Artigo de método

Clareza refinada baseada em clareza para organização de fibroblasto tridimensional em corações de rato saudáveis e feridos

DOI:

10.3791/62023

⸱

16 de maio de 2021

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Genetics, Biochemistry, and Microbiology, University of Cincinnati College of Medicine, 2Division of Molecular Cardiovascular Biology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 3Confocal Imaging Core, Cincinnati Children's Hospital Medical Center

Neste artigo

Resumo

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Um método refinado de limpeza tecidual foi desenvolvido e aplicado ao coração do rato adulto. Este método foi projetado para limpar tecido cardíaco denso e autofluorescente, mantendo a fluorescência do fibroblasto rotulada atribuída a uma estratégia de repórter genético.

Resumo

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A doença cardiovascular é a causa mais prevalente de mortalidade em todo o mundo e é frequentemente marcada pelo aumento da fibrose cardíaca que pode levar ao aumento da rigidez ventricular com função cardíaca alterada. Esse aumento da fibrose ventricular cardíaca deve-se à ativação de fibroblastos residentes, embora a forma como essas células operam dentro do coração tridimensional (3D), na linha de base ou após a ativação, não seja bem compreendida. Para examinar como os fibroblastos contribuem para doenças cardíacas e sua dinâmica no coração 3D, foi desenvolvido um refinado método de limpeza e imagem de tecido baseado em CLARITY que mostra fibroblastos cardíacos fluorescentes rotulados dentro de todo o coração do camundongo. Os fibroblastos residentes em tecidos foram geneticamente rotulados usando ratos repórteres florescentes Rosa26-loxP-eGFP cruzados com o fibroblasto cardíaco expressando linha de knock-in Tcf21-MerCreMer. Esta técnica foi utilizada para observar a dinâmica de localização do fibroblasto em todo o ventrículo esquerdo adulto em camundongos saudáveis e em modelos de camundongos fibrosos de doenças cardíacas. Curiosamente, em um modelo de lesão, foram observados padrões únicos de fibroblastos cardíacos no coração do rato ferido que se seguiu a faixas de fibras embrulhadas na direção contraltil. Nos modelos de lesão isquêmica, ocorreu a morte do fibroblasto, seguida de repopulação da zona de fronteira infarto. Coletivamente, esta técnica de esclarecimento de tecido cardíaco refinado e sistema de imagem digitalizada permite a visualização 3D de fibroblastos cardíacos no coração sem as limitações da falha de penetração de anticorpos ou questões anteriores em torno da fluorescência perdida devido ao processamento tecidual.

Introdução

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Embora os cardiomiócitos compõem a maior fração de volume do coração, os fibroblastos cardíacos são mais abundantes e estão criticamente envolvidos na regulação das características estruturais e reparadoras da linha de base deste órgão. Os fibroblastos cardíacos são altamente móveis, mecanicamente responsivos e fenotipicamente variando dependendo da extensão de sua ativação. Os fibroblastos cardíacos são necessários para manter os níveis normais de matriz extracelular (ECM), e a produção muito pequena ou muito de ECM por essas células pode levar à doença1,2,3. Dada a sua importância na doença, os fibroblastos cardíacos tornaram-se um tema de investigação cada vez mais importante para identificar novas estratégias de tratamento, especialmente na tentativa de limitar a fibrose excessiva4,5,6,7. Após a lesão, os fibroblastos ativam e diferenciam-se em um tipo de célula mais sintética conhecida como myofibroblast, que pode ser proliferativa e segregar eCM abundante, bem como ter atividade contraível que ajuda a remodelar os ventrículos.

Enquanto os fibroblastos cardíacos têm sido amplamente avaliados por suas propriedades nas culturas 2D6,8,9,10, muito menos se entende de suas propriedades e dinâmicas no coração vivo 3D, seja na linha de base ou com estimulação da doença. Aqui, um método refinado foi descrito para limpar o coração do camundongo adulto, mantendo a fluorescência de fibroblastos rotulados com um sistema de repórter genético Rosa26-loxP-eGFP x Tcf21-MerCreMer. Dentro do coração, Tcf21 é um marcador relativamente específico de fibroblastos quiescentes4. Depois que o tamoxifen é dado para ativar a proteína MerCreMer indutível, essencialmente todos os fibroblastos quiescentes expressarão permanentemente proteína fluorescente verde aprimorada (eGFP) do lócus Rosa26, o que permite seu rastreamento in vivo.

Existem inúmeros protocolos de limpeza tecidual bem estabelecidos, alguns dos quais foram aplicados ao coração11,12,13,14,15,16,17. No entanto, muitos dos reagentes usados em diferentes protocolos de limpeza de tecidos foram encontrados para saciar sinais de fluorescência endógena18. Além disso, o coração adulto é difícil de limpar devido às abundantes proteínas contendo grupo de heme que geram autofluorescência19. Portanto, o objetivo deste protocolo foi preservar a fluorescência do marcador fibroblasto com a inibição simultânea da autofluorescência de heme no coração adulto ferido para visualização 3D ideal in vivo12,13,14,16,17,20.

Estudos anteriores que tentavam examinar o fibroblasto cardíaco in vivo empregavam anticorpos perfumados para rotular essas células, embora tais estudos tenham sido limitados pela penetração de anticorpos e estrutura vascular cardíaca14,16,17,20. Embora Salamon et al. tenham mostrado clareamento tecidual com manutenção de fluorescência neuronal tópica no coração neonatal, e Nehrhoff et al. mostraram manutenção da fluorescência marcando células mielóides, a manutenção da fluorescência endógena por toda a parede ventricular ainda não foi demonstrada, incluindo a visualização de fibroblastos cardíacos adultos na linha de base ou após lesão13,20. Este protocolo de limpeza tecidual refina uma mistura de protocolos anteriores com base no método CLARITY (sistema de solvente rígido híbridoizado por lipídida-lipídida (PEG) e sistema solvente associado ao PEGASOS (sistema solvente associado ao FIL). Este protocolo refinado permitiu um exame mais robusto de fibroblastos cardíacos no coração do camundongo na linha de base e de como eles respondem a diferentes tipos de lesões. O protocolo é simples e reproduzível e ajudará a caracterizar o comportamento dos fibroblastos cardíacos in vivo.

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Protocolo

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Todos os experimentos envolvendo camundongos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) do Centro Médico Hospitalar Infantil de Cincinnati. A instituição também é certificada pela AAALAC (Associação Americana de Acreditação de Cuidados Com Animais laboratoriais). Os camundongos foram eutanizados por luxação cervical, e os camundongos submetidos a procedimentos cirúrgicos de sobrevivência receberam alívio da dor (veja abaixo). Todos os métodos utilizados para o tratamento da dor e eutanásia baseiam-se em recomendações do Painel de Eutanásia da Associação Médica Veterinária Americana. Todos os ratos estavam alojados em unidades de cama de espigas de milho com água e alimentos disponíveis o tempo todo. Os ratos foram alojados 4 em uma gaiola com o mesmo sexo. Para cirurgia ou limpeza de tecido não ferido, foram utilizados números iguais de camundongos machos e fêmeas de 6 a 8 semanas de idade.

NOTA: As condições cirúrgicas estéreis foram mantidas em todas as cirurgias. O cirurgião se transformou em esfregões limpos e um vestido estéril e, em seguida, vestiu capas de sapato e uma rede de cabelo. O cirurgião então esfregou as mãos com clorexidina e vestiu luvas cirúrgicas estéreis. O cirurgião foi auxiliado por um técnico que sedou, raspou e limpou o local da incisão 3 vezes cada, alternando entre 2% de clorohexino gluconato e 70% isopropanol. Os camundongos foram então levados ao cirurgião, e a cirurgia foi realizada. Entre os animais, os instrumentos foram esterilizados em um esterilizador de contas.

1. Recombinação de Cre

  1. Cross Rosa26-loxP-eGFP (Rosa26-nLacZ [FVB. Cg-Gt(ROSA)26Sortm1 (CAG-lacZ,-EGFP)Glh/J]) com ratos Tcf21-MerCreMer(Figura 1A)6,21.
  2. Quando a prole desta cruz atingir 6 semanas de idade, administre uma injeção intraperitoneal de 75 mg/kg de tamoxifen dissolvido em óleo de milho. 22 Administre este tamoxifeno duas vezes, 48 h de distância(Figura 1B).
  3. Após injeções de tamoxifen, coloque os camundongos em uma dieta de alimentos tamoxifen (~0,4 g/kg de citrato de tamoxifen) por uma semana. Após uma semana de tamoxifen chow, devolva os camundongos a uma dieta normal de chow autoclaved por uma semana antes de realizar a cirurgia(Figura 1B). Designe um número apropriado de camundongos (3 por condição cirúrgica) para serem controles ilesos. Sacrifique esses camundongos, e prossiga para o processo de compensação delineado abaixo após uma semana de dieta normal de comida.
  4. Seguindo o regime de tamoxifeno e recombinação, realize a cirurgia.

2. Modelos cirúrgicos

  1. Isquemia/reperfusão (I/R)23,24
    1. Anesthetize ratos com 1,5% de gás isoflurane no ar da sala em uma caixa ventilada; raspar seus peitos e pescoços com cortadores elétricos, e depois esfregar as áreas raspadas com um cotonete gluconato de 2% de clorhexidina.
    2. Use pomada lacrimal artificial para evitar o ressecamento durante a cirurgia, colocando pomada nos olhos dos camundongos sedados.
    3. Realize um corte no meio do pescoço usando uma tesoura cirúrgica para permitir a visualização da traqueia. Entubar com um cateter de 20 G colocando o tubo de intubação na traqueia e visualizar o cateter traqueal através da incisão do pescoço médio. Coloque os ratos em um ventilador enquanto sedado com gás isoflurane (1,5%) no ar da sala.
    4. Faça uma incisão sob o membro dianteiro esquerdo com uma tesoura cirúrgica, e corte os músculos intercostais entre as costelas 3 e 4. Espalhe as costelas abertas usando um retrátil.
    5. Coloque uma pequena esponja encharcada em soro fisiológico entre o pulmão e o coração para evitar danos ao pulmão.
    6. Usando uma agulha de anzol (6,5 mm, 3/8 c), amarre a artéria coronária esquerda com um nó de deslizamento liberado usando 8-0 Prolene, prolene.
    7. Remova a esponja usando fórceps.
    8. Sutura os músculos intercostais fechados usando seda trançada 4-0 e uma sutura contínua, ao mesmo tempo que exterioriza a extremidade do 8-0 nó de deslizamento prolene.
    9. Feche as incisões da pele usando adesivo de tecido tópico com a extremidade do nó de deslizamento de oclusão saliente.
    10. Após uma hora de oclusão, puxe a extremidade externa do nó de deslizamento para liberar internamente a oclusão da artéria coronária, aliviando a isquemia e causando reperfusão.
    11. Administre 0,02 mL de uma buprenorfina de liberação estendida de 1 mg/mL através de injeção subdérmica (liberação de 72 h) como analgésico, e coloque os camundongos em uma câmara de incubação oxigenada a 37 °C, separada de outros animais. Monitore os camundongos pelo menos a cada 15 minutos até que eles tenham se recuperado da anestesia e sejam capazes de manter uma posição severa ou sentada. Devolva os ratos para suas casas regulares.
    12. Avalie os animais para dor e angústia por 48 horas após a cirurgia, e monitore o local de incisão diariamente até que esteja totalmente curado.
    13. Observe os camundongos para hidratação, nutrição e bem-estar geral após a cirurgia até o sacrifício.
  2. Infarto do miocárdio (MI)25,26,27
    1. Realize as etapas 2.1.1-2.1.7.
    2. Use uma sutura contínua para fechar os músculos intercostais usando seda trançada 4-0.
    3. Feche a incisão da pele usando adesivo de tecido tópico.
    4. Realize as etapas 2.1.11-2.1.13.
  3. Infusão de bomba micro-osmótica angiotensina II/fenilefrina
    1. Prepare Preparar uma solução de trabalho de 10 μg/μL de angiotensina II e 500 μg/μL solução de trabalho de fenilefrina em condições estéreis (ou seja, em uma capa de fluxo laminar) adicionando 1 mg de angiotensina II a 100 μL de salina tamponada de fosfato estéril (PBS) e 250 mg de cloridrato de fenilefrina em 500 μL de PBS.
    2. Calcule a diluição de cada solução de trabalho e o volume final para dispensar à bomba micro-osmótica com base no peso do mouse.
      NOTA: Por exemplo, um mouse de 20 g requer 20 g x 14 dias x 1,5 μg/dia = 420 μg angiotensin, ou 42 μL de solução de trabalho, bem como 20 g x 14 dias x 50 μg/dia = 14000 μg cloridrato de fenilefrina, ou 28 μL de solução de trabalho.
    3. Para o peso de cada rato, dilua o estoque de trabalho da droga em PBS estéril e encha as bombas micro-osmóticas (0,25 μL/h, 14 dias, aproximadamente 100 μL) usando uma agulha de 27 G e uma seringa de 1 mL.
      NOTA: Isso gerará uma taxa de fluxo de 1,5 μg∙g-1∙dia-1 de angiotensina II e 50 μg∙g-1∙dia-1 de cloridrato de fenilefrina uma vez colocado nos camundongos.
    4. Anestesiar os camundongos com 1,5% de inalação de isoflurane (para efeito) em uma câmara ventilada contendo ar da sala.
    5. Coloque os camundongos anestesiados em uma mesa cirúrgica estéril na posição opina e mantenha anestesia com inalação de gás isoflurane (1,5%) através de um cone de nariz.
    6. Use pomada artificial nos olhos do animal para evitar o ressecamento durante a cirurgia.
    7. Raspe a pele sobre a área de implantação com cortadores de cabelo elétricos, e esterilize a área a ser cortada usando etanol e um cotonete estéril. Faça uma pequena incisão (aproximadamente 1 cm) com uma tesoura cirúrgica na camada epidérmica da pele do rato no lado lateral direito das costas, abaixo da omoplata. Use os lados maçante de um par de tesouras cirúrgicas para esticar suavemente a pele dentro e ao redor da área de implantação para inserir a minibomba.
    8. Coloque a bomba micro-osmótica dentro da incisão, e manobrá-la fisicamente à esquerda da linha média dorsal do mouse massageando manualmente a bomba sob a pele.
    9. Feche a incisão através de sutura contínua usando seda 4-0 com uma agulha de ponto de fita.
    10. Após a implantação da bomba, administre a liberação lenta de buprenorfina a uma dose de 0,1 mg/kg de peso corporal através de injeção subdérmica para analgesia (liberação lenta de 72 horas). Coloque os camundongos em uma câmara de incubação oxigenada a 37 °C, separados de outros animais. Monitore os camundongos pelo menos a cada 15 minutos até que se recuperem da anestesia e possam manter uma posição severa ou sentada.
    11. Após a recuperação da anestesia na câmara de aquecimento de 37 °C, coloque os ratos de volta em suas unidades habitacionais padrão.
    12. Monitore os camundongos para dor e angústia por 48 horas após a cirurgia, e monitore o local de incisão diariamente até que esteja totalmente curado.
    13. Observe os camundongos para hidratação, nutrição e bem-estar geral após a cirurgia até o sacrifício.

3. Limpar corações de ratos adultos usando um protocolo clarity ativo modificado

  1. Prepare uma área cirúrgica limpa esterilizando a superfície cirúrgica e todas as ferramentas cirúrgicas com 70% de etanol. Prepare uma solução de PBS frio 1x e 4% de paraformaldeído (PFA) em PBS (100 mL cada). Use luvas, jaleco, máscara facial e proteção ocular.
  2. Prepare o tampão de heparina diluindo 10 unidades de heparina em solução de cloreto de sódio de 0,9% w/v. Injete cada rato intraperitonealmente com 60 μL de heparina-NaCl usando uma seringa de 1 mL e agulha de 27 G.
  3. Cinco minutos após a injeção da solução heparina-NaCl, anestesia os camundongos usando inalação de isoflurane de 1,5% (para efeito) em uma câmara ventilada contendo ar da sala.
  4. Eutanize os camundongos por luxação cervical, onde a parte de trás da cabeça é mantida com a extremidade plana e fechada dos fórceps, enquanto a coluna vertebral é deslocada puxando a cauda.
  5. Limpe a superfície ventral do mouse com 70% de etanol em um cotonete. Faça uma incisão transversal de 3 cm aproximadamente 3 cm abaixo do processo xifoide usando uma tesoura cirúrgica.
  6. Separe a pele do tecido da parede abdominal subjacente, desgolhando o abdômen até o processo xifoide (mantenha a pele mais próxima da cauda e puxe a pele mais próxima da cabeça em direção à caixa torácica). Faça uma incisão transversal de 2 cm no tecido da parede abdominal subcutânea 3 cm abaixo do processo xifoide usando uma tesoura cirúrgica. Faça um corte vertical a partir desta incisão transversal, até a linha média e através da caixa torácica. Fixe a caixa torácica de volta, expondo o coração.
  7. Use uma agulha de 27 G e uma seringa de 10 mL para injetar PBS frio na veia cava e aorta superior (qualquer manipulação posicional do coração deve ser feita cuidadosamente com fórceps contundentes para evitar perfurações) para limpar o sangue do coração.
    NOTA: A perfusão suficiente pode ser notada por contração da cauda e descoloração dos pulmões.
  8. Use uma agulha de 27 G e uma seringa de 10 mL para injetar PFA de 4% no ar e aorta superiores para iniciar o processo de fixação.
  9. Extir suas imundo os corações. O atria, o ventrículo direito e o septo e o ventrículo esquerdo devem ser separados usando um bisturi de lâmina reta. Coloque este tecido em um tubo de centrífuga de 15 mL cheio de PFA frio de 4%, e coloque em um nutador a 4 °C durante a noite.
  10. Lave o coração 3 vezes por 1h cada um com PBS frio de 1x para remover o excesso de PFA.
  11. Prepare o hidrogel (denominado A4P0 para composição relativa de acrilamida/poliacrilamida) misturando os seguintes produtos químicos em um tubo de centrífuga de 15 mL: 10% de 40% de acrilamida, 10% 1x PBS, 80% água destilada.
  12. Adicione a solução de 0,25% do fotoinitiador (2,2-Azobis[2-(2-imidazolina-2yl)propano)dihidrocloide) à solução de hidrogel pouco antes de submergir o coração no hidrogel.
  13. Coloque o coração em um tubo cônico contendo o hidrogel. Enrole o tubo cônico em papel alumínio e incubar durante a noite a 4 °C sem perturbação física.
  14. Depois de aproximadamente 14 horas a 4 °C, mova o tubo cônico contendo o coração para um banho de contas de 37 °C.
  15. Após 2,5 h no banho de contas, remova o coração do hidrogel cuidadosamente com fórceps.
  16. Lave os corações 3 vezes por 1h cada em um tubo cônico de 15 mL contendo 1x PBS a 37 °C em um nutador.
  17. Coloque os corações na cesta da máquina de eletroforese ativa usando fórceps e coloque a tampa na cesta. Certifique-se de que a tampa está bem colocada.
  18. Encha o reservatório ativo da câmara de eletroforese com solução de limpeza eletroforética despejando solução na câmara.
  19. Uma vez que a câmara esteja cheia de solução de limpeza eletroforética, a cesta contendo o coração pode ser submersa. Coloque a tampa na máquina de eletroforese com segurança.
  20. Execute a máquina de eletroforese a 1,5 A, 37 °C por 1,5 h.
  21. Após 1,5 h de eletroforese, verifique os corações visualmente para garantir que nenhum tecido opaco permaneça. Se as regiões do tecido ainda estiverem opacas, reins submergir o coração em solução de eletroforese na câmara eletroforética, e continuar a eletroforese por 0,5 h de cada vez.
    NOTA: A eletroforese deve ser descontinuada a princípio dos sinais de danos teciduais (como a desgastação tecidual).
  22. Lave os corações em tubo cônico de 15 mL contendo 1x PBS por 1h, 3 vezes cada, a 37 °C em um nutador.
  23. Submergir os corações em um tubo cônico de 15 mL contendo N,N,N',N'-Tetrakis(2-Hydroxipropyl)etilenodiamina — um agente descolorante que reduz a autofluorescência da heme.
    NOTA: Esta solução deve ser alterada a cada 24 horas até que os corações estejam completamente claros (aproximadamente 2 dias).
  24. Lave os corações em um tubo cônico de 15 mL com 1x PBS 3 vezes por 1h cada para remover o excesso de descoloração do agente.
  25. Prepare a Solução de Correspondência de Índices Refrativos (RIMS) combinando 30 mL de tampão fosfato de 0,02 M, 40 g de 5-(N-2, 3-dihydroxypropylacetamido)-2, 4, 6-tri-iodo-N,N'-bis (2, 3 dihidroxipropyl) isophthalamida com agitação (deve ser completamente dissolvido — isso pode levar até uma hora), 5 mg de azida de sódio, 50 μL de Tween20 e 1 g de 1,4-diazabicicclo[2.2.2]octano, e ajustar o pH para 7,5.
  26. Equilibre os corações em RIMS por 48 h antes da imagem.

4. Imagem limpou corações usando um microscópio confocal de fóton único ereto

NOTA: O aparelho de imagem consiste na metade inferior de uma placa de vidro de 10 cm, um reservatório de fundo impresso em 3D, um deslizamento de vidro redondo e um reservatório superior impresso em 3D(Figura 1C-E). Os materiais impressos em 3D foram feitos internamente pelo Departamento de Engenharia Clínica do Hospital Infantil de Cincinnati.

  1. Use graxa de vácuo para selar o reservatório de fundo impresso em 3D em uma placa de petri de vidro, colocando uma fina camada de graxa de vácuo na parte inferior da peça impressa 3D(Figura 1C).
    NOTA: O reservatório deve ter a mesma altura da amostra que está sendo imageada (ou seja, a amostra não deve ser compactada pelo deslizamento de vidro colocado em cima dele, e a amostra também não deve ser capaz de flutuar e se mover dentro do reservatório).
  2. Encha o reservatório com RIMS e remova todas as bolhas com uma ponta de tubulação. Coloque o coração nas RIMS cuidadosamente com a parede ventricular esquerda voltada para cima, garantindo que nenhuma bolha seja introduzida na solução.
  3. Adere a uma mancha de vidro à superfície inferior da peça superior impressa em 3D(Figura Suplementar 1A) usando graxa a vácuo (novamente colocando uma fina camada de graxa de vácuo na peça impressa em 3D, e colocando-a no deslizamento da tampa)(Figura 1D).
  4. Coloque a tampa de vidro e o reservatório superior, cubra o lado para baixo, sobre o reservatório inferior(Figura Suplementar 1B), sem a introdução de bolhas. A adesão entre as RIMS e o deslizamento da tampa fornecerá um selo entre as peças do reservatório superior e inferior(Figura 1E).
  5. Encha o reservatório superior com glicerol para uso com um objetivo de imersão de glicerol de 10x.
  6. Use um microscópio de fótons equipado com uma cabeça de varredura confocal multifoton para imagem dos corações limpos.
  7. Abaixe o estágio do microscópio de fóton único e coloque a placa de Petri contendo a amostra no centro do palco. Levante o estágio e baixe o objetivo de imersão de glicerol de 10x no glicerol no reservatório superior do aparelho amostral. Certifique-se de que a amostra está em foco olhando para a borda da amostra usando as oculares.
  8. Mude da visão da ocular para a visão da câmera no computador clicando no botão ao vivo.
    1. Defina os parâmetros X e Y localizando primeiro a parte mais larga da amostra de tecido, que deve estar na parte inferior da placa de Petri.
    2. Clique em ND Aquisição e multiponto personalizado. Crie vários pontos encontrando primeiro o meio da amostra de tecido usando o joystick para varrer da esquerda para a direita e de cima para baixo.
    3. Em seguida, com base no tamanho do tecido, determine o tamanho do revestimento necessário (tipicamente 6 x 5 para um coração de rato de 6 a 8 semanas). Faça isso executando imagens de teste capturando apenas parâmetros X e Y (desmarcar z sob a guia ND Acquisition) para verificar se todo o comprimento e largura do tecido foram capturados.
  9. Para definir os parâmetros z, abra a navegação XYZe clique nos ícones para cima e para baixo até encontrar a parte superior e inferior da amostra.
    1. Abra o painel de correção de intensidade Z e ajuste a fluorescência na parte superior, média e inferior do tecido para corrigir a densidade tecidual aumentando ou diminuindo a potência do laser em cada ponto z. Defina-os clicando na seta definida à direita do painel de correção de intensidade Z.
    2. Defina o tamanho da etapa Z no painel ND Acquisition para 5 μm.
  10. Depois que os parâmetros X, Y e Z do coração forem delineados e a correção de intensidade z for definida, use o microscópio vertical automatizado com um objetivo de imersão de 10x glicerol com um scanner ressonante e tubos de fosfato de arsifídeo de gálio (PMTs GaAsP) para imagem dos corações limpos. Certifique-se de que as guias XY e Z sejam verificadas sob aquisição de NDe pressione a correção do Run Z.
  11. Costurar, desmixar e denoizar as imagens resultantes abrindo a imagem de vários pontos no software de processamento e clicando no botão de ponto. Na imagem,clique em blind unmixing, 2 canal, e depois encontre. e Na imagem, clique em denoise.ai, em seguida, clique no canal fluorescente de escolha (ou seja, GFP).
    NOTA: Este processo resulta em uma imagem 3D de fibroblastos GFP positivos em todo o ventrículo esquerdo.
  12. Use software de análise secundária para identificar ainda mais padrões e tendências na dispersão de fibroblastos cardíacos. Use a função Spots executando o programa de assistente de pontos.

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Resultados

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Os fibroblastos cardíacos são essenciais para a função de base do coração, bem como para a resposta à lesão cardíaca. Tentativas anteriores de entender o arranjo e a morfologia dessas células foram conduzidas em grande parte em configurações 2D. No entanto, foi publicada uma técnica de limpeza de tecido cardíaco refinado(Figura 2) e 3D, que permite a visualização avançada e mais detalhada de fibroblastos cardíacos. Com esta técnica de imagem, os fibroblastos foram encontrados densamente emba...

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Discussão

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Este artigo apresenta um método refinado de limpeza tecidual que permite a visualização de fibroblastos cardíacos in vivo, tanto na linha de base quanto na lesão seguinte, para caracterizar e entender melhor os fibroblastos no coração do camundongo. Este protocolo aprimorado aborda limitações nos protocolos de limpeza de tecidos existentes que tentaram identificar tipos de células específicas no coração adulto ou neonatal12,13,14

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Divulgações

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Os autores não têm nenhuma divulgação relacionada ao conteúdo deste manuscrito.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores gostariam de reconhecer o CCHMC Confocal Imaging Core por sua assistência e orientação no desenvolvimento deste modelo, bem como Matt Batie da Clinical Engineering para o projeto de todas as peças impressas em 3D. Demetria Fischesser foi apoiada por uma bolsa de treinamento dos Institutos Nacionais de Saúde, (NHLBI, T32 HL125204) e Jeffery D. Molkentin foi apoiado pelo Howard Hughes Medical Institute.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
4-0 seda trançadaEthiconK871H
8-0 proleneEthicon8730H
40% Solução de AcrilamidaBio-Rad1610140
Angiotensina IISigmaA9525-50G
Pomada Lacrimal ArtificialCovetrus048272
DABCO (1,4-diazabiciclo[2.2.2]octana)Millipore SigmaD27802-25G
GLUture adesivo tecidual tópicoInstrumentos de precisão mundial503763
heparinaSigmaH0777
Imaris Start Software de análiseInstrumentsN/A
Bombas micro-osmóticasAlzetModelo 1002
Nikon Elements Analysis SoftwareNikonN/A
Nikon A1R HD microscópio verticalNikonN / A
Normal autoclavado chowLabdiet5010
Nycodenz, 5- (N-2, 3-dihidroxipropiletamido) -2, 4, 6-tri-iodo-N,
N'-bis (2, 3 dihidroxipropil) isoftalamida		CosmoBioAXS-1002424
ParaformaldeídoMicroscopia Eletrônica Ciências15710
Cloridrato de fenilefrinaSigmaP6126-10G
FotoiniciadorWako ChemicalsVA-044
Rosa26-nLacZ [FVB. Cg-Gt (ROSA) 26Sortm1 (CAG-lacZ, -EGFP) Glh / J]Jackson LaboratoriesJax Nº de estoque: 012429
Azida de sódioSigma AldrichS2002-5G
Solução de cloreto de sódioHospira, Inc.NDC 0409-4888-10
TamoxifenoSigma AldrichT5648
Tamoxifeno alimentarEnvigoTD.130860
Tween-20Thermo Fisher ScientificBP337-500
Quadrol, N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hidroxipropil)etilenodiamina, agente descoloranteMillipore Sigma122262-1L
X-Clarity câmara de limpeza eletroforéticaLogos BiosystemsC30001
Solução de limpeza eletroforética X-ClarityLogos BiosystemsC13001
Cesto de tecidos de eletroforese X-ClarityLogos BiosystemsC12001
Suporte de cesto de tecidos de eletroforese X-ClarityLogos BiosystemsC12002
Oxford

Referências

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