Summary
このプロトコルの目的は、ゴールデンゲートクローニングに基づくモジュラークローニングシステムを使用して、マルチ遺伝子構造を組み立てるための詳細なステップバイステップガイドを提供することです。また、当社の経験に基づいて最適なアセンブリを確保するための重要な手順に関する推奨事項も示します。
Abstract
ゴールデンゲートクローニング法は、ユーザー定義の配置で複数の遺伝子の迅速な組み立てを可能にします。それは彼らの認識部位の外に切り取り、短い突出しを作成するタイプIIS制限酵素を利用する。このモジュラークローニング(MoClo)システムは、プロモーター、コード配列(CDS)、ターミネーターなどの異なるDNA部分を最初にエントリーベクターにクローン化する階層的なワークフローを使用します。複数のエントリ ベクターは、転写単位に組み立てられます。その後、いくつかの転写ユニットが多遺伝子プラスミドに接続します。ゴールデンゲートクローニング戦略は、1ポット反応で、瘢痕、方向性、モジュール式の組み立てを可能にするため、大きな利点があります。階層ワークフローは通常、エントリベクターを超えてシーケンシングを必要としない、さまざまな多遺伝子構造の簡単なクローニングを可能にします。蛍光タンパク質ドロップアウトを使用することで、簡単な目視スクリーニングが可能です。この研究は、酵母モジュラークローニング(MoClo)キットを使用してマルチ遺伝子プラスミドを組み立てるための詳細なステップバイステップのプロトコルを提供します。多遺伝子プラスミド集合体の最適および最適以下の結果を示し、コロニーのスクリーニングのためのガイドを提供する。このクローニング戦略は、酵母代謝工学や多遺伝子プラスミドクローニングが必要な他の状況に非常に適用可能です。
Introduction
合成生物学は、製薬、農業、化学産業に役立つ新しい機能を備えた生物学的システムの設計を目指しています。大量のDNA断片をハイスループットに組み立てることは、合成生物学の基礎技術です。このような複雑なプロセスは、複雑さの減少に伴って複数のレベルに分けることができます, 基礎工学科学から借用概念1,2.合成生物学では、DNA断片は通常、機能性に基づいて階層的に組み立てられる:(i)部分レベル:「部品」は、プロモーター、コーディング配列、ターミネーター、複製の起源などの特定の機能を持つDNA断片を指します。(ii) 転写単位(TU)レベル:TUは、プロモーター、コード配列、および単一の遺伝子を転写することができるターミネーターからなる。(iii) 多遺伝子レベル:多遺伝子プラスミドは、代謝経路全体からしばしば構成される複数のTUsを含む。BioBrick コミュニティによって開拓されたこの階層的なアセンブリは、合成生物学3での大量の DNA の組み立てのための基本的な概念です。
過去10年間で4,5,6,7,ゴールデンゲートクローニング技術は、階層DNAアセンブリ2を大幅に促進しました。ギブソンクローニング8、ライゲーション非依存クローニング(SLIC)9、ウラシル切除基クローン(USER)10、リガーゼサイクリング反応(LCR)11、およびインビボ組換え(DNAアセンブラー)12、13など、他の多部クローニング法もこれまでに開発されてきた。しかし、ゴールデンゲートクローニングは、遺伝子固有の配列から独立しているため、理想的なDNA組み立て方法であり、1ポット反応で瘢痕のない方向性のあるモジュール式アセンブリを可能にします。ゴールデンゲートクローニングは、非パリンドローム配列を認識するタイプIIS制限酵素を利用して、認識部位2の外側にずらした突出しを作成する。リガーゼは、その後、アニールされたDNA断片を結合して、マルチパートアセンブリを得る。このクローニング戦略をモジュラークローニング(MoClo)システムに適用することで、正しく組み立てられたコンストラクト4を含む90%以上の形質転換体をスクリーニングした最大10個のDNA断片の組み立てが可能になりました。
MoCloシステムは合成生物学の設計ビルドテスト周期を加速させた大きな利点を提供する。まず、交換可能な部分は、パラメータの大きなスペースを迅速にテストするために組み合わせクローニングを可能にします。例えば、代謝経路を最適化するには、通常、経路フラックスのバランスをとるために、各遺伝子に対して多くのプロモーターを循環させる必要があります。MoCloシステムは、このような厳しいクローン作成タスクを容易に処理できます。第二に、一部のプラスミドを配列する必要がありますが、通常はTUまたは多遺伝子プラスミドではありません。ほとんどの場合、コロニーPCRまたは制限消化によるスクリーニングは、TUおよび多遺伝子プラスミドレベルでの検証に十分です。これは、プラスミドの部分をクローニングすることがPCRを必要とする唯一のステップであり、突然変異を頻繁に導入するためである。第三に、MoCloシステムは、多遺伝子複合体代謝経路を構築するのに理想的である。最後に、普遍的な張り出しのために、一部のプラスミドを再利用し、バイオエンジニアリングコミュニティ全体と共有することができます。現在、MoCloキットは、植物14、15、5、16、17、真菌6、18、19、20、21、22、細菌7、23、24、25、26、27、および動物28、29のために利用可能です。マルチ王国のMoCloプラットフォームも最近導入されました30.
サッカロミセス・セレビシエのために、Leeら6は、酵母合成生物学コミュニティのための優れたリソースである汎用性の高いMoCloツールキットを開発しました。このキットは便利な96ウェル形式で提供され、適切に特徴づけられるプロモーター、蛍光タンパク質、ターミネーター、ペプチドタグ、選択マーカー、複製の起源、およびゲノム編集ツールを多様に集め、8種類の交換可能なDNA部品を定義します。このツールキットは、最大5つの転写ユニットを多遺伝子プラスミドに組み立て可能にします。これらの特徴は、部分的または全体の経路が標的化学物質を産生するために過剰発現される酵母代謝工学にとって貴重である。このキットを用いて、研究者は、酵母におけるゲラニオール、リナロール31、ペニシリン32、ムコニン酸33、インジゴ34、およびベタレイン35の生産を最適化しました。
ここでは、MoCloツールキットを使用してエピソードまたはゲノム発現のための多遺伝子経路を生成する方法を導く詳細なステップバイステップのプロトコルを提供します。このキットを多用することで、ゴールデンゲート反応における各部の正孔分布を確保するために、DNA濃度の正確な測定が重要であることを発見しました。また、T7 DNAリガーゼよりもT4 DNAリガーゼを使用することをお勧めします。最後に、BsmBIおよびBsaIの内部認識サイトは、組み立て前に削除または家畜化する必要があります。あるいは、複数の内部部位を除去し、同時にコドン最適化を達成するために、部品を合成することを検討してもよい。我々は 、S.セレビシエ でβカロテンおよびリコピン産生のための5遺伝子経路を発現することによって、このツールキットを使用する方法を実証する。さらに、このキットのゲノム編集ツールを使用して ADE2 軌跡をノックアウトする方法を示します。これらの色ベースの実験は、可視化を容易にするために選択された。また、ゴールデンゲートクローニングを用いて融合タンパク質を生成し、アミノ酸変異を作り出す方法も実証します。
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Protocol
注: このツールキットで提供される階層的なクローニングプロトコルは、3つの主要なステップに分けることができます: 1. 部分プラスミドのクローニング;2. クローニング転写ユニット (TI)3. 多遺伝子プラスミドのクローニング (図 1)。このプロトコルはプライマー設計から始まり、クローン化された多遺伝子プラスミドの適用で終わる。
1. プラスミド(pYTK001)のクローンを作成するためのプライマー設計:
- 5'末端に隣接するヌクレオチドTTTを含む順および逆プライマー、追加のヌクレオチド(CGTCTCN)を有するBsmBI認識部位、4ヌクレオチド(nt)オーバーハング(TCGG)を、追加のヌクレオチド(GGTCTCN)を有するBsaI認識部位(GGTCTCN)、および4-nt部分特異的オーバーハンを設計する。GoldenBraid 4.037 とゴールデンムタジェネシス38 は、ゴールデンゲート固有のプライマー設計に使用できるオンラインソフトウェアの一部です。
- BsaI または BsmBI 認識サイトが任意の部分に存在する場合は、ゴールデン ゲート アセンブリ39の前にこれらのサイトを変更する家畜化ステップを使用します。統合プラスミド(ステップ4を参照)については、任意のNotI認識部位を家畜化する。1つの望ましくない認識部位を持つ部品を家畜化するには、その部分を望ましくない部位の近くの2つの部分に分割する(図2A):
- ステップ 1.1 と同じ方法で、最初のサブパートのフォワードプライマーを設計します。しかし、BsmBIサイトと4-nt遺伝子特異的オーバーハングのみでリバースプライマーを設計します。
- BsmBI部位と、第1サブパートのリバースプライマーと重なる4-nt遺伝子特異的オーバーハングのみを使用して、第2サブパートフォワードプライマーを設計します。第 2 サブ部品のリバースプライマーをステップ 1.1 と同じ方法で設計します。
- リバース(ステップ1.2.1の場合)または前方プライマー(ステップ1.2.2)のいずれかで、目的の変異をプライマーの遺伝子特異的領域に導入する。
注: また、BsmBI-および BsaI フリーおよびコドン最適化部品は、商業的に合成することができます。コード配列(CDS)の場合、同義性突然変異は、アミノ酸コドンの第3ヌクレオチドで容易に組み込むことができる。しかし、プロモーターやターミネーターの場合、レポーターアッセイを使用して変異したプロモーターまたはターミネーター活性をチェックすることが推奨される39.配列の終わりに向かって望ましくない制限部位がある場合、より長い逆プライマーを用いて変異させることができる。複数の望ましくない部位が存在する場合、複数部位を変異可能にする部位特異的突然変異誘発が40を行うことができる。
- 時折、2つのタンパク質をリンカーとの間に単一の部分として融合させることが望ましい(図2A)。リンカーは、2つの個々のタンパク質41の構造的完全性を確保するのに役立ちます。
- 第1の遺伝子のフォワードプライマーは、ステップ1.1と同様である。逆プライマーには、BsmBI部位、4-nt遺伝子特異的オーバーハング、およびリンカー配列が含まれる。4-ntオーバーハングは、リンカーまたは第2の遺伝子の最初の数個のヌクレオチドのいずれかであることができます。
- 第2の遺伝子については、BsmBI認識部位と第1遺伝子の逆プライマーのそれに相補的な4-ntオーバーハングを有するようにフォワードプライマーを設計する。第2の遺伝子の逆プライマーをステップ1.1のように設計する。
- ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)42によって部品を増幅するには、高忠実度DNAポリメラーゼを使用して、ゲノムDNA、cDNA、またはプラスミドのいずれかから部品を増幅する。PCR産物を1%アガロースゲルで確認し、その後にゲル精製を行います。精製DNAを使用することが強く推奨され、ゲル精製が面倒な場合は、少なくともスピンカラムを使用してPCR産物を精製してください。
2. パートをエントリベクター(pYTK001)にクローニングして、パーツプラスミドを作成する (図2B)
- ゴールデンゲート反応ミックスを設定するには、各PCR産物とエントリーベクター(pYTK001)の20 fmol、10X T4リガーゼバッファーの1μL、Esp3Iの0.5 μL(BsmBIの非常に効率的なイソシゾマー)、T4リガースの0.5 μLを加えます。ddH2Oを追加して、合計ボリュームを10 μLにします。
- クローニング反応を設定するには、サーモサイクラーで次のプログラムを実行します:37°Cの25〜35サイクル(消化)5分(ライゲーション)、50°Cで50°Cで最終消化、80°Cで10分間酵素不活性化を行います。
注:複数のDNA断片を同時に遺伝子のクローンを入力ベクターにクローニングする場合、例えば融合遺伝子のクローニングや遺伝子の家畜化中に、35サイクルの消化/ライゲーションが推奨されます。 - 熱ショックによりDH5α株または同等の エシェリヒア・コリ 化学的に有能な細胞に反応ミックス全体を変換します。10 μLクローン製品全体を35 μL化学的に有能な 大腸菌 細胞(2 X 105 cfu/mL)に変換し、cfuは5 ng pYTK001を有能な細胞の100 μLに変換することで計算することが推奨されます。リソジニーブロス(LB)プレートに35 μg/mLクロラムフェニコール(Cm)を広げます。一晩で37°Cでインキュベートする。
- 16-18時間後、インキュベーターからプレートを取り出し、プレートを約5時間4°Cに保ち、スーパーフォルダグリーン蛍光タンパク質(sfGFP)がより強い緑色に発達させます。
- より簡単なスクリーニングのために、プレートを紫外線(UV)または青色光のトランイルミニューエータに置きます。コロニーを含むsfGFPは、UV光の下で蛍光を発する。
- 緑色のコロニーは、切り抜きpYTK001が含まれているため、負のコロニーです。白いコロニーは陽性である可能性が高い。クローニングは、通常、〜30〜100%白色コロニーがある場合に成功します。コロニーPCRまたは制限消化のいずれかによっていくつかの白色コロニーのさらなるスクリーニングを行う(推奨酵素:BsaI-HFv2)。
- いくつかの潜在的に正しいコロニーからプラスミドを精製し、サンガーシーケンシングによって配列を確認します。
3. 一部のプラスミドを「カセット」プラスミドに組み立てる
注: カセット プラスミドには、プロモーター、CDS、およびターミネータからなるユーザー定義の転写ユニット (TU) が含まれています。カセットプラスミドは、単一の遺伝子の発現を可能にする。カセットプラスミドが多遺伝子プラスミドに組み立てられる場合、最初のステップは、多遺伝子プラスミド中のタキの数と順序を決定することです。これらは、コネクタが多遺伝子プラスミド内のタウをリンクするので、カセットプラスミドに使用するコネクタを決定します。最初の TU の左コネクタは ConLS に、最後の TU の右側のコネクタは ConRE にする必要があります。彼らは多遺伝子プラスミドのConLS'とConRE'と重複します。残りのコネクタは、数値の増加順に並んでいる必要があります。たとえば、マルチ遺伝子プラスミドに 4 つの TU が含まれている場合、コネクタの組み合わせは ConLS-TU1-ConR1、ConL1-TU2-ConR2、ConL2-TU3-ConR3、および ConL3-TU4-ConRE になります (図 1)。
- 転写ユニットを組み立てる前に、左コネクタ、sfGFPドロップアウト(pYTK047)、右コネクタ、酵母選択マーカー、酵母の複製起源、mRFP1 の部分プラスミド、 大腸菌 起源およびアンピシリン耐性遺伝子(pYTK83)の6つの部分で中間ベクターを組み立てることをお勧めします。
- 上記の6つのプラスミドを精製します。UV-Vis分光光度計または蛍光ベースのアッセイを使用して濃度を記録し、各プラスミドをddH2Oで希釈して、1μLに20のfmolDNAが含まれるようにします。オンライン計算機を使用して、DNAモル濃度を計算します。
注: DNA濃度を正確に測定し、アセンブリが動作するために正確にパイプする、特に 5 から 7 個の部分プラスミドを持つアセンブリの場合は、非常に重要です。各プラスミドのDNA濃度の小さな誤差は、クローニング効率の有意な低下を引き起こす可能性があります。 - 各プラスミド1 μL、10X T4リガーゼバッファー1 μL、BsaI-HFv2(高効率バージョンのBsaI)0.5 μL、T4リガーゼの0.5 μLを加えます。ddH2Oを加えて、ボリュームを10 μLに設定します。
- クローニング反応を設定するには、サーモサイクラーで次のプログラムを実行します:37°Cの25〜35サイクル(消化)5分(消化)、5分間16°C(ライゲーション)を実行します。BsaIサイトは中間ベクターに保持する必要があるとして、最終的な消化と加熱不活性化ステップを省略します(図3)。
- DH5α株または他の 大腸菌 のコンピテントセルに全体の反応ミックスを変換します。50 μg/mL カルベニシリン(Cb)またはアンピシリンを用いたLBプレートに広げる。一晩で37°Cでインキュベートする。
注:カルベニシリンはアンピシリンの安定したアナログです。 - 16-18時間後、インキュベーターからプレートを取り出します。プレートには、淡い赤と淡い緑のコロニーの両方が含まれます(図6Cと6D)。プレートを4°Cで約5時間保ち、mRFP1とsfGFPを成熟させます。UV または青色光のトランイルミネーターを使用して、潜在的に正しい中間ベクターを含む緑色のコロニーを特定します。
- LB + Cbプレート上の緑色のコロニーをストリークアウトし、一晩で37°Cでインキュベートします。翌日、LB + Cmプレートに再びストリークアウトし、一晩で37°Cでインキュベートします。LB + Cmプレート上で成長するコロニーには、Cm耐性部品ベクターが保持されるため、誤って組み立てられたプラスミドが含まれています。
- LB + Cmプレート上で成長しないコロニーを選び、制限消化を行います(推奨酵素:BsaI-HFv2、Esp3I)正しく組み立てられたプラスミドを確認します。あるいは、スクリーニングのためにコロニーPCRを使用する。
- 上記の6つのプラスミドを精製します。UV-Vis分光光度計または蛍光ベースのアッセイを使用して濃度を記録し、各プラスミドをddH2Oで希釈して、1μLに20のfmolDNAが含まれるようにします。オンライン計算機を使用して、DNAモル濃度を計算します。
- 中間ベクトルが正常に組み立てられると、次のステップは、転写ユニットを組み立てることです。中間ベクトル、プロモーター、CDS、ターミネータの4ピースアセンブリ。
- 4つの部分プラスミドを精製します。1 μLに20fmolのDNAが含まれるように、その濃度を記録し、各プラスミドを希釈します。
- 反応ミックスを設定するには、ステップ 3.1.2 に従います。
- クローニング反応を設定するには、ステップ 2.2 に従います。
- クローニング反応ミックス全体をDH5αまたは同等の 大腸菌 のコンピテントセルに変換し、LB + Cbで一晩で37°Cでインキュベートします。
- 16-18時間後、インキュベーターからプレートを取り出します。白と淡い緑のコロニーが表示されます (図 6E と 6F).プレートを4°Cで約5時間保ち、sfGFPを成熟させます。UV または青色光のトランイルミネータを使用して、非蛍光白色コロニーを特定します。これらには、正しい転写単位が含まれています。
- ストリークアウトし、8-10白色コロニーを成長させ、コロニーPCRを行います。コロニーPCRから陽性を試験するコロニーからプラスミドを精製する。制限消化(推奨酵素:Esp3I)を実施し、さらに組み立てを確認する。
注: クローニングは制限消化と結紮のみを伴うので、シーケンス化転写単位は通常必要ありません。目的の全ての配列は、プラスミドレベルで確認されています。
4. カセットプラスミドを「多遺伝子」プラスミドに組み立てる:
注:多遺伝子プラスミドは、複数の遺伝子の発現を可能にする。下流の用途によっては、多遺伝子プラスミドが複製型または統合性を持つ可能性があります。複製性プラスミドは、複製の酵母起源を有する。従って、酵母細胞が分裂する時に安定的に維持することができる。統合プラスミドは、複製の酵母起源を有していない。代わりに、5'と3'の相同性の腕を持ち、相同組換えを通じて複数の遺伝子をゲノムの特定の場所に統合することができます。
- 多遺伝子プラスミドの場合は、最初に中間ベクターを組み立てます。
- 複製中間ベクトルを組み立てるには(図4A)、左コネクタ(ConLS'-pYTK008)、sfGFPドロップアウト(pYTK047)、右コネクタ(ConRE'-pYTK072)、酵母選択マーカー、酵母マーカー、 複製の酵母起源、およびmRFP1を 有するプラスミドの一部、複製の 大腸菌 起源、およびカナマイシン耐性遺伝子(pYTK084)を有する。
- アセンブリの場合は、3.1.1 から 3.1.3 までの手順に従います。
- 全体のクローニング反応ミックスをDH5αまたは同等の 大腸菌 のコンピテントセルに変換し、LBプラス50 μg/mLカナマイシン(Km)のプレートを使用します。一晩で37°Cでインキュベートする。
- 赤/緑のカラーベースのスクリーニングの場合は、ステップ 3.1.5 に従います。
- 誤アセンブリのスクリーニングのために、ストリークとLB + Kmプレート上の緑のコロニーを成長させます。その後、ステップ 3.1.6 に従います。
- 統合的な多遺伝子ベクター(図4B)では、まず目的のゲノム軌跡を決定し、その軌跡に統合するために約500塩基対の5'と3'相同性アームを設計します。
- 酵母ゲノムDNAから5'と3'相同性の腕をエントリーベクターpYTK001にクローン化します。手順 1 と 2 に従います。
- 左コネクタ(ConLS'-pYTK008)、sfGFPドロップアウト(pYTK047)、右コネクタ(ConRE'-pYTK072)、酵母選択マーカー、酵母選択マーカー、7つのプラスミドを組み立てます。 3'相同性アーム、mRFP1を 有するプラスミド、複製の大腸菌起源、およびカナマイシン耐性遺伝子(pYTK090)、および5'相同性アーム。
- 組み立てとスクリーニングについては、ステップ 4.1.1 に従います。
- 複製中間ベクトルを組み立てるには(図4A)、左コネクタ(ConLS'-pYTK008)、sfGFPドロップアウト(pYTK047)、右コネクタ(ConRE'-pYTK072)、酵母選択マーカー、酵母マーカー、 複製の酵母起源、およびmRFP1を 有するプラスミドの一部、複製の 大腸菌 起源、およびカナマイシン耐性遺伝子(pYTK084)を有する。
- 多遺伝子プラスミドの組み立て
- ステップ4.1で得られた中間ベクターと工程3からカセットプラスミドのプラスミドを精製する。UV-Vis分光光度計または蛍光ベースのアッセイを使用して、それらの濃度を記録します。1 μLに20個のfmol DNAが含まれるように、それぞれddH 2 Oで希釈します。
- 中間ベクトル1 μL、各転写単位1 μL、10x T4リガーゼバッファ1μL、Esp3Iの0.5 μL、T4リガーゼの0.5 μLを加えます。ddH2Oを使用して10 μLにボリュームを持って下さいます。
- クローニング反応を設定するには、ステップ 2.2 に従います。
- クローニング反応ミックス全体をDH5αまたは同等の 大腸菌 のコンピテントセルに変換し、LB + Km上のプレートを一晩で37°Cでインキュベートします。
- ステップ 3.2.5 の場合と同様に、グリーン/ホワイトのスクリーニングを実行します。
- いくつかの白いコロニーからプラスミドを精製し、制限消化を行います.NotI-HF酵素を使用することは、大 腸菌 起源とKm選択マーカー部分にそれぞれ2つのNotI部位があるため、推奨される(図4B)。組み立てられたプラスミドが非常に大きい場合、別の制限部位を選択してさらに確認することができます。あるいは、制限消化に進む前にコロニーPCRでスクリーニングする。
染色体またはプラスミドベースの遺伝子発現に多遺伝子プラスミドを適用する
- 染色体遺伝子発現のために多遺伝子プラスミドを酵母ゲノムに組み込む ( 図5)
- 目的の遺伝子座に対するガイドRNA(gRNA)を設計します。ベンチリング、CRISPRdirect 43、CHOPCHOP44などの複数のオンライン・リソースを使用して、ターゲット上の最大特異性を決定することをお勧めします。
- 合成した20-nt gRNAをギブソンクローニングによりpCASプラスミド45 にクローン化する。それぞれ3'のHDVリボザイムと5'のtracrRNAに結合する逆プライマー対を用いてPCRによりpCASプラスミドを直線化する(図5)。あるいは、gRNAをsgRNAドロップアウトプラスミド(pYTK050)にクローンし、リンカーを用いて中退プラスミドをカセットプラスミドに組み立てます。その後、Cas9の部分プラスミド(pYTK036)でCas9 TUを組み立てます。最後に、Cas9 TUとsgRNA TUを複製型の多遺伝子プラスミドに組み立てます。
- 1 μLの NotI-HF酵素を一晩で1 μLで、5~15 μgの統合多遺伝子プラスミドを直線化します。pCAS-gRNAと線形統合型多遺伝子プラスミドの1 μgを S.cerevisiaeに変換する。市販の酵母変換キットを使用するか、ガイツとSchiestl、200746によってプロトコルに従って有能な細胞を準備します。
注:NotI消化後に線形化された多遺伝子プラスミドを精製する必要はありません。 - 回収後に細胞をペレットに、上清を捨て、等量の水で洗浄する。完全な合成培地(CSM)中退プレートまたは酵母エキスペプトンデキストロース培地(YPD)プレート上のプレートは、酵母選択的マーカーに応じて、抗生物質を用いた。コロニーが形成される2日間、37°Cでインキュベートする。コロニーが見られない場合は、30°Cでさらに1〜2日間インキュベートする。
- コロニーPCR47による統合のためのスクリーニング酵母コロニー。
- pCASを治すために、非選択的なYPDプレートに正しい統合を有するコロニーを抜き出す。一晩で30°Cで成長します。新鮮なYPDプレートにYPDプレートから1コロニーをストリーク。再び、一晩で30°Cで成長する。第2のYPDプレートから、pCASの選択マーカーであるYPDプラス100μg/mLヌルセオトリシンにコロニーをストリークする。正常な硬化は、酵母細胞が選択的プレート上で増殖しない場合に起こります。
注: pCAS プラスミドが 2 ラウンドの非選択的 YPD で硬化しない場合は、再び新しい YPD に 1~2 ラウンドの新しい YPD をシークします。
- プラスミドベースの遺伝子発現のための複製型多遺伝子プラスミドの変換
- 100 ng-1 μg 純粋なマルチ遺伝子プラスミドを S. cerevisiae の有能な細胞に変換します。
- 使用する酵母選択マーカーに応じて、CSMドロップアウトプレートまたはYPDプラス抗生物質プレートへの変換直後に酵母細胞をプレート。コロニーを形成するために2〜3日間30°Cでインキュベートする。
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Representative Results
ここで、βカロテン(黄色)およびリコピン(赤色)産生に対する4つの複製多遺伝子プラスミドの結果。 ADE2 遺伝子座を破壊するための1つの統合的な多遺伝子プラスミドが構築され、そのコロニーは赤色である。
CDS をエントリベクトルにクローニングする (pYTK001)
ERG20は、記載したようにプラスミドpLM49448から酵母ゲノムと3つのカロテノイド遺伝子からpYTK001の入り口ベクターに増幅した。酵母プロモーター pENO2、pTIP1、pPYK1およびpPDC1およびターミネーター tTDH2、tHSP26、tADH2、tACS2を一部プラスミドとしてクローニングした。リコピンを産生するためにCrtYB(G247A)に点突然変異が導入され、BTS1-ERG20融合構築物がプレニル中間体からカロテノイドに対してより良いチャネルを作られた。図6Aおよび6Bは、プラスミドのクローニングが成功した代表的プレートを示し、90.35±4.22%のコロニーが潜在的に正しい(白)の緑色/白スクリーニングの例を示す。
転写ユニット(カセットプラスミド)の組み立て
カセットプラスミドを組み立てる前に、多遺伝子プラスミドの設計が確定した。4つのカロテノイドのTUsでは、異なるコネクタを持つ4つの中間ベクトルが、ステップ3.1に続いて最初にクローン化された。 図6Cおよび6Dは、中間ベクターの組み立て成功からの代表的プレートを示し、赤色/緑色スクリーニングの例を示し、17.56±3.32%のコロニーが正(緑色)である。この比率は比較的低いが、緑色蛍光によりスクリーニングが大いに促進される。
次に、BTS1-ERG20、ERG20、crtE、crtYB、crtYB(G247A)、およびcrtIのTUを、ステップ3.2(表1)に従って組み立てた。図6Eおよび6Fは、TUsの組み立て成功の代表的プレートを示し、65.02±4.99%のコロニーが陽性(白)であるグリーン/ホワイトスクリーニング方法の例を示す。
多遺伝子プラスミドの組み立て
4つの複製性および1つの統合的な多遺伝子プラスミドを組み立てた。複製型多遺伝子プラスミドの場合、ERG20、BTS1-ERG20、crtE、crtYB、crtYB(G247A)、crtIの4つの組み合わせで組み立てられ、βカロテン用に2つ、リコピン生産用の2つのプラスミドを作成しました(表2)。 中間ベクタークローニングに対する潜在的に正しいコロニー(緑色)の比率は1.83±0.15%であった(図7Aおよび7B)。この数は少ないようですが、緑色蛍光を検出してスクリーニングが容易になりました(図7B)。中間プラスミドをクローニングすると、中間体からマルチ遺伝子プラスミド(白色)を組み立てる成功率は93.77±1.65%であった(図7Cおよび7D)。図7Eおよび7Fは、正のコロニー(白)の数が無視できるものであったため、多遺伝子プラスミドの最適以下の組み立てを示す。酵母に変えた後、3日目にβカロテン(黄色)とリコピン(赤)を産生するコロニーが成長しました。各プレートから4つのコロニーを新鮮なプレートにストリークアウトし、さらに2日間成長させた。図8Aおよび8Bは、BTS1-ERG20を融合させることで、ERG20単独で使用するよりも暗い色で見られるように、カロテノイド産生に向けてゲラニルゲラニル・ピロリン酸を導くということを示している。抽出49およびUV-Vis分光光度法によるカロテノイドの定量化を、本物の標準との間に、BTS1-ERG20の融合が0.729μg/mgのβ-カロテンの生成につながり、これは0.021μg/mg-カロテン単独で生成される0.021μg/β mg-カロテンよりも約35倍高いことが分かる。同様に、リコピンの産生は、ERG20(0.068 μg/mg)単独と比較して、BTS1-ERG20(1.126 μg/mg)の株で約16.5倍高い(図8C)。
複製型多遺伝子プラスミドは、(A)BTS1-ERG20融合TUおよび(B)ERG20TUを用いて酵母に変換した。各プレートには、左側の酵母は、βの生産のためのcrtE TU、crtYB TUおよびcrtI TUを含むプラスミドを有する-右側のカロテンおよび酵母は、crtE TU、crtYB(G247A)TU、およびリコピンの産生のためのcrtI TUを含むプラスミドを有する。
統合プラスミドの場合、ConLS'、sfGFPドロップアウト、ConRE'、HIS 3(酵母選択マーカー)、ADE2 5'および3'相同性アームはステップ4.1.2に続いて組み立てられました。 5'と3'相同性の腕は500 bp離れていて、統合後に〜180個のアミノ酸を削除した。さらに、5'の相同性の腕は3'の終わりに向かって6つの停止コドンを持っていた。変異したADE2は、赤いコロニー50をもたらした。ADE2 gRNA 5'-ATTGGGAC GTATGTGtTGAGG-3'51を使用し、ゲノム統合のためのステップ 5.1 に従った。3~4日後、YPDプレート+100μg/mLヌルセオトリシンに赤いコロニーが観察され、ADE2が正常に破壊されたことを示す(図8Dおよび 8E)。
図1:多遺伝子組み立ての概要組み立ては3つのレベルで行われます。 レベル1では、CDS、または他の部分を、ゲノムから増幅または合成し、次いでBsmBI(またはEsp3I)酵素を用いてpYTK001エントリベクターにクローン化する。ColE1 : 大腸菌 複製の起源;CmR: クロラムフェニコール耐性遺伝子レベル2では、プロモーター、CDS、およびターミネーターを含む転写ユニット(TU)を、BsaI酵素を用いて組み立てる。レベル3では、最大5つの転写ユニットが、BsmBI(またはEsp3I)酵素を使用して多遺伝子プラスミドに組み立てられます。多遺伝子プラスミドは、複製可能または統合的な場合があります。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:個々の部品を増幅する、遺伝子を家畜化または点突然変異を作成し、融合タンパク質を組み立てるためのプライマー設計プライマーには、BsmBIとBsaI認識とカットサイト、適切な組み立てのためのMoCloオーバーハングが含まれます。MoClo のオーバーハングは、1、2、3、4、および 5、6、7、8 として表されます。家畜化または融合タンパク質を作成するための内部プライマーには、BsmBIが含まれていますが、BsaIサイトは含まれていません。これらのオーバーハングは、カスタマイズされた内部シーケンス(NNNNとN'N'N'n'は紫色)です。最適な酵素消化のために、末端"ttt"が含まれています。GOI:関心のある遺伝子。(B) B ) BmBI (または Esp3I) を使用して、pYTK001 エントリベクターに増幅された部分をクローニングします。相補的なオーバーハングは、部品の統合とBsmBI認識サイトの除去につながります。ColE1 : 大腸菌複製の起源;CmR: クロラムフェニコール耐性遺伝子この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:転写ユニットアセンブリ TUプラスミドを組み立てるには、組み合わせTUアセンブリを容易にするために中間ベクトルの組み立てが推奨される。中間ベクターを組み立てるには、コンLX(X:5つの左コネクタのうちの1つ)、sfGFPドロップアウト、コンRY(Y:5つの右コネクタのうちの1つ)、酵母ORI(複製の起源)、および酵母マーカー部分をBsaI酵素を使用してmRFP1ドロップアウトベクターにクローンします。中間プラスミドはアンピシリンに耐性があります。BsaI認識サイトはTUプラスミドクローニングのために保持されています。TUプラスミドをクローン化するために、プロモーター、CDS、およびターミネーターを、BsaIを用いて中間ベクターに組み立てる。クローン化されたTUは、次のステップ多遺伝子アセンブリのためのConLXおよびConRY領域にBsmBIサイトを有する。クローンTUはまたアンピシリンに耐性があります。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 名前 | コンルX(左コネクタ) | プロモーター | CDS | ターミネータ | コンリー(右コネクタ) |
| BTS/ERG20 TU | LS | pENO2 | BTS1/ERG20 | tTDH2 | R1 |
| ERG20 TU | LS | pENO2 | ERG20 | tTDH2 | R1 |
| クルテ TU | L1 | pTIP1 | クルテ | tHSP26 | R2 |
| クルトイブ TU | L2 | pPDC1 | クルトイブ | tADH2 | R3 |
| crtYBG247A TU | L2 | pPDC1 | crtYBG247A | tADH2 | R3 |
| crtI TU | L3 | pPYK1 | crtI | tACS2 | 再 |
表1:本研究で用いた転写単位 プロモーターとターミネーターは 、S.セレビシエから増幅されました。 BTS1( ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ)および ERG20( ファルネシルピロリン酸シンセターゼ)は 、S.セレビシエから増幅した。 crtE( ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ )、crtYB( 二官能リコピンシクラーゼ/フィトエンシンターゼ)、 およびcrtI( フィトエンデサチュラーゼ)は ザントフィロマイセスデンドロホウス由来であった。
図4:多遺伝子プラスミドアセンブリ (A) レプリケーションプラスミドアセンブリ。複製中間ベクターの組み立てには、コンLS'、sfGFPドロップアウト、コンRE'、酵母ORI、酵母マーカー、およびBsaI酵素を使用したmRFP1ドロップアウトベクター上の 大腸菌 起源およびマーカーのクローニングが含まれる。ConLSとConREのサイトは、ベクトルにBsmBI認識サイトを導入します。カナマイシンを用いた選択プレート上の緑色のコロニーを探すことで、潜在的に正しいアセンブリをスクリーニングすることができます。以前に組み立てたTUsは、BsmBI酵素を使用して中間ベクターにクローン化することができます。このプラスミドは、酵母の宿主で複製することを可能にする酵母ORIを含む。(B)統合プラスミドアセンブリ。統合中間ベクターの組み立てには、コンLS、sfGFPドロップアウト、コンRE'、5'ホモロジーアーム、3'ホモロジーアーム、酵母マーカー、大 腸菌 起源およびマーカーをBsaI酵素を使用してRFPドロップアウトベクターにクローニングする。正しいアセンブリは、カナマイシンを使用した選択プレートに緑色で表示されるはずです。先に作製した転写単位は、BsmBI酵素を用いて複製中間ベクターにクローン化することができる。このベクターは、酵母ORIを有しておらず、CRISPRおよび相同組換えによって標的の軌跡に統合されるであろう。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 名前 | TU1 | TU2 | TU3 | TU4 | 積 |
| B/E-β-カロテン | BTS1/ERG20 | クルテ | クルトイブ | crtI | βカロテン |
| B/Eリコピン | BTS1/ERG20 | クルテ | crtYBG247A | crtI | リコピン |
| E-β-カロテン | ERG20 | クルテ | クルトイブ | crtI | βカロテン |
| E-リコピン | ERG20 | クルテ | crtYBG247A | crtI | リコピン |
表2:本研究で用いた多遺伝子プラスミド
図5:CRISPRの統合 (A) CRISPRとヘルパープラスミドクローニング。pCASプラスミドには、gRNAの最適な発現を得るためのCas9エンドヌクレアーゼおよび成分(tRNAプロモーター、SNR52ターミネーター、HDVリボザイム、およびトラクルRNA)が含まれています。ギブソンクローニングを使用して、線形化されたpCASで合成gRNAを組み立てることによって、pCAS+gRNAプラスミドをクローン化する。(B) CRISPRは遺伝的統合を支援した。ステップ1:コトランスフォーメーション:pCAS +gRNAは、目的の遺伝子(GOI)、酵母選択的マーカー、およびゲノム座を標的とする5'および3'ホモロジー領域を含む統合プラスミドと共に酵母に変換された。最適な統合のために、NotIで統合プラスミドを線形化します。ステップ2:標的遺伝子座での統合:酵母マーカーに選択的なプレート上で形質転換酵母を成長させる、抗生物質または栄養栄養剤のいずれか。統合を確認するためにジェノタイピングを行います。ステップ3:非選択的プレート上の酵母をストリークさせることにより、pCAS +gRNAプラスミドを治す。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:大腸菌におけるエントリーベクターおよび転写単位レベルクローニングの代表的プレート遺伝子のクローニング成功の代表的プレートは、(A)可視光および(B)UV光の下での遺伝子の入り口ベクターpYTK001へのクローニングに成功した。正のコロニーは白で、負のコロニーは緑です。正のコロニーの比率は、90.35±4.22%である。転写単位レベルのアセンブリと(C)可視光と(D)UV光の下での緑/赤の選択のための中間ベクトルの組み立てに成功しました。正のコロニーは緑色です。正のコロニーの比率は、17.56±3.32%である。中間ベクトルからの転写部の組み立てに成功し、(E)可視光および(F)UV光下でのグリーン/ホワイトスクリーニング。正のコロニーは白で、負のコロニーは緑です。正のコロニーの比率は、65.02±3.32%である。データは3つの生物学的複製からである。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図7: 大腸菌における多遺伝子プラスミドクローニングの代表的プレートマルチ遺伝子レベルアセンブリ用の中間ベクターの組み立てと(A)可視光および(B)UV光下での赤/緑選択。正のコロニーは緑で、負のコロニーは赤である。正のコロニーの比率は、1.83±0.15%である。中間ベクトルとグリーン/ホワイトの選択(C)から複数のタクを、可視光の下で、そして(D)UV光の組み立てに成功しました。正のコロニーは白です。正のコロニーの比率は93.77±1.65%である。多遺伝子プラスミドの(E)可視光および(F)UV光の下での最適でないアセンブリ。正のコロニーの数はごくわずかです。データは3つの生物学的複製からである。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図8:酵母における統合および複製性プラスミドの代表的プレート複製型多遺伝子プラスミドは、(A)BTS1-ERG20融合TUおよび(B)ERG20TUを用いて酵母に変換した。各プレートには、左側の酵母は、βの生産のためのcrtE TU、crtYB TUおよびcrtI TUを含むプラスミドを有する-右側のカロテンおよび酵母は、crtE TU、crtYB(G247A)TU、およびリコピンの産生のためのcrtI TUを含むプラスミドを有する。(C) UV-vis分光計を用いた4つの多遺伝子プラスミドを用いた酵母エキスからβカロテンとリコピンを定量する。最大吸光度は、それぞれβカロテンとリコピンについて450nmおよび470nmで記録した。絶対定量は、本物の標準(補助図S3)を使用して行われました。BTS1-ERG20の融合は、ERG20単独と比較してβカロテンが約35倍高く、リコピンが約16.5倍高くなる。多遺伝子積分プラスミドとgRNAとヘルパーDNAを含む(D)と、ヘルパーDNAとしてのgRNAおよび多遺伝子統合プラスミドとの統合によるADE2遺伝子座の破壊の代表的プレート(E)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
Leeらが開発したMoCloベースのクローニングキットは、酵母ゲノムへの複製または統合のために、1〜5個の転写ユニットを多遺伝子プラスミドに迅速に組み立てる優れたリソースを提供します。このキットを使用すると、酵母で複数の遺伝子を発現する際に頻繁に存在する時間のかかるクローニングのボトルネックを排除します。
T4 DNAリガーゼでクローニングするゴールデンゲートの消化/ライゲーションサイクルについて、5つの異なる条件をテストしました。我々は、37°Cで5分間30サイクルの消化と5分間の16°Cでのライゲーション、50分間50°Cでの最終消化ステップ、10分間の80°Cでのタンパク質不活性化ステップが4ピースアセンブリで潜在的に正しい99.5%のコロニーをもたらしたことを発見した(補足図S1およびS33)。16°Cでのライゲーションにより、最適なリガーゼ活性とオーバーハングアニールが保証されます。50°Cでの最終消化は、消化された製品の再結紮を防ぎます。このサイクルは、特に指定されていない限り、すべてのアセンブリ反応に続いた。
また、最適な結果を得るには、特別な注意が必要な重要なステップもいくつか見つけました。転写ユニットを組み立てる前に、中間ベクトルを sfGFP ドロップアウトで組み立てることを強くお勧めします。理論的には、7つの部分すべてをmRFP1で 大腸菌 ベクターにクローン化し、続いて赤/白のスクリーニングを行うことができます。しかし、実際には、mRFP1は非常にゆっくりと色を発達させ、可視光の下で淡い赤色と淡黄色の 大腸菌 コロニーを区別することは困難である。sfGFPがUV範囲52で吸収するので、UVまたは青色光トランイルミネーターを用いて、明るい緑色コロニーのスクリーニングを容易にする。また、中間ベクトルをクローニングすることで、様々なプロモーター、CDS、ターミネータの組み合わせがより簡単に組み合わせることができ、4つの部分を持つアセンブリは通常、より多くの部品を持つアセンブリよりもより多くの正のコロニーをもたらすので、簡単に組合せライブラリを作成することができます。 補足図S2 は、6ピースから8ピースのアセンブリに対する潜在的に正しいコロニーの比率の漸進的な減少を示す。
各部品の正モル濃度を確保するために、すべての部品の濃度を細心の注意を払って測定する必要があります。UV-Vis分光計を用いて部品を定量化することは、通常は十分であるが、蛍光ベースのアッセイのようなより敏感な方法は、より良い結果を与えるかもしれない。すべての部品を正確に定量化しないと、アセンブリの効率が低くなることがよくあります。1つは、それぞれ、非常に効率的なEsp3IとBsaI-HFv2を選択する必要があります。T4 は、キットのオーバーハングの両方に適しており、カスタマイズされたオーバーハングは、文献36と一致する 2 つの部分を融合する必要があることを観察しましたが、元の論文では T7 リガース6を推奨しました。サイクル数を増やすと、ある程度正しいコロニーの数を増やすことができます。例えば、消化と結紮の25サイクルは3〜4個の部品を組み立てるのに十分ですが、30〜35サイクルはより多くの部品にとってより良い結果を与えます。
MolCloの戦略はモジュラーおよび非常に多目的なクローニングを可能にするので代替の多部アセンブリー方法8、9、10、11、12より有利である。ただし、部品には複数の BsmBI、BsaI、または NotI サイトが存在することがあるため、主な制限は、家畜化のステップです。すべての部品を変更すると、時間がかかる場合があります。この場合、これらの制限部位を含まないCDSの合成を検討してもよい。しかし、プロモーターおよびターミネーターの場合、1ヌクレオチドであっても変異すると、その機能性が変化する可能性がある。従って、レポーターアッセイを用いてこれらの部品の活性を検証することが推奨される39.別の制限は、このキットは、マルチ遺伝子プラスミド内の5つの転写ユニットまでしか許可されないということです。より多くの転写ユニットが必要な場合は、互換性の高いオーバーハング36のセットを選択して、追加のコネクタを構築することができます。
このキットは、27のプロモーター、6つのターミネーター、7つの酵母選択マーカー、および複製の2つの酵母起源を提供します。プロモーターやターミネーターなどのカスタマイズされたパーツは、ネイティブまたは合成のいずれかであり、このプロトコルに従ってエントリーベクターにクローン化することができます。酵母MoCloキットは、主に酵母で価値の高い化学物質を生産するために多遺伝子代謝経路を過剰発現させるために使用されています。このプロトコルは、酵母で生物学的回路用の異なるスイッチが必要な場合にも使用できます。また、タンパク質とタンパク質の相互作用、タンパク質の局在化、酵素活性に関する基本的な生物学的問題の調査に、このキットを適用する大きな可能性があります。全体的に、このプロトコルは非常に柔軟で信頼性が高く、酵母生物学におけるあらゆる厳しいクローニングをサポートすることができます。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
この作品は、ニューヨーク州立大学研究財団(賞#71272)とバッファロー大学のインパクト賞(賞#:000077)によって資金提供されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mm Glass beads | RPI research products | 9831 | For lysing yeast cells |
| Bacto Agar | BD & Company | 214010 | Component of the yeast complete synthetic medium (CSM) |
| Bacto Peptone | BD& Company | 211677 | Component of the yeast extract peptone dextrose medium (YPD) |
| BsaI-HFv2 | New England Biolabs | R3733S | a highly efficient version of BsaI restriction enzyme |
| Carbenicillin | Fisher Bioreagents | 4800-94-6 | Antibiotic for screening at the transcription unit level |
| Chloramphenicol | Fisher Bioreagents | 56-75-7 | Antibiotic for screening at the entry vector level |
| CSM-His | Sunrise Sciences | 1006-010 | Amino acid supplement of the yeast complete synthetic medium (CSM) |
| Dextrose | Fisher Chemical | D16-500 | Carbon source of the yeast complete synthetic medium (CSM) |
| Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids | BD & Company | 291940 | Nitrogen source of the yeast complete synthetic medium (CSM) |
| dNTP mix | Promega | U1515 | dNTPs for PCR |
| Esp3I | New England Biolabs | R0734S | a highly efficient isoschizomer of BsmBI |
| Frozen-EZ Yeast Trasformation II Kit | Zymo Research | T2001 | For yeast transformation |
| Hexanes | Fisher Chemical | H302-1 | For carotenoid extraction from yeast cells |
| Kanamycin | Fisher Bioreagents | 25389-94-0 | Antibiotic for screening at the multigene plasmid level |
| LB Agar, Miller | Fisher Bioreagents | BP1425-2 | Lysogenic agar medium for E. coli culturing |
| LB Broth, Miller | Fisher Bioreagents | BP1426-2 | Lysogenic liquid medium for E. coli culturing |
| Lycopene | Cayman chemicals | NC1142173 | For lycopene quantification |
| MoClo YTK | Addgene | 1000000061 | Depositing Lab: John Deuber |
| Monarch Plasmid Miniprep Kit | New England Biolabs | T1010L | For plasmid purification from E.coli |
| Nanodrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND2000c | For measuring accurate DNA concentrations |
| NotI-HF | New England Biolabs | R3189S | Restriction enzyme for integrative multigene plasmid linearization |
| Nourseothricin Sulphate | Goldbio | N-500-100 | Antibiotic Selection marker for the pCAS plasmid used in this study |
| Phusion HF reaction Buffer (5X) | New England Biolabs | B0518S | Buffer for PCR using Phusion polymerase |
| Phusion High Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530S | High fidelity polymerase for all the PCR reactions |
| pLM494 | Addgene | 100539 | Plasmid used to amplify crtI, crtYB and crtE used in this study |
| Quartz Cuvette | Thermo Electron | 10050801 | For quantifing carotenoids |
| T4 ligase | New England Biolabs | M0202S | Ligase for Golden Gate cloning |
| Thermocycler | BIO-RAD | 1851148 | For performing all the PCR and cloning reactions |
| Tissue Homogenizer | Bullet Blender | Model: BBX24 | For homogenization of yeast cells |
| UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | Genesys 150 | For quantifing carotenoids |
| Yeast Extract | Fisher Bioreagents | BP1422-500 | Component of the yeast extract peptone dextrose medium (YPD) |
| β-carotene | Alfa Aesar | AAH6010603 | For β-carotene quantification |
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