Bewertung funktioneller Metriken der Skelettmuskelgesundheit in Mikrobeschwerden der menschlichen Skelettmuskulatur

Zusammenfassung

Dieses Manuskript beschreibt ein detailliertes Protokoll zur Herstellung von Arrays von 3D-Mikrogeweben der menschlichen Skelettmuskulatur und minimalinvasiven Downstream-In-situ-Funktionsassays, einschließlich kontraktiler Kraft- und Kalziumhandhabungsanalysen.

Zusammenfassung

Dreidimensionale (3D) In-vitro-Modelle der Skelettmuskulatur sind ein wertvoller Fortschritt in der biomedizinischen Forschung, da sie die Möglichkeit bieten, die Reform und Funktion der Skelettmuskulatur in einem skalierbaren Format zu untersuchen, das experimentellen Manipulationen zugänglich ist. 3D-Muskelkultursysteme sind wünschenswert, da sie es Wissenschaftlern ermöglichen, skelettierte Muskeln ex vivo im Kontext menschlicher Zellen zu untersuchen. 3D-In-vitro-Modelle ahmen Aspekte der nativen Gewebestruktur der erwachsenen Skelettmuskulatur genau nach. Ihre universelle Anwendung ist jedoch durch die Verfügbarkeit von Plattformen begrenzt, die einfach herzustellen, kostengünstig und benutzerfreundlich sind und relativ hohe Mengen an menschlichem Skelettmuskelgewebe liefern. Da die Skelettmuskulatur eine wichtige funktionelle Rolle spielt, die im Laufe der Zeit in vielen Krankheitszuständen beeinträchtigt wird, ist eine experimentelle Plattform für Mikrorisikostudien am praktischsten, wenn minimal-invasive Messungen der transienten und kontraktilen Kalziumkraft direkt in der Plattform selbst durchgeführt werden können. In diesem Protokoll wird die Herstellung einer 96-Well-Plattform namens "MyoTACTIC" und die Massenproduktion von 3D-Mikrogeweben (hMMTs) für menschliche Skelettmuskeln beschrieben. Darüber hinaus werden die Methoden für eine minimalinvasive Anwendung der elektrischen Stimulation beschrieben, die wiederholte Messungen der Skelettmuskelkraft und der Kalziumhandhabung jedes Mikrogewebes im Laufe der Zeit ermöglicht.

Einleitung

Die Skelettmuskulatur ist eines der am häufigsten vorkommenden Gewebe im menschlichen Körper und unterstützt wichtige Körperfunktionen wie Fortbewegung, Wärmehomöostase und Stoffwechsel¹. In der Vergangenheit wurden Tiermodelle und zweidimensionale (2D) Zellkultursysteme verwendet, um biologische Prozesse und Krankheitspathogenese sowie pharmakologische Verbindungen bei der Behandlung von Skelettmuskelerkrankungen zu untersuchen^2,3. Während Tiermodelle unser Wissen über die Skelettmuskulatur in Gesundheit und Krankheit stark verbessert haben, wurde ihre translationale Wirkung durch hohe....

Protokoll

1. PDMS MyoTACTIC Plattenherstellung

HINWEIS: PDMS MyoTACTIC Plattenherstellung erfordert eine PU-Negativform, die wie zuvor beschrieben hergestellt werden kann³⁰. Die CAD-SolidWorks-Datei (Computer-Aided Design) für die MyoTACTIC-Plattenkonstruktion wurde auf GitHub (https://github.com/gilbertlabcode/MyoTACTIC-SolidWork-CAD-file) zur Verfügung gestellt.

1. Bereiten Sie ~ 110 g PDMS-Polymerlösung in einem Einweg-Kunststoffbecher im Verhältnis 1:15 von Monomer zu Härter unter Verwendung der Komponenten im Siliconelastomer-Kit vor. Rühren Sie die Polymerlösung für 2-3 min mit einer 5 ml serologischen Einwegpipet....

Ergebnisse

Beschrieben sind Hierin Verfahren zum Gießen einer 96-Well-PDMS-basierten MyoTACTIC-Kulturplattform aus einer PU-Form, zur Herstellung von Arrays von hMMT-Replikgeweben und zur Analyse von zwei Aspekten der hMMT-Funktion innerhalb der Kulturvorrichtung -Krafterzeugung und Calciumhandhabung. Abbildung 1 bietet einen schematischen Überblick über die Vorbereitung von MyoTACTIC-Kulturbohrungen vor der hMMT-Aussaat. PDMS ist ein weit verbreitetes Polymer auf Silikonbasis, das leicht geformt werde.......

Diskussion

Dieses Manuskript beschreibt Methoden zur Herstellung und Analyse eines 3D-hMMT-Kulturmodells, das auf Studien der grundlegenden Muskelbiologie, Krankheitsmodellierung oder für die Prüfung von Kandidatenmolekülen angewendet werden kann. Die MyoTACTIC-Plattform ist kostengünstig, einfach herzustellen und benötigt eine relativ kleine Anzahl von Zellen, um Skelettmuskel-Mikrogewebe herzustellen. hMMTs, die innerhalb der MyoTACTIC-Kulturplattform gebildet werden, bestehen aus ausgerichteten, mehrkernigen und quergestreiften .......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
0,9% Kochsalzlösung, sterile	Hausmarke	1010	10 mL Aliquots der Lösung werden hergestellt und bei 4° gelagert; C
25G Nadel	BD, Medstore, Universität Toronto	2548-CABD305127
6-Aminocapronsäure, ≥ 99% (Titration), Pulver	Sigma - Aldrich	A2504-100G	Eine Stammlösung von 50 mg / ml wird durch Auflösen von 5 mg 6-Aminocapronsäurepulver in 100 mL autoklaviertem, destilliertem Wasser erzeugt. Die Lösung wird vakuumfiltriert und 10 mL Aliquots werden bei 4° gelagert; C
6,35 mm ID Schlauch	VWR	60985-528
AB1167 Myoblast Cell Line	Institut de Myologie (Paris, Frankreich)
Arbiträrsignalgenerator	Rigol	DG1022Z
Basalmembranextrakt (Geltrex)	Thermo Fisher Scientific	A14132-02	Gelagert als Aliquots von 50 & Mikro; L oder 100 µ L bei -80°; C
Tisch-Vakuumkammer	Sigma - Aldrich	D2672
BNC auf Aligator Clip-Kabel			Bestellt bei Amazon
Culture Plastics	Sarstedt		Enthält Kulturplatten, serologische Pipetten usw
Dimethylsulfoxid	Sigma - Aldrich	D8418-250ML
DPBS, Pulver, kein Kalzium, kein Magnesium	Thermo Fisher Scientific
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1X)	Gibco	11995-065	Hierbei handelt es sich um ein DMEM mit hohem Glukosegehalt und L-Glutamin und Natriumpyruvat
Fetales Rinderserum	Fisher Scientific	10437028
Fibrinogen aus Rinderplasma	Sigma - Aldrich	F8630-5G	Aliquots im Bereich von 7 - 10 mg Fibrinogenpulver werden hergestellt und bei -20 ° C gelagert. C
Filtropur Spritzenfilter, 0,22 μm Porengröße	Sarstedt	83.1826.001
Pferdeserum	Gibco	16050-122
Humanes rekombinantes Insulin	Sigma - Aldrich	91077C	Stammlösung ist 100X und wird durch Auflösen von 1 mg humanem rekombinantem Insulin in 1 mL DMEM und 1 & Mikro hergestellt; L von NaOH 10N. Die Lösung wird filtriert und als 1 mL Aliquote bei 4 μg gelagert; C
Bilderfassungssoftware	Olympus	cellSens Dimension
Bildverarbeitungssoftware	National Institutes of Health	ImageJ
Isotemp Ofen	Thermo Fisher Scientific	201
Mikroskop	Olympus	IX83
Mikroskop - Kamerahalterung	Labcam	Labcam für iPhone	Bei Amazon bestellt
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)	Gibco	15140-122
Einwegspritzen aus Kunststoff, 1cc	BD	2606-309659
Einwegspritzen aus Kunststoff, 50cc	BD	2612-309653
Pluronic F-127, Pulver, BioReagenz	Sigma - Aldrich	P2443-250G	Eine 5%ige Stammlösung von Pluronsäure wird hergestellt, indem 5 g Pluronsäurepulver in 100 ml gekühltem, autoklaviertem, destilliertem Wasser aufgelöst werden. Die Lösung wird vakuumfiltriert und 10 mL Aliquots werden bei 4° gelagert; C
Polydimethylsiloxane (Sylgard 184 Silikonelastomer Kit)	Dow	4019862	Kits sind auch bei Thermo Fisher Scientific, Sigma - Aldrich usw. erhältlich.
Polyurethan-Negativform	im Haus
Trennmittel	Mann Release Technologies	200
Drehschieber-Vakuumpumpe	Edwards	A65401906
Skalpell	Almedic, Medstore, Universität von Toronto	2586-M36-0100
Einschneidige Rasierklinge	VWR	55411-050
Skelettmuskelzelle Basal Medium	Promocell	C-23260	30 mL Aliquote werden erzeugt und bei 4°C gelagert.
Wachstumsmedium für Skelettmuskelzellen (gebrauchsfertig)	Promocell	C-23060	42 mL Aliquots werden erzeugt und bei 4 °C gelagert.
Smartphone (iPhone)	Apple	SE
Standard Duty Trockenvakuumpumpe	Welch	2546B-01
Sterilisationsbeutel	Alliance	211-SCM2
Fingerhut	Igege		Bestellt bei Amazon
Thrombin aus menschlichem Plasma	Sigma - Aldrich	T6884-250UN	100 Einheiten Thrombin werden in 1 ml einer 0,1%igen BSA-Lösung gelöst. 10 & Mikro; L-Aliquots werden bei -20°C zubereitet und gelagert.
Verzinnter Kupferdraht	Arco	B8871K48	Bestellt bei Amazon
Trypan Blue Solution, 0,4 %	Thermo Scientific	15250061
Trypsin-EDTA, 0,25 %	Thermo FIsher Scientific	25200072
Vakuumkammer 2	SP Bel-Art	F42027-0000

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