हम प्रेरित न्यूरोनल प्रोजेनिटर कोशिकाओं (iNPCs) में मानव त्वचा से व्युत्पन्न फाइब्रोब्लास्ट को फिर से प्रोग्राम करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, और उनके बाद में प्रेरित एस्ट्रोसाइट्स (आईएएस) में भेदभाव। इस विधि से बड़ी मात्रा में आईएनपीसी और आईए का तेजी से और प्रजनन योग्य उत्पादन होता है।
न्यूरोलॉजिकल विकारों पर अनुसंधान मुख्य रूप से रोग तंत्र पर न्यूरॉन्स के प्रभाव पर केंद्रित है। पशु मॉडलों की सीमित उपलब्धता गंभीर रूप से रोग के लिए सेल प्रकार विशिष्ट योगदान के अध्ययन को प्रभावित करती है। इसके अलावा, पशु मॉडल आमतौर पर मानव रोगियों में देखे गए उत्परिवर्तन और रोग पाठ्यक्रमों में परिवर्तनशीलता को प्रतिबिंबित नहीं करते हैं। प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (आईपीएससी) के उत्पादन के लिए पुनर्प्रोग्रामिंग तरीकों रोगी विशिष्ट अनुसंधान में क्रांतिकारी बदलाव किया है और रोग तंत्र का अध्ययन करने के लिए मूल्यवान उपकरण बनाया है । हालांकि, आईपीएससी प्रौद्योगिकी में समय, श्रम प्रतिबद्धता, क्लोनल चयनशीलता और एपिजेनेटिक मार्कर की हानि जैसे नुकसान हैं। इन तरीकों के हालिया संशोधनों से सेल वंश या विशिष्ट कोशिका प्रकारों की अधिक प्रत्यक्ष पीढ़ी की अनुमति होती है, क्लोनल अलगाव या एक pluripotent स्टेम सेल राज्य को दरकिनार करते हुए। हमने न्यूरलाइजिंग मीडिया के संयोजन में रेट्रोवायरल वैक्टर का उपयोग करते हुए त्वचा फाइब्रोब्लास्ट से प्रेरित न्यूरोनल प्रोजेनिटर कोशिकाओं (आईएनपीसी) को उत्पन्न करने के लिए एक तेजी से प्रत्यक्ष रूपांतरण विधि विकसित की है। iNPCs को न्यूरॉन्स (आईएनएस) ओलिगोडेन्ड्रोसाइट्स (आईओएस) और एस्ट्रोसाइट्स (आईओएस) में विभेदित किया जा सकता है। आईएएस उत्पादन तेजी से दवा और रोग तंत्र परीक्षण की सुविधा के रूप में iNPCs से भेदभाव केवल 5 दिन लगते हैं । इसके अलावा, आईएएस के साथ काम करना आसान है और बड़ी संख्या में शुद्ध आबादी में उत्पन्न होता है। हमने कई न्यूरोलॉजिकल और न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों के लिए संभावित चिकित्सीय रणनीतियों का मूल्यांकन करने के लिए माउस जीएफपी + न्यूरॉन्स और रोगी व्युत्पन्न आईए का उपयोग करके एक अत्यधिक प्रजनन योग्य सह-संस्कृति परख विकसित की। महत्वपूर्ण बात, आईए परख ३८४-अच्छी तरह से प्रारूप के लिए स्केलेबल है एक थाली में कई छोटे अणुओं के मूल्यांकन की सुविधा । यह दृष्टिकोण विविध आनुवंशिक पृष्ठभूमि के साथ कई रोगी कोशिका लाइनों के एक साथ चिकित्सीय मूल्यांकन की अनुमति देता है। एक परख में कई यौगिकों को स्क्रीन करने के लिए आईए और क्षमता का आसान उत्पादन और भंडारण व्यक्तिगत चिकित्सा के लिए अनुकूलनीय इस पद्धति को प्रस्तुत करता है।
अंतर्निहित रोग तंत्र को समझना न्यूरोलॉजिकल रोगों के लिए महत्वपूर्ण है क्योंकि यह संभावित चिकित्सीय रणनीतियों के विकास में सहायक होता है। जबकि पशु मॉडल ऐतिहासिक रूप से तंत्रिका तंत्र के रोगों पर शोध करने के लिए सोने का मानक रहा है, एक नैदानिक सेटिंग में संभावित चिकित्सा का सीधा अनुवाद अक्सर सीमित सफलता1,2,3दिखाता है। अनुवाद की कमी के कारण आनुवंशिक पृष्ठभूमि और चूहों में उत्परिवर्तन की परिवर्तनशीलता की कमी, रोग फेनोटाइप का अधूरा प्रदर्शन और दवा संवेदनशीलता में भिन्नता या मानव रोगियों में डोजिंग हैं जो इनस्ल माउस उपभेदों में अच्छी तरह से चित्र नहीं हैं। इसके अलावा, कई दुर्लभ न्यूरोलॉजिकल विकारों के लिए, कोई या कुछ पशु मॉडल उपलब्ध हैं। प्रासंगिक मानव कोशिका प्रकारों में सीधे रोग तंत्र का अध्ययन अनुसंधान की सुविधा और क्लिनिक के लिए अनुवाद में सुधार कर सकता है । सीएनएस विकारों के लिए, प्राथमिक मानव कोशिकाओं को पुनः प्राप्त करना मुश्किल है और एक बहुत ही सीमित स्रोत का प्रतिनिधित्व करता है क्योंकि बायोप्सी आक्रामक हैं या केवल रोग के अंतिम चरण में पोस्टमार्टम प्राप्त किया जा सकता है। पिछले 15 वर्षों में, सेलुलर रीप्रोग्रामिंग तकनीक के विकास ने तेजी से विट्रो में मानव न्यूरोलॉजिकल और न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों को मॉडल करने की क्षमता का विस्तार किया है।
सेल रीप्रोग्रामिंग के पारंपरिक तरीकों में फाइब्रोब्लास्ट या अन्य सेल प्रकारों को प्रेरित प्लेरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) में शामिल किया गया है जो सभी तीन रोगाणु परतों से सेल प्रकारों में अंतर करने में सक्षम है4। ताकाहाशी और यामानाका सबसे पहले यह दर्शाते थे कि चार स्टेम सेल ट्रांसक्रिप्शन कारकों की पुनः अभिव्यक्ति आईपीएससी5 बननेके लिए दैहिक कोशिकाओं को रीडायरेक्ट करने के लिए पर्याप्त है । इसके बाद आईपीएससी को विशिष्ट सेल प्रकारों में और अधिक अंतरित किया जा सकता है। हालांकि, इस प्रक्रिया की कमी यह है कि यह श्रम गहन और स्थिर स्टेम सेल क्लोन उत्पन्न करने और अलग करने के लिए समय लेने वाली है। स्टेम सेल क्लोन में मदर सेल के दैहिक उत्परिवर्तन या विशिष्ट एबरेंसी भी बनाए रखे जाते हैं और अध्ययन के परिणामों को प्रभावित कर सकते हैं6. इसके अलावा, बढ़ते साक्ष्य ों से पता चलता है कि कोशिकाओं को रोकने के लिए पुनर्प्रोग्रामिंग प्रक्रिया मूल्यवान एपिजेनेटिक परिवर्तनों को मिटाती है जो सेलुलर रोग तंत्र4,7,8को प्रभावित कर सकते हैं। हाल के वर्षों में, शोधकर्ताओं ने संशोधित पुनर्प्रोग्रामिंग विधियों पर ध्यान केंद्रित किया, जिससे विभिन्न सेल प्रकारों की अधिक प्रत्यक्ष पीढ़ी की अनुमति दी गई, जबकि pluripotent स्टेम सेल राज्य9,10,11,12 (13, 14में समीक्षा) को दरकिनार करतेहुए। प्रारंभिक सफलताओं से पता चला है कि कार्डियोमायोसाइट्स15,न्यूरॉन्स16 और हेपेटोसाइट्स17 को फाइब्रोब्लास्ट के विट्रो स्ट्रेंथेरियल रीप्रोग्रामिंग में कई वंश-विशिष्ट प्रतिलेखन कारकों या माइक्रोआरएनए18की एक्टोपिक अभिव्यक्ति द्वारा पता चला। इसके बाद19,20के दशक में न्यूरोलॉजिकल विकारों को मॉडल करने के लिए कोशिकाओं को सीधे रीप्रोग्रामिंग करने का अध्ययन किया गया । जैसा कि ऊपर बताया गया है, इस तरह के प्रत्यक्ष पुनर्प्रोग्रामिंग या रूपांतरण प्रोटोकॉल में शास्त्रीय आईपीएससी प्रोटोकॉल पर संभावित फायदे हैं जिनमें गति और क्लोनल अलगाव कदम का एब्लेशन शामिल है। इसके अलावा, साक्ष्य ों से पता चलता है कि ये प्रोटोकॉल रोगी की आयु से संबंधित अधिक मात्रा में एपिजेनेटिक जानकारी बनाए रखने की अनुमति देते हैं और संभावना है कि रोग प्रासंगिक मार्कर7,8के लिए भी सही है ।
आज तक, न्यूरोलॉजिकल विकारों पर सबसे अधिक विट्रो अनुसंधान मुख्य रूप से न्यूरॉन्स पर केंद्रित किया गया है। हालांकि, यह सर्वविदित है कि एस्ट्रोसाइट्स जैसे अन्य सेल प्रकार, माइक्रोग्लिया और ओलिगोडेन्ड्रोसाइट्स रोग विकृति और न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों जैसे अल्जाइमर रोग (एडी), एमियोट्रोफिक लेटरल स्क्लेरोसिस (एएलएस), पार्किंसंस रोग (पीडी), हंटिंगटन रोग (एचडी), मल्टीपल स्क्लेरोसिस (एमएस), और अन्य न्यूरोलॉजिकल पैथोलॉजी जैसे रिटेट सिंड्रोम (आरटीटी), स्लीप डिसऑर्डर, एडिक्शन,, मिर्गी, lysosomal भंडारण विकार, अवसाद, माइग्रेन और रोग दर्द21,22,23, 24,25,26। एस्ट्रोसाइट्स केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) में सबसे प्रचुर मात्रा में कोशिका प्रकार हैं और हाल ही में, उन्हें पैथोलॉजिकल दृष्टिकोण से मोटे तौर पर उपेक्षित किया गया है7। वे अब स्वस्थ सीएनएस के लगभग सभी homeostatic कार्यों का समर्थन करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका के लिए जाना जाता है । इसके अतिरिक्त, यह स्पष्ट है कि उनका एक महत्वपूर्ण रोग प्रभाव है और रोग तंत्र को समझने और चिकित्सीय रणनीतियों का मूल्यांकन करने में बहुत मूल्यवान हैं19।
वर्तमान विवरण में, हम मानव रोगी फाइब्रोब्लास्ट को प्रेरित न्यूरोनल प्रोजेनिटर कोशिकाओं (आईएनपीसी) में सीधे रूपांतरण के लिए एक प्रोटोकॉल का विस्तार करते हैं, जिसमें यामानाका रीप्रोग्रामिंग कारकों (Klf4, Oct3/4, Sox2 और सी-Myc) को व्यक्त करने वाले रेट्रोवायरल वैक्टर का उपयोग करके और बाद में तंत्रिकाकरण मीडिया के संपर्क में आता है। पिछले अध्ययनों ने तंत्रिका कोशिकाओं (14में समीक्षा) के लिए सीधे पुनर्प्रोग्रामिंग के लिए ट्रांसक्रिप्शनल कारकों के विभिन्न संयोजनों का उपयोग किया है, लेकिन वर्णित प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले कारक मोटे तौर पर वायरल वैक्टर के घर उत्पादन के लिए प्लाज्मिड के रूप में उपलब्ध हैं, या वायरल पुनर्प्रोग्रामिंग किट जाने के लिए वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध हैं। परिणामस्वरूप iNPCs को न्यूरोलॉजिकल रोगों में उनकी भूमिका का अध्ययन करने के लिए प्रेरित न्यूरॉन्स (आईएनएस)27,ओलिगोडेन्ड्रोसाइट्स (आईओएस)24 और एस्ट्रोसाइट्स (आईओएस)19 में और अंतर किया जा सकता है। हमारे प्रोटोकॉल में आईपीएससी की समय-लेने वाली पीढ़ी शामिल नहीं है जो सबसे अधिक उपलब्ध प्रोटोकॉल मानव एस्ट्रोसाइट्स28के व्युत्पन्न के लिए उपयोग करते हैं। लगभग 98% से 100% सीधे पुनर्प्रोग्राम किए गए iNPCs जीएफएपी-पॉजिटिव एस्ट्रोसाइट्स29 में अंतर कर सकते हैं, जबकि फाइब्रोब्लास्ट से एस्ट्रोसाइट्स30तक प्रत्यक्ष रूपांतरण विधि का उपयोग करके केवल 2% की तुलना में। हाल ही में, हमारे वर्णित पुनर्प्रोग्रामिंग विधि का उपयोग करके एक तुलनात्मक प्रतिलिपि अध्ययन से पता चला है कि दाता फाइब्रोब्लास्ट से पुनर्प्रोग्राम किए गए iNPCs प्रतिलेखन और कार्यात्मक स्तर पर वृद्धावस्था सुविधाओं को बनाए रख सकते हैं जो आयु मिलान वाले पोस्टमॉर्टम एस्ट्रोसाइट्स और प्राथमिक एस्ट्रोसाइट्स29के समान है। इस प्रकार, यह रूपांतरण प्रोटोकॉल रोग तंत्र की जांच करने और उम्र से संबंधित न्यूरोडीजेनेरेटिव और न्यूरोलॉजिकल विकारों के लिए उपन्यास चिकित्सीय दृष्टिकोणों का मूल्यांकन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है।
यहां हम iNPCs उत्पन्न करने और आईए में आगे भेदभाव करने के लिए उपयोग किए गए प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, जो बड़े पैमाने पर छोटे आणविक स्क्रीनिंग परख के लिए सबसे उपयुक्त हैं। रोग तंत्र और आईओएस के साथ दवा परीक्षण न्यूरॉन्स या मेटाबोलिक और जैव रासायनिक विश्लेषण के साथ सह संस्कृतियों के रूप में विभिन्न तरीकों का उपयोग किया जा सकता है। इस प्रणाली का लाभ आईपीएससी की तुलना में इन सेल लाइनों की गति और रखरखाव में आसानी है। इसके अलावा, आईए भेदभाव के लिए छोटे भागों में iNPCs जमे हुए किया जा सकता है जो समय की विस्तारित अवधि में निरंतर परिस्थितियों में दवा परीक्षण की सुविधा प्रदान करता है । कुल मिलाकर, बड़े नमूना संख्या की तुलना इस तरह संभव हो जाती है जो एक बड़े और अधिक प्रतिनिधि रोगी आबादी में यौगिकों की चिकित्सीय क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए दरवाजा खोलता है।
संक्षेप में, प्रत्यक्ष रूपांतरण रोगी त्वचा फाइब्रोब्लास्ट से प्रेरित न्यूरोनल प्रोजेनिटर कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए एक तेज और आसान तरीका है। इस विधि की गति के साथ-साथ उत्पन्न कोशिकाओं की बड़ी संख्या के कारण यह विधि लाभप्रद है जिसे बनाए रखना आसान है। इसके अलावा, बढ़ते साक्ष्य ों से पता चलता है कि सीधे पुनर्प्रोग्रामिंग विधियां क्लासिक आईपीएससी रीप्रोग्रामिंग तकनीक की तुलना में कम एपिजेनेटिक मार्क्स को हटा देती हैं, इसलिए रोग के वातावरण को अधिक बरकरार छोड़ जाता है4,7,8। एस्ट्रोसाइट्स के लिए आईएनपीसी का भेदभाव बहुत सीधे आगे है और कई स्वतंत्र प्रयोगशालाओं के बीच भी अत्यधिक पुन: उत्पन्न होता है19,29,33. iNPCs को छोटे हिस्सों में जमे हुए किया जा सकता है और सीधे भेदभाव उद्देश्यों के लिए गल सकता है, जो प्रयोगों के बीच भिन्नता को कम करने में मदद करता है क्योंकि मार्ग संख्या को समान रखा जा सकता है। एस्ट्रोसाइट्स कई न्यूरोलॉजिकल रोगों में रोग प्रगति में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं और इसलिए काम करने के लिए एक दिलचस्प सेल प्रकार हैं। एस्ट्रोसाइट्स का उपयोग मशीनी अध्ययन, मेटाबोलिक अध्ययन या दवा परीक्षण परख के लिए किया जा सकता है और आमतौर पर मोनोलेयर के रूप में उगाया जाता है। इसके अलावा, एस्ट्रोसाइट्स को न्यूरोनल सर्वाइवल और आकृति विज्ञान पर एस्ट्रोसाइट्स के प्रभाव का आकलन करने के लिए माउस या मानव न्यूरॉन्स के साथ सह-संस्कृति प्रणालियों में जोड़ा जा सकता है, जिनमें से दोनों दवा परीक्षण34के लिए अच्छे रीडआउट हैं।
इस प्रोटोकॉल का सफलतापूर्वक उपयोग करने के लिए कुछ बिंदुओं और संभावित सीमाओं को ध्यान में रखने की जरूरत है । उदाहरण के लिए मानव त्वचा फाइब्रोब्लास्ट उनके सेल डिवीजन दर के साथ-साथ वायरल वैक्टर के जवाब में बहुत भिन्न होती है। चूंकि ये मानकीकृत सेल लाइनें नहीं हैं, वे मानव जाति के रूप में ही चर रहे हैं, प्रत्येक पंक्ति अलग है । कई रीप्रोग्रामिंग विधियों के लिए, फाइब्रोब्लास्ट को फिर से प्रोग्राम करना आसान है जिसमें मध्यम से तेज सेल डिवीजन दर बनाम कोशिकाएं हैं जो मुश्किल से नकल कर रही हैं। प्रतिकृति दर त्वचा बायोप्सी गुणवत्ता और प्रसंस्करण से प्रभावित हो सकती है, फाइब्रोब्लास्ट के मार्ग संख्या के साथ-साथ हैंडलिंग से। प्राथमिक त्वचा फाइब्रोब्लास्ट के साथ काम करते समय, यह महत्वपूर्ण है कि कोशिकाओं को सेनेसेंस के प्रेरण से बचने के लिए बहुत घना न होने दें। यदि फाइब्रोब्लास्ट अच्छी तरह से विकसित नहीं होते हैं, तो एक नए स्टॉक या कम मार्ग की कोशिश करना सबसे अच्छा है, हालांकि कुछ मामलों में, रोग स्वयं भी एक भूमिका निभा सकता है। मानक 10% की तुलना में फाइब्रोब्लास्ट मीडिया में 15% या 20% एफबीएस का उपयोग करके सेल डिवीजन में कभी-कभी सुधार किया जा सकता है।
रिप्रोग्रामिंग वायरल वैक्टर की गुणवत्ता सफलता के लिए उच्च महत्व की है। हमारे हाथों में, रेट्रोवायरल वैक्टर लेंटीवायरल वैक्टर या अन्य गैर-एकीकृत वायरस की तुलना में अधिक कुशल थे; हालांकि, यह वायरल वेक्टर गुणवत्ता और शुद्धता पर निर्भर हो सकता है। वाणिज्यिक रेट्रोवायरल वेक्टर किट आमतौर पर वायरल वेक्टर एकाग्रता को निर्दिष्ट करते हैं और अक्सर एक निश्चित सेल लाइन के लिए संक्रमण की बहुलता भी देते हैं। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि प्राथमिक फाइब्रोब्लास्ट वायरल वेक्टर तेज निर्धारित करने के लिए कंपनियों द्वारा उपयोग की जाने वाली सेल लाइन से भिन्न होते हैं। इसके अलावा, यहां तक कि जब एक ही वाणिज्यिक किट का आदेश, बैचों के बीच भिन्नता आम है । इसके अलावा, वायरल वैक्टर का तेज भी फाइब्रोब्लास्ट सेल लाइनों के बीच भिन्न होता है। कुछ लाइनें अधिक संवेदनशील हो सकती हैं और इसलिए ट्रांसड्यूड कोशिकाएं मर सकती हैं, जबकि अन्य सेल लाइनें वायरल तेज के लिए अधिक प्रतिरोधी हो सकती हैं। इस प्रकार, किसी दिए गए सेल लाइन के लिए ट्रांसडक्शन दक्षता का निर्धारण करना महत्वपूर्ण हो सकता है, खासकर यदि सेल लाइन धीरे-धीरे बढ़ रही है या पिछले रूपांतरण प्रयास विफल हो गए हैं। हमारे हाथों में, रूपांतरण के लिए एक विशिष्ट रेट्रोवायरल वेक्टर की कितनी आवश्यकता है, इसका मूल्यांकन करने का सबसे अच्छा तरीका वायरल वेक्टर के कई कमजोर पड़ने के साथ एक इम्यूनोफ्लोरेटेंट धुंधला करना है। प्रत्येक वेक्टर के लिए ट्रांसजीन व्यक्त करने वाली कोशिकाओं की संख्या को 70% या उससे अधिक की ट्रांसडक्शन दक्षता के उद्देश्य से गिना जा सकता है। हमारे अनुभव में, इसी तरह के MOIs सबसे सेल लाइनों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है लेकिन एमओआई यदि आवश्यक हो तो समायोजित किया जा सकता है ।
रूपांतरण प्रक्रिया के दौरान, कोशिकाओं को बहुत जल्दी विभाजित नहीं करना महत्वपूर्ण है। समय जब तक कोशिकाओं को विभाजित करने के लिए तैयार कर रहे है प्राथमिक सेल लाइन और उसकी विशेषताओं, वायरल वेक्टर की गुणवत्ता का इस्तेमाल किया और मीडिया की गुणवत्ता सहित कई कारकों पर निर्भर करता है । महत्वपूर्ण बात यह है कि जब कोशिकाओं को उच्च घनत्व पर रखा जाता है तो रूपांतरण की सफलता दर बहुत अधिक होती है। यहां तक कि अगर कोशिकाएं आकृति विज्ञान को बदलने लगती हैं, तो कोशिकाओं को समय से पहले विभाजित करने से अधिक समय तक छोड़ देना बेहतर होता है। विभाजन बहुत जल्दी होता है रूपांतरण अपनी प्रगति में रोक सकता है और कोशिकाओं को फाइब्रोब्लास्ट की तरह आकार और व्यवहार में वापस अंतर करने के लिए नेतृत्व । इसके अलावा, उन्हें बहुत जल्दी कमजोर करने से एनपीसी के छोटे और कॉम्पैक्ट सेल निकायों की तुलना में अधिक विस्तारित सेल निकाय हो सकते हैं। इस प्रकार, पहले विभाजन हमेशा रूढ़िवादी होना चाहिए; कोशिकाओं को बहुत अधिक पतला करने की तुलना में 1:1 या 1:2 विभाजन के साथ बहुत घने रखना बेहतर है। प्रारंभिक विभाजन के बाद कुछ सेल मृत्यु की उम्मीद है। ध्यान दें, कोशिकाएं विभाजन के बाद पहले दिन हमेशा बदतर (चापलूसी) दिखती हैं, जो सामान्य है। सेल आकार पर सबसे अच्छा निर्णय 2-3 दिन बाद किया जाना चाहिए। महत्वपूर्ण बात यह है कि विकास कारकों और मीडिया घटकों की गुणवत्ता भी महत्वपूर्ण है । विकास कारकों वाले मीडिया की छोटी मात्रा तैयार करना महत्वपूर्ण है ताकि पूरी तरह से तैयार मीडिया का उपयोग केवल 5-7 दिनों के लिए अधिकतम किया जा सके । समय की विस्तारित अवधि के लिए कमरे के तापमान या 37 डिग्री सेल्सियस पर मीडिया मत रखो। मीडिया में बदलाव होते ही जल्दी से इस्तेमाल करें और फ्रिज में रखें। इसके अलावा, 2 एमएल के बजाय 1 एमएल पर मीडिया की मात्रा कम रखने से विशेष रूप से सेल लाइनों के लिए मदद मिल सकती है जो परिवर्तित करने के लिए अधिक प्रतिरोधी हैं। यदि कोशिकाएं मीडिया का तेजी से उपभोग करती हैं, जिसे मीडिया रंग में परिवर्तन द्वारा देखा जा सकता है लाल से पीले (एसिडिफिकेशन रेट) तक, मीडिया की मात्रा को 2 मिलील तक समायोजित करें। रैपिड मीडिया की खपत एक सकारात्मक संकेत है और अक्सर प्रसार में वृद्धि के साथ रूपांतरण के बाद के चरणों में मनाया जाता है।
एनपीसी मीडिया में एक्पुटेज की मौजूदगी को लेकर भी काफी संवेदनशील होते हैं और एक्पुटेस को इनक्यूबेशन समय कम रखना बहुत जरूरी है। हम 2-4 मिनट की इनक्यूबेशन अवधि की सलाह देते हैं, माइक्रोस्कोप के नीचे अक्सर कोशिकाओं की जांच करते हैं ताकि यह देखा जा सके कि वे अलग होते हैं। मीडिया से एंजाइम मिश्रण को हटाने के लिए विभाजन के बाद कोशिकाओं को अपकेंद्रित्र करना आवश्यक है। यह भी मन में पारित होने की संख्या रखने के रूप में सेल लाइनों विस्तारित संस्कृति अभिव्यक्ति प्रोफाइल के परिवर्तन के लिए अग्रणी पर बदल सकते है महत्वपूर्ण है । इस प्रकार, शुरुआती मार्ग पर कई सेल स्टॉक को फ्रीज करना महत्वपूर्ण है। कोशिकाओं को 10% DMSO और ९०% एनपीसी मीडिया में जमे हुए और तरल नाइट्रोजन में दीर्घकालिक संग्रहीत किया जाना चाहिए । इस मीडिया में सीरम की कमी के कारण यह ठंड कक्षों का उपयोग कर एक धीमी गति से फ्रीज सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है और एक बार रात भर जमे हुए, तुरंत तरल नाइट्रोजन के लिए हस्तांतरण । हालांकि इस प्रोटोकॉल में कोई क्लोनल चयन नहीं किया जाता है, यह संभव है कि विस्तारित खेती और पासिंग अनुकूल विकास और जीवित रहने की दर के साथ प्रारंभिक कोशिका आबादी के प्राकृतिक चयन की ओर जाता है। इसलिए, प्रयोग करते समय मार्ग संख्या और हैंडलिंग को ध्यान में रखना महत्वपूर्ण है। हम प्रयोगों के लिए कम मार्ग का उपयोग करना पसंद करते हैं, यदि संभव हो, तो हम 20 से अधिक बार सेल लाइनों को पास करने से अधिक नहीं हैं। चूंकि एनपीसी तेजी से बढ़ते हैं, इसलिए प्रयोगों के लिए कम मार्ग पर बड़ी संख्या में स्टॉक जमे हुए हो सकते हैं । विशेष रूप से उच्च विकास दर वाली सेल लाइनों में मीडिया एसिडिफिकेशन का खतरा अधिक है । इस प्रकार, जैसे-जैसे सेल लाइनें अलग-अलग गति के साथ बढ़ती हैं, प्रसार के आधार पर मीडिया की मात्रा को समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है। यदि कोशिकाओं को लगातार अत्यधिक अम्लीय मीडिया में छोड़ दिया जाता है, तो यह नियंत्रण और रोग कोशिका रेखाओं दोनों के स्वास्थ्य को प्रभावित कर सकता है। यह भी स्वस्थ एस्ट्रोसाइट्स प्रतिक्रियाशील बनने के लिए कारण बनता है, आगे भेदभाव और प्रयोगों में उनके उपयोग को प्रभावित ।
एस्ट्रोसाइट भेदभाव के लिए, कोशिकाओं को कम घनत्व पर रखना महत्वपूर्ण है क्योंकि उच्च घनत्व कोशिकाओं को अंतर करने से रोकेगा और वे उच्च दरों पर प्रसार करते रहेंगे। इस प्रकार, प्रत्येक सेल लाइन के लिए उनकी प्रसार दर पर निर्भर सीडिंग घनत्व को समायोजित करने की आवश्यकता है। हम विभिन्न सीडिंग घनत्व की कोशिश करने की सलाह देते हैं और उचित भेदभाव सुनिश्चित करने के लिए एस्ट्रोसाइट मार्कर के साथ धुंधला/आरटी-पीसीआर करते हैं। आईओएस गुणवत्ता का आकलन न्यूरॉन्स के साथ सह-संस्कृति परख का उपयोग करके स्वस्थ नियंत्रणों के साथ किया जा सकता है। बशर्ते रोग विकृति प्रतिक्रियाशील फेनोटाइप का कारण न बन जाए, न्यूरॉन्स को कई दिनों तक आईए के संपर्क में रहना चाहिए। एस्ट्रोसाइट आकृति विज्ञान व्यक्तिगत सेल लाइनों के बीच बहुत भिन्न हो सकता है और रोग फेनोटाइप से भी प्रभावित हो सकता है। इसके अलावा, बीमारियों में जहां एस्ट्रोसाइट्स पर भारी प्रभाव पड़ता है, वे बड़े, लम्बी एक्सटेंशन के साथ एक प्रतिक्रियाशील फेनोटाइप दिखा सकते हैं।
The authors have nothing to disclose.
हम अनुसंधान अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण नमूने दान करने के लिए सभी रोगियों और स्वस्थ स्वयंसेवकों का शुक्रिया अदा करते हैं । इसके अलावा, हम एक सहयोगी के रूप में अपनी प्रयोगशाला में तकनीक की पुष्टि करने के लिए स्वतंत्र रूप से ऊतक संस्कृति और लौरा Ferraiuolo में निरंतर विशेषज्ञ तकनीकी सहायता के लिए रोशेल रोड्रिगो का शुक्रिया अदा करते हैं । इस काम को अमेरिका के स्वास्थ्य अनुदान R01 NS644912-4 और RC2 NS69476-01 (A.L.S.) और ALS अनुसंधान अनुदान P2ALS और मदद लिंक फाउंडेशन के लिए पैकार्ड केंद्र से धन प्राप्त किया । K.M स्विस नेशनल साइंस फाउंडेशन के साथ-साथ मस्कुलर डिस्ट्रॉफी एसोसिएशन, रिट सिंड्रोम रिसर्च ट्रस्ट और SCN2A फाउंडेशन के परिवारों से युवा अन्वेषक विकास पुरस्कार से भी धन प्राप्त किया ।
100mm x 2mm Style dish, Cell culture treated, Nonpyrogenic | Corning | 430167 | Tissue culture |
15 ml conical screw cap centrifuge tubes, copolymer polypropylene | USA Scientific | 1475-1611 | Used for lifting and centrifuge cells |
50mL Conical Centrifuge Tubes | USA Scientific | 1500-1811 | Media preparation |
Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | Antibiotic with antifungal activity for media preparation |
B-27 Supplement (50X), serum free | Invitrogen | 17504044 | For NPC and base media |
Cryogenic vials 1.2ML | Corning | CLS430658-500EA | For freezing cell stocks |
DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Gibco | 10569010 | For fibroblast and Astrocyte media |
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Gibco | 10565042 | For NPC and base media |
DMSO | Sigma | D2438-50ML | For freezing cell stocks |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190136 | Referred in protocol as PBS. For fibronectin dilution and cell wash |
EZ Retrovirus iPSC Reprogramming Kit | ALSTEM | RF101 | Retrovirus containing the Yamanaka factors. Virus can also be made in-house. |
Fetal Bovine Serum, certified | Gibco | 16000-036 | Referred in protocol as FBS . For Fibroblast and Astrocyte media |
Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use | Fisher | 14-955-461 | Filter media (50mL) |
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma | H3149-10KU | Referred in protocol as Heparin. Used in conversion media. Powder diluted in ultrapure water. Final stock concentration of 5000X |
Human Plasma Fibronectin Purified Protein | Millipore Sigma | FC010-10MG | Referred in protocol as Fibronectin, used in 1:200 dilution for coating. |
Isopropanol (technical grade) | Fisher Scientific | S25372A | For freezing cell stocks |
Mr. Frosty | Thermo Fisher | 5100-0001 | For freezing cell stocks |
N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502048 | For Astrocyte, NPC and base media |
Recombinant Human EGF | Preprotech | AF-100-15 | Referred in protocol as EGF, used in conversion media. Powder diluted in PBS, final concentration of 1mg/mL, stored in small frozen aliquots |
Recombinant Human FGF-basic | Preprotech | 100-18B | Referred in protocol as FGF, used in NPC and conversion media. Powder diluted in PBS, final concentration of 1mg/mL, stored in small frozen aliquots |
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | Referred in protocol as Accutase. Used for lifting during the conversion process and NPCs. |
Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System | Millipore Sigma | S2GPU05RE | Media filtration |
Tissue culture plate, 6 well, Flat bottom with Low evaporation lid | Fisher | 08-772-1B | Tissue culture |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Invitrogen | 25300062 | Lifting of Fibroblasts and Astrocytes |
Whatman Puradisc 25 syringe filters, 0.2 μm, PES sterile | Millipore Sigma | 80-2502 | Filter media (50mL) |