Summary
Detta dokument beskriver metoder för generering, läkemedelsbehandling och analys av patient-härledda explants för att bedöma tumör läkemedel svar i ett levande, patient-relevant, prekliniska modellsystem.
Abstract
En förståelse för läkemedelsresistens och utvecklingen av nya strategier för att sensibilisera mycket resistenta cancerformer förlitar sig på tillgången till lämpliga prekliniska modeller som exakt kan förutsäga patientens svar. En av nackdelarna med befintliga prekliniska modeller är oförmågan att kontextuellt bevara den mänskliga tumör microenvironment (TME) och korrekt representera intratumoral heterogenitet, vilket begränsar den kliniska översättningen av data. Däremot, genom att representera kulturen av levande fragment av mänskliga tumörer, tillåter den patient-härledda explant (PDE) plattformen läkemedelssvar att undersökas i ett tredimensionellt (3D) sammanhang som speglar de patologiska och arkitektoniska funktionerna i de ursprungliga tumörerna så nära som möjligt. Tidigare rapporter med PDEs har dokumenterat plattformens förmåga att skilja chemosensitive från kemoresistant tumörer, och det har visat sig att denna segregering är prediktiv för patientens svar på samma kemoterapier. Samtidigt ger PDEs möjlighet att förhöra molekylära, genetiska och histologiska funktioner hos tumörer som förutsäger läkemedelssvar och därigenom identifiera biomarkörer för patient stratifiering samt nya interventionella metoder för att sensibilisera resistenta tumörer. Detta dokument rapporterar PDE metodik i detalj, från samling av patient prover till slut punkt analys. Det ger en detaljerad beskrivning av explant härledning och kultur metoder, belyser skräddarsydda villkor för vissa tumörer, där så är lämpligt. För endpointanalys finns fokus på multiplexerad immunofluorescens och multispektral avbildning för rumslig profilering av viktiga biomarkörer inom både tumör- och stromalregioner. Genom att kombinera dessa metoder är det möjligt att generera kvantitativa och kvalitativa läkemedelssvarsdata som kan relateras till olika clinicopathologiska parametrar och därmed potentiellt användas för biomarköridentifiering.
Introduction
Utvecklingen av effektiva och säkra cancermedel kräver lämpliga prekliniska modeller som också kan ge insikt i verkningsmekanismer som kan underlätta identifieringen av prediktiva och farmakodynamiska biomarkörer. Heterogenitet mellan och intratumor1,2,3,4,5 och TME6,7,8,9,10,11,12 är kända för att påverka läkemedel mot cancer, och många befintliga prekliniska cancermodeller som cellinjer, organoider och musmodeller kan inte fullt ut tillgodose dessa avgörande Funktioner. En "idealisk" modell är en som kan rekapitulera de komplexa rumsliga interaktionerna av maligna med icke-maligna celler inom tumörer samt återspegla de regionala skillnaderna inom tumörer. Den här artikeln fokuserar på PDEs som en framväxande plattform som kan uppfylla många av dessa krav13.
Det första exemplet på användningen av mänskliga PDEs, även känd som histokulturer, går tillbaka till slutet av 1980-talet när Hoffman et al. genererade skivor av nyförrättade mänskliga tumörer och odlade dem i en kollagenmatris14,15. Detta innebar att etablera ett 3D-odlingssystem som bevarade vävnadsarkitektur, vilket säkerställer upprätthållandet av stromala komponenter och cellinteraktioner inom TME. Utan att dekonstruera den ursprungliga tumören förebådade Hoffman m.fl.16 ett nytt tillvägagångssätt för translationell forskning, och sedan denna tid har många grupper optimerat olika explantmetoder i syfte att bevara vävnadens integritet och generera exakta läkemedelssvarsdata17,18,19,20,21,22,23,24 , även om vissa skillnader mellan protokollen är uppenbara. Butler et al. odlade explanter i gelatinsvampar för att hjälpa diffusionen av näringsämnen och läkemedel genom exemplaret20,21,25, medan Majumder et al. skapade ett tumörekosystem genom att odla explanter ovanpå en matris bestående av tumör- och stromatproteiner i närvaro av autologt serum som härrör från samma patient22, 23.
Mer nyligen har vår grupp inrättat ett protokoll där explanter genereras av fragmentering av tumörer i 2- 3 mm3-storlekbitar som sedan placeras utan ytterligare komponenter på genomsläppliga membran vid luft-vätskegränssnittet i ett odlingssystem24. Sammantaget har dessa många studier visat att PDEs tillåter kulturen av intakta, levande fragment av mänskliga tumörer som behåller den rumsliga arkitekturen och regionala heterogenitet av de ursprungliga tumörerna. I originalexperiment utsattes explanter eller histokulturer vanligtvis för homogenisering efter läkemedelsbehandling, varefter olika lönsamhetsanalyser tillämpades på homogeniserade prover såsom histokulturläkemedelssvarsanalysen20,21,MTT (3-(6)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid), laktatdehydrogenasanalysen eller den omzurinbaserade analysen2,2 . Den senaste tidens framsteg inom slutpunktsanalysteknik, särskilt digital patologi, har nu utökat repertoaren av endpointtester och analyser som kan utföras på explanter29,30. För att tillämpa dessa nya tekniker, istället för homogenisering, explanter fixeras i formalin, bäddas in i paraffin (FFPE) och analyseras sedan med hjälp av immunstainingtekniker, vilket möjliggör rumslig profilering. Exempel på detta tillvägagångssätt har dokumenterats för icke-småcellig lungcancer (NSCLC), bröstcancer, kolorektal cancer och mesoteliom explanter varigenom immunohistokemisk färgning för spridningsmarkören, Ki67, och den apoptotiska markören, klyvd poly-ADP ribose polymeras (cPARP), användes för att övervaka förändringar i cellproliferation och celldöd24,31,32,33,34.
Multiplexerad immunofluorescens är särskilt mottaglig för rumslig profilering av läkemedelssvar hos explanter vid endpoint35. Det är till exempel möjligt att mäta omlokalisering och rumslig fördelning av specifika klasser av immunceller, såsom makrofager eller T-celler, inom TME vid läkemedelsbehandling13,36,37,38, och undersöka om ett terapeutiskt medel kan gynna övergången från "kall tumör" till "varm tumör"39 . Under de senaste åren har denna grupp fokuserat på härledning av PDEs från olika tumörtyper (NSCLC, njurcancer, bröstcancer, kolorektal cancer, melanom) och testning av en rad cancermedel inklusive kemoterapier, småmolekylära hämmare och immunkontrollpunktshämmare (ICIs). Endpointanalysmetoder har optimerats för att inkludera multiplexerad immunofluorescens för att möjliggöra rumslig profilering av biomarkörer för livskraft samt biomarkörer för olika beståndsdelar i TME.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Vävnadssamling
- Efter kirurgi, överföra ny resected mänskliga tumör exemplar till ett rör som innehåller 25 mL av färsk kultur medium (Dulbeccos modifierade Eagle medium kompletteras med 4,5 g/L glukos och L-glutamin + 1% (v/v) fetala kalv serum + 1% penicillin-streptomycin) och lagras på is. Bearbeta explanten inom 2 timmar från operationen i en steril klass II-huva.
2. Explant preparat
- Rengör all kirurgisk utrustning (ympblad/dentalvaxyta/pincett) med 70% industriell metylerad spritlösning (IMS).
- Fyll en 10 cm odlingsfat (se materialbordet) med ~ 25 ml färskt medium och placera den ovanpå en isbädd.
- Använd pincett och överför provexemplaret till en dentalvaxyta (se materialbordet)och skär vävnaden i fragment på cirka 2–3 mm3 med två hudtransplantationsblad.
OBS: För bästa prestanda, börja skära vävnaden för att få en individuell remsa av 2-3 mm tjocklek och skär sedan remsan längs längden för att få de slutliga explanterna. Upprepa processen tills hela provet har hackats. - Överför explanterna snabbt till det iskalla odlingsmediet i 10 cm skålen. Ta en del av explanterna (6-9 stycken), placera dem i ett 1 ml-rör som innehåller 10% av icke-buffrad formalinlösning och lämna vid rumstemperatur (RT) i 24 timmar.
OBS: Dessa fragment kommer att representera kontrollexplanterna för det "okulturerade" tillståndet. - Fyll önskat antal brunnar av 6-brunnsplattor med 1,5 ml färskt medium per brunn och placera en organotypisk kulturinsatsskiva (se materialtabellen) i varje brunn så att den flyter ovanpå mediet och undviker försiktigt luftbubblor vid medieinläggsgränssnittet.
- Välj explanter slumpmässigt och placera dem en i taget ovanpå skärskivan. För att vara förenlig med det "okulturerade" tillståndet, använd 6-9 explanter per brunn. Placera multiwellplattan i en CO2-inkubator vid 37 °C och 5% CO2och låt explanterna återhämta sig i 16 timmar.
OBS: För att undvika att krossa vävnaden rekommenderas skonsam hantering av pincetterna starkt.
3. Läkemedelsbehandling
- Efter 16 h, ta nya 6-brunnsplattor, tillsätt 1,5 ml färskt medium till varje brunn, tillsätt relevanta läkemedel vid önskade koncentrationer och inkludera en brunn för fordonskontrollen. Använd pincetterna och flytta varje insats som innehåller explanterna till de nylagade 6-brunnsplattorna som innehåller drogerna. Placera plattorna i CO2-inkubatorn vid 37 °C och 5% CO2 för 24–48 h.
- Överför de okulturerade explanterna som tidigare fastställts i formalin till en histologikassett (se avsnitt 4 nedan) och lagra i 70% IMS fram till slutet av experimentet.
4. Histologisk bearbetning
- Vävnadsfixering
- Efter läkemedelsbehandling överför du skärskivorna som innehåller explanterna till nya 6-brunnsplattor som innehåller 10% formalin och tillsätt några droppar 10% formalin på toppen av explanterna för att säkerställa fullständig täckning med fixativet.
VARNING: Formalin är farligt. Undvik kontakt med huden och hantera den inuti en rökmat för att förhindra inandning. - Låt explanterna stanna över natten (20–24 h) i 10% formalin.
- Nästa dag blötlägg det relevanta antalet små histologisvampar i 70% IMS och placera dem i histologikassetter. Överför försiktigt alla explanter från ett givet läkemedelsbehandlingstillstånd på en enda svamp (behåll explanternas orientering så att sidorna av explanterna i kontakt med insatsskivorna, och därför de läkemedelsbehandlade områdena, placeras i kontakt med svampen). Placera en annan presoaked svamp ovanpå explanterna och säkra i en histologikassett (en kassett per brunn / behandling).
- Sänk ned kassetterna i 70% IMS och lämna på RT i 24 timmar.
- Efter läkemedelsbehandling överför du skärskivorna som innehåller explanterna till nya 6-brunnsplattor som innehåller 10% formalin och tillsätt några droppar 10% formalin på toppen av explanterna för att säkerställa fullständig täckning med fixativet.
- Paraffininbäddning och vävnadssektionering
- Följande dag överför du histologikassetterna som innehåller explanterna till vävnadsprocessorns provkorg (se materialförteckningen) och fäst locket. Placera korgen i retorten och stäng försiktigt. Välj önskat program och starta processorn. Töm retorten, öppna den för att ta bort korgen och överför korgen till inbäddningscentrets vaxbad.
- Efter inbäddning överför du metallkassettlocken till korgen och återgår till vävnadsprocessorns svar för rengöringsprogrammet. Torka av sensorn med en torr vävnad, ta bort överflödigt vax från retortlocket och fortsätt med rengöringsprogrammet.
- Placera ett paraffinblock i den roterande mikrotomen, skär några sektioner vid 4 μm och återför blocket till is. Flytta blocket och skär mer 4 μm sektioner. Överför sektionerna med en liten pensel och tång på ett vattenbad för att ta bort veck och bubblor.
- Placera sektionerna centralt på mikroskopbilder, dränera rutschkanorna i några minuter och placera dem i ett glidställ för att torka över natten i en inkubator vid 37 °C. När sektionerna är torra förvarar du dem på RT i en bildmapp eller låda för att skydda mot damm.
5. Hematoxylin och eosin (H&E) färgning
- Fyll färgfläcken (se tabellen över material)med reagenser och ställ in det önskade programmet för H&E-färgning: hematoxilininkubationstid: 5 min; eosin inkubationstid: 3 min.
- Fäst skjutstället på bäraren, placera det i den första behållaren med xylen och starta programmet. Ta bort skjuthållaren från racket och ta behållaren med skjutstället till monteringsområdet.
- Montera rutschkanorna med dibutyl ftalat xylen (DPX) under utsugningshuven. Placera DPX på varje täckslip och sänk bilden på täcket med sektionen nedåt, så att DPX kan sprida ut sig.
OBS: DPX är farligt. Undvik hudkontakt och användning i en angiven rökhuv.
6. Immunstaining
OBS: Följande steg bör utföras på RT om inget annat anges.
- Deparaffinering och rehydrering
- Placera rutschkanorna i ett glidställ och värm vid 65 °C i 10 minuter innan sektionerna avparaffiniseras i xylen i 3 min (2x). Minimera mängden överföringslösning.
OBS: Xylen är brandfarlig, farlig och irriterande. Handtag inuti rökhuven med dubbla lager handskar. Undvik hud- och ögonkontakt. Kassera avfall i en förseglad behållare. - Rehydrera bilderna i en alkoholgradient enligt följande: 99% IMS för 1 min (2x) och 95% IMS i 1 min. Minimera mängden överföringslösning.
OBS: IMS är mycket brandfarligt, flyktigt och irriterande. Hantera insidan av rökhuven och undvik hud- och ögonkontakt. - Doppa skjutstället helt i ultrapure (UP) vatten i 5 min.
- Placera rutschkanorna i ett glidställ och värm vid 65 °C i 10 minuter innan sektionerna avparaffiniseras i xylen i 3 min (2x). Minimera mängden överföringslösning.
- Antigenhämtning
- Förbered antigenhämtningsbuffert enligt tillverkarens riktlinjer för den specifika antikropp som används.
OBS:Citratbufferten 0,2 M, pH 6 eller tris(hydroximetyl)aminometan (Tris)-etylendiamintetraättiksyra (EDTA) 0,1 M, pH 9, är de vanliga buffertar som används för sura respektive alkaliska förhållanden. Citronsyra monohydrat och Tris är irriterande medel. Förbered alla lagerlösningar i rökhuven. Undvik kontakt med hud och ögon. - Dränk racket som innehåller bilderna i antigenhämtningsbuffert och mikrovågsugn (se materialtabellen)med full effekt (800 W) i 20 minuter.
OBS: Håll bilderna helt nedsänkta i bufferten under hela processen. För att undvika överdriven minskning av buffertvolymen, placera ett lock ovanpå den använda behållaren.
- Förbered antigenhämtningsbuffert enligt tillverkarens riktlinjer för den specifika antikropp som används.
- Multiplex immunofluorescens (mIF)
OBS: Den här processen tar 1–2 dagar.- Fyll en ren behållare med 250 ml UP-vatten och sänk ner skjutstället helt i 2 min (2x). Fortsätt med monteringen av varje bild i en rutskiva (se materialtabellen).
- För att montera en glidning på en täckplatta, förbered ett glastråg med vatten. Sänk ner både täckplattan och skjut i vattnet och placera vävnadssektionssidan mot täckplattan.
- Placera glidans nederkant ovanpå protuberancesna längst ner på täckplattan och rikta slutligen bilden mot täckplattan så att vattnet kan fylla gapet däremellan utan att någon luft fastnar. Håll täckplattan och glid ihop och placera dem i ett täckställ.
- Fyll täckplattan med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och vänta tills bufferten tvättar rutschkanorna och flöda ut genom gravitation (2x). Pipett 110 μL av blockerande buffert (se tabellen av material)på varje täckplatta och inkubera i 10 min.
- Förbered önskad primär antikroppsutspäding i PBS eller blockeringsbuffert enligt tillverkarens rekommendationer. Inkubera bilderna med primär antikropp (110 μL per bild) i 30 min. Tvätta rutschkanorna med 5 ml PBS (2x), enligt beskrivningen i 6.3.2.
- Inkubera bilderna med 110 μL pepparrotperoxidaspolymer i 30 min. Tvätta rutschkanorna med 5 ml PBS (2x), enligt beskrivningen i 6.3.2.
- Förbered fluoroforutspädning i förstärkningsdubent 1:100 (v/v) och inkubera bilderna med fluorofor (110 μL per bild) i 10 min. Tvätta rutschkanorna med 5 ml PBS (2x), enligt beskrivningen i 6.3.2.
OBS: För användning av fluorofor 780, följ tillverkarens riktlinjer. Försöket kan pausas här om diabilderna inkuberas i den slutliga tvätten av PBS och lagras vid 4 °C över natten. - Lossa bilderna från täckplattorna och gå tillbaka till antigenhämtningssteget för att starta färgningen med en annan antikropp. Upprepa färgningen så att önskat antal antikroppar testas.
- Efter steg 6.3.5 för den sista fluoroforen som används, håll rutschkanorna på täckplattorna, förbered 6 μM-lösningen av 4'-6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) dilaktat med UP-vatten och mothåll rutschkanorna i 5 min (110 μL varje bild). Tvätta rutschkanorna med UP-vatten (2x) och ta bort överflödigt vatten genom att torka kanterna på bilderna. Montera täckglasen på rutschkanorna med monteringsmedium och förvara på RT i mörker.
- Fyll en ren behållare med 250 ml UP-vatten och sänk ner skjutstället helt i 2 min (2x). Fortsätt med monteringen av varje bild i en rutskiva (se materialtabellen).
7. Skanning
Bildskanning utfördes med hjälp av ett multispektralt automatiserat bildsystem (se tabellen över material).
- Montera bilderna i bäraren och ladda dem i skannern i önskad ordning.
OBS: Det rekommenderas att en kontrollrutschbana inkluderas där ingen fluorofor eller DAPI används under immunohistokemisk färgning. Denna bild kommer att användas som kontroll för inneboende florescence (autofluorescens (AF)) av vävnaden. - När du har startat bildskannerprogramvaran väljer du Redigera protokoll på startsidan. Skapa ett nytt protokoll som adresserar namn, bildläge, vilken typ av multispektral skanning som ska utföras (4–7 kanaler) och studera (katalog).
OBS: Om du vill ändra standardinställningarna för analyserade band väljer/avmarkerar du önskade filter med funktionen Välj skanningsband - Fortsätt med Scan Exposure and Load Carrieroch välj slutligen operatören för protokollinställningarna. Välj Ta översikt om du vill identifiera vävnaden i bilden. Välj en bild som visas på bärarenoch välj ett visst område i vävnaden med den röda markören för att få den i direktsändning i skärmens vänstra fönster.
- Välj DAPI-filtretoch klicka på Autofokus eller justera skjutreglaget Steghöjd manuellt för att fokusera intresseområdet. Klicka på Autoexpose så att systemet kan hitta den bästa exponeringen för det filtret/bandet.
Obs: Exponeringstiden för varje filter är inställd på 12 ms. När du har exponerat systemet automatiskt, förfina exponeringstiden till en bättre uppskattning. Det är också möjligt att åsidosätta värdet för automatisk exponering genom att skriva in ett värde manuellt i den markerade cellen. - Upprepa ovanstående steg för alla filter i protokollet. Om det behövs, ändra platser och/eller bilder för att hitta de bästa signalerna för att ställa in exponeringarna.
OBS: Om vävnaden är markerad i rött i direktsänd vy är den analyserade filtrets fluorescerande signal mättad och automatisk exponering måste upprepas. - När exponeringsinställningarna har upprättats klickar du på knappen Tillbaka och sparar protokollet. Välj Skanna bilder på webbplatsensstartsida (se tabellen med material).
- Stapla alla transportörer som ska skannas in på Slide Carrier Hoteloch notera ordningen på bilderna för att tilldela sitt ID till systemet.
OBS: På programvaruskärmen kommer varje operatör att vara relaterad till en plats som innehåller 4 bilder. - Om du vill konfigurera flera bilder med samma parametrar klickar du på Konfigurera uppgifteroch väljer en eller flera platser med alternativet Usjunger samma regler för samma bilder. När Redigera bilder öppnas konfigurerar du: Uppgifter, Studieoch Protokolloch klickar på OK.
- Märk varje bild genom att klicka på ikonen Plats och skriv ett namn i slide-ID-cellen. Klicka på Skanna för att börja skanna.
OBS: När slotikonen blir blå och bilderna markeras med en blå pil har bäraren alla regler och är redo att skannas. Det går att spara bild-ID: n, studierna, protokollen och aktiviteterna genom att klicka på knappen Spara installation.
8. Analys
OBS: Protokollet nedan illustrerar metoden för fenotypanalys.
- Bildförberedelse
- Om du vill förbereda bilderna för analys öppnar du visningsprogrammet (se tabellen över material) och väljer Läs in bilder. Välj önskade skanningar för utbildningsprojektet till höger på skärmen.
- För varje genomsökning klickar du på Stämpeloch väljer Projekt i rutan Välj för: Definiera en stämpel med storlek 1 x 1 i bildfältet som ska användas senare som mall för utbildningsanalysen. Observera att denna stämpel kommer att markeras som en röd ruta.
OBS: Antalet stämpelanteckningar för projektet är godtyckligt. Det rekommenderas att generera en för den inneboende fluorescensskanningen och några fler som i allmänhet är representativa för signalfördelningen i vävnaden. - Slutligen öppnar du alla skanningar av experimentet. För var och en klickar du på Stämpel, och den här gången väljer du alternativet Batch i rutan Välj för: Placera en stämpel som omger varje explant.
OBS: Den här gången kommer frimärkena att markeras som gröna rutor och kommer att krävas när batchanalysen lanseras. Välj lämplig storlek för stämplarna (1 x 1, 2 x 2, 3 x 3) och undvik överlappning av stämplarna, vilket skulle generera duplicerade data i den exporterade filen.
- Utbildningsanalys
- Starta programvaran för analys (se tabellen över material) och skapa ett nytt projekt: Välj | Nya | Projekt.
- Skriv ett namn i rutan Projektnamn och konfigurera typen av projekt.
OBS: Experimenten utfördes med följande specifikationer: segmentering av träningsbara vävnader; adaptiv cellsegmentering; fenotypning. - Läs in skanningarna som innehåller stämplarna för utbildning: Arkiv | Öppna | Bild. Navigera genom bilderna i vyn med ett lägeoch välj skanningarna med inbyggd fluorescens.
- Klicka på knappen Autofluorescence (AF) och med autofluorescensväljarenritar du på en oförstörd del av vävnaden. Klicka på Förbered bilder så att programvaran kan subtrahera intensiteten av inneboende fluorescens från alla bilder som laddas upp för träning.
- Klicka på knappen Redigera markörer och färger och ange markörnamnen i rutan som är associerad med fluoroforen. Klicka på steget Segment tissue ovanpå skärmen för att öppna fönstret Vävnadssegmenteringsutbildning.
- I fönstret Vävnadskategorier skriver du in namnet på vävnadskategorierna för att segmentera bilderna i (t.ex. Tumör, Stroma, Bakgrund, Nekros).
- I fönstret Vävnadssegmenteringsutbildning klickar du på knappen Rita och ritar regioner runt grupper av celler för att definiera en vävnadskategori av intresse. Om du till exempel vill definiera ett tumörområde ritar du en region runt en grupp tumörceller. Växla till nästa kategori och upprepa ritningsprocessen.
Det rekommenderas att rita regioner i de flesta av de bilder som laddas upp för träning. Det är också möjligt att förfina utbildningen genom att redigera mönsterskalan och segmenteringsupplösningen vars detaljer beskrivs bättre i användarhandboken. - Efter att ha definierat träningsregionerna, fortsätt med Träna vävnadssegmenteraren.
OBS: Under träningsprocessen visar programvaran procentandelen noggrannhet av vävnadssegmentering. För optimala resultat rekommenderas att vävnadssegmentering är minst 90% exakt. När segmenteraren har stabiliserats klickar du på knappen Klar. - Klicka på knappen Segment alla om du vill visa masken För vävnadskategori på alla bilder.
- Efter att ha verifierat kvaliteten på vävnadssegmentering, rita om träningsregionerna runt de områden som var felaktigt klassificerade och träna om vävnadssegmenteraren tills processen är framgångsrik.
- Klicka på cellsegmenteringssteget i stegfältet högst upp i fönstret för att fortsätta med analysen.
- Välj de cellfack som ska segmentera: Nuclei, Cytoplasmaoch/eller Membrane.
OBS: Eftersom adaptiv cellsegmentering endast kan upptäcka celler med kärnsignal, avvälja inte Kärnor. Även om det också är möjligt att segmentera cytoplasma och/eller membran, rekommenderas att välja den starkaste, mest rikliga kärnkomponenten först (t.ex. DAPI). - Konfigurera kärnkomponenten med skjutreglaget Typisk intensitet för att justera tröskelvärdet som används för att identifiera nukleära pixlar. Notera förhandsgranskningsfönstret som öppnas och ger direkt feedback när tröskelvärdet justeras.
OBS: Detta tröskelvärde är adaptivt och mäts i förhållande till den omgivande bakgrunden. Öka detta värde om för mycket bakgrund upptäcks som nukleär. Sänk detta värde om svaga kärnor missas. Använd knappen Visa/dölj regioner för att blinka segmenteringsmaskerna på och av och kontrollera om rätt pixlar identifieras som nukleära. - Om du vill dela kluster av kärnpixlar använder du panelen Dela kärnkomponent. Välj den knapp som bäst beskriver färgningskvaliteten på kärnorna. Använd sedan skjutreglaget för att justera delningskänsligheten, med tanke på att lägre värden resulterar i mer delning.
- Klicka på knappen Segment alla för att segmentera alla bilder. Om resultatet inte är korrekt ändrar du inställningarna och tränar programvaran igen tills en tillfredsställande segmentering uppnås.
- Fortsätt till det sista steget i analysen: Fenotypning. På panelen Fenotyper lägger du till listan över fenotyper som ska upptäckas och skriver namnet i motsvarande textruta. Klicka på knappen Redigera fenotyper, välj en viss cell för att få upp en rullgardinsmeny och välj motsvarande fenotyp.
OBS: Minst fem celler för varje fenotyp är nödvändiga för att träna klassificeraren. Om du stänger av visualiseringen av atomkärnorna kan du bättre sevisualisering av den cellfenotyp som behöver tilldelas. - När valet för utbildning är klart klickar du på knappen Tågklassificerare.
OBS: Programvaran kommer att klassificera varje enskild cell i bilden, och när fel i klassificeringen inträffar är det möjligt att redigera cellernas fenotyp och upprepa träningen av klassificeraren. Spara projektet innan du fortsätter med batchanalysen och klicka på Export i verktygsfältet högst upp på skärmen. - Välj fliken Badanalys på den vänstra menyn och läs in projektet i rutan Batchalgoritm eller Projekt .
- Klicka på Exportalternativ för att skapa separata kataloger för varje bild och navigera med knappen Bläddra för att hitta den plats där du exporterar data. Klicka på alla alternativ för bilder och tabeller för export.
- Till höger på skärmen klickar du på Lägg till bilder och laddar alla bilder som innehåller stämplar för tidigare förberedda partier (steg 7.3). Klicka på knappen Kör för att starta batchanalysen och bearbeta en stämpel i taget och exportera motsvarande data.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Multispektral avbildning av mIF-färgade histologiska sektioner tillåter identifiering och fenotypning av enskilda cellpopulationer och identifiering av tumör- och strosala komponenter i explant TME(figur 2). Multispektral avbildning är särskilt användbart för analys av vävnader med hög inneboende autofluorescens, såsom vävnad med högt kollageninnehåll, eftersom det gör det möjligt att dekonvolutera autofluorescenssignalen från andra signaler och uteslutas från efterföljande analys. Efterföljande i silico vävnad och cell segmentering möjliggör kvantifiering av läkemedelssvar med en mängd utdata inklusive, men inte begränsat till, råa celltal (t.ex. procent positivitet), signalintensitet, cellstorlek, vävnadsområde och rumslig plats för enskilda celler.
Vävnad och cell segmentering är därför mycket användbara för kvantitativ analys av läkemedelsbehandling resultat och identifiering av tumör- och stromal-specifika svar. Till exempel tillåter färgning för Ki67 och cPARP tillsammans med en tumörmarkör kvantering av spridnings- respektive celldödsnivåer i explanter (figur 3). I det angivna exemplet är Ki67- och cPARP-nivåerna för stromal- och tumörregioner i PDE som svar på det antiprogrammerade celldödsproteinet 1 (PD-1) immunkontrollpunktshämmare (ICI), nivolumab. Dessutom tillåter förmågan att extrahera rumslig information från färgade sektioner beräkningen av intercellavstånd samt avstånd till tumörgränser och andra strukturer. Därför kan förändringar i cellulär distribution efter läkemedelsbehandling analyseras kvantitativt (figur 4). Exemplet som visas representerar PDE-behandling med nivolumab.
Figur 1: Arbetsflöde för generering och analys av PDEs. (A) Nyligen vidarebosatta mänskliga tumörprover bearbetas och ordnas på en genomsläpplig kulturinsatsskiva som flyter i odlingsmedium. b)Efter läkemedelsbehandlingen skördas explanterna, utsätts för FFPE och delas sedan upp för histologisk analys, t.ex. (C) mIF-färgning och skanning av vävnadssektionerna utförs för att generera multispektrala bilder från vilka enskilda signaler kan dekonvoluteras och analyseras separat. (D) Analys av sammansatta bilder möjliggör separation av tumör och stromal områden och bedömning av fenotyp av olika celltyper. Förkortningar: PDE = patient-härledd explant; FFPE = fast i formalin, inbäddad i paraffin; H&E = hematoxylin och eosin; mIF = multiplex immunofluorescens; HRP = pepparrotperoxidas; H2O2 = väteperoxid; Ab = antikropp; TSA = förstärkning av tyramidsignalen. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: Exempel på en mIF-betsad vävnadssektion. NSCLC explant vävnad färgades för markörer för cellens livskraft, nämligen cPARP (röd) och Ki67 (grön) samt en pan-cytokeratin markör (gul) och DAPI (blå) för att markera atomkärnor. Multispektral imaging utfördes för att dekonvolutera fluorescerande signaler och ta bort autofluorescens. Bilder visar 20x förstoring av det markerade fältet. Skalstänger = 50 μm. Förkortningar: mIF = multiplex immunofluorescens; NSCLC = icke-småcellig lungcancer; cPARP = klyvt poly-ADP ribose polymeras; CK = cytokeratin; DAPI = 4'-6-diamidino-2-fenylindole; AF = automatisk överströmning. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 3: Kvantifiering av celldöd och spridning i pdes. Exempel på box- och morrhårsdiagram som visar apoptosinduktion i NSCLC PDEs efter 24 h behandling med 5 μg/mL nivolumab jämfört med medelkontroll. Andelen spridning (Ki67) och procentandelen av apoptotisk celldöd (cPARP) händelser visas i tumörområdet respektive stroma. Varje punkt representerar en enda explant, rutans centrala linje representerar medianvärdet för fördelningen och sidorna av lådan (nederkant respektive överst) representerar den första respektive tredje kvartilen. Felstaplar representerar det interkvartila intervallet (längre än 1,5 x IQR). Förkortningar: PDE = patient-härledd explant; NSCLC = icke-småcellig lungcancer; cPARP = klyvt poly-ADP ribose polymeras; IQR = interquartile intervall. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 4: Rumslig organisation efter läkemedelsbehandling. (A) Representativa bilder som visar mIF-färgning av T-cellsmarkörer-CD4, FOXP3, CD8 (vänster panel)-utförd på en melanomexplant och motsvarande fenotypanalys (höger) som identifierar avstånd mellan CD8+ celler och Treg-celler (CD4+/FOXP3+). Skalstänger = 200 μm. (B) Histogram plot som visar ökat avstånd mellan cytotoxiska T-celler (CD8 +) och Treg-celler (CD4+/FOXP3+) efter behandling av melanom PDEs med 5 μg/ml nivolumab, vilket bekräftar effekterna på mål av IO-läkemedlet. Densitetsenheten uttrycks som antalet celler dividerat med summan av alla celler per bandbredd. Förkortningar: mIF = multiplex immunofluorescens; CD = differentieringskluster; FOXP3 = Gaffelhuvudruta P3; PDE = patient-härledd explant; NSCLC = icke-småcellig lungcancer; IO = immunoonkologi. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta dokument beskriver metoderna för produktion, läkemedelsbehandling och analys av PDEs och belyser fördelarna med plattformen som ett prekliniskt modellsystem. Ex vivo odling av en nyligen resected tumör, som inte innebär dess dekonstruktion, möjliggör bevarandet avtumörarkitekturen 13,24 och därmed de rumsliga interaktionerna mellan cellulära komponenter i TME samt intratumoral heterogenitet. Denna metod visar hur det genom att använda en tumörspecifik markör är möjligt att identifiera områden av tumörvävnad kontra områden av stroma och därför separera läkemedelssvar inom dessa avdelningar (figur 3). Dessutom kan flera biomarkörer profileras samtidigt för att bedöma till exempel immuncellernas rörelse på mål inom TME (figur 4).
En tidigare publikation dokumenterade tillämpningen av denna PDE-plattform på stratifiering av NSCLC PDEs för standardbehandling kemoterapi, cisplatin, visar att det är möjligt att separera kemoresistant från chemosensitive populationer24. Dessa PDE-relaterade resultat speglar patientens svar. Genom att följa de metoder som beskrivs här är det möjligt att genomföra liknande metoder för andra tumörtyper och med olika typer av läkemedel, kemoterapeutiska eller på annat sätt. Separationen av PDE i läkemedelskänsliga och läkemedelsresistenta populationer skapar en ovärderlig resurs för att generera ytterligare mekanistisk insikt i läkemedelsresistens. Till exempel, eftersom PDEs kan bearbetas för RNA, DNA, protein eller metabolitisolering, kan detta möjliggöra implementering av "omisk" teknik för att identifiera viktiga biomarkörer som är prediktiva för respons. Alternativt kan FFPE-sektioner som genereras från behandlade PDEs användas för omfattande rumslig profilering för att förstå hur olika celltyper i PDE bidrar till läkemedelsresistens.
Detta kan underlättas av ytterligare utveckling av multispektral avbildning och masscytometri närmar sig35,40,41,42,43, vilket skulle göra det möjligt att profilera hundratals biomarkörer samtidigt. Prekliniska modeller som utvärderar immunoterapeutisk effekt är mycket eftertraktade, och detta dokument visar att PDEs kan fylla denna kritiska nisch (figur 3 och figur 4). Monoklonala antikroppar riktade mot immunkontroller, såsom cytotoxiska T-lymfocytantigen 4 och PD-1/programmerad död ligand-1 (PD-L1), har utvecklats44,45,46,47 med några anmärkningsvärda förbättringar i den totala patientens överlevnad i ett stort antal solida tumörer jämfört med standard kemoterapi. ICI är dock effektiva hos ett begränsat antal patienter av skäl som inte är tydliga, vilket kräver identifiering av prediktiva biomarkörer48. Det enastående inslaget i pdes-bevara 3D arkitekturen av tumör vävnad-underlättar utvärderingen av ICI effekt (figur 3) och övervakning av immunceller som svar på ICI behandling(figur 4). PDE är således en idealisk plattform för att särskilja ICI-känsliga kontra ICI-resistenta fall och för att undersöka de mekanismer som ligger till grund för denna distinktion.
PDE-tekniken lider av några nackdelar. Genereringen av exakta, experimentella resultat från PDEs förlitar sig på tumör integritet, och ibland är tumör prover efter kirurgi för nekrotiska för att bearbeta för PDEs. Dessutom, trots några specifika exempel på retention av vävnad integritet efter långvarig kultur25, för de flesta rapporterade fall, integritet och livskraft har förlorats efter 72 h i kultur, och vävnad sönderfall uppstår. Tidsfönstret för att utföra läkemedelsexperiment är därför relativt begränsat, vilket förbjuder användningen av denna modell för studier av mekanismerna för förvärvad läkemedelsresistens eller studien av invasion och metastasering13. En utvidgning av explanternas livskraft kan bli möjlig i framtiden genom utveckling av ny teknik, såsom byggnadsställningar och perfunderade kanaler, som kan underlätta spridning och upptag av näringsämnen, vilket möjliggör en mer utvidgad kultur.
Till dess att dessa förbättringar kan göras bör dock PDE-plattformen betraktas som en kortsiktig kulturmetod som kan ge omedelbara uppgifter om läkemedelssvar. Det bör användas tillsammans med andra modellsystem, såsom organoider och PDX-modeller, som kan ge långsiktiga läkemedelssvarsdata. Sammantaget är PDE-plattformen ett proof-of-concept prekliniskt modellsystem som är till nytta för att bestämma känsligheten hos en patients tumör för ett givet cancermedel, för att härleda insikt i mekanismer för läkemedelsverkan i en riktig tumör och för att utveckla prediktiva och farmakodynamiska biomarkörer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inget att avslöja
Acknowledgments
Vi tackar kirurgerna och patologerna på universitetssjukhusen i Leicester NHS Trust för att tillhandahålla kirurgisk resected tumör vävnad. Vi tackar också histologianläggningen inom Core Biotechnology Services för hjälp med vävnadsbearbetning och sektionering av FFPE-vävnadsblock och Kees Straatman för stöd med användning av Vectra Polaris. Denna forskning stöddes och finansierades av Explant Consortium bestående av fyra partners: University of Leicester, MRC Toxicology Unit, Cancer Research UK Therapeutic Discovery Laboratories och LifeArc. Ytterligare stöd gavs av CRUK-NIHR Leicester Experimental Cancer Medicine Centre (C10604/A25151). Finansiering för GM, CD och NA tillhandahölls av Breast Cancer Now's Catalyst Programme (2017NOVPCC1066), som stöds av finansiering från Pfizer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Sigma | 320099 | Staining reagent |
| Antibody Diluent / Block, 1x | Perkin Elmer | ARD1001EA | Antibody diluent/blocking buffer |
| Barnstead NANOpure Diamond | Barnstead | Ultra Pure (UP) H2O machine | |
| Citric Acid Monohydrate | Sigma-Aldrich | C7129 | Reagent for citrate buffer |
| Costar Multiple Well Cell Culture Plates | Corning Incorporated | 3516 | 6 multiwell plate |
| DAPI Dilactate | Life Technologies | D3571 | |
| 100 x 17 mm Dish, Nunclon Delta | ThermoFisher Scientific | 150350 | 100 mm diameter dish for tissue culture |
| DMEM (1x) Dubelcco's Modified Eagle Medium + 4.5 g/L D-Glucose + 110 mg/mL Sodium Pyruvate | Gibco (Life Technologies) | 10569-010 | Tissue culture medium (500 mL) |
| DPX mountant | VWR | 360294H | Mounting medium |
| DPX mountant | Merck | 6522 | Mounting medium |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | 3609 | Reagent for TE buffer |
| Eosin | CellPath | RBC-0100-00A | Staining reagent |
| Foetal Bovine Serum | Gibco | 10500-064 | For use in tissue culture medium |
| 37% Formaldehyde | Fisher (Acros) | 119690010 | 10% Formalin |
| iGenix, microwave oven IG2095 | iGenix | IG2095 | Microwave used for antigen retreival |
| Industrial methylated spirit (IMS) | Genta Medical | 199050 | 99% Industrial Denatured Alcohol (IDA) |
| InForm Advanced Image Analysis Software | Akoya Biosciences | InForm | |
| Leica ASP3000 Tissue Processor | Leica Biosystems | Automated Vacuum Tissue Processor | |
| Leica Arcadia H and C | Leica Biosystems | Embedding wax bath | |
| Leica RM2125RT | Leica Biosystems | Rotary microtome | |
| Leica ST4040 Linear Stainer | Leica Biosystems | H&E stainer | |
| Mayer's Haematoxylin | Sigma | GHS132-1L | Staining reagent |
| Millicell Cell Culture Inserts, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | Merck Milipore | PICMORG50 | Organotypic culture insert disc |
| Novolink Polymer Detection System | Leica Biosystems | RE7150-K | DAB staining kit |
| OPAL 480 | Akoya Biosciences | FP1500001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 520 | Akoya Biosciences | FP1487001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 570 | Akoya Biosciences | FP1488001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 620 | Akoya Biosciences | FP1495001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 650 | Akoya Biosciences | FP1496001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 690 | Akoya Biosciences | FP1497001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 780 / OPAL TSA-DIG Reagent | Akoya Biosciences | FP1501001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent and TSA-DIG reagent |
| Opal Polymer HRP Ms Plus Rb, 1x | Perkin Elmer | ARH1001EA | HRP polymer |
| Penicillin/streptomycin solution | Fisher Scientific | 11548876 | For use in tissue culture medium |
| PhenoChart Whole Slide Contextual Viewer | Akoya Biosciences | PhenoChart | Viewer software for scanned images |
| Phosphate Buffered Saline Tablets | Thermo Scientific Oxoid | BR0014G | PBS |
| 1x Plus Amplification Diluent | Perkin Elmer | FP1498 | Fluorophore diluent |
| Prolong Diamond Antifade Mountant | Invitrogen | P36961 | Mounting medium |
| Slide Carrier | Perkin Elmer | To load slides into Slide Carrier Hotel for scanning with Vectra Polaris | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S/3160/63 | 10% Formalin |
| Sodium Hydroxide pellets | Fisher Scientific | S/4920/53 | Reagent for citrate buffer |
| Tenatex Toughened Wax - Pink (500 g) | KEMDENT | 1-601 | Dental wax surface |
| Thermo Scientific Shandon Sequenza Slide Rack for Immunostaining Center | Fisher Scientific | 10098889 | Holder for slides and slide clips |
| Thermo Scientific Shandon Plastic Coverplates | Fisher Scientific | 11927774 | Slide clips |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Sigma-Aldrich | 252859 | Reagent for TE buffer |
| VectaShield | Vecta Laboratories | H-1000-10 | Mounting medium |
| Vectra Polaris Slide Scanner | Perkin Elmer | Vectra Polaris | Slide scanner |
| Xylene | Genta Medical | XYL050 | De-waxing agent |
References
- Gerlinger, M., et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. The New England Journal of Medicine. 366 (10), 883-892 (2012).
- Jamal-Hanjani, M., et al. Tracking the evolution of non-small-cell lung cancer. The New England Journal of Medicine. 376 (22), 2109-2121 (2017).
- McGranahan, N., Swanton, C. Biological and therapeutic impact of intratumor heterogeneity in cancer evolution. Cancer Cell. 27 (1), 15-26 (2015).
- Casey, T., et al. Molecular signatures suggest a major role for stromal cells in development of invasive breast cancer. Breast Cancer Research and Treatment. 114 (1), 47-62 (2009).
- Gerdes, M. J., et al. Emerging understanding of multiscale tumor heterogeneity. Frontiers in Oncology. 4, 366 (2014).
- Komohara, Y., Takeya, M. CAFs and TAMs: maestros of the tumour microenvironment. The Journal of Pathology. 241 (3), 313-315 (2017).
- Miyake, M., et al. CXCL1-mediated interaction of cancer cells with tumor-associated macrophages and cancer-associated fibroblasts promotes tumor progression in human bladder cancer. Neoplasia. 18 (10), 636-646 (2016).
- Hisamitsu, S., et al. Interaction between cancer cells and cancer-associated fibroblasts after cisplatin treatment promotes cancer cell regrowth. Human Cell. 32 (4), 453-464 (2019).
- Witz, I. P. The tumor microenvironment: the making of a paradigm. Cancer Microenvironment. 2, Suppl 1 9-17 (2009).
- Fu, X. T., et al. Tumor-associated macrophages modulate resistance to oxaliplatin via inducing autophagy in hepatocellular carcinoma. Cancer Cell International. 19, 71 (2019).
- Chen, D., Zhang, X. Tipping tumor microenvironment against drug resistance. Journal of Oncology Translational Research. 1 (1), 106 (2015).
- Roma-Rodrigues, C., Mendes, R., Baptista, P. V., Fernandes, A. R. Targeting tumor microenvironment for cancer therapy. International Journal of Molecular Sciences. 20 (4), 840 (2019).
- Powley, I. R., et al. Patient-derived explants (PDEs) as a powerful preclinical platform for anti-cancer drug and biomarker discovery. British Journal of Cancer. 122 (6), 735-744 (2020).
- Freeman, A. E., Hoffman, R. M. In vivo-like growth of human tumors in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 83 (8), 2694-2698 (1986).
- Vescio, R., et al. A. al. In vivo-like drug responses of human tumors growing in three-dimensional gel-supported primary culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 84 (14), 5029-5033 (1987).
- Hoffman, R. M. 3D Sponge-matrix histoculture: an overview. Methods in Molecular Biology. 1760, 11-17 (2018).
- Vescio, R. A., Connors, K. M., Kubota, T., Hoffman, R. M. Correlation of histology and drug response of human tumors grown in native-state three-dimensional histoculture and in nude mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 88 (12), 5163-5166 (1991).
- Furukawa, T., Kubota, T., Hoffman, R. M. Clinical applications of the histoculture drug response assay. Clinical Cancer Research. 1 (3), 305-311 (1995).
- Centenera, M. M., Raj, G. V., Knudsen, K. E., Tilley, W. D., Butler, L. M. Ex vivo culture of human prostate tissue and drug development. Nature Reviews Urology. 10 (8), 483-487 (2013).
- Centenera, M. M., et al. Evidence for efficacy of new Hsp90 inhibitors revealed by ex vivo culture of human prostate tumors. Clinical Cancer Research. 18 (13), 3562-3570 (2012).
- Dean, J. L., et al. Therapeutic response to CDK4/6 inhibition in breast cancer defined by ex vivo analyses of human tumors. Cell Cycle. 11 (14), 2756-2761 (2012).
- Majumder, B., et al. Predicting clinical response to anticancer drugs using an ex vivo platform that captures tumour heterogeneity. Nature Communications. 6, 6169 (2015).
- Goldman, A., et al. Temporally sequenced anticancer drugs overcome adaptive resistance by targeting a vulnerable chemotherapy-induced phenotypic transition. Nature Communications. 6, 6139 (2015).
- Karekla, E., et al. Ex vivo explant cultures of non-small cell lung carcinoma enable evaluation of primary tumor responses to anticancer therapy. Cancer Research. 77 (8), 2029-2039 (2017).
- Ricciardelli, C., et al. Novel ex vivo ovarian cancer tissue explant assay for prediction of chemosensitivity and response to novel therapeutics. Cancer Letters. 421, 51-58 (2018).
- Yoshimasu, T., et al. Histoculture drug response assay (HDRA) guided induction concurrent chemoradiotherapy for mediastinal node-positive non-small cell lung cancer. Gan To Kagaku Ryoho. Cancer and chemotherapy. 30 (2), 231-235 (2003).
- Pirnia, F., et al. Ex vivo assessment of chemotherapy-induced apoptosis and associated molecular changes in patient tumor samples. Anticancer Research. 26, 1765-1772 (2006).
- Maund, S. L., Nolley, R., Peehl, D. M. Optimization and comprehensive characterization of a faithful tissue culture model of the benign and malignant human prostate. Laboratory Investigation. 94 (2), 208-221 (2014).
- Vasaturo, A., Galon, J. Multiplexed immunohistochemistry for immune cell phenotyping, quantification and spatial distribution in situ. Methods in Enzymology. 635, 51-66 (2020).
- Fuhrman, K., et al. Molecularly guided digital spatial profiling for multiplexed analysis of gene expression with spatial and single cell resolution. Journal of Biomolecular Techniques. 31, 14-15 (2020).
- Twiddy, D., et al. A TRAIL-R1-specific ligand in combination with doxorubicin selectively targets primary breast tumour cells for apoptosis. Breast Cancer Research. 12 (1), 58 (2010).
- Cai, H., et al. Cancer chemoprevention: Evidence of a nonlinear dose response for the protective effects of resveratrol in humans and mice. Science Translational Medicine. 7 (298), (2015).
- Busacca, S., et al. Resistance to HSP90 inhibition involving loss of MCL1 addiction. Oncogene. 35 (12), 1483-1492 (2016).
- Kolluri, K. K., et al. Loss of functional BAP1 augments sensitivity to TRAIL in cancer cells. Elife. 7, 30224 (2018).
- Toki, M. I., et al. High-plex predictive marker discovery for melanoma immunotherapy-treated patients using digital spatial profiling. Clinical Cancer Research. 25 (18), 5503-5512 (2019).
- Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).
- Park, I. J., et al. Prediction of radio-responsiveness with immune-profiling in patients with rectal cancer. Oncotarget. 8 (45), 79793-79802 (2017).
- Mezheyeuski, A., et al. Multispectral imaging for quantitative and compartment-specific immune infiltrates reveals distinct immune profiles that classify lung cancer patients. The Journal of Pathology. 244 (4), 421-431 (2018).
- Kather, J. N., et al. Topography of cancer-associated immune cells in human solid tumors. Elife. 7, 36967 (2018).
- Zollinger, D. R., Lingle, S. E., Sorg, K., Beechem, J. M., Merritt, C. R. GeoMx™ RNA assay: high multiplex, digital, spatial analysis of RNA in FFPE tissue. Methods in Molecular Biology. 2148, 331-345 (2020).
- Zugazagoitia, J., et al. Biomarkers associated with beneficial PD-1 checkpoint blockade in non-small cell lung cancer (NSCLC) identified using high-plex digital spatial profiling. Clinical Cancer Research. 26 (16), 4360-4368 (2020).
- Allo, B., Lou, X., Bouzekri, A., Ornatsky, O. Clickable and high-sensitivity metal-containing tags for mass cytometry. Bioconjugate Chemistry. 29 (6), 2028-2038 (2018).
- Gerdtsson, E., et al. Multiplex protein detection on circulating tumor cells from liquid biopsies using imaging mass cytometry. Convergent Science Physical Oncology. 4 (1), 015002 (2018).
- Reck, M., et al. Pembrolizumab versus chemotherapy for PD-L1-positive non-small-cell lung cancer. The New England Journal of Medicine. 375 (19), 1823-1833 (2016).
- Le, D. T., et al. KEYNOTE-164: Phase 2 study of pembrolizumab for patients with previously treated, microsatellite instability-high advanced colorectal carcinoma. Journal of Clinical Oncology. 34, 15_suppl 3631 (2016).
- Diaz, L. A., et al. KEYNOTE-177: Randomized phase III study of pembrolizumab versus investigator-choice chemotherapy for mismatch repair-deficient or microsatellite instability-high metastatic colorectal carcinoma. Journal of Clinical Oncology. 35, 4_suppl 815 (2017).
- Long, G. V., et al. Impact of baseline serum lactate dehydrogenase concentration on the efficacy of pembrolizumab and ipilimumab in patients with advanced melanoma: data from KEYNOTE-006. European Journal of Cancer. 72, 122-123 (2017).
- Voong, K. R., Feliciano, J., Becker, D., Levy, B. Beyond PD-L1 testing-emerging biomarkers for immunotherapy in non-small cell lung cancer. Annals of Translational Medicine. 5 (18), 376 (2017).
