Summary
本論文では、患者に関連する生きた前臨床モデルシステムにおける腫瘍薬物反応を評価するための患者由来外植物の生成、薬物治療、分析の方法について説明する。
Abstract
薬剤耐性の理解と高耐性癌を感作するための新しい戦略の開発は、患者の応答を正確に予測できる適切な前臨床モデルの入手可能性に依存しています。既存の前臨床モデルの欠点の1つは、ヒト腫瘍微小環境(TME)を文脈的に保存し、腫瘍内不均一性を正確に表す能力ができないことであり、したがって、データの臨床翻訳を制限する。対照的に、ヒト腫瘍の生きた断片の培養を表すことによって、患者由来の外植(PDE)プラットフォームは、元の腫瘍の病理学的および構造的特徴を可能な限り密接に反映する3次元(3D)コンテキストで薬物応答を検査することを可能にする。PdEsを用いた以前の報告では、化学抵抗性腫瘍と化学感受性を区別するプラットフォームの能力が文書化されており、この分離は同じ化学療法に対する患者の応答を予測することが示されている。同時に、PEは、薬物応答を予測する腫瘍の分子、遺伝的、および組織学的特徴を問い合う機会を可能にし、それによって患者の階層化のためのバイオマーカーおよび耐性腫瘍を感作するための新しい介入アプローチを同定する。本論文では、患者サンプルの収集からエンドポイント分析まで、PDEの方法論を詳細に報告する。それは、必要に応じて、特定の腫瘍のオーダーメイド条件を強調し、外植派生と培養方法の詳細な説明を提供します。エンドポイント解析では、腫瘍領域と間質領域の両方で主要なバイオマーカーの空間プロファイリングを行う多重化免疫蛍光とマルチスペクトルイメージングに焦点を当てています。これらの方法を組み合わせることで、様々な臨床病理学的パラメータに関連し、バイオマーカー同定に使用される可能性のある定量的および定性的な薬物応答データを生成することができる。
Introduction
効果的で安全な抗癌剤の開発には、予測および薬力学的バイオマーカーの同定を促進できる作用機序に関する洞察を提供できる適切な前臨床モデルが必要です。腫瘍間ヘテロジニティー1、2、3、4、5、TME 6、7、8、9、10、11、12は抗癌剤反応に影響を与える知られており、細胞株、オルガノイド、マウスモデルなどの多くの既存の前臨床癌モデルは、これらの重要な重要な特性を十分に収容できない顔立ち。「理想的な」モデルは、腫瘍内の非悪性細胞との悪性細胞の複雑な空間相互作用を再現し、腫瘍内の地域差を反映することができるモデルです。この記事では、これらの要件の多くを満たすことができる新しいプラットフォームとして、PE に焦点を当てています13.
ヒトPDEの使用の最初の例は、組織培養とも呼ばれ、ホフマンらが切除したばかりのヒト腫瘍のスライスを生成し、コラーゲンマトリックス14、15で培養した1980年代後半にさかのぼる。これには、組織アーキテクチャを保存する3D培養システムを確立し、TME内の間質成分および細胞相互作用の維持を保証する。元の腫瘍を分解することなく、Hoffman et al.16は翻訳研究の新しいアプローチを告げ、この時以来、多くのグループは、組織の完全性を維持し、正確な薬物応答データ17、18、19、20、21、22、23、24を生成することを目的として、異なる外植法を最適化してきましたプロトコル間の違いは明らかですが、試験体らはゼラチンスポンジの外植を培養し、標本20、21、25を通して栄養素や薬物の拡散を助けるのに対し、Majumderらは同じ患者由来の自家血清の存在下で腫瘍および間質タンパク質で構成されるマトリックスの上に外植物を培養することによって腫瘍生態系を作り出した。 23.
さらに最近では、我々のグループは、2〜3mm3サイズの部分に腫瘍の断片化によって外植物を生成するプロトコルを設定し、培養システム24の空気液体界面で透過性膜に追加の成分を置かずに配置する。これらの多数の研究を組み合わせることで、PEは、元の腫瘍の空間的アーキテクチャと地域の不均一性を保持するヒト腫瘍の無傷の生きた断片の培養を可能にすることが実証されている。オリジナルの実験では、 外植または組織培養は、通常、薬物治療に従ってホモジナイゼーションを行い、その後、組織培養薬応答アッセイ20、21、MTT(3-(6)-2、5-ジフェニルテトラゾリウムブロマイド)アッセイ、乳酸デヒドロゲン酵素アッセイ、またはレサズラジン-27ベースのサンプルに様々な生存率アッセイを適用した。.エンドポイント解析技術、特にデジタル病理の最近の進歩は、現在、外植29、30で行うことができるエンドポイントテストとアッセイのレパートリーを拡大しています。これらの新しい技術を応用するために、外植はホルマリンに固定され、パラフィン(FFPE)に埋め込まれ、免疫染色技術を用いて分析され、空間プロファイリングが可能になります。このアプローチの例は、非小細胞肺癌(NSCLC)、乳癌、大腸癌、および中皮腫外植物について文書化されており、それによって増殖マーカー、Ki67、およびアポトーシスマーカー、切断ポリADPリボーゼポリメラーゼ(cPARP)は、細胞増殖および死の変化を監視するために使用された。
多重化された免疫蛍光は、エンドポイント35での外植における薬物応答の空間プロファイリングに特に適している。例えば、薬物治療13、36、37、38のTME内で、マクロファージやT細胞などの特定のクラスの免疫細胞の再局在化と空間分布を測定し、治療剤が「冷たい腫瘍」から「ホット腫瘍」39への移行を支持できるかどうかを調べることができます。 .近年、このグループは、異なる腫瘍タイプ(NSCLC、腎癌、乳癌、大腸癌、黒色腫)からのPEの誘導と、化学療法、低分子阻害剤、免疫チェックポイント阻害剤(ICI)を含む様々な抗癌剤の試験に焦点を当てています。エンドポイント分析方法は、TMEの異なる構成要素のバイオマーカーと同様に、生存可能性のためのバイオマーカーの空間プロファイリングを可能にする多重化された免疫蛍光を含むように最適化されています。
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Protocol
1. 組織の収集
- 手術後、切除されたばかりのヒト腫瘍標本を、25mLの新鮮な培養培地(4.5 g/LグルコースおよびL-グルタミン+1%(v/v)胎児の子牛血清+1%ペニシリン-レンサマイシンを添加した改変イーグル培地を含むチューブに移し、氷の上に貯蔵する。無菌クラスIIフードで手術の2時間以内に外植を処理します。
2. Explant製剤
- 70%の産業メチル化精神(IMS)溶液ですべての外科用機器(移植片の刃/歯科ワックス表面/ピンセット)をきれいにしなさい。
- 10cmの培養皿( 材料表参照)に約25mLの新鮮な培地を充填し、氷のベッドの上に置きます。
- ピンセットを使用して、試料を歯科ワックス表面に移し(材料表を参照)、2つの皮膚移植片ブレードを使用して組織を約2〜3mm3の断片にスライスします。
注: 最適なパフォーマンスを得るために、組織をスライスして 2 ~ 3 mm の厚さの個々のストリップを取得し、長さに沿ってストリップを切断して最終的な外植体を得ます。全体の標本が切れるまでプロセスを繰り返します。 - 10cm皿の氷冷培地に速やかに外植を移します。外植体の割合(6~9個)を取り、非緩衝ホルマリン溶液の10%を含む1mLチューブに入れ、室温(RT)で24時間放置します。
注: これらのフラグメントは、「未培養」状態のコントロールの外植を表します。 - 6ウェルプレートの望ましい数のウェルを井戸あたり1.5mLの新鮮な培地で満たし、各ウェルにorganotypic培養インサートディスク( 材料表を参照)を入れ、媒体の上に浮かぶようにし、メディア挿入インターフェースで気泡を慎重に避けます。
- 外植をランダムに選択し、挿入ディスクの上に一度に 1 つずつ配置します。「未培養」状態と一致するためには、井戸ごとに6~9個の外植を使用してください。マルチウェルプレートをCO2インキュベーターの37°Cと5%CO2に入れ、16時間回収します。
注:ティッシュを押しつぶすことを避けるために、ピンセットの穏やかな取扱いが強く推奨される。
3. 薬物治療
- 16時間後、新しい6ウェルプレートを取り、各ウェルに新鮮な培地の1.5mLを追加し、所望の濃度で関連する薬物を追加し、車両制御のためのウェルを含む。ピンセットを使用して、外植を含む各インサートを、薬物を含む新しく調製された6ウェルプレートに移動します。プレートをCO2インキュベーターの37°C、5%CO2(24~48時間)に置きます。
- 以前ホルマリンに固定されていた未培養の外植物を占頭カセット(下記のセクション4を参照)に移し、実験の終わりまで70%IMSに保管する。
4. 組織学的処理
- 組織固定
- 薬物治療後、外植を含む挿入ディスクを10%ホルマリンを含む新しい6ウェルプレートに移し、10%ホルマリンを外植の上部に数滴加えて固定液で完全なカバレッジを確保します。
注意:ホルマリンは危険です。皮膚との接触を避け、吸入を防ぐために煙の食べ物の中でそれを処理します。 - 10%ホルマリンで一晩(20〜24時間)外植を残します。
- 翌日、関連する数の小さなヒストロジースポンジを70%IMSに浸し、それらを占めるカセットの中に入れてください。与えられた薬物治療条件から1つのスポンジに、すべての外植物を穏やかに移す(外植の側面が挿入ディスクに接触し、したがって薬物処理領域がスポンジに接触するように、外植の向きを維持する)。外植の上に別のあらかじめ浸したスポンジを置き、神学のカセット(ウェル/トリートメントごとに1カセット)内に固定します。
- 70% IMS にカセットを沈め、RT で 24 時間放置します。
- 薬物治療後、外植を含む挿入ディスクを10%ホルマリンを含む新しい6ウェルプレートに移し、10%ホルマリンを外植の上部に数滴加えて固定液で完全なカバレッジを確保します。
- パラフィン埋め込みと組織切片
- 翌日、外植を含む組織学的カセットを組織処理装置のサンプルバスケットに移し( 材料表を参照)、蓋を固定します。バスケットをレトルトに入れ、そっと閉じます。目的のプログラムを選択し、プロセッサを起動します。レトルトを水切りし、バスケットを取り除くために開き、バスケットを埋め込みセンターワックスバスに移します。
- 埋め込んだ後、金属カセットの蓋をバスケットに移し、洗浄プログラム用のティッシュプロセッサのレトルトに戻します。乾燥したティッシュでセンサーを拭き取り、レトルトの蓋から余分なワックスを取り除き、クリーニングプログラムを進めます。
- ロータリーミクロトームにパラフィンブロックを置き、4μmでいくつかのセクションを切り、ブロックを氷に戻します。ブロックの位置を変更し、さらに4 μmのセクションを切ります。小さなペイントブラシと鉗子でセクションを水浴に移し、折り目や泡を取り除きます。
- 切片を顕微鏡スライドの上に中央に置き、スライドを数分間排水し、スライドラックに入れて37°Cのインキュベーターで一晩乾燥させます。 セクションが乾燥したら、ほこりから保護するために、スライドフォルダまたはボックスにRTでそれらを保存します。
5. ヘマトキシリンとエオシン(H&E)染色
- 染色剤( 材料表を参照)に試薬を充填し、H&E染色に必要なプログラムを設定します:ヘマトキシリンインキュベーション時間:5分。エオジンインキュベーション時間:3分
- スライドラックをキャリアに取り付け、最初の容器にxyleneを入れ、プログラムを開始します。スライドキャリアをラックから取り外し、スライドラック付きのコンテナを取り付けエリアに持って行きます。
- 抽出フードの下にジブチルフタレートキシレン(DPX)でスライドをマウントします。各カバースリップにDPXを置き、スライドをセクションを下に置いてカバースリップに下げ、DPXが広がるようにします。
注: DPX は危険です。皮膚との接触を避け、指定されたヒュームフードで使用してください。
6. 免疫染色
注: 特に明記されていない限り、RTで以下の手順を実行する必要があります。
- 脱パラフィンと水分補給
- スライドラックにスライドを入れ、65°Cで10分間加熱してから、3分間(2x)のキシレンで切り離します。持ち越し溶液の量を最小限に抑えます。
注:キシレンは可燃性、危険、刺激性です。二重層手袋を使用しながら、ヒュームフードの内側にハンドル。皮膚と目の接触を避けてください。密閉容器内の廃棄物を処分する。 - 1 分間(2x)の場合は 99% の IMS、1 分間の 95% IMS の場合は、アルコール勾配でスライドを水分補給します。持ち越し溶液の量を最小限に抑えます。
注: IMS は、非常に可燃性、揮発性、および刺激性があります。ヒュームフードの内側を取り扱い、皮膚と目の接触を避けてください。 - スライドラックを超純度(UP)水に5分間完全に沈めます。
- スライドラックにスライドを入れ、65°Cで10分間加熱してから、3分間(2x)のキシレンで切り離します。持ち越し溶液の量を最小限に抑えます。
- 抗原検索
- 使用する特定の抗体に関するメーカーのガイドラインに従って、抗原検索バッファーを準備します。
注:クエン酸緩衝液0.2M、pH6、または トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(トリス)-エチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)0.1M、pH9、それぞれ酸性またはアルカリ性条件に使用される一般的な緩衝液である。クエン酸一水和物およびトリスは刺激剤である。ヒュームフード内のすべてのストックソリューションを準備します。皮膚や目との接触を避けてください。 - スライドを含むラックを抗原検索バッファーに、マイクロ波 ( 材料表を参照) をフルパワー (800 W) で 20 分間水没します。
注: プロセス全体の間、スライドをバッファーに完全に沈めておきます。バッファーのボリュームが過度に減少しないように、使用する容器の上に蓋を置きます。
- 使用する特定の抗体に関するメーカーのガイドラインに従って、抗原検索バッファーを準備します。
- 多重免疫蛍光(mIF)
注: この処理には 1 ~ 2 日かかります。- 250 mLのUP水で清潔な容器を充填し、スライドラックを2分(2x)に完全に浸します。スライドカバープレートに各スライドを組み立てるに進みます( 資料表を参照)。
- スライドをカバープレートに組み立てるには、グラストラフを水で準備します。カバープレートとスライドの両方を水中に沈め、カバープレートに向けて組織セクション側を配置します。
- カバープレートの下部にある突起部の上にスライドの下端を配置し、最後にスライドをカバープレートに合わせて、空気が閉じ込められずに間の隙間を埋めることができます。カバープレートを持ち、一緒にスライドし、カバープレートラックに入れてください。
- カバープレートにリン酸緩衝生理食塩分(PBS)を充填し、バッファがスライドを洗浄し、重力(2x)で流れ出るのを待ちます。各カバープレートに110 μLのブロッキングバッファ( 材料表を参照)をパイプし、10分間インキュベートします。
- メーカーの推奨に従ってPBSまたはブロッキングバッファーに所望の一次抗体希釈を準備します。スライドを一次抗体(各スライド110 μL)で30分間インキュベートします。6.3.2で説明したように、PBS(2x)の5 mLでスライドを洗浄します。
- 110 μLの西洋ワサビペルオキシダーゼポリマーでスライドを30分間インキュベートします。6.3.2で説明したように、PBS(2x)の5 mLでスライドを洗浄します。
- 増幅希釈液1:100(v/v)でフルオロフォア希釈を調製し、10分間フルオロフォア(各スライド110μL)でスライドをインキュベートします。6.3.2で説明したように、PBS(2x)の5 mLでスライドを洗浄します。
メモ:フルオロフォア780の使用については、メーカーのガイドラインに従ってください。スライドがPBSの最終洗浄でインキュベートされ、一晩4°Cで保存された場合、実験はここで一時停止することができます。 - カバープレートからスライドを外し、抗原検索ステップに戻り、別の抗体で染色を開始します。テストする抗体の所望の数に対して染色を繰り返します。
- 最後のフルオロフォアのステップ6.3.5に続いて、カバープレートにスライドを保持し、4'-6-ジミディノ-2-フェニリンドール(DAPI)の6 μM溶液をUP水で希釈し、スライドを5分間(110 μLずつ)に逆流させます。上水(2x)でスライドを洗浄し、スライドの端を乾燥させて余分な水を除去します。取り付け媒体を使用してスライド上のカバーリップを組み立て、暗闇の中でRTで保存します。
- 250 mLのUP水で清潔な容器を充填し、スライドラックを2分(2x)に完全に浸します。スライドカバープレートに各スライドを組み立てるに進みます( 資料表を参照)。
7. スキャン
メモ:スライドスキャンは、マルチスペクトル自動イメージングシステムを使用して実行しました( 資料表を参照)。
- スライドをキャリアに組み込み、希望の順序でスキャナーにロードします。
注:免疫染色の際にフルオロフォアやDAPIを使用しないコントロールスライドを含めればおすすめです。このスライドは、組織の内在性蛍光(自己蛍光(AF))の制御として使用されます。 - スライド スキャナー ソフトウェアを起動したら、ホームページから[プロトコルの編集] を選択します。名前、イメージングモード、実行するマルチスペクトルスキャンの種類(4~7チャンネル)、およびスタディ(ディレクトリ)をアドレス指定する新しいプロトコルを作成します。
注: 分析されたバンドのデフォルト設定を変更するには、スキャンバンドを選択する機能を使用して、目的のフィルタを選択/選択解除 します。 - スキャン露出と負荷キャリアを続行し、最後にプロトコルの設定用のキャリアを選択します。[概要を取る]を選択して、スライド上の組織を検出します。キャリアに表示されるスライドを選択し、赤いカーソルを持つ組織の特定の領域を選択して、画面の左側のウィンドウでライブ ビューにします。
- DAPI フィルタを選択し、[オートフォーカス] をクリックするか、[ステージの高さ] スライダを手動で調整して対象フィールドにフォーカスを設定します。[自動公開]をクリックして、システムがそのフィルタ/バンドに最適な露出を見つけられるようにします。
注: 各フィルタの露出時間は 12 ミリ秒に設定されています。システムを自動公開した後、露出時間をより良い見積もりに調整します。また、ハイライトされたセルに手動で値を入力して、自動露出の値をオーバーライドすることもできます。 - プロトコル内のすべてのフィルタについて、上記の手順を繰り返します。必要に応じて、場所やスライドを変更して、露出を設定するための最良の信号を見つけます。
注:ライブビューで組織が赤色でハイライト表示されている場合、分析されたフィルタの蛍光シグナルは飽和状態になり、自動露出を繰り返す必要があります。 - 露出設定が確立されたら、[ 戻る ] ボタンをクリックし、プロトコルを 保存 します。ソフトウェアのホーム ページ (「 資料の表」を参照) で、[ スライドのスキャン] を選択します。
- スキャンするすべてのキャリアを スライドキャリアホテルに積み重ね、スライドの順序をメモして、ID をシステムに割り当てます。
注:ソフトウェア画面では、各キャリアは4枚のスライドを含むスロットに関連付けられています。 - 複数のスライドを同じパラメータで構成するには、[タスクの構成] をクリックし、 Uが同じスライドに対して同じルールを設定するオプションを使用して 1 つ以上のスロットを選択します。[スライドの編集]が開いたら、[タスク]、[スタディ]、[プロトコル] を構成し、[OK]をクリックします。
- [スロット] アイコンをクリックして各スライドにラベルを付け、[スライド ID]セルに名前を入力します。スキャンを開始するには、[スキャン] をクリックします。
注: スロット アイコンが青色に変わり、スライドが青い矢印でマークされると、キャリアはすべてのルールを持ち、スキャンする準備が整います。[セットアップの保存] ボタンをクリックすると、スライド ID、研究、プロトコル、およびタスクを 保存 できます。
8. 分析
注: 以下のプロトコルは、表現型解析の方法を示しています。
- 画像準備
- イメージを解析用に準備するには、ビューア ソフトウェアを開き ( 表を参照)、[ スライドのロード] を選択します。画面右側のトレーニングプロジェクトに対して、目的のスキャンを選択します。
- 各スキャンに対して [スタンプ] をクリックし、[選択対象:画像フィールドでサイズ 1 x 1 のスタンプを定義する] ボックスで [プロジェクト] を選択し、後でトレーニング分析のテンプレートとして使用します。このスタンプは赤い四角としてマークされることを確認します。
注: プロジェクトのスタンプ注釈の数は任意です。それは、内在蛍光スキャンのための1つと、一般的に組織内のシグナル分布を代表するいくつかのものを生成することをお勧めします。 - 最後に、実験のすべてのスキャンを開きます。各々のスタンプをクリックし、今度は[選択:各外植を外接するスタンプを配置する]ボックスで[バッチ]オプションを選択します。
注: 今回は、スタンプは緑色の四角形としてマークされ、バッチ分析が開始されると必須となります。スタンプに適したサイズ(1 x 1、2 x 2、3 x 3)を選択し、エクスポートされたファイルに重複したデータを生成するスタンプの重複を避けます。
- トレーニング分析
- 解析用ソフトウェアを起動し( 表を参照)、新しいプロジェクトを作成 |します。新しい|プロジェクト.
- [ プロジェクト名 ] ボックスに名前を入力し、 プロジェクトの種類を構成します。
注: 実験は、次の仕様を使用して行われました: トレーニング可能な組織セグメンテーション;適応細胞セグメンテーション;フェノタイピング。 - トレーニング用のスタンプを含むスキャンをロードします: ファイル||を開くイメージ. シングルモードビューでは、画像をナビゲートし、蛍光を含むスキャンを選択します。
- 自己蛍光(AF)ボタンをクリックし、自己蛍光ピッカーで、組織の染色されていない部分に描画します。[画像の準備]をクリックして、トレーニング用にアップロードされたすべての画像から、組み込みの蛍光の強度を差し引くようにします。
- マーカー と色の編集 ボタンをクリックし、蛍光色素に関連付けられたボックスに マーカー名 を入力します。画面上部の セグメント組織 ステップをクリックして、 組織セグメンテーショントレーニング ウィンドウを開きます。
- [ 組織カテゴリ] ウィンドウで、画像をセグメント化する 組織カテゴリの名前 を入力します (例: 腫瘍、 ストロマ、 背景、 壊死)。
- [ 組織セグメンテーション トレーニング ] ウィンドウで、[ 図形描画 ] ボタンをクリックし、セルのグループの周りに領域を描画して、目的の組織カテゴリを定義します。例えば、腫瘍領域を定義するには、 腫瘍 細胞のグループの周りに領域を描く。次のカテゴリに切り替えて、描画プロセスを繰り返します。
注: トレーニング用にアップロードされた画像のほとんどで地域を描画することをお勧めします。また、 パターンスケール と セグメンテーション解像度 を編集して、ユーザマニュアルで詳細を説明することでトレーニングを絞り込むこともできます。 - トレーニング領域を定義した後は、 組織セグメンタのトレーニングに進みます。
注: トレーニングの過程で、ソフトウェアは組織のセグメンテーションの精度の割合を表示します。最適な結果を得るには、組織セグメンテーションを90%以上正確に行うことを推奨します。セグメンタが安定したら、[ 完了 ]ボタンをクリックします。 - すべての画像で 組織カテゴリ マスクを表示するには、[ セグメント全体 ]ボタンをクリックします。
- 組織のセグメンテーションの品質を確認した後、誤って分類された領域の周りにトレーニング領域を再描画し、プロセスが成功するまで 組織セグメンタ を再訓練します。
- ウィンドウ上部のステップバーでセルセグメンテーションステップをクリックして、解析を進めます。
- セグメントに細胞コンパートメントを選択します: 核、 細胞質、および /または膜。
注意:適応細胞セグメンテーションは核信号を持つ細胞のみを検出することができるので 、Nucleiを選択解除しないでください。細胞質や膜をセグメント化することも可能ですが、最も強く、最も豊富な核成分を最初に選択することをお勧めします(例えば、DAPI)。 - [ 標準強度] スライダを使用して、核のピクセルを検出するためのしきい値を調整して、核コンポーネントを設定します。しきい値が調整されると、プレビュー ウィンドウが開き、ライブ フィードバックが表示されます。
注: このしきい値はアダプティブで、周囲の背景を基準にして測定されます。あまりにも多くの背景が核として検出された場合は、この値を増やします。かすかな核が見逃されている場合は、この値を下げます。 [領域の表示/非表示 ]ボタンを使用して、セグメンテーション マスクのオンとオフを点滅させ、正しいピクセルが核として検出されているかどうかを確認します。 - 核のピクセルのクラスターを分割するには、 核コンポーネント分割パネルを 使用します。核の染色品質を最もよく表すボタンを選択します。次に、スライダバーを使用して 分割感度を調整し、値を小さくすると分割が増えることに注意してください。
- [ すべてのセグメント ]ボタンをクリックして、すべての画像を分割します。結果が正確でない場合は、設定を変更し、満足のいくセグメンテーションが達成されるまでソフトウェアを再トレーニングします。
- 分析の最後のステップに進みます: 「フェノタイピング」を参照してください。[ 表現型] パネルで、検出する表現型のリストを追加し、対応するテキスト ボックスに 名前 を入力します。[ 表現型の編集 ] ボタンをクリックし、特定のセルを選択してドロップダウン メニューを表示し、対応する表現型を選択します。
注: 分類器をトレーニングするには、表現型ごとに少なくとも 5 つのセルが必要です。核の視覚化をオフにすると、割り当てる必要がある細胞表現型をより良く視覚化できます。 - トレーニングの選択が完了したら、[ トレーニング分類器 ] ボタンをクリックします。
注意:ソフトウェアは、画像内のすべての単一のセルを分類し、分類のエラーが発生するたびに、細胞の表現型を編集し、分類器のトレーニングを繰り返することが可能です。バッチ分析に進む前にプロジェクトを保存し、画面上部のツールバーの エクスポート をクリックします。 - 左側のメニューの[ バス解析 ]タブを選択し、[ バッチ アルゴリズム ]または[ プロジェクト ]ボックスにプロジェクトをロードします。
- [ エクスポート オプション] をクリックしてイメージごとに個別のディレクトリを作成し、[ 参照 ] ボタンを使用してデータをエクスポートする場所を探します。エクスポートする 画像 と 表 のすべてのオプションをクリックします。
- 画面の右側で、[ スライドの追加 ] をクリックし、前に準備したバッチのスタンプを含むすべての画像をロードします (手順 7.3)。[ 実行 ]ボタンをクリックしてバッチ分析を開始し、対応するデータをエクスポートして一度に1つのスタンプを処理します。
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Representative Results
mIF染色された組織学的切片のマルチスペクトルイメージングにより、個々の細胞集団の同定とフェノタイピング、および外植TMEにおける腫瘍および間質成分の同定が可能である(図2)。マルチスペクトルイメージングは、自己蛍光シグナルを他のシグナルからデコンボルテージし、その後の分析から除外することができるため、コラーゲン含有量の高い組織など、高い内在性自己蛍光を有する組織の分析に特に有用である。その後のシリコ組織および細胞セグメンテーションでは、生細胞数(例えば、陽性率のパーセント)、シグナル強度、細胞サイズ、組織面積、および個々の細胞の空間位置を含むが、これらに限定されない多数の出力を有する薬物応答の定量化を可能にする。
従って組織および細胞のセグメンテーションは、薬物治療結果の定量的分析および腫瘍および間質特異的応答の同定に極めて有用である。例えば、Ki67とcPARPの染色は、腫瘍マーカーと一緒に、それぞれ外植で増殖および細胞死レベルの定量を可能にする(図3)。与えられた例では、Ki67およびcPARPレベルは、抗プログラムされた細胞死タンパク質1(PD-1)免疫チェックポイント阻害剤(ICI)、ニボルマブに応答してPES中の間質および腫瘍領域について定量される。さらに、染色されたセクションから空間情報を抽出する機能により、細胞間距離、および腫瘍境界および他の構造までの距離を計算することができます。したがって、薬物治療後の細胞分布の変化を定量的に分析することができる(図4)。図示した例は、ニボルマブによるPDE処理を表す。
図1:PESの生成と分析のためのワークフロー (A)切除されたばかりのヒト腫瘍標本は、培養培地に浮かぶ透過性培養挿入ディスク上で処理および配置される。(B) 薬物治療の後、外植は収穫され、FFPEを受け、次いで、例えばH&E染色のために組織学的分析のために切り離される。(C)組織切片のmIF染色とスキャンを行い、個々の信号を個別にデコンボルトして分析できるマルチスペクトル画像を生成する。(D) 複合画像の解析により、腫瘍と間質領域の分離と、異なる細胞タイプの表現型の評価が可能になります。略語: PDE = 患者由来の外植;FFPE =ホルマリンで固定され、パラフィンに埋め込まれる。H&E = ヘマトキシリンおよびエオシン;mIF = 多重免疫蛍光;HRP = わさびペルオキシダーゼ;H2O2 = 過酸化水素;Ab = 抗体;TSA = チラミド信号増幅。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:mIF染色組織部の例 NSCLC外植組織は、細胞生存率のマーカー、すなわち、cPARP(赤)およびKi67(緑色)ならびに汎サイトケラチンマーカー(黄色)およびDAPI(青)を有核に印示するために染色された。マルチスペクトルイメージングを行い、蛍光シグナルをデコンボルテージし、自己蛍光を除去した。画像は、選択したフィールドの 20 倍の倍率を示しています。スケールバー= 50 μm略語: mIF = 多重免疫蛍光;NSCLC = 非小細胞肺癌;cPARP = 切断ポリ- ADP リボース ポリメラーゼ;CK = サイトケラチン;DAPI = 4'-6-ジミディノ-2-フェニリンドール;AF = 自己蛍光。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:PEにおける細胞死と増殖の定量化 培地制御と比較して5μg/mLニボルマブで24時間処理した後のNSCLC PEでのアポトーシス誘導を示す箱およびウィスカプロットの例。増殖率(Ki67)とアポトーシス細胞死(cPARP)事象の割合は、それぞれ腫瘍領域と間質に表示されます。各ポイントは単一の外植を表し、ボックスの中心線は分布の中央値を表し、ボックスの側面(下と上)はそれぞれ第1四分位数と第3四分位数を表します。誤差範囲は、四分位数の範囲を表します(1.5 x IQR 以上)。略語: PDE = 患者由来の外植;NSCLC = 非小細胞肺癌;cPARP = 切断ポリ- ADP リボース ポリメラーゼ;IQR = 四分位範囲。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:薬物治療に続く空間組織.(A)黒色腫の外植物に対して行われたT細胞マーカー-CD4、FOXP3、CD8(左パネル)のmIF染色を示す代表的な画像、およびCD8+細胞とTreg細胞(CD4+/FOXP3+)間の細胞間距離を同定する対応する表現型分析(右)。スケールバー=200μm(B)ニボルマブの5μg/mLで黒色腫PESを処理した後の細胞傷害性T細胞(CD8+)とトグ細胞(CD4+/FOXP3+)間の距離の増加を示すヒストグラムプロットは、IO薬のオンターゲット効果を確認した。密度単位は、帯域幅当たりの全セルの合計でセル数を割った値で表されます。略語: mIF = 多重免疫蛍光;CD = 分化のクラスター;FOXP3 = フォークヘッドボックス P3;PDE = 患者由来の外植;NSCLC = 非小細胞肺癌;IO = 免疫腫瘍学。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
本論文では、PEの生成、薬物治療、分析の方法を説明し、前臨床モデルシステムとしてのプラットフォームの利点を強調する。その脱構築を伴わない切除された腫瘍のex vivo培養は、腫瘍アーキテクチャ13、24、したがって、TMEにおける細胞成分の空間的相互作用ならびに腫瘍内不均一性の保持を可能にする。この方法は、腫瘍特異的マーカーを用いて、腫瘍組織の領域と間質の領域を識別し、したがってこれらのコンパートメント内で薬物応答を分離する方法を示す(図3)。さらに、複数のバイオマーカーを同時にプロファイリングして、例えばTME内の免疫細胞のオンターゲットの動きを評価することができる(図4)。
以前の出版物は、このPDEプラットフォームの適用を、治療化学療法の標準のためのNSCLC PEの階層化に、シスプラチン、化学感受性集団24から化学耐性を分離することが可能であることを示す。これらのPDE関連の知見は、患者の応答を反映する。ここに記載の方法に従うことによって、他の腫瘍タイプおよび異なるタイプの薬物、化学療法薬またはそれ以外の場合にも同様のアプローチを行なう可能性がある。PMEを薬剤に敏感で薬剤耐性集団に分離することは、薬剤耐性に関するさらなる機械主義的洞察を生み出す貴重な資源を作り出す。たとえば、PBEはRNA、DNA、タンパク質、または代謝産物の単離のために処理できるため、「オミック」技術を実装して応答の予測である主要なバイオマーカーを同定することができます。あるいは、治療されたPPEから生成されたFFPEセクションを広範な空間プロファイリングに使用して、PDEの異なる細胞タイプが薬剤耐性にどのように寄与するかを理解することができる。
これは、マルチスペクトルイメージングと質量サイトメトリーのさらなる発展が35、40、41、42、43に近づき、数百のバイオマーカーを同時にプロファイリングできるようにすることで促進される可能性があります。免疫療法の有効性を評価する前臨床モデルが求められているが、この論文は、PESがこの重要なニッチを埋めることができることを示している(図3および図4)。細胞傷害性Tリンパ球抗原4およびPD-1/プログラム死リガンド-1(PD-L1)などの免疫チェックポイントを標的としたモノクローナル抗体は、標準的な化学療法に比べて多数の固形腫瘍における患者全体の生存率を著しく改善し、44、45、46、47を開発した。しかしながら、ICIは、明確ではない理由で限られた数の患者に有効であり、予測バイオマーカー48の同定を必要とする。腫瘍組織の3Dアーキテクチャを保存するPESの顕著な特徴は、ICIの有効性の評価を促進する(図3)およびICI処置に応答して免疫細胞を監視する(図4)。したがって、PEはICI感受性とICI耐性のケースを区別し、この区別を支えるメカニズムを調査するための理想的なプラットフォームです。
PDE テクノロジは、いくつかの欠点に苦しんでいます。PDEからの正確な実験的結果の生成は、腫瘍の完全性に依存し、時には、手術後の腫瘍サンプルは、PEのために処理するにはあまりにも壊死性です。さらに、長期培養25後の組織完全性の保持のいくつかの具体例にもかかわらず、ほとんどの報告された症例に対して、培養中の72時間後に完全性および生存率が失われ、組織崩壊が生じる。したがって、薬物実験を行う時間は比較的限られており、後天性の薬剤耐性のメカニズムの研究や、浸潤・転移13の研究のためにこのモデルを使用することを禁止する。今後、スキャフォールドや灌流チャネルなどの新技術の開発により、外植の存続可能性を拡張することが可能になり、栄養素の拡散や取り込みを促進し、より拡張された培養が可能になる可能性があります。
しかし、これらの改善が可能になるまで、PDEプラットフォームは、即時の薬物応答データを提供できる短期培養方法とみなされるべきである。これは、より長期的な薬物応答データを提供することができるオルガノイドやPDXモデルなどの他のモデルシステムと一緒に利用されるべきです。全体として、PDEプラットフォームは、患者の腫瘍の特定の抗癌剤に対する感受性の決定、実際の腫瘍における薬物作用のメカニズムに関する洞察を導き出し、予測および薬力学的バイオマーカーの開発に使用される概念実証前臨床モデルシステムである。
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Disclosures
開示するものは何もない
Acknowledgments
私たちは、外科的切除腫瘍組織を提供してくれたレスターNHSトラスト大学病院の外科医と病理学者に感謝します。我々はまた、Vectra Polarisを使用したサポートのためのFFPE組織ブロックとキース・ストラートマンの組織処理および切除に関する支援をコアバイオテクノロジーサービス内の組織学施設に感謝します。この研究は、レスター大学、MRC毒物学ユニット、がん研究英国治療発見研究所、LifeArcの4つのパートナーで構成されるExplantコンソーシアムによって支援され、資金提供されました。CRUK-NIHRレスター実験がん医学センター(C10604/A25151)による追加サポートが提供されました。GM、CD、NAの資金は、ファイザーからの資金提供によって支援されている乳がんナウの触媒プログラム(2017NOVPCC1066)によって提供されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Sigma | 320099 | Staining reagent |
| Antibody Diluent / Block, 1x | Perkin Elmer | ARD1001EA | Antibody diluent/blocking buffer |
| Barnstead NANOpure Diamond | Barnstead | Ultra Pure (UP) H2O machine | |
| Citric Acid Monohydrate | Sigma-Aldrich | C7129 | Reagent for citrate buffer |
| Costar Multiple Well Cell Culture Plates | Corning Incorporated | 3516 | 6 multiwell plate |
| DAPI Dilactate | Life Technologies | D3571 | |
| 100 x 17 mm Dish, Nunclon Delta | ThermoFisher Scientific | 150350 | 100 mm diameter dish for tissue culture |
| DMEM (1x) Dubelcco's Modified Eagle Medium + 4.5 g/L D-Glucose + 110 mg/mL Sodium Pyruvate | Gibco (Life Technologies) | 10569-010 | Tissue culture medium (500 mL) |
| DPX mountant | VWR | 360294H | Mounting medium |
| DPX mountant | Merck | 6522 | Mounting medium |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | 3609 | Reagent for TE buffer |
| Eosin | CellPath | RBC-0100-00A | Staining reagent |
| Foetal Bovine Serum | Gibco | 10500-064 | For use in tissue culture medium |
| 37% Formaldehyde | Fisher (Acros) | 119690010 | 10% Formalin |
| iGenix, microwave oven IG2095 | iGenix | IG2095 | Microwave used for antigen retreival |
| Industrial methylated spirit (IMS) | Genta Medical | 199050 | 99% Industrial Denatured Alcohol (IDA) |
| InForm Advanced Image Analysis Software | Akoya Biosciences | InForm | |
| Leica ASP3000 Tissue Processor | Leica Biosystems | Automated Vacuum Tissue Processor | |
| Leica Arcadia H and C | Leica Biosystems | Embedding wax bath | |
| Leica RM2125RT | Leica Biosystems | Rotary microtome | |
| Leica ST4040 Linear Stainer | Leica Biosystems | H&E stainer | |
| Mayer's Haematoxylin | Sigma | GHS132-1L | Staining reagent |
| Millicell Cell Culture Inserts, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | Merck Milipore | PICMORG50 | Organotypic culture insert disc |
| Novolink Polymer Detection System | Leica Biosystems | RE7150-K | DAB staining kit |
| OPAL 480 | Akoya Biosciences | FP1500001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 520 | Akoya Biosciences | FP1487001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 570 | Akoya Biosciences | FP1488001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 620 | Akoya Biosciences | FP1495001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 650 | Akoya Biosciences | FP1496001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 690 | Akoya Biosciences | FP1497001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 780 / OPAL TSA-DIG Reagent | Akoya Biosciences | FP1501001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent and TSA-DIG reagent |
| Opal Polymer HRP Ms Plus Rb, 1x | Perkin Elmer | ARH1001EA | HRP polymer |
| Penicillin/streptomycin solution | Fisher Scientific | 11548876 | For use in tissue culture medium |
| PhenoChart Whole Slide Contextual Viewer | Akoya Biosciences | PhenoChart | Viewer software for scanned images |
| Phosphate Buffered Saline Tablets | Thermo Scientific Oxoid | BR0014G | PBS |
| 1x Plus Amplification Diluent | Perkin Elmer | FP1498 | Fluorophore diluent |
| Prolong Diamond Antifade Mountant | Invitrogen | P36961 | Mounting medium |
| Slide Carrier | Perkin Elmer | To load slides into Slide Carrier Hotel for scanning with Vectra Polaris | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S/3160/63 | 10% Formalin |
| Sodium Hydroxide pellets | Fisher Scientific | S/4920/53 | Reagent for citrate buffer |
| Tenatex Toughened Wax - Pink (500 g) | KEMDENT | 1-601 | Dental wax surface |
| Thermo Scientific Shandon Sequenza Slide Rack for Immunostaining Center | Fisher Scientific | 10098889 | Holder for slides and slide clips |
| Thermo Scientific Shandon Plastic Coverplates | Fisher Scientific | 11927774 | Slide clips |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Sigma-Aldrich | 252859 | Reagent for TE buffer |
| VectaShield | Vecta Laboratories | H-1000-10 | Mounting medium |
| Vectra Polaris Slide Scanner | Perkin Elmer | Vectra Polaris | Slide scanner |
| Xylene | Genta Medical | XYL050 | De-waxing agent |
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