Summary
تصف هذه الورقة أساليب توليد العلاج الدوائي وتحليل النباتات المشتقة من المريض لتقييم استجابات أدوية الورم في نظام نموذج حي ومناسب للمريض قبل السريرية.
Abstract
إن فهم مقاومة الأدوية ووضع استراتيجيات جديدة لتوعية السرطانات شديدة المقاومة يعتمدان على توافر نماذج مناسبة قبل السريرية يمكنها التنبؤ بدقة باستجابات المرضى. أحد عيوب النماذج الموجودة قبل السريرية هو عدم القدرة على الحفاظ على البيئة الدقيقة للورم البشري (TME) بشكل سياقي وتمثيل التغايرية داخل الرحم بدقة ، مما يحد من الترجمة السريرية للبيانات. وعلى النقيض من ذلك، من خلال تمثيل ثقافة الشظايا الحية للأورام البشرية، تسمح منصة التشميل المشتقة من المريض (PDE) بفحص استجابات الأدوية في سياق ثلاثي الأبعاد (ثلاثي الأبعاد) يعكس السمات المرضية والمعمارية للأورام الأصلية قدر الإمكان. وقد وثقت التقارير السابقة مع PDEs قدرة المنصة على التمييز بين العلاج الكيميائي الحسي من الأورام الكيميائية ، وقد ثبت أن هذا الفصل هو تنبؤي باستجابات المرضى لنفس العلاج الكيميائي. وفي الوقت نفسه، تتيح أجهزة مكافحة الأمراض الوراثية الفرصة لاستجواب السمات الجزيئية والوراثية والهسولوجية للأورام التي تتنبأ بالاستجابات الدوائية، وبالتالي تحديد المؤشرات الحيوية لتقسيم المرضى إلى طبقات فضلا عن النهج التدخلية الجديدة لتوعية الأورام المقاومة. هذه الورقة تقارير منهجية PDE بالتفصيل، من جمع عينات المرضى من خلال لتحليل نقطة النهاية. وهو يقدم وصفا مفصلا لأساليب الاشتقاق والثقافة التفسيرية ، وتسليط الضوء على الظروف المخصصة لأورام معينة ، عند الاقتضاء. لتحليل نقطة النهاية ، هناك تركيز على تعدد المناعة والتصوير متعدد الأطياف للتنميط المكاني للمؤشرات الحيوية الرئيسية داخل كل من المناطق الورمية والسترومالية. ومن خلال الجمع بين هذه الأساليب، يمكن توليد بيانات كمية ونوعية للاستجابة للأدوية يمكن ربطها بمختلف البارامترات الباثولوجية العيادية، وبالتالي يمكن استخدامها لتحديد العلامات البيولوجية.
Introduction
ويتطلب تطوير عوامل فعالة وآمنة مضادة للانسان نماذج مناسبة قبل السريرية يمكن أن توفر أيضا نظرة ثاقبة لآليات العمل التي يمكن أن تسهل تحديد المؤشرات الحيوية التنبؤية والدوائية. بين وبين التجانس داخل التومور1،2،3،4،5 و TME6،7،8،9،10،11،12 معروفة للتأثير على استجابات الأدوية المضادة للسرطان ، والعديد من نماذج السرطان الموجودة قبل السريرية مثل خطوط الخلايا ، organoids ، ونماذج الماوس ليست قادرة على استيعاب هذه الاستجابات بشكل كامل حاسم ملامح. النموذج "المثالي" هو النموذج الذي يمكن أن يلخص التفاعلات المكانية المعقدة للخلايا الخبيثة غير الخبيثة داخل الأورام وكذلك يعكس الاختلافات الإقليمية داخل الأورام. تركز هذه المقالة على PDEs كمنصة ناشئة يمكنها تلبية العديد من هذه المتطلبات13.
يرجع أول مثال على استخدام PDEs البشرية ، والمعروف أيضا باسم زراعة الهستو ، إلى أواخر الثمانينيات عندما قام هوفمان وآخرون بتوليد شرائح من الأورام البشرية الطازجة واستزراعها في مصفوفة الكولاجين14،15. وشمل ذلك إنشاء نظام ثقافة ثلاثي الأبعاد يحافظ على بنية الأنسجة، ويضمن الحفاظ على المكونات السترومالية وتفاعلات الخلايا داخل TME. دون تفكيك الورم الأصلي، هوفمان وآخرون16 بشرت نهجا جديدا للبحوث التحويلية، ومنذ هذا الوقت، وقد الأمثل العديد من المجموعات أساليب مختلفة explant بهدف الحفاظ على سلامة الأنسجة وتوليد بيانات دقيقة استجابة المخدرات17،18،19،20،21،22،24 ، على الرغم من أن بعض الاختلافات بين البروتوكولات واضحة. بتلر وآخرون المستزرعة explants في الإسفنج الجيلاتين للمساعدة في نشر المواد الغذائية والأدوية من خلال عينة20،21،25، في حين أن Majumder وآخرون خلق نظام بيئي الورم عن طريق زراعة explants على رأس مصفوفة تتكون من الورم والبروتينات سترومال في وجود مصل أوتولوجوس المستمدة من نفس المريض22، 23.
في الآونة الأخيرة ، وضعت مجموعتنا بروتوكولا يتم بموجبه إنشاء النباتات الخارجية عن طريق تجزئة الأورام إلى قطع بحجم 2 - 3 مم3- يتم وضعها بعد ذلك دون مكونات إضافية على أغشية نفاذية في واجهة الهواء السائل لنظام الثقافة24. وقد أظهرت هذه الدراسات العديدة مجتمعة أن PDEs تسمح بثقافة الأجزاء الحية السليمة من الأورام البشرية التي تحتفظ بالعمارة المكانية وعدم التجانس الإقليمي للأورام الأصلية. في التجارب الأصلية، كانت النباتات أو النباتات النسيجية تخضع عادة للتجانس بعد العلاج من المخدرات، وبعد ذلك تم تطبيق مختلف المقايسات الجدوى على عينات متجانسة مثل الهيدروجينيلترات المخدرات استجابة المقايسة20،21، و MTT (3-(6) - 2،5-ديفينيلتيترازوليوم بروميد) المقايسة ، وdhydrogenase اللاكتات المقايسة ، أو المقايسة القائمة على الريزازورين26،27،28 . التقدم الأخير في تقنيات تحليل نقطة النهاية ، وخاصة علم الأمراض الرقمي ، قد وسع الآن ذخيرة اختبارات نقطة النهاية والمقاسات التي يمكن إجراؤها على explants29،30. لتطبيق هذه التقنيات الجديدة، بدلا من التجانس، يتم إصلاح النباتات في الفورماليين، جزءا لا يتجزأ من البارافين (FFPE) ومن ثم تحليلها باستخدام تقنيات الاحتواء المناعي، مما يسمح التنميط المكاني. وقد تم توثيق أمثلة على هذا النهج لسرطان الرئة الخلايا غير الصغيرة (NSCLC)، وسرطان الثدي، سرطان القولون والمستقيم، وورم الظهارة المتوسطة النباتات التي بموجبها تلطيخ المناعية الكيميائية لعلامة الانتشار، Ki67، وعلامة أبوبتوتيك، مشقوق بولي ADP الريبوز بوليمراز (cPARP)، واستخدمت لرصد التغيرات في انتشار الخلايا وموت الخلية24،31،32،33،34.
متعددة immunofluorescence قابلة بشكل خاص للتنميط المكاني للاستجابات المخدرات في explants عند نقطة النهاية35. على سبيل المثال ، من الممكن قياس إعادة توطين وتوزيع مكاني لفئات محددة من الخلايا المناعية ، مثل الضامة أو الخلايا التائية ، داخل TME عند العلاج الدوائي13و36و37و38، والتحقيق فيما إذا كان العامل العلاجي يمكن أن يفضل الانتقال من "الورم البارد" إلى "الورم الساخن"39 . في السنوات الأخيرة ، ركزت هذه المجموعة على اشتقاق PDEs من أنواع الأورام المختلفة (NSCLC ، سرطان الكلى ، سرطان الثدي ، سرطان القولون والمستقيم ، سرطان الميلانوما) واختبار مجموعة من عوامل مضادة للسرطان بما في ذلك العلاج الكيميائي ، ومثبطات الجزيئات الصغيرة ، ومثبطات نقاط التفتيش المناعية (ICIs). وقد تم تحسين أساليب تحليل نقطة النهاية لتشمل تعدد المناعة للسماح بالتنميط المكاني للمؤشرات الحيوية من أجل الجدوى وكذلك المؤشرات الحيوية لمختلف مكونات TME.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. جمع الأنسجة
- بعد الجراحة، نقل عينات الورم البشري الطازجة إلى أنبوب يحتوي على 25 مل من متوسط الثقافة الطازجة (متوسط النسر المعدل في دولبيكو يكمله 4.5 غرام/ لتر من الجلوكوز وL-الجلوتامين + 1٪ (v/v) مصل عجل الجنين + 1٪ البنسلين-ستريبتومايسين) وتخزينها على الجليد. معالجة explant داخل 2 ساعة من الجراحة في غطاء محرك السيارة من الدرجة الثانية العقيمة.
2. إعدادإكسبلانت E
- تنظيف جميع المعدات الجراحية (شفرات الكسب غير المشروع / سطح شمع الأسنان / ملاقط) مع 70٪ روح ميثيلية الصناعية (IMS) الحل.
- ملء طبق ثقافة 10 سم (انظر جدول المواد)مع ~ 25 مل من المتوسطة الطازجة، ووضعه على رأس سرير من الجليد.
- باستخدام ملاقط، نقل العينة على سطح الشمع الأسنان (انظر جدول المواد)،وشريحة الأنسجة إلى شظايا من حوالي 2-3 ملم3 باستخدام اثنين من ريش الكسب غير المشروع الجلد.
ملاحظة: للحصول على أفضل أداء، ابدأ في تقطيع الأنسجة للحصول على شريط فردي من 2-3 مم من السمك، ثم قطع الشريط على طول للحصول على explants النهائي. كرر العملية حتى يتم تقطيع العينة بأكملها. - نقل explants على الفور في وسط ثقافة الجليد الباردة في طبق 10 سم. تأخذ نسبة من explants (6-9 قطعة)، ووضعها في أنبوب 1 مل تحتوي على 10٪ من محلول الفورمالين غير المخزنة، وترك في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 24 ساعة.
ملاحظة: هذه الأجزاء سوف تمثل explants عنصر التحكم الشرط "uncultured". - ملء العدد المطلوب من الآبار من لوحات 6-جيدا مع 1.5 مل من المتوسطة الطازجة لكل بئر، ووضع قرص إدراج الثقافة organotypic (انظر جدول المواد) في كل بئر بحيث يطفو على رأس المتوسط، وتجنب بعناية فقاعات الهواء في واجهة وسائل الإعلام إدراج.
- حدد explants عشوائيا، ووضعها واحدة في وقت واحد على رأس قرص إدراج. لتكون متسقة مع شرط "غير مثقف"، استخدم 6-9 explants لكل بئر. ضع لوحة متعددة بويل في حاضنةCO2 في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2،والسماح لل explants لاسترداد لمدة 16 ساعة.
ملاحظة: لتجنب سحق الأنسجة، ينصح بشدة بالتعامل اللطيف مع الملاقط.
3. العلاج من المخدرات
- بعد 16 ساعة، واتخاذ لوحات جديدة 6-جيدا، إضافة 1.5 مل من المتوسطة الطازجة إلى كل بئر، إضافة الأدوية ذات الصلة في التركيزات المطلوبة، وتشمل بئر للسيطرة على السيارة. باستخدام الملاقط، نقل كل إدراج تحتوي على explants إلى لوحات 6-الآبار المعدة حديثا التي تحتوي على المخدرات. ضع اللوحات فيحاضنة ثاني أكسيد الكربون عند 37 درجة مئوية و5٪ثاني أكسيد الكربون لمدة 24-48 ساعة.
- نقل explants غير مثقف ثابتة سابقا في الفورمالين في كاسيت الأنسجة (انظر القسم 4 أدناه)، وتخزينها في IMS 70٪ حتى نهاية التجربة.
4. المعالجة النسيجية
- تثبيت الأنسجة
- بعد العلاج من المخدرات، نقل إدراج أقراص تحتوي على explants في لوحات جديدة 6-جيدا تحتوي على 10٪ الفورمالين، وإضافة بضع قطرات من 10٪ الفورمالين على الجزء العلوي من explants لضمان تغطية كاملة مع المثبتة.
تحذير: الفورمولين خطر. تجنب أي ملامسة للبشرة، والتعامل معها داخل الغذاء الدخان لمنع استنشاق. - السماح لل explants أن تبقى بين عشية وضحاها (20-24 ساعة) في 10٪ الفورماتين.
- في اليوم التالي، نقع العدد ذي الصلة من الإسفنج الأنسجة الصغيرة في IMS 70٪، ووضعها داخل أشرطة الأنسجة. نقل بلطف جميع explants من حالة علاج المخدرات معينة على اسفنجة واحدة (الحفاظ على اتجاه explants بحيث يتم وضع الجانبين من explants في اتصال مع أقراص إدراج، وبالتالي المناطق المعالجة بالمخدرات، في اتصال مع الاسفنج). ضع إسفنجة أخرى مسبقة السفنج فوق النباتات ، وآمنة داخل كاسيت الأنسجة (كاسيت واحد لكل بئر / علاج).
- غمر أشرطة في IMS 70٪، وترك في RT لمدة 24 ساعة.
- بعد العلاج من المخدرات، نقل إدراج أقراص تحتوي على explants في لوحات جديدة 6-جيدا تحتوي على 10٪ الفورمالين، وإضافة بضع قطرات من 10٪ الفورمالين على الجزء العلوي من explants لضمان تغطية كاملة مع المثبتة.
- تضمين البارافين وتقسم الأنسجة
- في اليوم التالي، نقل أشرطة النسيج التي تحتوي على explants في سلة عينة من معالج الأنسجة (انظر جدول المواد)،وتأمين الغطاء. ضع السلة في المعوجة وإغلاق بلطف. حدد البرنامج المطلوب، ثم ابدأ المعالج. استنزاف المعوجة، وفتحه لإزالة السلة، ونقل السلة إلى حمام الشمع مركز تضمين.
- بعد تضمين، نقل أغطية كاسيت معدنية في السلة، والعودة إلى المعوجة من معالج الأنسجة لبرنامج التنظيف. امسح المستشعر بمنديل جاف، وأزل أي شمع زائد من غطاء المعوجة، وامضي قدما في برنامج التنظيف.
- وضع كتلة البارافين في microtome الدوارة، وقطع بضعة أقسام في 4 ميكرومتر، والعودة كتلة إلى الجليد. قم بتغيير موضع الكتلة، وقطع المزيد من المقاطع 4 ميكرومتر. نقل المقاطع مع فرشاة الطلاء الصغيرة والملقط على حمام مائي لإزالة التجاعيد والفقاعات.
- ضع المقاطع مركزيا على شرائح المجهر، واستنزف الشرائح لبضع دقائق، ووضعها في رف شرائح لتجف بين عشية وضحاها في حاضنة عند 37 درجة مئوية. عندما تكون الأقسام جافة، قم بتخزينها في RT في مجلد شرائح أو مربع للحماية من الغبار.
5. هيماتوكسيلين و إيوزين (H &؛ E) تلطيخ
- ملء البقع (انظر جدول المواد)مع الكواشف، وتعيين البرنامج المطلوب لتلطيخ H & E: وقت حضانة الهيماتوكسيلين: 5 دقائق؛ وقت حضانة اليوزين: 3 دقائق.
- إرفاق حامل الشريحة إلى الناقل، وضعه في الحاوية الأولى مع xylene، وبدء البرنامج. قم بإزالة حامل الشرائح من الحامل، و خذ الحاوية مع حامل الشرائح إلى منطقة التركيب.
- جبل الشرائح مع ثنائي بوتيل الفثالات xylene (DPX) تحت غطاء محرك السيارة استخراج. ضع DPX على كل غطاء، واخفض الشريحة على الغطاء مع القسم لأسفل، مما يسمح ل DPX بالانتشار.
ملاحظة: DPX خطرة. تجنب أي اتصال مع الجلد واستخدامها في غطاء الدخان المعين.
6. التثبيط المناعي
ملاحظة: يجب تنفيذ الخطوات التالية في RT ما لم يذكر خلاف ذلك.
- إزالة الترطيب والإماهة
- ضع الشرائح في حامل الشرائح، وحرارة عند 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق قبل إزالة التنقية من المقاطع في xylene لمدة 3 دقائق (2x). تقليل مقدار الحل ترحيل.
ملاحظة: الزيلين قابل للاشتعال وخطر ومهيج. مقبض داخل غطاء الدخان أثناء استخدام قفازات مزدوجة الطبقات. تجنب ملامسة الجلد والعين. التخلص من النفايات داخل حاوية مغلقة. - إعادة ترطيب الشرائح في تدرج الكحول على النحو التالي: 99٪ IMS لمدة دقيقة واحدة (2x) و 95٪ IMS لمدة دقيقة واحدة. تقليل مقدار الحل ترحيل.
ملاحظة: نظام الرصد الدولي شديد الاشتعال، ومتقلب، ومهيج. التعامل مع داخل غطاء الدخان، وتجنب الجلد والعين الاتصال. - اغمر حامل الشريحة بالكامل في ماء فائق النحافة (UP) لمدة 5 دقائق.
- ضع الشرائح في حامل الشرائح، وحرارة عند 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق قبل إزالة التنقية من المقاطع في xylene لمدة 3 دقائق (2x). تقليل مقدار الحل ترحيل.
- استرجاع المستضد
- إعداد مستضد استرجاع العازلة وفقا للمبادئ التوجيهية للشركة المصنعة للأجسام المضادة معينة المستخدمة.
ملاحظة: Citrate العازلة 0.2 M، درجة الحموضة6، أو تريس (هيدروكسي ميثيل)أمينوميثان (تريس) - إيثيلينديامين حمض رباعي الأسيتيك (EDTA) 0.1 M، درجة الحموضة 9، هي المخازن المؤقتة الشائعة المستخدمة للظروف الحمضية أو القلوية، على التوالي. حمض الستريك أحادي الهيدروهيدرات وتريس هي عوامل مهيجة. إعداد جميع حلول المخزون في غطاء الدخان. تجنب ملامسة الجلد والعينين. - غمر الحامل الذي يحتوي على الشرائح في مخزن استرجاع مستضد، وميكروويف (انظر جدول المواد)بكامل طاقته (800 واط) لمدة 20 دقيقة.
ملاحظة: الاحتفاظ الشرائح بالكامل مغمورة في المخزن المؤقت أثناء العملية بأكملها. لتجنب التقليل الزائد من حجم المخزن المؤقت، ضع غطاء فوق الحاوية المستخدمة.
- إعداد مستضد استرجاع العازلة وفقا للمبادئ التوجيهية للشركة المصنعة للأجسام المضادة معينة المستخدمة.
- تعدد المناعة (mIF)
ملاحظة: تستغرق هذه العملية 1-2 أيام.- املأ حاوية نظيفة بماء UP سعة 250 مل، واغمر حامل الشريحة بالكامل لمدة دقيقتين (2x). تابع تجميع كل شريحة في لوحة شريحة (راجع جدول المواد).
- لتجميع شريحة على لوحة تغطية، قم بإعداد حوض زجاجي بالماء. غمر كل من لوحة الغطاء والانزلاق في الماء، ووضع الجانب قسم الأنسجة التي تواجه لوحة الغلاف.
- ضع الحافة السفلية للشريحة أعلى الخطوط في الجزء السفلي من لوحة الغلاف، وأخيرا قم بمحاذاة الشريحة إلى لوحة الغلاف، مما يسمح للماء بسد الفجوة بينهما دون وجود هواء محصور. أمسك لوحة الغلاف وانزلق معا، وضعها في رف لوحة تغطية.
- املأ لوحة الغلاف بمحلول ملحي عازل بالفوسفات (PBS)، وانتظر حتى يغسل العازل الشرائح، ويتدفق عن طريق الجاذبية (2x). Pipet 110 ميكرولتر من العازلة حجب (انظر جدول المواد)على كل لوحة غلاف واحتضان لمدة 10 دقيقة.
- إعداد تخفيف الأجسام المضادة الأولية المطلوبة في برنامج تلفزيوني أو حظر العازلة وفقا لتوصيات الشركة المصنعة. احتضان الشرائح مع الأجسام المضادة الأولية (110 ميكرولتر لكل شريحة) لمدة 30 دقيقة. غسل الشرائح مع 5 مل من برنامج تلفزيوني (2x) ، كما هو موضح في 6.3.2.
- احتضان الشرائح مع 110 ميكرولتر من الفجل بيروكسيديز البوليمر لمدة 30 دقيقة. غسل الشرائح مع 5 مل من برنامج تلفزيوني (2x) ، كما هو موضح في 6.3.2.
- إعداد تخفيف الفلوروفوري في التضخيم 1:100 (v/v)، واحتضان الشرائح مع الفلوروفور (110 ميكرولتر لكل شريحة) لمدة 10 دقائق. غسل الشرائح مع 5 مل من برنامج تلفزيوني (2x) ، كما هو موضح في 6.3.2.
ملاحظة: لاستخدام الفلوروفور 780، اتبع إرشادات الشركة المصنعة. قد يتم إيقاف التجربة مؤقتا هنا إذا تم احتضان الشرائح في الغسيل النهائي لبرنامج PBS وتخزينها عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها. - فك الشرائح من لوحات الغلاف، والعودة إلى خطوة استرجاع مستضد لبدء تلطيخ مع الأجسام المضادة المختلفة. كرر تلطيخ العدد المطلوب من الأجسام المضادة ليتم اختبارها.
- بعد الخطوة 6.3.5 لآخر الفلوروفور قيد الاستخدام، احتفظ بالشرائح على لوحات الغلاف، واستعد محلول 6 ميكرومتر من 4'-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) مع الماء UP، وتعطشين الشرائح لمدة 5 دقائق (110 ميكرولتر لكل شريحة). اغسل الشرائح بالماء UP (2x)، وأزل الماء الزائد عن طريق تجفيف حواف الشرائح. تجميع الأغطية على الشرائح باستخدام تركيب المتوسطة، وتخزينها في RT في الظلام.
- املأ حاوية نظيفة بماء UP سعة 250 مل، واغمر حامل الشريحة بالكامل لمدة دقيقتين (2x). تابع تجميع كل شريحة في لوحة شريحة (راجع جدول المواد).
7. المسح الضوئي
ملاحظة: تم إجراء مسح الشرائح باستخدام نظام تصوير آلي متعدد الأطياف (انظر جدول المواد).
- تجميع الشرائح في الناقل، وتحميلها في الماسح الضوئي في الترتيب المطلوب.
ملاحظة: يوصى بتضمين شريحة تحكم لا يستخدم فيها أي فلوروفور أو DAPI أثناء تلطيخ المناعة الكيميائية. سيتم استخدام هذه الشريحة كتحكم في الفلورسينس الجوهري (الفلورة التلقائية (AF)) للأنسجة. - بعد تشغيل برنامج الماسح الضوئي للشرائح، حدد تحرير البروتوكول من الصفحة الرئيسية. إنشاء بروتوكول جديد يتناول الاسم، ووضع التصوير، ونوع المسح متعدد الأطياف التي يتعين القيام بها (4-7 قنوات)، ودراسة (الدليل).
ملاحظة: لتعديل الإعدادات الافتراضية للنطاقات التي تم تحليلها، حدد/قم بإلغاء تحديد عوامل التصفية المطلوبة باستخدام الدالة تحديد نطاقات المسح الضوئي - تابع مع التعرض الضوئي وتحميل الناقل، وأخيرا حدد الناقل لإعداد البروتوكول. حدد نظرة عامة للكشف عن النسيج على الشريحة. اختر شريحة معروضة على الحامل،وحدد منطقة معينة من النسيج مع المؤشر الأحمر لعرضها مباشرة على النافذة اليسرى من الشاشة.
- حدد عامل تصفية DAPI، وانقر فوق التركيز البؤري التلقائي أو قم بضبط شريط تمرير Stage Height يدويا لتركيز مجال الاهتمام. انقر على العرض التلقائي للسماح للنظام للعثور على أفضل التعرض لهذا المرشح / النطاق.
ملاحظة: يتم تعيين وقت التعرض لكل عامل تصفية في 12 مللي ثانية. بعد تعريض النظام تلقائيا، قم بتحسين وقت التعريض الضوئي إلى تقدير أفضل. من الممكن أيضا تجاوز قيمة العرض التلقائي بكتابة قيمة يدويا في الخلية المميزة. - كرر الخطوات أعلاه لكافة عوامل التصفية في البروتوكول. إذا لزم الأمر، قم بتغيير المواقع و/أو الشرائح للعثور على أفضل الإشارات لإعداد التعرض.
ملاحظة: إذا تم تمييز الأنسجة باللون الأحمر في المنظر المباشر، فإن إشارة الفلورسنت للمرشح الذي تم تحليله مشبعة، ويجب تكرار التعرض التلقائي. - بمجرد أن يتم إنشاء إعدادات التعريض الضوئي، انقر على الزر "الخلف"، واحفظ البروتوكول. من الصفحة الرئيسية للبرنامج (راجع جدول المواد)،حدد مسح الشرائح.
- قم بتكديس كافة شركات الاتصالات ليتم مسحها ضوئيا في فندق Slide Carrier، وأحاط علما بترتيب الشرائح لتعيين معرفها في النظام.
ملاحظة: على شاشة البرنامج، سيتم ربط كل ناقل بفتحة تحتوي على 4 شرائح. - لتكوين شرائح متعددة بنفس المعلمات، انقر فوق تكوين المهام، وحدد فتحة واحدة أو أكثر مع خيار Uالذي يخان نفس القواعد لنفس الشرائح. بمجرد فتح تحرير الشرائح، قم بتكوين: المهام والدراسة والبروتوكول،وانقر فوق موافق.
- قم بتسمية كل شريحة بالنقر فوق رمز الفتحة، واكتب اسما في الخلية معرف الشريحة. انقر على المسح الضوئي لبدء المسح الضوئي.
ملاحظة: بمجرد أن يتحول رمز الفتحة إلى اللون الأزرق ويتم وضع علامة على الشرائح بسهم أزرق، يكون لدى الناقل كافة القواعد ويكون جاهزا للمسح الضوئي. من الممكن حفظ معرفات الشرائح والدراسات والبروتوكولات والمهام بالنقر فوق الزر حفظ الإعداد.
8. تحليل
ملاحظة: يوضح البروتوكول أدناه طريقة تحليل النمط الظاهري.
- إعداد الصورة
- لإعداد الصور للتحليل، افتح برنامج المشاهد (راجع جدول المواد)،وحدد تحميل الشرائح. حدد المسح المطلوب لمشروع التدريب على الجانب الأيمن من الشاشة.
- لكل مسح ضوئي، انقر على ختم، واختر Project في المربع حدد ل: حدد طابعا بحجم 1 × 1 في حقل الصورة لاستخدامه لاحقا كنموذج لتحليل التدريب. لاحظ أنه سيتم وضع علامة على هذا الطابع كمربع أحمر.
ملاحظة: عدد التعليقات التوضيحية الطابع للمشروع إجبارية. فمن المستحسن لتوليد واحد لمسح مضان الجوهرية وعدد قليل من أكثر التي تمثل عموما توزيع إشارة داخل الأنسجة. - وأخيرا، افتح جميع عمليات المسح الضوئي للتجربة. لكل واحد، انقر على ختم،وهذه المرة، اختر الخيار دفعة في المربع حدد ل: وضع ختم حظر كل explant.
ملاحظة: هذه المرة، سيتم وضع علامة الطوابع كمربعات خضراء وسوف تكون مطلوبة بمجرد بدء تحليل الدفعة. اختر الحجم المناسب للطوابع (1 × 1 ، 2 × 2 ، 3 × 3) وتجنب تداخل الطوابع ، مما قد يولد بيانات مكررة في الملف المصدر.
- تحليل التدريب
- قم بتشغيل البرنامج للتحليل (راجع جدول المواد)،وإنشاء مشروع جديد: حدد ملف | | جديدة مشروع.
- اكتب اسما في المربع اسم المشروع، ثم قم بتكوين نوع المشروع.
ملاحظة: أجريت التجارب باستخدام المواصفات التالية: تجزئة الأنسجة القابلة للتدريب؛ تجزئة الخلايا التكيفية؛ فينوتيبينج. - تحميل عمليات المسح التي تحتوي على الطوابع للتدريب: ملف | فتح | صورة. في طريقة عرض وضع واحد، انتقل من خلال الصور وحدد عمليات المسح الضوئي مع مضان جوهري.
- انقر على زر Autofluorescence (AF) ، ومع منتقي Autofluorescence، ارسم على جزء غير ملطخ من الأنسجة. انقر على إعداد الصور للسماح للبرنامج بطرح كثافة الفلورسينس الجوهري من جميع الصور التي تم تحميلها للتدريب.
- انقر على زر تحرير علامات وألوان، وأدخل أسماء العلامات في المربع المقترن بالفلوروفور الخاص بهم. انقر على خطوة أنسجة الجزء أعلى الشاشة لفتح نافذة التدريب على تقسيم الأنسجة.
- في نافذة فئات الأنسجة، اكتب اسم فئات الأنسجة لتقسيم الصور إلى (على سبيل المثال، ورم، ستروما، خلفية، نخر).
- في إطار التدريب على تقسيم الأنسجة، انقر على زر رسم ورسم المناطق حول مجموعات من الخلايا لتحديد فئة الأنسجة ذات الاهتمام. على سبيل المثال، لتحديد منطقة الورم، ارسم منطقة حول مجموعة من الخلايا السرطانية. التبديل إلى الفئة التالية وتكرار عملية الرسم.
ملاحظة: يوصى برسم المناطق في معظم الصور التي تم تحميلها للتدريب. من الممكن أيضا تحسين التدريب عن طريق تحرير مقياس النمط ودقة التقسيم التي يتم وصف تفاصيلها بشكل أفضل في دليل المستخدم. - بعد تحديد مناطق التدريب ، تابع تدريب مجزئ الأنسجة.
ملاحظة: أثناء عملية التدريب، يعرض البرنامج النسبة المئوية لدقة تجزئة الأنسجة. للحصول على أفضل النتائج، يوصى بأن يكون تقسيم الأنسجة دقيقا بنسبة 90٪ على الأقل. بمجرد استقرار القطاع، انقر على الزر "تم". - لرؤية قناع فئة الأنسجة على جميع الصور، انقر على زر "تقسيم الكل".
- بعد التحقق من جودة تجزئة الأنسجة، قم بإعادة رسم مناطق التدريب حول المناطق التي تم تصنيفها بشكل غير صحيح، وإعادة تدريب مجزئ الأنسجة حتى تنجح العملية.
- انقر على خطوة تقسيم الخلية في شريط الخطوة في أعلى النافذة للمتابعة في التحليل.
- اختيار المقصورات الخلوية إلى الجزء: نواة، السيتوبلازم،و / أو الغشاء.
ملاحظة: كما يمكن تقسيم الخلايا التكيفية فقط الكشف عن الخلايا مع إشارة نووية، لا إلغاء تحديد Nuclei. على الرغم من أنه من الممكن أيضا تقسيم السيتوبلازم و / أو الغشاء ، فمن المستحسن اختيار العنصر النووي الأقوى والأكثر وفرة أولا (على سبيل المثال ، DAPI). - تكوين المكون النووي باستخدام شريط التمرير "كثافة نموذجية" لضبط العتبة المستخدمة للكشف عن بكسل النووية. لاحظ نافذة المعاينة التي تفتح وتوفر ملاحظات مباشرة عند ضبط العتبة.
ملاحظة: هذه العتبة هي التكيف ويتم قياس نسبة إلى الخلفية المحيطة بها. زيادة هذه القيمة إذا تم الكشف عن خلفية أكثر من اللازم باعتبارها نووية. خفض هذه القيمة إذا كان يتم تفويت نواة خافتة. استخدم الزر إظهار/إخفاء المناطق لوميض أقنعة التقسيم وإيقاف تشغيله، وتحقق مما إذا كان يتم الكشف عن وحدات البكسل الصحيحة كوحدات بيكسل نووية. - لتقسيم مجموعات من وحدات البكسل النووية، استخدم لوحة تقسيم المكونات النووية. اختر الزر الذي يصف جودة تلطيخ النوى بشكل أفضل. ثم استخدم شريط التمرير لضبط حساسية التقسيم،مع الأخذ في الاعتبار أن القيم المنخفضة ستؤدي إلى المزيد من التقسيم.
- انقر على زر "قطعة الكل" لتقسيم جميع الصور. إذا لم تكن النتيجة دقيقة، قم بتعديل الإعدادات وإعادة تدريب البرنامج حتى يتم تحقيق تجزئة مرضية.
- انتقل إلى الخطوة الأخيرة من التحليل: Phenotyping. في لوحة الأنماط الظاهرية، أضف قائمة الأنماط الظاهرية التي سيتم اكتشافها، واكتب الاسم في مربع النص المطابق. انقر على زر تحرير الأنماط الظاهرية، وحدد خلية معينة لإحضار قائمة منسدلة، واختر النمط الظاهري المطابق.
ملاحظة: خمس خلايا على الأقل لكل النمط الظاهري ضرورية لتدريب المصنف. إيقاف التصور من النوى يسمح تصور أفضل للنمط الظاهري الخلية التي تحتاج إلى تعيين. - بمجرد الانتهاء من اختيار التدريب، انقر على زر مصنف القطار.
ملاحظة: سيقوم البرنامج بتصنيف كل خلية في الصورة، وكلما حدثت أخطاء في التصنيف، فمن الممكن تحرير النمط الظاهري للخلايا وتكرار تدريب المصنف. حفظ المشروع قبل المتابعة لتحليل الدفعة، وانقر على تصدير في شريط الأدوات في الجزء العلوي من الشاشة. - حدد علامة التبويب تحليل حمام في القائمة اليمنى ثم قم بتحميل المشروع في المربع خوارزمية الدفعة أو المشروع.
- انقر على خيارات التصدير لإنشاء أدلة منفصلة لكل صورة، ومع الزر استعراض، انتقل للعثور على الموقع لتصدير البيانات. انقر على جميع الخيارات من الصور والجداول للتصدير.
- على الجانب الأيمن من الشاشة، انقر على إضافة شرائح وتحميل جميع الصور التي تحتوي على طوابع للدفعات المعدة مسبقا (الخطوة 7.3). انقر على زر تشغيل لبدء تحليل الدفعة ومعالجة طابع واحد في كل مرة، وتصدير البيانات المقابلة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يسمح التصوير متعدد الأطياف للأقسام النسيجية الملطخة ب mIF بتحديد مجموعات الخلايا الفردية وتحديد مكونات الورم والسترومال في TME(الشكل 2). التصوير متعدد الأطياف مفيد بشكل خاص لتحليل الأنسجة ذات الفلورة الذاتية العالية ، مثل الأنسجة ذات محتوى الكولاجين العالي ، لأنه يسمح بفك إشارة الفلورة الذاتية من الإشارات الأخرى واستبعادها من التحليل اللاحق. في وقت لاحق في الأنسجة silico وتجزئة الخلايا يسمح للقياس الكمي للاستجابة المخدرات مع العديد من النواتج بما في ذلك، على سبيل المثال لا الحصر، أرقام الخلايا الخام (على سبيل المثال، الإيجابية في المئة)، وكثافة الإشارة، وحجم الخلية، ومنطقة الأنسجة، والموقع المكاني للخلايا الفردية.
ولذلك فإن تجزئة الأنسجة والخلايا مفيدة للغاية للتحليل الكمي لنتائج العلاج الدوائي وتحديد الاستجابات الخاصة بالورم والسترومال. على سبيل المثال، تلطيخ لKi67 وcPARP جنبا إلى جنب مع علامة الورم يسمح لكمية الانتشار ومستويات موت الخلية، على التوالي، في explants (الشكل 3). في المثال المعطى، يتم كمية مستويات Ki67 و cPARP للمناطق سترومال والورم في PDEs استجابة لبروتين موت الخلايا المضادة المبرمجة 1 (PD-1) مثبط نقطة التفتيش المناعية (ICI)، نيفولوماب. بالإضافة إلى ذلك ، فإن القدرة على استخراج المعلومات المكانية من المقاطع الملطخة تسمح بحساب مسافات الخلايا وكذلك المسافات إلى حدود الورم والهياكل الأخرى. لذلك ، يمكن تحليل التغيرات في التوزيع الخلوي بعد العلاج من المخدرات كميا(الشكل 4). المثال هو مبين يمثل العلاج PDE مع نيفولوماب.
الشكل 1: سير العمل لتوليد وتحليل PDEs. (أ) يتم معالجة عينات الورم البشري الطازجة وترتيبها على ثقافة نفاذية إدراج القرص العائمة في وسط الثقافة. (ب)بعد العلاج من المخدرات، يتم حصاد النباتات، وتخضع لFFPE، ومن ثم تقسيمها للتحليل النسيجي، على سبيل المثال، لتلطيخ H &؛ E. (ج)يتم إجراء تلطيخ ومسح mIF لأقسام الأنسجة لتوليد صور متعددة الأطياف يمكن من خلالها تفكيك الإشارات الفردية وتحليلها بشكل منفصل. (د)تحليل الصور المركبة يسمح فصل مناطق الورم والستروم وتقييم النمط الظاهري لأنواع مختلفة من الخلايا. الاختصارات: PDE = explant المشتقة من المريض; FFPE = ثابتة في الفورماتين، جزءا لا يتجزأ من البارافين؛ H & E = هيماتوكسيلين و إيوزين; mIF = تعدد المناعة؛ HRP = الفجل البيروكسيداز; H2O 2 =بيروكسيد الهيدروجين; Ab = الأجسام المضادة; TSA = تضخيم إشارة tyramide. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: مثال على قسم الأنسجة الملطخة ب mIF. تم تلطيخ الأنسجة explant NSCLC لعلامات صلاحية الخلية، وهي cPARP (الأحمر) وKi67 (الأخضر) فضلا عن علامة عموم cytokeratin (الأصفر) وDAPI (الأزرق) للاحتفال النوى. تم إجراء التصوير متعدد الأطياف لإزالة الفلورسنت وإزالة الفلورسنت. تظهر الصور تكبير 20x للحقل المحدد. أشرطة المقياس = 50 ميكرومتر. المختصرات: mIF = تعدد المناعة؛ NSCLC = سرطان الرئة الخلايا غير الصغيرة; cPARP = مشقوق بولي-ADP الريبوز بوليمراز; CK = السيتوكيراتين; DAPI = 4'-6-دياميدينو-2-فينيليندول; AF = الفلورة التلقائية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3:تحديد كمي لوفيات الخلايا وانتشارها في PDEs. مثال على مربع وشعيرات المؤامرات التي تظهر التعريفي موت الخلايا المبرمج في NSCLC PDEs بعد 24 ساعة من العلاج مع 5 ميكروغرام / مل nivolumab بالمقارنة مع السيطرة المتوسطة. يتم عرض النسبة المئوية لانتشار (Ki67) والنسبة المئوية لأحداث موت الخلايا المبرمج (cPARP) في منطقة الورم والستروما على التوالي. تمثل كل نقطة explant واحد، يمثل الخط المركزي من المربع وسيط التوزيع، والجانبين من مربع (أسفل وأعلى) تمثل الربعين الأول والثالث، على التوالي. تمثل أشرطة الخطأ النطاق بين الأعمدة (أكثر من 1.5 x IQR). الاختصارات: PDE = explant المشتقة من المريض; NSCLC = سرطان الرئة الخلايا غير الصغيرة; cPARP = مشقوق بولي-ADP الريبوز بوليمراز; IQR = مجموعة بين الكوارتيل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4:التنظيم المكاني بعد العلاج من المخدرات. (أ) صور تمثيلية تظهر تلطيخ mIF لعلامات الخلايا التائية CD4، FOXP3، CD8 (اللوحة اليسرى) - أجريت على explant الميلانوما، وتحليل النمط الظاهري المقابل (يمين) تحديد مسافات بين الخلايا بين خلايا CD8+ وخلايا Treg (CD4+/FOXP3+). أشرطة المقياس = 200 ميكرومتر (B) رسم تخطيطي يظهر زيادة المسافة بين الخلايا التائية السامة للخلايا (CD8+) وخلايا Treg (CD4 +/FOXP3+) بعد علاج PDEs الميلانوما مع 5 ميكروغرام / مل من نيفولوماب ، مما يؤكد الآثار على الهدف من دواء IO. يتم التعبير عن وحدة الكثافة على أنها عدد الخلايا مقسوما على مجموع جميع الخلايا لكل عرض نطاق ترددي. المختصرات: mIF = تعدد المناعة؛ CD = مجموعة من التمايز؛ FOXP3 = مربع رأس الشوكة P3; PDE = explant المشتقة من المريض; NSCLC = سرطان الرئة الخلايا غير الصغيرة; IO = علم المناعة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تصف هذه الورقة طرق توليد الأدوية وعلاجها وتحليلها وتسلط الضوء على مزايا المنصة كنظام نموذجي قبل السريري. ex vivo زراعة ورم استئصالها حديثا، والتي لا تنطوي على تفكيكها، ويسمح للاحتفاظ بنية الورم13،24، وبالتالي، والتفاعلات المكانية للمكونات الخلوية في TME وكذلك التغايرية داخل الطبيعة. توضح هذه الطريقة كيف أنه باستخدام علامة خاصة بالورم ، من الممكن تحديد مناطق أنسجة الورم مقابل مناطق ستروما وبالتالي استجابات الدواء المنفصلة داخل هذه المقصورات(الشكل 3). بالإضافة إلى ذلك، يمكن تحديد المؤشرات الحيوية المتعددة في وقت واحد لتقييم، على سبيل المثال، حركة الخلايا المناعية على الهدف داخل TME (الشكل 4).
وقد وثق منشور سابق تطبيق هذه المنصة PDE على التقسيم الطبقي ل NSCLC PDEs لمعيار العلاج الكيميائي للرعاية ، cisplatin ، مما يدل على أنه من الممكن فصل الكيميائي من السكان الكيميائيينالحسيين 24. تعكس هذه النتائج المتعلقة ب PDE استجابات المرضى. باتباع الطرق الموضحة هنا ، من الممكن اتباع نهج مماثلة لأنواع الأورام الأخرى ومع أنواع مختلفة من الأدوية أو العلاج الكيميائي أو غير ذلك. إن فصل هذه العقاقير إلى مجموعات سكانية حساسة للأدوية ومقاومة للأدوية يخلق موردا لا يقدر بثمن لتوليد المزيد من البصيرة الآلية في مقاومة الأدوية. على سبيل المثال، نظرا لأنه يمكن معالجة PDEs لعزل الحمض النووي الريبي أو الحمض النووي أو البروتين أو المستقلب، فإن هذا يمكن أن يسمح بتنفيذ تقنيات "الأوميك" لتحديد المؤشرات الحيوية الرئيسية التي تنبئ بالاستجابة. بدلا من ذلك، يمكن استخدام أقسام FFPE الناتجة عن PDEs المعالجة للتنميط المكاني الواسع لفهم كيفية مساهمة أنواع الخلايا المختلفة في PDE في مقاومة الأدوية.
ويمكن تسهيل ذلك من خلال مزيد من التطورات في التصوير متعدد الأطياف والقياس الخلوي الشامل النهج35،40،41،42،43، والتي من شأنها أن تسمح مئات من المؤشرات الحيوية لتكون لمحة في وقت واحد. النماذج ما قبل السريرية التي تقيم فعالية العلاج المناعي مطلوبة كثيرا بعد، وهذه الورقة توضح أن PDEs يمكن أن تملأ هذا المكان الحرج(الشكل 3 والشكل 4). تم تطوير الأجسام المضادة أحادية النسيلة التي تستهدف نقاط التفتيش المناعية ، مثل مستضد الخلايا الليمفاوية T السامة للخلايا 4 و PD-1 /المبرمجة ليغاند-1 (PD-L1) ،44و45و46و47 مع بعض التحسينات الملحوظة في بقاء المريض بشكل عام في عدد كبير من الأورام الصلبة مقارنة بالعلاج الكيميائي القياسي. ومع ذلك ، فإن ICIs فعالة في عدد محدود من المرضى لأسباب غير واضحة ، مما يستلزم تحديد المؤشرات الحيوية التنبؤية48. الميزة البارزة من PDEs الحفاظ على العمارة 3D من الأنسجة الورم يسهل تقييم فعالية ICI (الشكل 3) ورصد الخلايا المناعية استجابة للعلاج ICI (الشكل 4). وبالتالي، فإن هذه العوامل هي منصة مثالية للتمييز بين الحالات الحساسة ل ICI والحالات المقاومة ل ICI والتحقيق في الآليات التي يقوم عليها هذا التمييز.
PDE التكنولوجيا لا تعاني من بعض العيوب. يعتمد توليد نتائج دقيقة وتجريبية من PDEs على سلامة الورم ، وفي بعض الأحيان ، تكون عينات الورم بعد الجراحة نخرية للغاية لمعالجتها ل PDEs. وعلاوة على ذلك، على الرغم من بعض الأمثلة المحددة على الاحتفاظ بسلامة الأنسجة بعد زراعة طويلة25،بالنسبة لمعظم الحالات المبلغ عنها، فقدت السلامة والقدرة على البقاء بعد 72 ساعة في الثقافة، ويحدث تفكك الأنسجة. ولذلك فإن فترة الوقت لإجراء تجارب المخدرات محدودة نسبيا، وتحظر استخدام هذا النموذج لدراسة آليات مقاومة الأدوية المكتسبة أو دراسة الغزو والانبثاث13. وقد يصبح توسيع نطاق صلاحية النباتات السابقة ممكنا في المستقبل من خلال تطوير تكنولوجيات جديدة، مثل السقالات والقنوات المتغلغلة، مما قد يسهل نشر المواد الغذائية وامتصاصها، مما يسمح بتوسيع نطاق الثقافة.
ومع ذلك، وإلى أن يتسنى إدخال هذه التحسينات، ينبغي اعتبار منصة PDE طريقة ثقافية قصيرة الأجل يمكن أن توفر بيانات فورية عن الاستجابة للأدوية. وينبغي استخدامه جنبا إلى جنب مع النظم النموذجية الأخرى، مثل الأجهزة العضوية ونماذج PDX، التي يمكن أن توفر بيانات الاستجابة للأدوية على المدى الطويل. بشكل عام ، فإن منصة PDE هي نظام نموذج ما قبل السريري لإثبات المفهوم الذي هو مفيد في تحديد حساسية ورم المريض لعامل معين مضاد للحساسية ، واشتقاق نظرة ثاقبة إلى آليات العمل الدوائي في ورم حقيقي ، وتطوير المؤشرات الحيوية التنبؤية والدائية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
لا شيء للكشف عنه
Acknowledgments
نشكر الجراحين وأخصائيي علم الأمراض في المستشفيات الجامعية في ليستر NHS Trust على توفير أنسجة الورم الجراحية التي تم استئصالها. نشكر أيضا منشأة الأنسجة داخل خدمات التكنولوجيا الحيوية الأساسية للمساعدة في معالجة الأنسجة وتجزؤ كتل أنسجة FFPE وKees Straatman لدعمها باستخدام Vectra Polaris. تم دعم وتمويل هذا البحث من قبل اتحاد Explant الذي يضم أربعة شركاء: جامعة ليستر ، ووحدة السموم MRC ، ومختبرات اكتشاف السرطان في المملكة المتحدة العلاجية ، و LifeArc. وقدم مركز CRUK-NIHR ليستر التجريبي لطب السرطان دعما إضافيا (C10604/A25151). تم توفير التمويل لجنرال موتورز، CD، وNA من قبل برنامج محفز سرطان الثدي الآن (2017NOVPCC1066)، الذي يدعمه التمويل من شركة فايزر.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Sigma | 320099 | Staining reagent |
| Antibody Diluent / Block, 1x | Perkin Elmer | ARD1001EA | Antibody diluent/blocking buffer |
| Barnstead NANOpure Diamond | Barnstead | Ultra Pure (UP) H2O machine | |
| Citric Acid Monohydrate | Sigma-Aldrich | C7129 | Reagent for citrate buffer |
| Costar Multiple Well Cell Culture Plates | Corning Incorporated | 3516 | 6 multiwell plate |
| DAPI Dilactate | Life Technologies | D3571 | |
| 100 x 17 mm Dish, Nunclon Delta | ThermoFisher Scientific | 150350 | 100 mm diameter dish for tissue culture |
| DMEM (1x) Dubelcco's Modified Eagle Medium + 4.5 g/L D-Glucose + 110 mg/mL Sodium Pyruvate | Gibco (Life Technologies) | 10569-010 | Tissue culture medium (500 mL) |
| DPX mountant | VWR | 360294H | Mounting medium |
| DPX mountant | Merck | 6522 | Mounting medium |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | 3609 | Reagent for TE buffer |
| Eosin | CellPath | RBC-0100-00A | Staining reagent |
| Foetal Bovine Serum | Gibco | 10500-064 | For use in tissue culture medium |
| 37% Formaldehyde | Fisher (Acros) | 119690010 | 10% Formalin |
| iGenix, microwave oven IG2095 | iGenix | IG2095 | Microwave used for antigen retreival |
| Industrial methylated spirit (IMS) | Genta Medical | 199050 | 99% Industrial Denatured Alcohol (IDA) |
| InForm Advanced Image Analysis Software | Akoya Biosciences | InForm | |
| Leica ASP3000 Tissue Processor | Leica Biosystems | Automated Vacuum Tissue Processor | |
| Leica Arcadia H and C | Leica Biosystems | Embedding wax bath | |
| Leica RM2125RT | Leica Biosystems | Rotary microtome | |
| Leica ST4040 Linear Stainer | Leica Biosystems | H&E stainer | |
| Mayer's Haematoxylin | Sigma | GHS132-1L | Staining reagent |
| Millicell Cell Culture Inserts, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | Merck Milipore | PICMORG50 | Organotypic culture insert disc |
| Novolink Polymer Detection System | Leica Biosystems | RE7150-K | DAB staining kit |
| OPAL 480 | Akoya Biosciences | FP1500001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 520 | Akoya Biosciences | FP1487001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 570 | Akoya Biosciences | FP1488001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 620 | Akoya Biosciences | FP1495001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 650 | Akoya Biosciences | FP1496001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 690 | Akoya Biosciences | FP1497001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 780 / OPAL TSA-DIG Reagent | Akoya Biosciences | FP1501001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent and TSA-DIG reagent |
| Opal Polymer HRP Ms Plus Rb, 1x | Perkin Elmer | ARH1001EA | HRP polymer |
| Penicillin/streptomycin solution | Fisher Scientific | 11548876 | For use in tissue culture medium |
| PhenoChart Whole Slide Contextual Viewer | Akoya Biosciences | PhenoChart | Viewer software for scanned images |
| Phosphate Buffered Saline Tablets | Thermo Scientific Oxoid | BR0014G | PBS |
| 1x Plus Amplification Diluent | Perkin Elmer | FP1498 | Fluorophore diluent |
| Prolong Diamond Antifade Mountant | Invitrogen | P36961 | Mounting medium |
| Slide Carrier | Perkin Elmer | To load slides into Slide Carrier Hotel for scanning with Vectra Polaris | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S/3160/63 | 10% Formalin |
| Sodium Hydroxide pellets | Fisher Scientific | S/4920/53 | Reagent for citrate buffer |
| Tenatex Toughened Wax - Pink (500 g) | KEMDENT | 1-601 | Dental wax surface |
| Thermo Scientific Shandon Sequenza Slide Rack for Immunostaining Center | Fisher Scientific | 10098889 | Holder for slides and slide clips |
| Thermo Scientific Shandon Plastic Coverplates | Fisher Scientific | 11927774 | Slide clips |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Sigma-Aldrich | 252859 | Reagent for TE buffer |
| VectaShield | Vecta Laboratories | H-1000-10 | Mounting medium |
| Vectra Polaris Slide Scanner | Perkin Elmer | Vectra Polaris | Slide scanner |
| Xylene | Genta Medical | XYL050 | De-waxing agent |
References
- Gerlinger, M., et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. The New England Journal of Medicine. 366 (10), 883-892 (2012).
- Jamal-Hanjani, M., et al. Tracking the evolution of non-small-cell lung cancer. The New England Journal of Medicine. 376 (22), 2109-2121 (2017).
- McGranahan, N., Swanton, C. Biological and therapeutic impact of intratumor heterogeneity in cancer evolution. Cancer Cell. 27 (1), 15-26 (2015).
- Casey, T., et al. Molecular signatures suggest a major role for stromal cells in development of invasive breast cancer. Breast Cancer Research and Treatment. 114 (1), 47-62 (2009).
- Gerdes, M. J., et al. Emerging understanding of multiscale tumor heterogeneity. Frontiers in Oncology. 4, 366 (2014).
- Komohara, Y., Takeya, M. CAFs and TAMs: maestros of the tumour microenvironment. The Journal of Pathology. 241 (3), 313-315 (2017).
- Miyake, M., et al. CXCL1-mediated interaction of cancer cells with tumor-associated macrophages and cancer-associated fibroblasts promotes tumor progression in human bladder cancer. Neoplasia. 18 (10), 636-646 (2016).
- Hisamitsu, S., et al. Interaction between cancer cells and cancer-associated fibroblasts after cisplatin treatment promotes cancer cell regrowth. Human Cell. 32 (4), 453-464 (2019).
- Witz, I. P. The tumor microenvironment: the making of a paradigm. Cancer Microenvironment. 2, Suppl 1 9-17 (2009).
- Fu, X. T., et al. Tumor-associated macrophages modulate resistance to oxaliplatin via inducing autophagy in hepatocellular carcinoma. Cancer Cell International. 19, 71 (2019).
- Chen, D., Zhang, X. Tipping tumor microenvironment against drug resistance. Journal of Oncology Translational Research. 1 (1), 106 (2015).
- Roma-Rodrigues, C., Mendes, R., Baptista, P. V., Fernandes, A. R. Targeting tumor microenvironment for cancer therapy. International Journal of Molecular Sciences. 20 (4), 840 (2019).
- Powley, I. R., et al. Patient-derived explants (PDEs) as a powerful preclinical platform for anti-cancer drug and biomarker discovery. British Journal of Cancer. 122 (6), 735-744 (2020).
- Freeman, A. E., Hoffman, R. M. In vivo-like growth of human tumors in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 83 (8), 2694-2698 (1986).
- Vescio, R., et al. A. al. In vivo-like drug responses of human tumors growing in three-dimensional gel-supported primary culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 84 (14), 5029-5033 (1987).
- Hoffman, R. M. 3D Sponge-matrix histoculture: an overview. Methods in Molecular Biology. 1760, 11-17 (2018).
- Vescio, R. A., Connors, K. M., Kubota, T., Hoffman, R. M. Correlation of histology and drug response of human tumors grown in native-state three-dimensional histoculture and in nude mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 88 (12), 5163-5166 (1991).
- Furukawa, T., Kubota, T., Hoffman, R. M. Clinical applications of the histoculture drug response assay. Clinical Cancer Research. 1 (3), 305-311 (1995).
- Centenera, M. M., Raj, G. V., Knudsen, K. E., Tilley, W. D., Butler, L. M. Ex vivo culture of human prostate tissue and drug development. Nature Reviews Urology. 10 (8), 483-487 (2013).
- Centenera, M. M., et al. Evidence for efficacy of new Hsp90 inhibitors revealed by ex vivo culture of human prostate tumors. Clinical Cancer Research. 18 (13), 3562-3570 (2012).
- Dean, J. L., et al. Therapeutic response to CDK4/6 inhibition in breast cancer defined by ex vivo analyses of human tumors. Cell Cycle. 11 (14), 2756-2761 (2012).
- Majumder, B., et al. Predicting clinical response to anticancer drugs using an ex vivo platform that captures tumour heterogeneity. Nature Communications. 6, 6169 (2015).
- Goldman, A., et al. Temporally sequenced anticancer drugs overcome adaptive resistance by targeting a vulnerable chemotherapy-induced phenotypic transition. Nature Communications. 6, 6139 (2015).
- Karekla, E., et al. Ex vivo explant cultures of non-small cell lung carcinoma enable evaluation of primary tumor responses to anticancer therapy. Cancer Research. 77 (8), 2029-2039 (2017).
- Ricciardelli, C., et al. Novel ex vivo ovarian cancer tissue explant assay for prediction of chemosensitivity and response to novel therapeutics. Cancer Letters. 421, 51-58 (2018).
- Yoshimasu, T., et al. Histoculture drug response assay (HDRA) guided induction concurrent chemoradiotherapy for mediastinal node-positive non-small cell lung cancer. Gan To Kagaku Ryoho. Cancer and chemotherapy. 30 (2), 231-235 (2003).
- Pirnia, F., et al. Ex vivo assessment of chemotherapy-induced apoptosis and associated molecular changes in patient tumor samples. Anticancer Research. 26, 1765-1772 (2006).
- Maund, S. L., Nolley, R., Peehl, D. M. Optimization and comprehensive characterization of a faithful tissue culture model of the benign and malignant human prostate. Laboratory Investigation. 94 (2), 208-221 (2014).
- Vasaturo, A., Galon, J. Multiplexed immunohistochemistry for immune cell phenotyping, quantification and spatial distribution in situ. Methods in Enzymology. 635, 51-66 (2020).
- Fuhrman, K., et al. Molecularly guided digital spatial profiling for multiplexed analysis of gene expression with spatial and single cell resolution. Journal of Biomolecular Techniques. 31, 14-15 (2020).
- Twiddy, D., et al. A TRAIL-R1-specific ligand in combination with doxorubicin selectively targets primary breast tumour cells for apoptosis. Breast Cancer Research. 12 (1), 58 (2010).
- Cai, H., et al. Cancer chemoprevention: Evidence of a nonlinear dose response for the protective effects of resveratrol in humans and mice. Science Translational Medicine. 7 (298), (2015).
- Busacca, S., et al. Resistance to HSP90 inhibition involving loss of MCL1 addiction. Oncogene. 35 (12), 1483-1492 (2016).
- Kolluri, K. K., et al. Loss of functional BAP1 augments sensitivity to TRAIL in cancer cells. Elife. 7, 30224 (2018).
- Toki, M. I., et al. High-plex predictive marker discovery for melanoma immunotherapy-treated patients using digital spatial profiling. Clinical Cancer Research. 25 (18), 5503-5512 (2019).
- Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).
- Park, I. J., et al. Prediction of radio-responsiveness with immune-profiling in patients with rectal cancer. Oncotarget. 8 (45), 79793-79802 (2017).
- Mezheyeuski, A., et al. Multispectral imaging for quantitative and compartment-specific immune infiltrates reveals distinct immune profiles that classify lung cancer patients. The Journal of Pathology. 244 (4), 421-431 (2018).
- Kather, J. N., et al. Topography of cancer-associated immune cells in human solid tumors. Elife. 7, 36967 (2018).
- Zollinger, D. R., Lingle, S. E., Sorg, K., Beechem, J. M., Merritt, C. R. GeoMx™ RNA assay: high multiplex, digital, spatial analysis of RNA in FFPE tissue. Methods in Molecular Biology. 2148, 331-345 (2020).
- Zugazagoitia, J., et al. Biomarkers associated with beneficial PD-1 checkpoint blockade in non-small cell lung cancer (NSCLC) identified using high-plex digital spatial profiling. Clinical Cancer Research. 26 (16), 4360-4368 (2020).
- Allo, B., Lou, X., Bouzekri, A., Ornatsky, O. Clickable and high-sensitivity metal-containing tags for mass cytometry. Bioconjugate Chemistry. 29 (6), 2028-2038 (2018).
- Gerdtsson, E., et al. Multiplex protein detection on circulating tumor cells from liquid biopsies using imaging mass cytometry. Convergent Science Physical Oncology. 4 (1), 015002 (2018).
- Reck, M., et al. Pembrolizumab versus chemotherapy for PD-L1-positive non-small-cell lung cancer. The New England Journal of Medicine. 375 (19), 1823-1833 (2016).
- Le, D. T., et al. KEYNOTE-164: Phase 2 study of pembrolizumab for patients with previously treated, microsatellite instability-high advanced colorectal carcinoma. Journal of Clinical Oncology. 34, 15_suppl 3631 (2016).
- Diaz, L. A., et al. KEYNOTE-177: Randomized phase III study of pembrolizumab versus investigator-choice chemotherapy for mismatch repair-deficient or microsatellite instability-high metastatic colorectal carcinoma. Journal of Clinical Oncology. 35, 4_suppl 815 (2017).
- Long, G. V., et al. Impact of baseline serum lactate dehydrogenase concentration on the efficacy of pembrolizumab and ipilimumab in patients with advanced melanoma: data from KEYNOTE-006. European Journal of Cancer. 72, 122-123 (2017).
- Voong, K. R., Feliciano, J., Becker, D., Levy, B. Beyond PD-L1 testing-emerging biomarkers for immunotherapy in non-small cell lung cancer. Annals of Translational Medicine. 5 (18), 376 (2017).
