Explante de tecido córnea porcina para estudar a eficácia do vírus Herpes Simplex-1

Pessoas que sofrem de infecções oculares muitas vezes incorrem em perda de visão¹. Com alta soroprevalência em todo o mundo, indivíduos infectados pelo HSV sofrem de infecções oculares recorrentes que levam a cicatrizes na córnea, ceratite estromica e neovascularização^2,3,4,5. As infecções por HSV também têm se mostrado com menos frequência, uma série de condições graves entre pacientes imunocomprometidos e não tratados como encefalite e morbidade sistêmica^6,7,8. Drogas como o Acyclovir (ACV) e seus análogos nucleosídeos têm mostrado sucesso consistente na contenção da infecção do HSV-1 e até mesmo na reativação de^controle,mas o uso prolongado dessas drogas está associado à insuficiência renal, anormalidades fetais e falha em restringir o surgimento da resistência a drogas às cepas virais em evolução^{9,10,11,12,13}. Complexidades associadas às infecções oculares do HSV-1 foram previamente estudadas in vitro usando monocamadas e culturas 3D de células córneas humanas e in vivo usando infecções oculares de murina ou coelho. Embora esses modelos in vitro forneçam dados significativos sobre os componentes biológicos celulares das infecções pelo HSV-1, eles, no entanto, não conseguem imitar a complexidade intrincada do tecido córnea e pouco fazem para iluminar a propagação dendrítica do vírus¹⁴. Em contraste, embora os sistemas in vivo sejam mais perspicazes em mostrar infecção espalhada em córneas e respostas de ativação imunológica durante a infecção pelo HSV-1, eles vêm com a ressalva de que eles exigem pesquisadores treinados e grandes instalações para cuidados com animais para ignorar os experimentos.

Aqui usamos córneas suínas como modelo ex vivo para examinar o sistema de feridas induzidas pela infecção por HSV-1. Tanto a farmacologia potencial de certas drogas quanto a biologia celular e molecular do sistema de feridas causada pela infecção podem ser estudadas através de culturas de explanta tecidual. Este modelo também pode ser alterado para uso de outras infecções virais e bacterianas. Neste estudo, foram utilizadas córneas suínas para testar a eficácia antiviral de uma pequena molécula pré-clínica, BX795. O uso de córneas suínas foi preferido devido à facilidade de acesso e custo-benefício. Além disso, os modelos suínos de córneas são bons modelos de olhos humanos, sendo as córneas fáceis de isolar, adequadamente dimensionadas para infecção e visualização e robustas para manusear¹⁵. As córneas suínas também são comparáveis à complexidade dos modelos de córnea humanas tanto na permeabilidade da córnea trans quanto na absorção sistêmica¹⁵. Usando este modelo para o estudo, pudemos elucidar como o BX795 é digno de uma investigação mais aprofundada como um inibidor competente da infecção pelo vírus HSV-1 e adiciona à literatura de classificá-lo como um potencial composto antiviral de pequenas moléculas¹⁶.

Todo o tecido suíno usado neste estudo foi fornecido por uma organização privada terceirizada e nenhum dos manuseamentos de animais foi realizado pela Universidade de Illinois em Chicago.

1. Materiais

1. Reagentes
   1. Use os seguintes reagentes para ensaio de placa: metilcelulose em pó, meio de águia modificada de Dulbecco (DMEM), soro bovino fetal (FBS), penicilina e estreptomicina (P/S) para ensaio de placa.
   2. Use comprimidos de cristal violeta e etanol (grau de biologia molecular) para preparar solução violeta cristalina para ensaio de placa.
2. Vero cell growth media - DMEM whole media
   1. Abra a garrafa de mídia DMEM dentro da capa de cultura de tecido. Remova 55 mL de mídia da garrafa usando uma pipeta sorológica e descarte-a. Adicione 50 mL de FBS de P/S ao DMEM. Leve à geladeira a 4 °C.
3. Mídia de ensaio de placa - Estoque de 5% de mídia de metilcelulose
   1. Meça 2,5 g de pó de metilcelulose com um ímã de agitação dentro de uma garrafa de vidro de 500 mL e autoclave-a. Depois que a garrafa esfriar até a temperatura ambiente, pegue 500 mL de mídia inteira DMEM contendo 50 mL de FBS e 5 mL de P/S e adicione-a à garrafa de vidro contendo metilcelulose.
   2. Mexa a 4 °C por 2 dias usando um agitador magnético. Leve à geladeira a 4 °C.
4. Preparação da mídia para córnea suína excizada
   1. Abra uma garrafa de mídia essencial mínima (MEM) dentro da capa de cultura de tecido. Descarte 10 mL de MEM da garrafa usando uma pipeta sorológica.
   2. Adicione 5 mL de insulina-transferrina-selênio (ITS) e 5 mL de antibiótico antimíctico (AA) à mídia e leve à geladeira a 4°C.
5. Mestre e estoque de cristal violeta:
   1. Para fazer a solução de estoque cristalino, adicione 1 g de pó violeta cristalina a 100 mL de 20% de etanol na água. Este estoque (1% c/v de cristal violeta) pode ser armazenado e usado por até um ano quando armazenado em um lugar escuro.
   2. Para fazer um estoque de trabalho a partir disso, adicione 50 mL de solução de estoque original a 350 mL de água. Adicione 100mL de etanol a esta solução para fazer uma solução de cristal violeta de 500 mL (0,1% w/v de violeta cristalina).
      NOTA: Ambas as soluções precisam ser armazenadas no escuro.

2. Procedimento

1. Isolamento das córneas suínas de olhos inteiros¹⁷
   1. Ao receber os olhos suínos de um fornecedor adequado, armazene no gelo se houver um atraso com o processamento de tecidos como retratado na Figura 1.
   2. Certifique-se de que os equipamentos de proteção individual são usados e usados durante este procedimento para evitar contaminação, bem como acidentes de derramamento de humor vítreo.
   3. Pulverizar a área de trabalho com 70% de etanol para limpar e desinfetar. Para garantir que o espaço de trabalho esteja estável, espalhe uma tampa de banco e tape pelos lados com segurança, conforme retratado na Figura 2.
   4. Coloque os olhos suínos na gaze (Figura 3). Utilizando gaze de 50 mm, segure a seção posterior(Figura 4A) dos olhos suínos, conforme mostrado na Figura 4B com uma mão.
   5. Com uma agulha de 30 G, faça delicadamente um único poke no centro da superfície epitelial do olho cuidadosamente e certifique-se de que não há danos ao estroma(Figura 5). A cutucada deve ser limitada ao epitélio (~100-200 μm) para evitar o envolvimento estromalítico.
   6. Usando uma lâmina esterilizada afiada, faça uma pequena incisão na esclera a 1 mm de distância da córnea. Corte a borda da córnea garantindo que o humor vítreo não vaze usando uma ação rotativa rápida e suave da mão(Figura 6A). Segurando a córnea na borda córnea-esclera com uma pinça plana, corte as membranas de amarração restantes do olho usando a lâmina(Figura 6B).
   7. Pegue a córnea e coloque-a em uma placa de 12 poços sobreposta com 2 mL de meio de córnea. A córnea deve ser colocada de frente para cima, demonstrada em uma série de passos nas Figuras 7A-D, Figura 8).
   8. Adicione 5 μL da solução de vírus contendo unidades de formação de placas (PFU) de 5 x^{10 5} placas (PFU) de 17 GFP ao local desbridado na superfície da córnea. Coloque a placa de 12 poços contendo córneas suínas infectadas em uma incubadora com 5% de CO₂ por 72 h.
   9. Pulverize quaisquer olhos adicionais não utilizados em experimentos com alvejante 10% e descartados com segurança em sacos de risco biológico.
2. Visualização
   NOTA: O vírus deve ser visualizado todos os dias antes da adição de medicamentos.
   1. Ligue o microscópio estéreo e a fonte de luz LED e deixe a lâmpada da máquina aquecer antes de imaginar as córneas. Leve cuidadosamente a placa de córneas para instrumento sem perturbar a solução. Altere o filtro para que o GFP (380-460 nm) seja usado para olhar amostras. Defina o tempo de exposição para 500 ms para capturar imagens.
   2. Primeiro, coloque a placa de córnea sob o estereoscópio e capture as imagens na menor ampliação de 7,5x. Acompanhe isso com uma série de imagens de ampliação crescentes (por exemplo, 15x, 25x, 35x) de tal formação viral de spread e dendrito é visualizada claramente
   3. Certifique-se de devolver as córneas infectadas de volta à incubadora de cultura tecidual e salvar todas as imagens que foram tiradas.
3. Quantificação da infecção por vírus
   NOTA: Os de vírus das córneas suínas devem ser avaliados todos os dias para analisar o efeito do tratamento medicamentoso.
   1. Para quantificar o vírus, as células vero sementes a uma densidade de 5 x 10⁵ de células por poço se usar uma placa de 6 poços como feito neste experimento. Faça isso um dia antes da infecção. Incubar as células banhadas durante a noite para garantir que elas sejam confluentes para quantificação do vírus.
   2. Alíquota de 500 μL de mídia livre de soro em múltiplos tubos de microcentrifuuge. Insira o cotonete estéril de algodão mergulhado nos tubos cheios de mídia livre de soro. Os cotonetes de algodão precisam ser mergulhados e molhados por pelo menos 5 minutos antes do uso.
   3. Sem perturbar a mídia subjacente, transporte a placa de córnea suína infectada para um armário de biossegurança. Usando os cotonetes de algodão molhado, faça 3 revoluções no sentido horário e 3 revoluções no sentido anti-horário a um diâmetro de 5 mm do centro da córnea suína infectada sem aplicar pressão excessiva.
   4. Insira o cotonete de algodão no tubo de microcentrifusagem preenchido com soro e gire-o no sentido horário e anti-horário 5 vezes. A ponta metálica do cotonete deve ser cortada para que se encaixe inteiramente no tubo de microcentrifuuge e a tampa possa ser fechada.
   5. Coloque o tubo de microcentrifuge contendo a ponta de algodão esfregado em uma máquina de vórtice e vórtice em alta velocidade por 1 min.
   6. Realize a quantificação do vírus através de um ensaio de placa nestas amostras.
      NOTA: Esta etapa de quantificação precisa ser realizada nos dias 2, 4 e opcionalmente em 6 dias após a infecção.
4. Quantificação de vírus por ensaio de placa
   NOTA: Para realizar um ensaio de placa, cresça e emplaque células Vero em uma placa de 6 poços e garanta 90% de confluência de células antes do início do ensaio. Use um frasco confluente de 75 cm² dessas células. Todas as etapas abaixo precisam ser realizadas dentro de um armário de biossegurança.
   1. Lave a monocamada confluente das células Vero no frasco com 10 mL de soro fisco tampão de fosfato fresco (PBS) após aspirar o meio de cultura. Repita o passo de lavagem mais uma vez com PBS depois de aspirar o primeiro conjunto de solução de lavagem.
   2. Adicione 1 mL de 0,05% trypsin à monocamada celular. Incubar o frasco a 37 °C por 5 min. A olho nu, certifique-se de que as células se desvincularão da superfície interna do frasco. Se não, espere mais 5 minutos antes de examinar o frasco novamente. Quando as células parecerem separadas, adicione 9 mL de toda a mídia à monocamada para garantir que as células se desalojam completamente da superfície do frasco.
   3. Colete todas as células do frasco junto com toda a mídia e coloque-as em um tubo de centrífuga de 15 mL.
   4. Para cada poço das 6 placas que são usadas para ensaio de placa, use 300 μL do tubo centrífuga. Cubra cada poço da placa de 6 poços com 2 mL de mídia inteira. Deixe as placas na incubadora durante a noite para permitir que elas cresçam e formem uma monocamada confluente em cada poço.
   5. Para realizar um ensaio de placa, realizar uma diluição serial das amostras precisa ser realizada antes da quantificação do vírus.
   6. Realize uma diluição de₁₀1 vezes do vírus em tubos de microcrífugas usando mídia livre de soro até que uma diluição de 10^-8 seja alcançada. Quando em uma diluição de 10^-3, transfira 1 mL da diluição para a monocamada de células banhadas depois de aspirar a mídia de crescimento nas células da placa de 6 poços, este será o passo da infecção. Incubar a placa infectada a 37 °C incubadora por 2 h.
   7. Aspire a mídia de infecção existente, lave com PBS duas vezes suavemente para revestir células e adicione 2 mL de mídia carregada de metilcelulose por poço a todos os 6 poços. Incubar por 72 h ou até que a formação de placas possa ser vista. As placas podem ser identificadas pela formação de pequenas lacunas entre as células da monocamada celular.
   8. Adicione 1 mL de metanol lentamente ao canto de cada poço, usando a parede como ponta guia. Incubar a placa de 6 poços à temperatura ambiente por 15 minutos. Aspire lentamente o conteúdo de cada poço da placa sem perturbar ou agitar a monocamada celular.
   9. Adicione 1 mL de solução de trabalho cristal violeta a cada poço de 6 placas de poço, garantindo que todas as células estejam cobertas. Incubar a placa de 6 poços no escuro por 30 minutos. Descarte a solução violeta cristalina aspirando-a e seque os poços em uma folha de papel absorvente.
   10. Conte o número de placas no poço de diluição mais alta para quantificar o conteúdo total do vírus na solução inicial. Repita o processo duas vezes para confirmar o título viral.

Para entender a eficácia dos antivirais experimentais, eles precisam ser testados extensivamente antes de serem enviados para testes clínicos in vivo em humanos. Nesse sentido, devem ser identificados controles positivos, controle negativo e grupos de testes. Trifluorothymidina (TFT) tem sido usada há muito tempo como o tratamento preferido para tratar a ceratite de herpes topicamente16. Usados como controle positivo, os grupos córneas tratados com TFT mostram menor propagação de infecções. Como controle negativo, usamos DMSO ou controle de veículo dissolvido em PBS. BX795, a droga pré-clínica experimental foi o grupo de teste. Um total de 4 córneas foram atribuídas a cada grupo e as drogas foram adicionadas 3 vezes por dia às córneas suínas. Nossos resultados usando imagens de fluorescência estereoscópica mostram que a eficácia antiviral do BX795 é semelhante ao TFT no controle da propagação viral. A disseminação viral em nossos estudos pode ser visualizada por meio da imagem do canal de fluorescência verde no estereoscópio. Observou-se que o veículo só tratava córneas negativas do grupo controle mostrou disseminação do vírus da zona central de infecção para sua periferia em 6 dias após a inoculação viral inicial, enquanto ambas as drogas (BX795 e TFT) limpam a infecção no dia 4 - 6 imagens(Figura 9A). Da mesma forma, os cotonetes oculares retirados nos dias 2 e 4 pós-infecção mostram uma inibição completa do vírus no controle positivo e amostras tratadas com BX795, enquanto um aumento acentuado no titulador do vírus infeccioso é observado no grupo de controle negativo(Figura 9B).

Figura 1: Olhos suínos mantidos no gelo até que o tecido seja processado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Configuração do banco de trabalho. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Olhos suínos colocados na gaze. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Olho suíno com agulha 30G retratado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: agulha de 30 G usada; orifício feito no centro da superfície epitelial. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Ação rotativa usada para cortar em torno da borda da córnea usando lâmina esterilizada afiada (A,B). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: Imagens de córnea. (A,B) A córnea finalmente cortada usando uma tesoura afiada(C) C É mantida por pinças (D) Córnea completamente isolada, pronta para uso Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 8: Córneas colocadas em placa de 12 poços e incubadas por 72 h. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 9: Progressão da propagação viral tomada durante o curso da infecção. Córneas suínas recém-extirpadas foram infectadas com HSV-1 17-GFP e(A)imagens usando microscópio nos dias 2, 4 e 6 pós infecção. O tratamento tópico com DMSO, TFT ou BX795 foi iniciado no dia 2 após a infecção. (B) Os ensaios de placa foram realizados utilizando cotonetes retirados das córneas suínas em Células Vero. O teste ANOVA bidirecional foi realizado para compreender diferenças significativas entre os grupos de tratamento. n=4, ****p=0,0001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores declaram que não há conflito de interesses e nenhum interesse financeiro concorrente.