Descrevemos o uso de uma córnea suína para testar a eficácia antiviral de drogas experimentais.
Vírus e bactérias podem causar uma variedade de defeitos da superfície ocular e degeneração, como feridas e úlceras através de infecção corneal. Com uma soroprevalência que varia de 60 a 90% em todo o mundo, o Vírus Herpes Simplex tipo-1 (HSV-1) geralmente causa lesões mucocutâneas da região orofacial que também se manifestam como lesões e cegueira associada à infecção. Embora as drogas antivirais atuais sejam eficazes, o surgimento de resistência e persistência de efeitos colaterais tóxicos requer o desenvolvimento de novos antivirais contra este patógeno onipresente. Embora a avaliação in vitro forneça alguns dados funcionais sobre um antiviral emergente, eles não demonstram a complexidade do tecido ocular in vivo. No entanto, os estudos in vivo são caros e exigem pessoal treinado, especialmente quando se trabalha com agentes virais. Portanto, os modelos ex vivo são passos eficientes, mas baratos para testes antivirais. Aqui discutimos um protocolo para estudar a infecção pelo HSV-1 usando córneas suínas ex vivo e um método para tratá-los topicamente usando drogas antivirais existentes e novas. Também demonstramos o método para realizar um ensaio de placa usando o HSV-1. Os métodos detalhados podem ser usados para realizar experimentos semelhantes para estudar infecções que se assemelham ao patógeno HSV-1.
Pessoas que sofrem de infecções oculares muitas vezes incorrem em perda de visão1. Com alta soroprevalência em todo o mundo, indivíduos infectados pelo HSV sofrem de infecções oculares recorrentes que levam a cicatrizes na córnea, ceratite estromica e neovascularização2,3,4,5. As infecções por HSV também têm se mostrado com menos frequência, uma série de condições graves entre pacientes imunocomprometidos e não tratados como encefalite e morbidade sistêmica6,7,8. Drogas como o Acyclovir (ACV) e seus análogos nucleosídeos têm mostrado sucesso consistente na contenção da infecção do HSV-1 e até mesmo na reativação decontrole,mas o uso prolongado dessas drogas está associado à insuficiência renal, anormalidades fetais e falha em restringir o surgimento da resistência a drogas às cepas virais em evolução9,10,11,12,13. Complexidades associadas às infecções oculares do HSV-1 foram previamente estudadas in vitro usando monocamadas e culturas 3D de células córneas humanas e in vivo usando infecções oculares de murina ou coelho. Embora esses modelos in vitro forneçam dados significativos sobre os componentes biológicos celulares das infecções pelo HSV-1, eles, no entanto, não conseguem imitar a complexidade intrincada do tecido córnea e pouco fazem para iluminar a propagação dendrítica do vírus14. Em contraste, embora os sistemas in vivo sejam mais perspicazes em mostrar infecção espalhada em córneas e respostas de ativação imunológica durante a infecção pelo HSV-1, eles vêm com a ressalva de que eles exigem pesquisadores treinados e grandes instalações para cuidados com animais para ignorar os experimentos.
Aqui usamos córneas suínas como modelo ex vivo para examinar o sistema de feridas induzidas pela infecção por HSV-1. Tanto a farmacologia potencial de certas drogas quanto a biologia celular e molecular do sistema de feridas causada pela infecção podem ser estudadas através de culturas de explanta tecidual. Este modelo também pode ser alterado para uso de outras infecções virais e bacterianas. Neste estudo, foram utilizadas córneas suínas para testar a eficácia antiviral de uma pequena molécula pré-clínica, BX795. O uso de córneas suínas foi preferido devido à facilidade de acesso e custo-benefício. Além disso, os modelos suínos de córneas são bons modelos de olhos humanos, sendo as córneas fáceis de isolar, adequadamente dimensionadas para infecção e visualização e robustas para manusear15. As córneas suínas também são comparáveis à complexidade dos modelos de córnea humanas tanto na permeabilidade da córnea trans quanto na absorção sistêmica15. Usando este modelo para o estudo, pudemos elucidar como o BX795 é digno de uma investigação mais aprofundada como um inibidor competente da infecção pelo vírus HSV-1 e adiciona à literatura de classificá-lo como um potencial composto antiviral de pequenas moléculas16.
Pesquisas anteriores mostraram que o BX795 tem um papel promissor como agente antiviral contra a infecção pelo HSV-1; inibindo a quinase de ligação tank 1 (TBK1)16. Tanto o TBK1 quanto a autofagia desempenharam um papel em ajudar a inibir a infecção pelo HSV-1, como demonstrado nas células epiteliais da córnea humana. O BX795 mostrou-se extremamente eficaz com a atividade antiviral em uma concentração de 10μM e usando tanto a análise de manchas ocidentais quanto a análise de placas vi…
The authors have nothing to disclose.
Este estudo foi apoiado por subvenções do NIH (R01 EY024710, RO1 AI139768 e RO1 EY029426) ao D.S. A.A. foi apoiado por uma bolsa F30EY025981 do National Eye Institute, NIH. O estudo foi realizado utilizando as córneas suínas obtidas da empresa Park Packing, 4107 Ashland Avenue, New City, Chicago, IL-60609
30 G hypodermic needles. | BD | 305128 | |
500 mL glass bottle. | Thomas Scientific | 844027 | |
Antimycotic and Antibiotic (AA) | GIBCO | 15240096 | Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use |
Benchtop vortexer. | BioDot | BDVM-3200 | |
Biosafety cabinet with a Bio-Safety Level-2 (BSL-2) certification. | Thermofisher Scientific | Herasafe 2030i | |
Calgiswab 6" Sterile Calcium Alginate Standard Swabs. | Puritan | 22029501 | |
Cell scraper – 25 cm | Biologix BE | 70-1180 70-1250 | |
Crystal violet | Sigma Aldrich | C6158 | Store the powder in a dark place |
Dulbecco’s modified Eagle’s medium – DMEM | GIBCO | 41966029 | Store at 4 °C until use |
Ethanol | Sigma Aldrich | E7023 | |
Fetal bovine serum -FBS | Sigma Aldrich | F2442 | Aliquot into 50 mL tubes and keep frozen until use |
Flat edged tweezers – 2. | Harward Instruments | 72-8595 | |
Freezers –80 °C. – | Thermofisher Scientific | 13 100 790 | |
Fresh box of blades. | Thomas Scientific | TE05091 | |
Guaze | Johnson & Johnson | 108 square inch folder 12 ply | |
HSV-1 17GFP | grown in house | – | Original strain from Dr. Patricia Spears, Northwestern University. GFP expressing HSV-1 strain 17 |
Insulin, Transferrin, Selenium – ITS | GIBCO | 41400045 | Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use |
Magnetic stirrer. | Thomas Scientific | H3710-HS | |
Metallic Scissors. | Harward Instruments | 72-8400 | |
Micropipettes 1 to 1000 µL. | Thomas Scientific | 1159M37 | |
Minimum Essential Medium – MEM | GIBCO | 11095080 | Store at 4 °C until use |
OptiMEM | GIBCO | 31985047 | Store at 4 °C until use |
Penicillin/streptomycin. | GIBCO | 15140148 | Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use |
Phosphate Buffer Saline -PBS | GIBCO | 10010072 | Store at room temperature |
Porcine Corneas | Park Packaging Co., Chicago, IL | 0 | Special order by request |
Procedure bench covers – as needed. | Thermofisher Scientific | S42400 | |
Serological Pipettes | Thomas Scientific | P7132, P7127, P7128, P7129, P7137 | |
Serological Pipetting equipment. | Thomas Scientific | Ezpette Pro | |
Stereoscope | Carl Zeiss | SteREO Discovery V20 | |
Stirring magnet. | Thomas Scientific | F37120 | |
Tissue culture flasks, T175 cm2. | Thomas Scientific | T1275 | |
Tissue culture incubators which can maintain 5% CO2 and 37 °C temperature. | Thermofisher Scientific | Forma 50145523 | |
Tissue culture treated plates (6-well). | Thomas Scientific | T1006 | |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | GIBCO | 25-300-062 | Aliquot into 10 mL tubes and keep frozen until use |
Vero cells | American Type Culture Collection ATCC | CRL-1586 |