirimleri (önerilen enzimler: BsaI-HFv2, Esp3I) gerçekleştirin. Alternatif olarak, tarama için koloni PCR kullanın.
- Yukarıdaki altı plazmidi arındırın. Konsantrasyonlarını bir UV-Vis spektrofotometresi veya floresan bazlı bir test kullanarak kaydedin ve her plazmidi ddH2O ile seyreltin, böylece 1 μL 20 fmol DNA'ya sahiptir. Çevrimiçi bir hesap makinesi kullanarak DNA azı dişi konsantrasyonu hesaplayın.
- Ara vektör başarıyla bir araya getirildikten sonra, bir sonraki adım transkripsiyon ünitelerini birleştirmektir. Bu, aşağıdaki parçalara sahip 4 parçalı bir montaj: ara vektör, bir promotör, bir CDS ve bir sonlandırıcı.
- Dört parçalı plazmidleri arındırın. Konsantrasyonlarını kaydedin ve plazmidlerin her birini seyreltin, böylece 1 μL 20 fmol DNA'ya sahiptir.
- Reaksiyon karışımını ayarlamak için Adım 3.1.2'yi izleyin.
- Klonlama reaksiyonlarını ayarlamak için Adım 2.2'yi izleyin.
- Tüm klonlama reaksiyon karışımını bir gecede 37 °C'de LB + Cb. Incubate üzerindeki DH5α veya eşdeğer E. coli yetkin hücrelerine ve plakasına dönüştürün.
- 16-18 saat sonra plakayı inkübatörden çıkar. Beyaz ve soluk yeşil koloniler görünecektir (Şekil 6E ve 6F). SfGFP'nin olgunlaşması için plakayı yaklaşık 5 saat boyunca 4 °C'de tutun. Floresan olmayan beyaz kolonileri tanımlamak için bir UV veya mavi ışık transilluminator kullanın. Bunlar potansiyel olarak doğru transkripsiyon ünitelerini içerir.
- Çizgi ve büyümek 8-10 beyaz koloniler ve bir koloni PCR gerçekleştirmek. Koloni PCR'den pozitif test eden kolonilerden plazmidleri arındırın. Montajı daha fazla doğrulamak için kısıtlama sindirimi (önerilen enzim: Esp3I) gerçekleştirin.
NOT: Klonlama yalnızca kısıtlama sindirimi ve ligasyon içerdiğinden, transkripsiyon birimlerini sıralamak genellikle gerekli değildir. Tüm ilgi dizileri parça plazmid seviyesinde onaylandı.
4. Kaset plazmidlerini "çok genli" plazmidlere monte etmek:
NOT: Çok genli plazmidler birden fazla genin ifadesini sağlar. Aşağı akış uygulamasına bağlı olarak, çok genli plazmidler çoğaltıcı veya bütünleştirici olabilir. Çoğaltıcı plazmidler replikasyon maya kökenine sahiptir; bu nedenle, maya hücresi bölündüğünde dikkatlice muhafaza edilebilir. Bütünleştirici plazmidler replikasyon maya kökenine sahip değildir. Bunun yerine, homolog rekombinasyon yoluyla birden fazla genin genomun belirli bir locisine entegrasyonunu sağlayan 5' ve 3' homoloji kollarına sahiptirler.
- Çok genli plazmidler için önce bir ara vektör monte edin.
- Çoğaltıcı ara vektörleri birleştirmek için (Şekil 4A), aşağıdaki altı parçayı birleştirin: sol konektör (ConLS'-pYTK008), sfGFP bırakma (pYTK047), sağ konektör (ConRE'-pYTK072), bir maya seçim işaretçisi, replikasyonun maya kaynağı ve mRFP1 ile parça plazmidi, bir E. coli replikasyon kaynağı ve kanamycin dirençli gen (pYTK084).
- Derleme için 3.1.1 ile 3.1.3 arasında adımları izleyin.
- Tüm klonlama reaksiyon karışımını DH5α veya eşdeğer E. coli yetkin hücrelere dönüştürün ve LB artı 50 μg/mL kanamycin (Km) üzerindeki plakayı dönüştürün. Gece boyunca 37 °C'de kuluçkaya yaslanın.
- Kırmızı/yeşil renk tabanlı tarama için 3.1.5 adımlarını izleyin.
- Yanlış montajların taranmasına yönelik olarak, yeşil kolonileri lb + km plaka üzerinde çizgi edin ve büyütün. Ardından 3.1.6 adımını izleyin.
- Bütünleştirici çok genli vektörler için (Şekil 4B), önce ilgi çekici genomik lokusu belirleyin, ardından bu çekirgeye entegre olmak için yaklaşık 500 baz çift 5' ve 3' homoloji kolu tasarlayın.
- Maya genomik DNA'sından 5' ve 3' homoloji kollarını vektör-pYTK001 girişine klonla. 1. ve 2.
- Aşağıdaki yedi plazmidi birleştirin: sol konektör (ConLS'-pYTK008), sfGFP bırakma (pYTK047), sağ konektör (ConRE'-pYTK072), maya seçim işaretçisi, 3' homoloji kolu, mRFP1 ile parça plazmid, replikasyon E. coli kaynağı ve kanamycin dirençli gen (pYTK090) ve 5' homoloji kolu.
- Montaj ve tarama için 4.1.1 adımlarını izleyin.
- Çoğaltıcı ara vektörleri birleştirmek için (Şekil 4A), aşağıdaki altı parçayı birleştirin: sol konektör (ConLS'-pYTK008), sfGFP bırakma (pYTK047), sağ konektör (ConRE'-pYTK072), bir maya seçim işaretçisi, replikasyonun maya kaynağı ve mRFP1 ile parça plazmidi, bir E. coli replikasyon kaynağı ve kanamycin dirençli gen (pYTK084).
- Çok genli plazmid montajı
- Adım 4.1'de elde edilen ara vektörün plazmidlerini ve 3. Konsantrasyonlarını bir UV-Vis spektrofotometresi veya floresan bazlı bir test kullanarak kaydedin. Her biri ddH2O'da seyreltin, böylece 1 μL 20 fmol DNA'ya sahiptir.
- 1 μL ara vektör, her transkripsiyon ünitesinin 1 μL'si, 1 μL 10x T4 ligaz tamponu, 0,5 μL Esp3I ve 0,5 μL T4 ligaz ekleyin. DDH2O kullanarak hacmi 10 μL'ye getirin.
- Klonlama reaksiyonlarını ayarlamak için 2.2 adımını izleyin.
- Tüm klonlama reaksiyon karışımını DH5α veya eşdeğer E. coli yetkin hücrelere dönüştürün ve LB + Km. Incubate'de bir gecede 37 °C'de plakalayın.
- Yeşil/beyaz taramayı adım 3.2.5'te olduğu gibi gerçekleştirin.
- Plazmidleri birkaç beyaz koloniden arındırın ve kısıtlama sindirimi gerçekleştirin. NotI-HF enziminin kullanılması önerilir, çünkü E. coli orijin ve Km seçim işaretleyici kısmında sırasıyla iki NotI bölgesi vardır (Şekil 4B). Monte edilen plazmid çok büyükse, daha fazla onay için başka bir kısıtlama bölgesi seçilebilir. Alternatif olarak, kısıtlama sindirimine geçmeden önce koloni PCR ile ekran.
5. Kromozomal veya plazmid bazlı gen ekspresyözü için çok genli plazmidlerin uygulanması
- Kromozomal gen ekspresyözü için çok genli plazmidi maya genomuna entegre etmek (Şekil 5)
- İstenilen lokus için bir kılavuz RNA (gRNA) tasarlayın. Benchling, CRISPRdirect43ve CHOPCHOP44gibi birden çok çevrimiçi kaynağın kullanılması, hedefteki maksimum özgüllüğü belirlemeniz önerilir.
- Sentezlenen 20 nt gRNA'yı Gibson klonlayarak pCAS plazmid45'e klonlayın. PCAS plazmidini, sırasıyla HDV riboziminin 3' ve tracrRNA'nın 5' ine bağlayan ters bir astar çifti kullanarak PCR ile doğrusallaştırın (Şekil 5). Alternatif olarak, gRNA'yı sgRNA bırakma plazmidine (pYTK050) klonlayın ve bırakma plazmidini bağlayıcılarla bir kaset plazmidine monte edin. Ardından Cas9 TU'yu Cas9 parça plazmid (pYTK036) ile birleştirin. Son olarak, Cas9 TU ve sgRNA TU'ları çoğaltıcı çok genli bir plazmid halinde birleştirin.
- 5-15 μg bütünleştirici çok genli plazmidi bir gecede 1 μL NotI-HF enzimi ile doğrusallaştırın. 1 μg pCAS-gRNA ve doğrusal bütünleştirici çok genli plazmidi S. cerevisiae'yedönüştürün. Piyasada bulunan maya dönüşüm kitini kullanarak veya Geitz ve Schiestl protokolüne uyarak yetkin hücreler hazırlayın, 200746.
NOT: NotI sindirimi sonrası doğrusallaştırılmış çok genli plazmidi arındırmak gereksizdir. - İyileşmeden sonra hücreleri pelet, süpernatant atın, eşit miktarda su ile yıkayın. Tam sentetik orta (CSM) damlama plakasındaki plaka maya hücreleri veya maya seçici işaretleyiciye bağlı olarak antibiyotikli maya özü pepton dekstroz orta (YPD) plakası. Kolonilerin oluşması için iki gün boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatırın. Koloni görülmezse, 30 ° C'de bir ila iki gün daha kuluçkaya yatırın.
- Koloni PCR47ile entegrasyon için ekran maya kolonileri .
- pCAS'ı iyileştirmek için, seçici olmayan bir YPD plakaya doğru entegrasyonla koloniyi çizgile. Bir gecede 30 °C'de büyüyün. Bir koloniyi YPD plakasından yeni bir YPD plakasına çizin. Yine, bir gecede 30 ° C'de büyüyün. İkinci YPD plakasından pCAS'ın seçim işaretçisi olan YPD artı 100 μg/mL nourseothricin'e bir koloni çizin. Maya hücreleri seçici plakada büyümediğinde başarılı kürlenme meydana gelir.
NOT: pCAS plazmidi seçici olmayan iki turda tedavi edilmemişse, 1-2 tur daha taze bir YPD'ye tekrar serin.
- Plazmid bazlı gen ekspresyel için çoğaltıcı çok genli plazmidi dönüştürme
- 100 ng-1 μg saf çok genli plazmidi S. cerevisiae yetkin hücrelerine dönüştürün.
- Plaka maya hücreleri, kullanılan maya seçim işaretine bağlı olarak CSM damlama plakasına veya YPD artı antibiyotik plakasına dönüşümden hemen sonra. Kolonilerin oluşması için 2-3 gün boyunca 30 °C'de kuluçkaya yatırın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada β karoten (sarı) ve likopen (kırmızı) üretimi için dört çoğaltıcı çok genli plazmid sonuçları. ADE2 lokusunu bozmak için kolonileri kırmızı olan bir bütünleştirici çok genli plazmid inşa edildi.
CDS'leri giriş vektörüne klonlama (pYTK001)
ERG20 maya genomundan ve üç karotenoid gen crtE, crtYB, crtI plazmid pLM49448'den pYTK001 giriş vektörüne açıklandı. Maya promotörleri pENO2, pTIP1, pPYK1 ve pPDC1 ve terminatörler tTDH2, tHSP26, tADH2, tACS2 parça plazmidleri olarak klonlandı. Likopen üretmek için CrtYB'ye (G247A) bir nokta mutasyonu getirildi ve prenil arasını karotenoidlere daha iyi kanalize etmek için bir BTS1-ERG20 füzyon yapısı oluşturuldu. Şekil 6A ve 6B, bir parça plazmidinin başarılı bir şekilde klonlandığını temsili bir plaka gösterir ve 90.35 ±% 4.22 toplam koloninin potansiyel olarak doğru (beyaz) olmasıyla yeşil / beyaz taramanın bir örneğini sağlar.
Transkripsiyon ünitelerinin montajı (kaset plazmidleri)
Kaset plazmidini monte etmeden önce, çok genli plazmid tasarımı son halini ederek tamamlandı. Dört karotenoid TUs için, farklı konektörlere sahip dört ara vektör, 3.1 adımını takiben ilk olarak klonlandı. Şekil 6C ve 6D, ara vektörün başarılı bir montajından temsili bir plaka gösterir ve 17,56 ±% 3,32 toplam koloninin pozitif (yeşil) olduğu kırmızı / yeşil taramaya bir örnek sağlar. Bu oran nispeten düşük olmasına rağmen, tarama yeşil floresan tarafından büyük ölçüde kolaylaştırılmıştır.
Daha sonra, BTS1-ERG20, ERG20, crtE, crtYB, crtYB(G247A)ve crtI için TU'lar 3.2 (Tablo 1) adımını izleyerek birleştirildi. Şekil 6E ve 6F, TU'ların başarılı bir montajının temsili bir plakasını gösterir ve 65.02 ±% 4.99 toplam koloninin pozitif (beyaz) olduğu yeşil / beyaz bir tarama yöntemi örneği sağlar.
Çok genli plazmidlerin montajı
Dört çoğaltıcı ve bir bütünleştirici çok genli plazmid bir araya getirildi. Çoğaltıcı çok genli plazmidler için, ERG20, BTS1-ERG20, crtE, crtYB, crtYB (G247A) ve crtI dört farklı kombinasyonda bir araya getirildi ve dört plazmid oluşturdu: ikisi β-karoten ve ikisi likopen üretimi için (Tablo 2). Ara vektör klonlama için potansiyel olarak doğru kolonilerin (yeşil) oranı 1,83 ±% 0,15 idi(Şekil 7A ve 7B). Bu sayı düşük görünse de yeşil floresan tespit edilerek tarama kolaylaştı (Şekil 7B). Ara plazmid klonlandıktan sonra, ara plazmidlerin (beyaz) montajının başarı oranı 93.77±% 1.65 idi (Şekil 7C ve 7D). Şekil 7E ve 7F, pozitif kolonilerin (beyaz) sayısı ihmal edilebilir olduğu için çok genli plazmidlerin yetersiz bir montajını göstermektedir. Mayaya dönüştükten sonra, β karoten (sarı) ve likopen (kırmızı) üreten koloniler üçüncü günde büyüdü. Her tabaktan dört koloni taze tabaklara serilerek iki gün daha yetiştirildi. Şekil 8A ve 8B, BTS1-ERG20'yi birleştirmenin, sadece ERG20'yi kullanmaktan daha koyu renklerde görüldüğü gibi, karotenoid üretimine doğru daha fazla geranylgeranyl-pyrophosphate yönlendirdiğini göstermektedir. Ekstraksiyon 49 ve karotenoidlerin UV-Vis spektrofotometrisi ile otantik standartlarla ölçülmesi üzerine, BTS1-ERG20'nin füzyonunun, sadece ERG20 ile suş tarafından üretilen 0.021 μg/mg β-karotenden ~35 kat daha yüksek olan 0.729 μg/mg β-karoten üretimine yol açtığı görülmektedir. Aynı şekilde, likopen üretimi bts1-ERG20 (1.126 μg/mg) ile gerinimde sadece ERG20'ye (0.068 μg/mg) kıyasla ~16.5 kat daha yüksektir (Şekil 8C).
Çoğaltıcı çok genli plazmidler (A) BTS1-ERG20 füzyon TU ve (B) ERG20 TU ile mayaya dönüştü. Her plakada, sol taraftaki maya, β üretimi için crtE TU, crtYB TU ve crtI TU içeren plazmidlere sahiptir-sağ tarafta karoten ve maya, likopen üretimi için crtE TU, crtYB (G247A)TU ve crtI TU içeren plazmidlere sahiptir.
Bütünleştirici plazmid için, ConLS', sfGFP bırakma, ConRE', HIS3 (maya seçim işaretleyicisi), ADE2 5' ve 3' homoloji kolları 4.1.2 adımını takiben monte edildi. 5' ve 3' homoloji kolları birbirinden 500 bp uzaktaydı ve entegrasyondan sonra ~180 amino asit silindi. Ek olarak, 5' homoloji kolunun 3' ucuna doğru altı durak kodonu vardı. Mutasyona uğramış ADE2 kırmızı koloniler50ile sonuçlandı. ADE2 gRNA 5'-ATTGGGAC GTATGATTGTTGAGG-3'51 kullanıldı ve genomik entegrasyon için 5.1. 3-4 gün sonra, YPD plakası + 100 μg / mL nourseothricin üzerinde kırmızı koloniler gözlendi, bu da ADE2'nin başarıyla bozulduğunu gösteriyor (Şekil 8D ve 8E).
Şekil 1: Çok genli montaja genel bakış. Montaj üç düzeyde gerçekleşir. In0 düzey 1, CDS veya başka bir parça, genomdan yükseltilir veya sentezlendi ve daha sonra BsmBI (veya Esp3I) enzimi kullanılarak pYTK001 giriş vektörüne klonlanır. ColE1: Çoğaltmanın E. coli kaynağı; CmR: Kloramfenikol dirençli gen. Seviye 2'de, bir promotör, bir CDS ve bir sonlandırıcı içeren transkripsiyon ünitesi (TU) BsaI enzimi kullanılarak monte edilir. Seviye 3'te, BsmBI (veya Esp3I) enzimi kullanılarak çok genli bir plazmid içine beş adede kadar transkripsiyon ünitesi monte edilir. Çok genli plazmid çoğaltıcı veya bütünleştirici olabilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Parça plazmidlerinin astar tasarımı ve klonlama. (A) Tek tek parçaların amplifikasyonu, genlerin evcilleştirilmesi veya nokta mutasyonlarının oluşturulması ve füzyon proteinlerinin montajı için astar tasarımı. Astarlar arasında BsmBI ve BsaI tanıma ve kesim sahaları ve uygun montaj için MoClo çıkıntısı bulunur. MoClo çıkıntıları 1, 2, 3, 4 ve 5, 6, 7, 8 olarak temsil edilir. Evcilme veya füzyon proteini oluşturmak için dahili astarlar BsmBI'yi içerir, ancak BsaI alanlarını içermez. Bunların çıkıntları özelleştirilmiş iç dizilerdir (NNNN ve N'N'N'N' mor). Optimum enzim sindirimi için terminal "ttt" dahildir. GOI: ilgi gen. (B) BsmBI (veya Esp3I) kullanarak güçlendirilmiş parçaları pYTK001 giriş vektörüne klonlama. Tamamlayıcı çıkıntılar parçanın entegrasyonuna ve BsmBI tanıma sitesinin kaldırılmasına yol açar. ColE1: Çoğaltmanın E. coli kaynağı; CmR: Kloramfenikol dirençli gen. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Transkripsiyon ünitesi montajı. TU plazmidlerini monte etmek için, kombinatoryal TU montajını kolaylaştırmak için bir ara vektörün montajı önerilir. Ara vektörü birleştirmek için, Con LX (X: beş sol konektörden biri), sfGFP bırakma, Con RY (Y: beş sağ konektörden biri), bir maya ORI (çoğaltmanın kaynağı) ve bir maya işaretleyici parçasını BsaI enzimini kullanarak mRFP1 bırakma vektörüne klonlayın. Ara plazmid ampisiline karşı dayanıklıdır. BsaI tanıma siteleri TU plazmid klonlama için tutulur. TU plazmidini klonlamak için, bir promotör, bir CDS ve bir sonlandırıcı BsaI kullanılarak ara vektöre monte edilir. Klonlanmış TU, bir sonraki adım çok genli montaj için ConLX ve ConRY bölgelerinde BsmBI bölgelerine sahip olacak. Klonlanmış TU da ampisiline karşı dayanıklıdır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Adı | ConLX (sol bağlayıcı) | Organizatörü | Cd | Sonlandırıcı | ConRY (sağ konektör) |
| BTS/ERG20 Tu | Ls | pENO2 | BTS1/ERG20 | tTDH2 | R1 |
| ERG20 Tu | Ls | pENO2 | ERG20 | tTDH2 | R1 |
| crtE Tu | L1 | pTIP1 | crtE | tHSP26 | R2 |
| crtYB Tu | L2 | pPDC1 | crtYB | tADH2 | R3 |
| crtYBG247A Tu | L2 | pPDC1 | crtYBG247A | tADH2 | R3 |
| crtI Tu | L3 | pPYK1 | crtI | tACS2 | Re |
Tablo 1: Bu çalışmada kullanılan transkripsiyon üniteleri. Organizatörler ve sonlandırıcılar S. cerevisiae'denyükseltildi. BTS1 (geranylgeranyl diphosphate synthase) ve ERG20 (farnesyl pyrophosphate synthetase) S. cerevisiae'denyükseltildi. CrtE (geranylgeranyl diphosphate synthase), crtYB (bifunctional lycopene cyclase/phytoene synthase) ve crtI (fitoene desaturaz) genleri Xanthophyllomyces dendrorhous'tandı.
Şekil 4: Çok genli plazmid montajı. (A) Çoğaltıcı plazmid montajı. Çoğaltıcı ara vektörün montajı, Con LS', sfGFP bırakma, Con RE', bir maya ORI, bir maya işaretleyicisi ve BsaI enzimi kullanılarak mRFP1 bırakma vektörü üzerinde bir E. coli orijin ve işaretleyici klonlama içerir. ConLS' ve ConRE siteleri vektöre BsmBI tanıma sitelerini tanıtır. Potansiyel olarak doğru montajlar kanamycin ile seçici bir plaka üzerinde yeşil koloniler arayarak taranabilir. Daha önce monte edilen TU'lar daha sonra BsmBI enzimi kullanılarak ara vektöre klonlanabilir. Bu plazmid, bir maya konağında çoğalmasını sağlayan bir maya ORI içerir. (B) Bütünleştirici plazmid montajı. Bütünleştirici ara vektörün montajı, Con LS', sfGFP bırakma, Con RE', 5' homoloji kolu, 3' homoloji kolu, maya işaretleyici ve E. coli orijini ve işaretleyicisini BsaI enzimini kullanarak RFP bırakma vektörüne klonlamayı içerir. Doğru montajlar kanamycinli seçici bir plaka üzerinde yeşil görünmelidir. Daha önce yapılan transkripsiyon üniteleri, BsmBI enzimi kullanılarak çoğaltıcı ara vektöre klonlanabilir. Bu vektörün maya ORI'ı yoktur ve CRISPR ve homolog rekombinasyon yoluyla hedef lokusa entegre edilecektir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Adı | TU1 | TU2 | TU3 | TU4 | Ürün |
| B/E-β-Karoten | BTS1/ERG20 | crtE | crtYB | crtI | β karoten |
| B/E-Likopen | BTS1/ERG20 | crtE | crtYBG247A | crtI | Likopen |
| E-β-Karoten | ERG20 | crtE | crtYB | crtI | β karoten |
| E-Likopen | ERG20 | crtE | crtYBG247A | crtI | Likopen |
Tablo 2: Bu çalışmada kullanılan çok genli Plazmidler.
Şekil 5: CRISPR entegrasyonu. (A) CRISPR ve yardımcı plazmid klonlama. pCAS plazmid, bir gRNA'nın optimal ekspresyonu için Cas9 endonuclease ve bileşenlerini (tRNA promotörü, SNR52 sonlandırıcı, HDV ribozim ve tracrRNA) içerir. Sentetik gRNA'yı Gibson klonlama kullanarak doğrusallaştırılmış pCAS ile birleştirerek pCAS +gRNA plazmidini klonlayın. (B) CRISPR destekli genetik entegrasyon. Adım 1: Kotransformasyon: pCAS +gRNA, ilgi genlerini (GOI), bir maya seçici işaretleyicisini ve genomik lokusu hedefleyen 5' ve 3' homoloji bölgesini içeren bütünleştirici plazmid ile mayaya dönüştürüldü. Optimum entegrasyon için, bütünleştirici plazmidi NotI ile doğrusallaştırın. Adım 2: Hedef lokusta entegrasyon: Dönüştürülmüş mayayı, antibiyotik veya auxotrophic maya işaretleyicisi için seçici bir plaka üzerinde yetiştirmek. Tümleştirmeyi onaylamak için genotipleme gerçekleştirin. Adım 3: Seçici olmayan bir plaka üzerinde maya çizerek pCAS + gRNA plazmidini tedavi edin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: E. coli'de giriş vektörü ve transkripsiyon ünitesi seviye klonlamanın temsili plakaları. Bir genin pYTK001 giriş vektörüne(A)görünür ışık ve (B) UV ışığı altında başarılı bir şekilde klonlamasının temsili plakaları. Pozitif koloniler beyaz, negatif koloniler yeşildir. Pozitif kolonilerin genel koloni oranı %4,22 ± 90,35'tir. Transkripsiyon ünitesi seviye montajı ve (C) görünür ışık ve (D) UV ışığı altında yeşil / kırmızı seçim için ara vektörün başarılı montajı. Pozitif koloniler yeşildir. Pozitif kolonilerin genel koloni oranı %3,32 ± 17,56'dır. Transkripsiyon ünitesinin ara vektörden başarılı bir şekilde montajı ve (E) görünür ışık ve (F) UV ışığı altında yeşil / beyaz tarama. Pozitif koloniler beyaz, negatif koloniler yeşildir. Pozitif kolonilerin genel koloni oranı: 65.02 ± % 3.32' dir. Veriler üç biyolojik kopyadan. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: E. coli'deçok genli plazmid klonlamanın temsili plakaları. Çok gen seviyesi montajı için ara vektörün montajı ve (A) görünür ışık ve (B) UV ışığı altında kırmızı / yeşil seçim. Pozitif koloniler yeşil, negatif koloniler kırmızıdır. Pozitif kolonilerin genel koloni oranı %0,15 ± 1,83'tür. Görünür ışık ve(D) UV ışığı altında ara vektör ve yeşil/beyaz seleksiyondan(C)birden fazla TU'nun başarılı bir şekilde montajı. Pozitif koloniler beyazdır. Pozitif kolonilerin genel koloni oranı %1,65 ± 93,77'dir. Çok genli plazmidlerin (E) görünür ışık ve (F) UV ışığı altında suboptimal montajı. Pozitif kolonilerin sayısı ihmal edilebilir. Veriler üç biyolojik kopyadan. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 8: Mayadaki bütünleştirici ve çoğaltıcı plazmidlerin temsili plakaları. Çoğaltıcı çok genli plazmidler (A) BTS1-ERG20 füzyon TU ve (B) ERG20 TU ile mayaya dönüştü. Her plakada, sol taraftaki maya, β üretimi için crtE TU, crtYB TU ve crtI TU içeren plazmidlere sahiptir-sağ tarafta karoten ve maya, likopen üretimi için crtE TU, crtYB (G247A)TU ve crtI TU içeren plazmidlere sahiptir. (C) bir UV-vis spektrometresi kullanarak dört çok genli plazmid ile maya özünden β karoten ve likopen ölçülmesi. Maksimal emiciliği sırasıyla β karoten ve likopen için 450 nm ve 470 nm olarak kaydedildi. Mutlak niceleme otantik standartlar kullanılarak gerçekleştirildi (Tamamlayıcı Şekil S3). BTS1-ERG20'nin füzyonu, sadece ERG20'ye kıyasla ~35 kat daha yüksek β karoten ve ~16,5 kat daha yüksek likopen üretimine yol açar. ADE2 lokusun bozulması için temsili plakalar, çok genli bütünleştirici plazmidin bir gRNA ve yardımcı DNA(D)ile ve gRNA ve çok genli bütünleştirici plazmid ile yardımcı DNA(E)olarak entegrasyonu ile. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Tamamlayıcı Malzemeler. Bu dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Lee ve arkadaşları tarafından geliştirilen MoClo tabanlı klonlama kiti, maya genomuna çoğaltma veya entegrasyon için bir ila beş transkripsiyon ünitesinin çok genli bir plazmid içine hızlı bir şekilde montajı için mükemmel bir kaynak sağlar. Bu kitin kullanımı, mayadaki birden fazla geni ifade etmek için sıklıkla var olan zaman alıcı klonlama darboğazını ortadan kaldırır.
T4 DNA ligaz ile Golden Gate klonlamanın sindirim/ligasyon döngüleri için beş farklı koşulu test ettik. 5 dakika boyunca 37 °C'de 30 sindirme döngüsünün ve 5 dakika boyunca 16 °C'de ligasyonun ardından 10 dakika boyunca 50 °C'de son bir sindirim adımının ve 10 dakika boyunca 80 °C'de bir protein inaktivasyon adımının 4 parçalı bir montajda potansiyel olarak doğru olan% 99,5 koloni ile sonuçlandığını bulduk(Ek Şekil S1 ve Tablo S3). 16 °C'de ligasyon, optimum bağ aktivitesi ve çıkınlı tavlama sağlar. 50 °C'de son sindirim, sindirilen ürünlerin yeniden ligasyonunu önler. Aksi belirtilmedikçe, bu döngü tüm derleme reaksiyonları için izlendi.
Ayrıca, optimum sonuçlar için özel dikkat gerektiren bazı kritik adımlar bulduk. Transkripsiyon ünitelerini monte etmeden önce ara vektörlerin sfGFP bırakma ile bir araya getirilmesini şiddetle öneririz. Teorik olarak, yedi parça da mRFP1 ile E. coli vektörüne klonlanabilir ve ardından kırmızı/ beyaz tarama yapılabilir. Bununla birlikte, pratikte, mRFP1 çok yavaş renk geliştirir ve görünür ışık altında soluk kırmızı ve soluk sarı E. coli kolonilerini ayırt etmek zordur. SfGFP UV aralığında emdiği gibi52UV veya mavi ışık transilluminator kullanarak parlak yeşil koloniler için tarama kolaylaştırır. Ayrıca, bir ara vektörün klonlandırılması, çeşitli promotör, CDS ve terminatör kombinasyonlarının daha facile montajına izin verir ve dört parçalı bir montaj genellikle daha fazla parçaya sahip bir montajdan daha olumlu kolonilerle sonuçlanır, çünkü daha kolay bir kombinatoryal kütüphane oluşturulmasını sağlar. Ek Şekil S2, potansiyel olarak doğru kolonilerin 6 parçalık bir montajdan 8 parçalı bir montaja oranında aşamalı bir düşüş olduğunu göstermektedir.
Her parçanın equimolar konsantrasyonunun sağlanması için tüm parçaların konsantrasyonları titizlikle ölçülmelidir. Parçaların UV-Vis spektrometresi kullanılarak ölçülmesi genellikle yeterlidir, ancak floresan bazlı tahliller gibi daha hassas yöntemler daha iyi sonuçlar verebilir. Tüm parçaların doğru bir şekilde ölçülememesi genellikle düşük montaj verimliliğine neden olur. Sırasıyla yüksek verimli Esp3I ve BsaI-HFv2 seçilmelidir. T4'ün kitteki hem çıkıntılar hem de özelleştirilmiş çıkıntılar için iyi çalıştığını gözlemledik, bu iki parçayı kaynaştırmak için gereklidir, bu da literatür36ile tutarlıdır , orijinal makale T7 ligase6. Döngü sayısını artırmak, potansiyel olarak doğru kolonilerin sayısını bir dereceye kadar artırabilir. Örneğin, üç ila dört parçayı birleştirmek için 25 sindirme ve ligasyon döngüsü yeterlidir, ancak 30-35 döngü daha fazla parça için daha iyi sonuçlar verir.
MolClo stratejisi, modüler ve çok yönlü klonlamaya izin verdiği için alternatif çok parçalı montaj yöntemleri8,9,10,11,12'ye göre avantajlıdır. Ancak, parçaların bazen birden çok BsmBI, BsaI veya NotI sitesi olduğundan, birincil sınırlama evcillaştırma adımıdır. Tüm parçaların mutasyona uğraması zaman alabilir. Bu durumda, bu kısıtlama siteleri olmadan CDS sentezlemeyi düşünebilirsiniz. Ancak, organizatörler ve sonlandırıcılar için, tek bir nükleotid bile mutasyona uğramak işlevlerini değiştirebilir. Bu nedenle, bu parçaların aktivitesinin bir muhabir tahlili kullanılarak doğrulandırılması önerilir39. Başka bir sınırlama, bu kitin çok genli bir plazmidde sadece beş transkripsiyon ünitesine izin vermesidir. Daha fazla transkripsiyon ünitesi isteniyorsa, son derece uyumlu bir çıkıntı kümesi seçilerek ek konektörleroluşturulabilir 36.
Kit, 27 promotör, altı sonlandırıcı, yedi maya seçim işareti ve iki maya orijini sağlar. Yerel veya sentetik promotörler ve sonlandırıcılar gibi özelleştirilmiş parçalar, bu protokolü izleyen giriş vektörüne klonlanabilir. Maya MoClo kiti, öncelikle mayada yüksek değerli kimyasallar üretmek için çok genli metabolik yolları aşırı ifade etmek için kullanılmıştır. Bu protokol, mayada biyolojik devreler için farklı anahtarlar istendiğinde de kullanılabilir. Bu kiti protein-protein etkileşimleri, protein lokalizasyonu ve enzim aktiviteleri hakkındaki temel biyolojik soruların araştırılması için uygulamak için muazzam bir potansiyel de vardır. Genel olarak, bu protokol son derece esnek ve güvenilirdir ve maya biyolojisinde herhangi bir zorlu klonlamayı destekleyebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma New York Eyalet Üniversitesi Araştırma Vakfı (Ödül #: 71272) ve Buffalo Üniversitesi IMPACT Ödülü (Ödül #: 000077) tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mm Glass beads | RPI research products | 9831 | For lysing yeast cells |
| Bacto Agar | BD & Company | 214010 | Component of the yeast complete synthetic medium (CSM) |
| Bacto Peptone | BD& Company | 211677 | Component of the yeast extract peptone dextrose medium (YPD) |
| BsaI-HFv2 | New England Biolabs | R3733S | a highly efficient version of BsaI restriction enzyme |
| Carbenicillin | Fisher Bioreagents | 4800-94-6 | Antibiotic for screening at the transcription unit level |
| Chloramphenicol | Fisher Bioreagents | 56-75-7 | Antibiotic for screening at the entry vector level |
| CSM-His | Sunrise Sciences | 1006-010 | Amino acid supplement of the yeast complete synthetic medium (CSM) |
| Dextrose | Fisher Chemical | D16-500 | Carbon source of the yeast complete synthetic medium (CSM) |
| Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids | BD & Company | 291940 | Nitrogen source of the yeast complete synthetic medium (CSM) |
| dNTP mix | Promega | U1515 | dNTPs for PCR |
| Esp3I | New England Biolabs | R0734S | a highly efficient isoschizomer of BsmBI |
| Frozen-EZ Yeast Trasformation II Kit | Zymo Research | T2001 | For yeast transformation |
| Hexanes | Fisher Chemical | H302-1 | For carotenoid extraction from yeast cells |
| Kanamycin | Fisher Bioreagents | 25389-94-0 | Antibiotic for screening at the multigene plasmid level |
| LB Agar, Miller | Fisher Bioreagents | BP1425-2 | Lysogenic agar medium for E. coli culturing |
| LB Broth, Miller | Fisher Bioreagents | BP1426-2 | Lysogenic liquid medium for E. coli culturing |
| Lycopene | Cayman chemicals | NC1142173 | For lycopene quantification |
| MoClo YTK | Addgene | 1000000061 | Depositing Lab: John Deuber |
| Monarch Plasmid Miniprep Kit | New England Biolabs | T1010L | For plasmid purification from E.coli |
| Nanodrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND2000c | For measuring accurate DNA concentrations |
| NotI-HF | New England Biolabs | R3189S | Restriction enzyme for integrative multigene plasmid linearization |
| Nourseothricin Sulphate | Goldbio | N-500-100 | Antibiotic Selection marker for the pCAS plasmid used in this study |
| Phusion HF reaction Buffer (5X) | New England Biolabs | B0518S | Buffer for PCR using Phusion polymerase |
| Phusion High Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530S | High fidelity polymerase for all the PCR reactions |
| pLM494 | Addgene | 100539 | Plasmid used to amplify crtI, crtYB and crtE used in this study |
| Quartz Cuvette | Thermo Electron | 10050801 | For quantifing carotenoids |
| T4 ligase | New England Biolabs | M0202S | Ligase for Golden Gate cloning |
| Thermocycler | BIO-RAD | 1851148 | For performing all the PCR and cloning reactions |
| Tissue Homogenizer | Bullet Blender | Model: BBX24 | For homogenization of yeast cells |
| UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | Genesys 150 | For quantifing carotenoids |
| Yeast Extract | Fisher Bioreagents | BP1422-500 | Component of the yeast extract peptone dextrose medium (YPD) |
| β-carotene | Alfa Aesar | AAH6010603 | For β-carotene quantification |
References
- Endy, D.
- Engler, C., Gruetzner, R., Kandzia, R., Marillonnet, S. Golden gate shuffling: a one-pot DNA shuffling method based on type IIs restriction enzymes. PLoS One. 4 (5), 5553 (2009).
- Shetty, R. P., Endy, D., Knight, T. F. Engineering BioBrick vectors from BioBrick parts. Journal of Biological Engineering. 2, 5 (2008).
- Peccoud, J., et al. A Modular cloning system for standardized assembly of multigene constructs. PLoS ONE. 6 (2), (2011).
- Sarrion-Perdigones, A., et al. GoldenBraid: an iterative cloning system for standardized assembly of reusable genetic modules. PLoS One. 6 (7), 21622 (2011).
- Lee, M. E., DeLoache, W. C., Cervantes, B., Dueber, J. E. A Highly characterized yeast toolkit for modular, multipart assembly. ACS Synthetic Biology. 4 (9), 975-986 (2015).
- Andreou, A. I., Nakayama, N. Mobius assembly: A versatile Golden-Gate framework towards universal DNA assembly. PLoS One. 13 (1), 0189892 (2018).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Li, M. Z., Elledge, S. J. Harnessing homologous recombination in vitro to generate recombinant DNA via SLIC. Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).
- Geu-Flores, F., Nour-Eldin, H. H., Nielsen, M. T., Halkier, B. A. USER fusion: a rapid and efficient method for simultaneous fusion and cloning of multiple PCR products. Nucleic Acids Research. 35 (7), 55 (2007).
- de Kok, S., et al. Rapid and reliable DNA assembly via ligase cycling reaction. ACS Synthetic Biology. 3 (2), 97-106 (2014).
- Shao, Z., Zhao, H., Zhao, H. DNA assembler, an in vivo genetic method for rapid construction of biochemical pathways. Nucleic Acids Research. 37 (2), 16 (2009).
- Gibson, D. G. Synthesis of DNA fragments in yeast by one-step assembly of overlapping oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 37 (20), 6984-6990 (2009).
- Engler, C., et al. A golden gate modular cloning toolbox for plants. ACS Synthetic Biology. 3 (11), 839-843 (2014).
- Gantner, J., et al. Peripheral infrastructure vectors and an extended set of plant parts for the Modular Cloning system. PLoS One. 13 (5), 0197185 (2018).
- Ordon, J., et al. Generation of chromosomal deletions in dicotyledonous plants employing a user-friendly genome editing toolkit. Plant Journal. 89 (1), 155-168 (2017).
- Sarrion-Perdigones, A., et al. GoldenBraid 2.0: a comprehensive DNA assembly framework for plant synthetic biology. Plant Physiology. 162 (3), 1618-1631 (2013).
- Agmon, N., et al. Yeast Golden Gate (yGG) for the efficient assembly of S. cerevisiae transcription units. ACS Synthetic Biology. 4 (7), 853-859 (2015).
- Hernanz-Koers, M., et al. FungalBraid: A GoldenBraid-based modular cloning platform for the assembly and exchange of DNA elements tailored to fungal synthetic biology. Fungal Genetics and Biology. 116, 51-61 (2018).
- Prielhofer, R., et al. GoldenPiCS: a Golden Gate-derived modular cloning system for applied synthetic biology in the yeast Pichia pastoris. BMC Systems Biology. 11 (1), 123 (2017).
- Celinska, E., et al. Gate Assembly system dedicated to complex pathway manipulation in Yarrowia lipolytica. Microbial Biotechnology. 10 (2), 450-455 (2017).
- Pullmann, P. K., et al. A modular two yeast species secretion system for the production and preparative application of fungal peroxygenases. bioRxiv. , (2020).
- Wu, D., Schandry, N., Lahaye, T. A modular toolbox for Golden-Gate-based plasmid assembly streamlines the generation of Ralstonia solanacearum species complex knockout strains and multi-cassette complementation constructs. Molecular Plant Pathology. 19 (6), 1511-1522 (2018).
- Moore, S. J., et al. EcoFlex: A multifunctional MoClo kit for E. coli synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 5 (10), 1059-1069 (2016).
- Iverson, S. V., Haddock, T. L., Beal, J., Densmore, D. M. CIDAR MoClo: Improved MoClo assembly standard and new E. coli part library enable rapid combinatorial design for synthetic and traditional biology. ACS Synthetic Biology. 5 (1), 99-103 (2016).
- Vasudevan, R., et al. CyanoGate: A modular cloning suite for engineering cyanobacteria based on the plant MoClo syntax. Plant Physiology. 180 (1), 39-55 (2019).
- Leonard, S. P., et al. Genetic Engineering of bee gut microbiome acteria with a Ttoolkit for modular assembly of broad-host-range plasmids. ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1279-1290 (2018).
- Schwartz, M. L., Jorgensen, E. M. SapTrap, a toolkit for high-throughput CRISPR/Cas9 gene modification in Caenorhabditis elegans. Genetics. 202 (4), 1277-1288 (2016).
- Martella, A., Matjusaitis, M., Auxillos, J., Pollard, S. M., Cai, Y. EMMA: An extensible mammalian modular assembly toolkit for the rapid design and production of diverse expression vectors. ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1380-1392 (2017).
- Chiasson, D., et al. A unified multi-kingdom Golden Gate cloning platform. Scientific Reports. 9 (1), 10131 (2019).
- Denby, C. M., et al. Industrial brewing yeast engineered for the production of primary flavor determinants in hopped beer. Nature Communications. 9 (1), 965 (2018).
- Awan, A. R., et al. Biosynthesis of the antibiotic nonribosomal peptide penicillin in baker's yeast. Nature Communications. 8, 15202 (2017).
- Leavitt, J. M., et al. Biosensor-Enabled Directed evolution to improve muconic acid production in Saccharomyces cerevisiae. Biotechnology Journal. 12 (10), (2017).
- Hsu, T. M., et al. Employing a biochemical protecting group for a sustainable indigo dyeing strategy. Nature Chemical Biology. 14 (3), 256-261 (2018).
- Grewal, P. S., Modavi, C., Russ, Z. N., Harris, N. C., Dueber, J. E. Bioproduction of a betalain color palette in Saccharomyces cerevisiae. Metabolic Engineering. 45, 180-188 (2018).
- Potapov, V., et al. Comprehensive profiling of four base overhang ligation fidelity by T4 DNA ligase and application to DNA assembly. ACS Synthetic Biology. 7 (11), 2665-2674 (2018).
- Vazquez-Vilar, M., et al. Software-assisted stacking of gene modules using GoldenBraid 2.0 DNA-assembly framework. Methods in Molecular Biology. 1284, 399-420 (2015).
- Pullmann, P., et al. Mutagenesis: An efficient multi-site-saturation mutagenesis approach by Golden Gate cloning with automated primer design. Scientific Reports. 9 (1), 10932 (2019).
- Engler, C., Sylvestre, M. DNA Cloning and Assembly Methods. Valla, S., Lale, R. 1116, Humana Press. Ch. 9 119-131 (2014).
- Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC Biotechnology. 8, 91 (2008).
- Chen, X., Zaro, J. L., Shen, W. C. Fusion protein linkers: property, design and functionality. Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (10), 1357-1369 (2013).
- Mullis, K., et al. Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 51, Pt 1 263-273 (1986).
- Naito, Y., Hino, K., Bono, H., Ui-Tei, K. CRISPRdirect: software for designing CRISPR/Cas guide RNA with reduced off-target sites. Bioinformatics. 31 (7), 1120-1123 (2015).
- Labun, K., et al. CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Research. 47 (1), 171-174 (2019).
- Ryan, O. W., et al. Selection of chromosomal DNA libraries using a multiplex CRISPR system. Elife. 3, (2014).
- Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nature Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).
- Heintz, N., Gong, S. Small-scale preparations of yeast DNA. Cold Spring Harbor Protocols. 2020 (10), (2020).
- Hochrein, L., Mitchell, L. A., Schulz, K., Messerschmidt, K., Mueller-Roeber, B. L-SCRaMbLE as a tool for light-controlled Cre-mediated recombination in yeast. Nature Communications. 9 (1), 1931 (2018).
- Verwaal, R., et al. High-level production of beta-carotene in Saccharomyces cerevisiae by successive transformation with carotenogenic genes from Xanthophyllomyces dendrorhous. Applied and Environmental Microbiology. 73 (13), 4342-4350 (2007).
- Jones, E., et al. The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Metabolism and Gene Expression. Strathern, J. N., Jones, E. W., Broach, J. R. 11, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Ch. Regulation of amino acid and nucleotide biosynthesis in yeast 181 (1982).
- Sehgal, N., et al. CRISPR gene editing in yeast: an experimental protocol for an upper-division undergraduate laboratory course. Biochemistry and Molecular Biology Education. 46 (6), 592-601 (2018).
- Stepanenko, O. V., Stepanenko, O. V., Kuznetsova, I. M., Verkhusha, V. V., Turoverov, K. K. Sensitivity of superfolder GFP to ionic agents. PLoS One. 9 (10), 110750 (2014).
