Clareza refinada baseada em clareza para organização de fibroblasto tridimensional em corações de rato saudáveis e feridos

Demetria M. Fischesser; Evan C. Meyer; Michelle Sargent; Jeffery D. Molkentin

doi:10.3791/62023

Artigo de método

Clareza refinada baseada em clareza para organização de fibroblasto tridimensional em corações de rato saudáveis e feridos

DOI:

10.3791/62023

⸱

16 de maio de 2021

Demetria M. Fischesser¹^,² , Evan C. Meyer³ , Michelle Sargent² , Jeffery D. Molkentin²

¹Department of Molecular Genetics, Biochemistry, and Microbiology, University of Cincinnati College of Medicine, ²Division of Molecular Cardiovascular Biology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, ³Confocal Imaging Core, Cincinnati Children's Hospital Medical Center

Neste artigo

Resumo

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Um método refinado de limpeza tecidual foi desenvolvido e aplicado ao coração do rato adulto. Este método foi projetado para limpar tecido cardíaco denso e autofluorescente, mantendo a fluorescência do fibroblasto rotulada atribuída a uma estratégia de repórter genético.

Resumo

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A doença cardiovascular é a causa mais prevalente de mortalidade em todo o mundo e é frequentemente marcada pelo aumento da fibrose cardíaca que pode levar ao aumento da rigidez ventricular com função cardíaca alterada. Esse aumento da fibrose ventricular cardíaca deve-se à ativação de fibroblastos residentes, embora a forma como essas células operam dentro do coração tridimensional (3D), na linha de base ou após a ativação, não seja bem compreendida. Para examinar como os fibroblastos contribuem para doenças cardíacas e sua dinâmica no coração 3D, foi desenvolvido um refinado método de limpeza e imagem de tecido baseado em CLARITY que mostra fibroblastos cardíacos fluorescentes rotulados dentro de todo o coração do camundongo. Os fibroblastos residentes em tecidos foram geneticamente rotulados usando ratos repórteres florescentes Rosa26-loxP-eGFP cruzados com o fibroblasto cardíaco expressando linha de knock-in Tcf21-MerCreMer. Esta técnica foi utilizada para observar a dinâmica de localização do fibroblasto em todo o ventrículo esquerdo adulto em camundongos saudáveis e em modelos de camundongos fibrosos de doenças cardíacas. Curiosamente, em um modelo de lesão, foram observados padrões únicos de fibroblastos cardíacos no coração do rato ferido que se seguiu a faixas de fibras embrulhadas na direção contraltil. Nos modelos de lesão isquêmica, ocorreu a morte do fibroblasto, seguida de repopulação da zona de fronteira infarto. Coletivamente, esta técnica de esclarecimento de tecido cardíaco refinado e sistema de imagem digitalizada permite a visualização 3D de fibroblastos cardíacos no coração sem as limitações da falha de penetração de anticorpos ou questões anteriores em torno da fluorescência perdida devido ao processamento tecidual.

Introdução

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Embora os cardiomiócitos compõem a maior fração de volume do coração, os fibroblastos cardíacos são mais abundantes e estão criticamente envolvidos na regulação das características estruturais e reparadoras da linha de base deste órgão. Os fibroblastos cardíacos são altamente móveis, mecanicamente responsivos e fenotipicamente variando dependendo da extensão de sua ativação. Os fibroblastos cardíacos são necessários para manter os níveis normais de matriz extracelular (ECM), e a produção muito pequena ou muito de ECM por essas células pode levar à doença^1,²^,³. Dada a sua impo....

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Protocolo

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Todos os experimentos envolvendo camundongos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) do Centro Médico Hospitalar Infantil de Cincinnati. A instituição também é certificada pela AAALAC (Associação Americana de Acreditação de Cuidados Com Animais laboratoriais). Os camundongos foram eutanizados por luxação cervical, e os camundongos submetidos a procedimentos cirúrgicos de sobrevivência receberam alívio da dor (veja abaixo). Todos os métodos utilizados para o tratamento da dor e eutanásia baseiam-se em recomendações do Painel de Eutanásia da Associação Médica Veterinária Americana. Todos os ratos estavam alojados em unidades de cam....

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Resultados

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Os fibroblastos cardíacos são essenciais para a função de base do coração, bem como para a resposta à lesão cardíaca. Tentativas anteriores de entender o arranjo e a morfologia dessas células foram conduzidas em grande parte em configurações 2D. No entanto, foi publicada uma técnica de limpeza de tecido cardíaco refinado(Figura 2) e 3D, que permite a visualização avançada e mais detalhada de fibroblastos cardíacos. Com esta técnica de imagem, os fibroblastos foram encontrados densamente emba.......

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Discussão

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Este artigo apresenta um método refinado de limpeza tecidual que permite a visualização de fibroblastos cardíacos in vivo, tanto na linha de base quanto na lesão seguinte, para caracterizar e entender melhor os fibroblastos no coração do camundongo. Este protocolo aprimorado aborda limitações nos protocolos de limpeza de tecidos existentes que tentaram identificar tipos de células específicas no coração adulto ou neonatal^12,^13,¹⁴

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Divulgações

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Os autores não têm nenhuma divulgação relacionada ao conteúdo deste manuscrito.

Agradecimentos

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Os autores gostariam de reconhecer o CCHMC Confocal Imaging Core por sua assistência e orientação no desenvolvimento deste modelo, bem como Matt Batie da Clinical Engineering para o projeto de todas as peças impressas em 3D. Demetria Fischesser foi apoiada por uma bolsa de treinamento dos Institutos Nacionais de Saúde, (NHLBI, T32 HL125204) e Jeffery D. Molkentin foi apoiado pelo Howard Hughes Medical Institute.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
Nome	Empresa	Número de catálogo
4-0 seda trançada	Ethicon	K871H
8-0 prolene	Ethicon	8730H
40% Solução de Acrilamida	Bio-Rad	1610140
Angiotensina II	Sigma	A9525-50G
Pomada Lacrimal Artificial	Covetrus	048272
DABCO (1,4-diazabiciclo[2.2.2]octana)	Millipore Sigma	D27802-25G
GLUture adesivo tecidual tópico	Instrumentos de precisão mundial	503763
heparina	Sigma	H0777
Imaris Start Software de análise	Instruments	N/A
Bombas micro-osmóticas	Alzet	Modelo 1002
Nikon Elements Analysis Software	Nikon	N/A
Nikon A1R HD microscópio vertical	Nikon	N / A
Normal autoclavado chow	Labdiet	5010
Nycodenz, 5- (N-2, 3-dihidroxipropiletamido) -2, 4, 6-tri-iodo-N, N'-bis (2, 3 dihidroxipropil) isoftalamida	CosmoBio	AXS-1002424
Paraformaldeído	Microscopia Eletrônica Ciências	15710
Cloridrato de fenilefrina	Sigma	P6126-10G
Fotoiniciador	Wako Chemicals	VA-044
Rosa26-nLacZ [FVB. Cg-Gt (ROSA) 26Sortm1 (CAG-lacZ, -EGFP) Glh / J]	Jackson Laboratories	Jax Nº de estoque: 012429
Azida de sódio	Sigma Aldrich	S2002-5G
Solução de cloreto de sódio	Hospira, Inc.	NDC 0409-4888-10
Tamoxifeno	Sigma Aldrich	T5648
Tamoxifeno alimentar	Envigo	TD.130860
Tween-20	Thermo Fisher Scientific	BP337-500
Quadrol, N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hidroxipropil)etilenodiamina, agente descolorante	Millipore Sigma	122262-1L
X-Clarity câmara de limpeza eletroforética	Logos Biosystems	C30001
Solução de limpeza eletroforética X-Clarity	Logos Biosystems	C13001
Cesto de tecidos de eletroforese X-Clarity	Logos Biosystems	C12001
Suporte de cesto de tecidos de eletroforese X-Clarity	Logos Biosystems	C12002

Oxford

Referências

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Nagaraju, C. K., et al. Myofibroblast phenotype and reversibility of fibrosis in patients With end-stage heart failure. Journal of the American College of Cardiology. 73 (18), 2267-2282 (2019).
Yoon, S., Eom, G. H.

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Tissue Clearing Cardiac Fibroblasts CLARITY Protocol Three Dimensional Imaging Mouse Heart Cardiac Injury Confocal Microscopy Fibrosis Model Electrophoretic Clearing Fluorescent Labeling

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