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Methodenartikel

Bewertung funktioneller Metriken der Skelettmuskelgesundheit in Mikrobeschwerden der menschlichen Skelettmuskulatur

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DOI:

10.3791/62307

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18. Februar 2021

 ,  ,  , 
1Institute of Biomedical Engineering, University of Toronto, 2Donnelly Centre for Cellular and Biomolecular Research, University of Toronto, 3Department of Cell and Systems Biology, University of Toronto

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Manuskript beschreibt ein detailliertes Protokoll zur Herstellung von Arrays von 3D-Mikrogeweben der menschlichen Skelettmuskulatur und minimalinvasiven Downstream-In-situ-Funktionsassays, einschließlich kontraktiler Kraft- und Kalziumhandhabungsanalysen.

Zusammenfassung

Dreidimensionale (3D) In-vitro-Modelle der Skelettmuskulatur sind ein wertvoller Fortschritt in der biomedizinischen Forschung, da sie die Möglichkeit bieten, die Reform und Funktion der Skelettmuskulatur in einem skalierbaren Format zu untersuchen, das experimentellen Manipulationen zugänglich ist. 3D-Muskelkultursysteme sind wünschenswert, da sie es Wissenschaftlern ermöglichen, skelettierte Muskeln ex vivo im Kontext menschlicher Zellen zu untersuchen. 3D-In-vitro-Modelle ahmen Aspekte der nativen Gewebestruktur der erwachsenen Skelettmuskulatur genau nach. Ihre universelle Anwendung ist jedoch durch die Verfügbarkeit von Plattformen begrenzt, die einfach herzustellen, kostengünstig und benutzerfreundlich sind und relativ hohe Mengen an menschlichem Skelettmuskelgewebe liefern. Da die Skelettmuskulatur eine wichtige funktionelle Rolle spielt, die im Laufe der Zeit in vielen Krankheitszuständen beeinträchtigt wird, ist eine experimentelle Plattform für Mikrorisikostudien am praktischsten, wenn minimal-invasive Messungen der transienten und kontraktilen Kalziumkraft direkt in der Plattform selbst durchgeführt werden können. In diesem Protokoll wird die Herstellung einer 96-Well-Plattform namens "MyoTACTIC" und die Massenproduktion von 3D-Mikrogeweben (hMMTs) für menschliche Skelettmuskeln beschrieben. Darüber hinaus werden die Methoden für eine minimalinvasive Anwendung der elektrischen Stimulation beschrieben, die wiederholte Messungen der Skelettmuskelkraft und der Kalziumhandhabung jedes Mikrogewebes im Laufe der Zeit ermöglicht.

Einleitung

Die Skelettmuskulatur ist eines der am häufigsten vorkommenden Gewebe im menschlichen Körper und unterstützt wichtige Körperfunktionen wie Fortbewegung, Wärmehomöostase und Stoffwechsel1. In der Vergangenheit wurden Tiermodelle und zweidimensionale (2D) Zellkultursysteme verwendet, um biologische Prozesse und Krankheitspathogenese sowie pharmakologische Verbindungen bei der Behandlung von Skelettmuskelerkrankungen zu untersuchen2,3. Während Tiermodelle unser Wissen über die Skelettmuskulatur in Gesundheit und Krankheit stark verbessert haben, wurde ihre translationale Wirkung durch hohe Kosten, ethische Überlegungen und Unterschiede zwischen den Artenbehindert 2,4. Bei der Hinwendung zu menschlichen zellbasierten Systemen zur Untersuchung der Skelettmuskulatur sind 2D-Zellkultursysteme aufgrund ihrer Einfachheit günstig. Es gibt jedoch eine Einschränkung. Dieses Format versäumt es oft, die Zell-Zell- und Zell-extrazellulären Matrix-Interaktionen zu rekapitulieren, die natürlich im Körper auftreten5,6. In den letzten Jahren haben sich dreidimensionale (3D) Skelettmuskelmodelle als leistungsfähige Alternative zu Ganzentiermodellen und herkömmlichen 2D-Kultursystemen herauskristallisiert, indem sie die Modellierung physiologisch und pathologisch relevanter Prozesse ex vivoermöglichen 7,8. Tatsächlich haben eine Vielzahl von Studien über Strategien zur Modellierung der menschlichen Skelettmuskulatur in einem bioartifiziellen 3D-Kulturformatberichtet 1. Eine Einschränkung für viele dieser Studien besteht darin, dass die aktive Kraft nach der Entfernung des Muskelgewebes von den Kulturplattformen und der Befestigung an einem Kraftaufnehmer quantifiziert wird, was destruktiv ist und daher darauf beschränkt ist, als Endpunkt-Assay zu dienen9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 ,19,20,21. Andere haben Kultursysteme entwickelt, die nicht-invasive Methoden zur Messung der Wirkkraft ermöglichen, aber nicht alle sind für Molekültestanwendungen mit hohem Gehalt geeignet7,8,9,10,14,18,22,23,24,25,26,27,28 ,29.

Dieses Protokoll beschreibt eine detaillierte Methode zur Herstellung von Human Muscle Microtissues (hMMTs) in der Skelettmuskel (Myo) microTissue Array deviCe To Investigate forCe (MyoTACTIC) Plattform; ein 96-Well-Plate-Gerät, das die Massenproduktion von 3D-Skelettmuskel-Mikrogeweben30unterstützt. Die MyoTACTIC-Plattenherstellungsmethode ermöglicht die Erzeugung einer 96-Well-Polydimethylsiloxan (PDMS)-Kulturplatte und aller entsprechenden Well-Merkmale in einem einzigen Gießschritt, wobei jede Vertiefung eine relativ kleine Anzahl von Zellen für die Bildung von Mikrogeweben benötigt. Mikrogewebe, die in MyoTACTIC gebildet werden, enthalten ausgerichtete, gestreifte und mehrkernige Myotuben, die von Gut zu Brunnen des Geräts reproduzierbar sind und bei Reifung auf chemische und elektrische Reize in situ reagieren können30. Hierin werden die Technik zur Herstellung eines PDMS MyoTACTIC-Kulturplattengeräts aus einer Polyurethan (PU)-Replik, eine optimierte Methode zur Implementierung immortalisierter menschlicher myogener Vorläuferzellen zur Herstellung von hMMTs und die funktionelle Bewertung der technischen hMMT-Krafterzeugung und der Calciumhandhabungseigenschaften skizziert und diskutiert.

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Protokoll

1. PDMS MyoTACTIC Plattenherstellung

HINWEIS: PDMS MyoTACTIC Plattenherstellung erfordert eine PU-Negativform, die wie zuvor beschrieben hergestellt werden kann30. Die CAD-SolidWorks-Datei (Computer-Aided Design) für die MyoTACTIC-Plattenkonstruktion wurde auf GitHub (https://github.com/gilbertlabcode/MyoTACTIC-SolidWork-CAD-file) zur Verfügung gestellt.

  1. Bereiten Sie ~ 110 g PDMS-Polymerlösung in einem Einweg-Kunststoffbecher im Verhältnis 1:15 von Monomer zu Härter unter Verwendung der Komponenten im Siliconelastomer-Kit vor. Rühren Sie die Polymerlösung für 2-3 min mit einer 5 ml serologischen Einwegpipette, bis sie vollständig gemischt und homogen ist.
    VORSICHT: Vermeiden Sie PDMS-Polymerlösungenkontakt mit Haut und Augen; und vermeiden Sie das Einatmen. Tragen Sie beim Umgang mit der flüssigen PDMS-Mischung immer einen Laborkittel und Einweghandschuhe und lesen Sie das Sicherheitsdatenblatt (SDB) für spezifische Sicherheitsprotokolle.
    HINWEIS: Schützen Sie geräteoberflächen (z. B. Waage, Tischplatte usw.) mit einer Einwegabdeckung im Falle eines Verschüttens von PDMS-Polymerlösungen.
  2. Entgasen Sie die Mischung bei Raumtemperatur, indem Sie den Becher für ~ 30 minuten oder bis alle Blasen entfernt sind, in eine Tischvakuumkammer stellen, die an eine standardmäßige Trockenvakuumpumpe angeschlossen ist. Brechen Sie das Vakuum alle 5-10 Minuten, um die Entgasung zu unterstützen. Verwenden Sie ein leeres 50 ml Spritzenfass, um Luft zu tauchen und alle verbleibenden Blasen auf der Oberfläche der Polymermischung nach Bedarf auszublasen.
    HINWEIS: Ein Stück 6,35 mm ID-Schlauch kann zum Anschließen einer P1250-Pipettenspitze an den Lauf verwendet werden, um die Geschwindigkeit und Genauigkeit des Luftstroms zu verbessern.
  3. Während die PDMS-Polymerlösung entgast wird, entfernen Sie alle pdMS-Reste, die an der PU-Negativform haften, indem Sie die Kanten und die Oberfläche vorsichtig mit einem trockenen Papiertuch abwischen. Verwenden Sie die auf 70-100 kPag eingestellte Druckluft, um die verbleibenden feinen Partikel zu entfernen.
    HINWEIS: Schützen Sie die PU-Negativform vor Beschädigung und Partikelansammlung, indem Sie sie in einen verschließbaren Plastikbeutel legen und in einer Schublade aufbewahren, die vor dem Laborverkehr geschützt ist.
  4. Legen Sie die PU-Form in eine chemische Haube, die mit einer Einwegabdeckung geschützt wurde. Stellen Sie die Form horizontal auf ~75° und besprühen Sie die aktive Oberfläche mit einer gleichmäßigen Schicht Trennmittel. Besprühen Sie die Form von oben nach unten, dann von links nach rechts, während Sie die Dose 15-20 cm von der Form halten und eine flüssige Hin- und Herbewegung verwenden. Drehen Sie die Form um 180 ° und wiederholen Sie das Sprühen, dann lassen Sie die PU-Form für 10-15 min in der chemischen Haube sitzen, um zu trocknen.
    VORSICHT: Stellen Sie sicher, dass Trennmittel in einem chemischen Abzug verwendet wird, vermeiden Sie den Kontakt mit Haut und Augen und lesen Sie das Sicherheitsdatenblatt (SDB) für spezifische Sicherheitsprotokolle
    HINWEIS: Ein dünner Film muss die aktive Oberfläche vollständig bedecken, aber im nächsten Schritt kann eine übermäßige Beschichtung auf das PDMS übertragen werden, was sich wiederum negativ auf die hMMT-Aussaat auswirken kann. Die Oberfläche sollte sich glatt anfühlen, aber nicht nass.
  5. Gießen Sie 100 g PDMS gleichmäßig in die PU-Form und legen Sie sie in eine Vakuumkammer, die mit einer Drehschieber-Vakuumpumpe verbunden ist. Entgasen Sie die PDMS-gefüllte Form für ~ 45 minuten und brechen Sie die Vakuumdichtung alle 5-10 Minuten für die ersten 20 Minuten, um den Prozess zu beschleunigen. Lassen Sie es in der Vakuumkammer, bis die PDMS-Mischung vollständig frei von allen Blasen ist.
    HINWEIS: Eine Drehschieber-Vakuumpumpe wird verwendet, um ein niedrigeres Vakuum zu erreichen und die für diesen Schritt erforderliche Zeit zu reduzieren. Die Entgasung des PDMS-gefüllten Werkzeugs kann mit der Tischvakuumkammer und der standardmäßigen Trockenvakuumpumpe durchgeführt werden, jedoch ist die Zeit, um die Mischung aller Blasen zu entleeren, länger. Wesentlich ist die Entfernung aller Blasen aus der PDMS-Polymerlösung, insbesondere in den Regionen, die dazu bestimmt sind, hMMT-Verankerungspfosten zu werden. Blasen in dieser Region führen zu Ankerbruch, dem Verlust von Kulturbrunnen und wiederum dazu, dass ein kleines Stück PDMS in der Form verkeilt bleibt.
  6. Die entgaste PDMS-gefüllte PU-Form in einen 65 °C heißen Ofen geben und über Nacht inkubieren, um den flüssigen Gummi auszuhärten.
  7. Entfernen Sie die ausgehärtete PDMS-Positivplatte aus dem Ofen und kühlen Sie die Platte bei Raumtemperatur für mindestens 30 min ab.
  8. Lösen Sie mit einem klingenlosen Skalpell ausgehärtetes PDMS vorsichtig von der PU-Form, indem Sie die Rückseite des Griffs zwischen dem PDMS und den Wänden der Form führen. Beginnen Sie entlang der oberen Kante und trennen Sie alle 4 Seiten, bevor Sie auf die Basis der Form drücken und diesen Teil ablösen. Dieser Schritt ist abgeschlossen, wenn die Rückseite des Griffs reibungslos zwischen dem PDMS und allen 4 Wänden der PU-Form verläuft.
    HINWEIS: Arbeiten Sie langsam und vorsichtig mit dem klingenlosen Skalpell, um zu verhindern, dass die PU-Form reißt oder das PDMS zerreißt. Dieser Schritt sollte 15-20 Minuten dauern.
  9. Verwenden Sie ausgehend von einem Ende das klingenlose Skalpell, um den Rand des PDMS anzuheben und die Finger zwischen der ausgehärteten PDMS-Kulturplatte und der PU-Form zu arbeiten. Drücken Sie dann mit beiden Händen die Finger weiter unter die Platte und schälen Sie sich langsam nach oben und aus der PU-Form.
    HINWEIS: Arbeiten Sie langsam und verwenden Sie beide Hände, um den Teller gleichmäßig zu schälen. Minimieren Sie das Biegen, um die Wahrscheinlichkeit eines Ankerbruchs zu verringern. Dieser Schritt sollte 5-10 Minuten dauern.
  10. Verwenden Sie eine einschneidige Rasierklinge, um die Platte in Gruppen von 6 ± 2 MyoTACTIC-Vertiefungen (Abbildung 1) für Gewebeaussaatzwecke zu schneiden. Legen Sie vollständige MyoTACTIC-Platten oder Plattenportionen in einen Instrumentensterilisationsbeutel und Autoklaven für einen 25-minütigen Trockenzyklus (20 Minuten Sterilisationszeit und 5 Minuten Trocknungszeit) bei 120 ° C und 100-140 kPag.

2. Kultur von immortalisierten menschlichen Myoblasten-Vorläuferzellen

HINWEIS: Die in diesem Protokoll verwendeten immortalisierten Myoblasten wurden vom Institut de Myologie (Paris, Frankreich)31bezogen.

  1. Erhalten Sie eine Durchstechflasche mit gefrorenen Zellen aus dem flüssigen Stickstoff-Dewar und tauen Sie die Durchstechflasche in einem 37 °C warmen Wasserbad (in weniger als 1 minute) schnell auf. Die Zellen werden in einer Dichte von 7,5 x 105 Zellen pro 1 ml Gefriermedium eingefroren, das zu 90% aus fötalem Rinderserum (FBS) und 10% Dimethylsulfoxid (DMSO) besteht.
  2. Geben Sie den Inhalt der Durchstechflasche vorsichtig in ein konisches 15-ml-Röhrchen mit 9 ml vorgewärmtem Waschmedium, bestehend aus 89% DMEM 1x, 10% FBS und 1% Pen/Strep, um das DMSO zu verdünnen. Drehen Sie das 15 mL konische Rohr bei 400 x g für 10 min und saugen Sie dann das Medium ab, wobei Sie darauf achten, das Zellpellet zu vermeiden.
  3. Resuspendieren Sie das Pellet in 1 ml Wachstumsmedium, bestehend aus 84% Skelettmuskelzell-Basalmedium mit Skelettmuskelzell-Wachstumsmedium-Ergänzungsmischung, 15% FBS und 1% Pen / Streptokokken, und übertragen Sie es dann in ein 50 ml konisches Röhrchen mit 29 ml Wachstumsmedien.
  4. 10 mL Medien mit etwa 2,5 x 105 Zellen werden in eine 100 mm x 20 mm große Zellkulturschale überführt. Wiederholen Sie diesen Schritt mit den verbleibenden 20 ml der Zelllösung. Anschließend werden Zellkulturschalen in einen befeuchteten Zellkultur-Inkubator mit 37 °C und 5%CO2 überführt.
  5. Aktualisieren Sie die Kulturmedien jeden zweiten Tag. Kultivieren Sie die Zellen, bis sie ~ 70% -80% Konfluenz erreichen (typischerweise 4-5 Tage), an welchem Punkt die Zellen für die Aussaat vorbereitet sind. 1,5 x 105 Zellen werden benötigt, um jedes hMMT zu erzeugen. Passieren Sie daher die Zellen nach Bedarf, um die erforderliche Anzahl von Zellen zu erreichen.
    HINWEIS: Die immortalisierten Myoblasten-Vorläuferzelllinien sollten niemals 80% Konfluenz überschreiten, bevor Zellen in MyoTACTIC-Vertiefungen ausgesät, die Zellen weitergegeben oder Gefrierlager vorbereitet werden. hMMTs, die aus Zellen hergestellt werden, die 80% Konfluenz überschritten haben, erreichen oft keine kontraktile Reife. Passaging-Verfahren sind identisch mit den unten in Schritt 3 beschriebenen Methoden.

3. Aussaat von hMMTs mit MyoTACTIC

  1. Vorbereitung von MyoTACTIC-Kulturtöpfen und Reagenzien für die hMMT-Aussaat.
    HINWEIS: Dieses Protokoll enthält spezifische Details, um 6 hMMTs zu erzeugen.
    1. 2-3 h vor der Zellaussaat eine 6 Well MyoTACTIC Plattenportion in eine 10 cm große Zellkulturschale geben. Bereiten Sie jede einzelne MyoTACTIC-Kultur gut vor, indem Sie 100 μL einer 5% igen pluronic F-127-Lösung in jede Vertiefung geben. Legen Sie den Deckel auf die 10 cm Kulturschale, tragen Sie Paraffin auf, um den Raum zwischen der 10 cm Schale und dem Deckel zu versiegeln, und legen Sie dann die 10 cm Platte mit dem MyoTACTIC-Teil in eine Zentrifuge, die mit einem Plattenspinner-Adapter ausgestattet ist.
      HINWEIS: Wenn kein Zentrifugenplatten-Spinneradapter verfügbar ist, kann eine p20-Pipettenspitze verwendet werden, um Blasen hinter den Pfosten vorsichtig zu entfernen, wodurch sichergestellt wird, dass die gesamte Kulturoberfläche gleichmäßig beschichtet ist.
    2. Zentrifugiere bei 1.550 x g für 1 min, um alle Blasen in Kulturbrunnen, insbesondere hinter den Pfosten, zu entfernen. Die 10 cm große Zellkulturschale mit der MyoTACTIC-Plattenportion mit Pluronic F-127-Lösung bei 4 °C aufbewahren, bis die Zellen für die Aussaat vorbereitet sind.
      HINWEIS: Die pluronic F-127-Beschichtung kann für nur 2 h bis 24 h aufgetragen werden. Zum Beispiel können Brunnen am Ende des Tages mit Pluronic F-127-Lösung gefüllt werden, um sie am nächsten Tag zu verwenden. Überschreiten Sie nicht 24 h, da dies negative Auswirkungen auf den hMMT-Umbau hat und kein gesundes Gewebe bildet, das die kontraktile Reife erreicht.
    3. Einen 50 μL Basalmembranextrakt Aliquot und einen 10 μL Thrombin Aliquot (100 U/ml Stammlösung) auf Eis in der Kulturhaube langsam auftauen.
      HINWEIS: Gefrieren Sie die Aliquots des Basalmembranextrakts nicht erneut ein. Sie sind für den einmaligen Gebrauch. Thrombin-Aliquots sind wiederverwendbar und frieren daher nach Gebrauch bis zu 5 Mal wieder ein.
    4. ~ 7 mg pulverisiertes Fibrinogen in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen einwiegen und dann in die Zellkulturhaube überführen. 700 μL 0,9% (gew./vol) NaCl-Lösung in Wasser (oder Salzlösung) zugeben, um eine 10 mg/ml Endkonzentrationslösung zu erhalten. Fibrinogen nicht zum Auflösen vorwirbeln, sondern das Röhrchen für 3-5 min in einen 37 °C Zellkultur-Inkubator geben.
    5. Entfernen und streichen Sie das Röhrchen vorsichtig, dann pulsieren Sie die gelöste Lösung in einer Tisch-Mini-Zentrifuge (Mikrofuge) und kehren Sie zur Kulturhaube zurück. Filtrieren Sie die Fibrinogenlösung mit einer 1 ml Spritze, die mit einem 0,22 μm Spritzenfilter ausgestattet ist. Übertragen Sie die gelöste Fibrinogenlösung zusammen mit dem Basalmembranextrakt und den Thrombin-Aliquots auf Eis.
    6. Bereiten Sie schließlich das hMMT-Aussaatmedium vor, das nach dem Aussaaten der Gewebe in die Kulturtöpfe eingeführt wird. Dieses Medium enthält Skelettmuskelzell-Basalmedium, ergänzt mit 20% FBS, 1% P/S und 3% 6-Aminocapronsäure (ACA; 1,5 mg/ml Endkonzentration wird durch Verdünnung aus einer 50 mg/ml Stammlösung erreicht; % wird als v/v ausgedrückt). Vorwärmen Sie das Medium vor Gebrauch bei 37 °C vor.
  2. Vorbereitung von Zellen für die hMMT-Aussaat.
    1. Sammeln Sie die Zellkulturplatten aus dem Kulturinkubator. Saugen Sie das Medium von jeder Platte ab und waschen Sie die Zellen dann einmal mit D-PBS, indem Sie 5 ml D-PBS in jede Kulturplatte geben. Als nächstes aspirieren Sie das D-PBS und lösen Sie die Zellen, indem Sie 1 ml 0,25% Trypsin-EDTA in jede Kulturschale geben. Für 3 Min. in den Zellkultur-Inkubator geben.
    2. Halten Sie das Trypsin an, indem Sie 3 ml Waschmedium (89% von 1x DMEM + 10% FBS + 1% Pen / Strep) zur Kulturschale geben. Die Zelllösung wird in ein konisches Röhrchen mit geeigneter Größe überführt und dann die Zellen durch Zentrifugieren bei 400 x g für 10 min pelletiert. Aspirieren Sie die Medien und achten Sie darauf, das Zellpellet zu vermeiden. Dann resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml des Waschmediums.
    3. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und Trypanblaufarbstoff unter Hellfeldmikroskopie.
      Wenn Sie mehrere Zellplatten verwenden, ist diese Zellsuspension sehr konzentriert. Verdünnen Sie zellsuspensionen, bevor Sie nach Bedarf zählen.
    4. Da jedes Gewebe 150.000 Zellen benötigt, die in 15 μL der extrazellulären Matrix (ECM) -Mischung resuspendiert werden, werden 900.000 Zellen in 90 μL ECM-Mischung für 6 Gewebe benötigt. Um den Zell-ECM-Lösungsverlust zu berücksichtigen, der während des Herstellungsprozesses aufgrund von Blasenbildung oder Pipettenverlust auftritt, bereiten Sie eine zusätzliche Zell-ECM-Mischung vor (dh 8 Gewebe oder 1.200.000 Zellen in 120 μL ECM). Übertragen Sie das Volumen der Zellsuspension mit 1.200.000 Zellen in ein neues konisches Rohr. Erhöhen Sie das Volumen auf 10 ml mit Waschmedium und drehen Sie es bei 400 x g für 10 min.
    5. Während sich die Zellen drehen, bereiten Sie 150 μL ECM-Mischung in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen nach dem folgenden Rezept vor. Zuerst 60 μL DMEM (40% Volumen), dann 60 μL Fibrinogen 10 mg/ml Lösung (40% Volumen) und schließlich 30 μL Kellermembranextrakt (20% Volumen) hinzufügen. Lagern Sie die ECM-Mischung bis zum Gebrauch auf Eis.
      HINWEIS: Verwenden Sie immer Spitzen, die bei -20 °C vorgekühlt sind, wenn Sie mit Lösungen arbeiten, die Basalmembranextrakt enthalten. ECM-Mischung enthält 4 mg/ml Fibrinogen.
  3. Aussaat von hMMTs
    1. Sammeln Sie das konische Rohr, das die abgesponnenen Zellen enthält, und saugen Sie die Medien ab, wobei Sie darauf achten, das Zellpellet zu vermeiden. Streichen Sie kräftig mit einem behandschuhten Finger über das Ende der Röhre, um das Pellet zu entfernen, und fahren Sie fort, bis das Pellet als Zellschlamm erscheint.
      HINWEIS: Es ist wichtig, so viele Waschmedien wie möglich abzusaugen, um sicherzustellen, dass die Zell-ECM-Suspension die gewünschte Verdünnung aufweist. Verwenden Sie bei Bedarf eine Pipette, um die verbleibenden Waschmedien zu entfernen.
    2. 120 μL der ECM-Lösung in das Röhrchen mit dem Zellpellet überführen. Pipettieren Sie auf und ab, um die Zellen innerhalb des ECM gründlich zu resuspendieren, um eine einzelne Zellsuspension zu erzeugen. Pipettieren Sie langsam und vorsichtig, um das Einbringen von Blasen zu vermeiden, die das Arbeitsvolumen reduzieren würden. Legen Sie dann die Zell-ECM-Lösung bis zum Gebrauch auf Eis.
    3. Holen Sie MyoTACTIC-Plattenportionen mit pluronic F-127 beschichteten MyoTACTIC-Vertiefungen aus dem 4 °C-Kühlschrank und legen Sie die 10 cm große Schale mit den MyoTACTIC-Vertiefungen auf einen Eisbeutel in der Zellkulturhaube.
    4. Aspirieren Sie die Pluronic F-127-Lösung aus jeder Vertiefung. Das PDMS ist porös und saugt die pluronic F-127-Lösung auf, insbesondere wenn die Platten mit einer Zentrifuge heruntergesponnen wurden. Lassen Sie die restliche Pluronic F-127-Lösung freisetzen und setzen Sie sich auf dem Boden des Bohrlochs ab, indem Sie die Vertiefungen 5 Minuten lang ruhen lassen und dann erneut absaugen.
      HINWEIS: Verwenden Sie eine Pasteurpipette mit einer p1250-Spitze am Ende und einer p200-Spitze über der p1250-Spitze, wenn Sie die Pluronic F-127-Lösung ansaugen. Dies verbessert die Präzision, um ein versehentliches Absaugen der Pfostenstrukturen zu verhindern. Vermeiden Sie es, den ovalen poolförmigen Zellsaatbereich am Boden des Bohrlochs mit der Pipette abzukratzen, da dies die Pluronic F-127-Beschichtung stört und den hMMT-Selbstorganisationsprozess stört. Die richtige Technik besteht darin, die Pipettenspitze direkt über den ovalen Pool zu bewegen, während die Pluronic F-127-Lösung abgesaugt wird.
    5. Pipettieren Sie die Zell-ECM-Suspension vorsichtig, um alle Zellen, die möglicherweise auf den Boden der Röhre gesunken sind, wieder zu verstopfen. Anschließend werden 105 μL Zell-ECM-Suspension in ein frisches, vorgekühltes 1,5-ml-Röhrchen gegeben. Achten Sie darauf, das Rohr in der Nähe der Oberseite zu greifen, um zu verhindern, dass sich die Lösung erwärmt.
    6. 0,84 μL der 100 U/ml Thrombin-Stammlösung in die 105 μL Zell-ECM-Suspension gegeben werden, um eine Endkonzentration von 0,2 U/mg Fibrinogen zu erhalten. Pipettieren Sie schnell, vorsichtig und gründlich, um zu mischen, während Sie die Einführung von Blasen vermeiden.
      HINWEIS: Thrombin initiiert die schnelle Umwandlung von Fibrinogen in ein Fibringerinnsel. Daher gibt es nur eine begrenzte Zeit, um die Gewebe bei Thrombinzugabe auszusäen. Um eine vorzeitige Gerinnung zu vermeiden, bevor das Zell-ECM-Gemisch in die Kulturtöpfe überführt wird, stellen Sie eine p20-Pipette auf 15 μL, bevor Sie das Thrombin hinzufügen. Verwenden Sie vorgekühlte Spitzen oder tauchen Sie die Pipettenspitze für einige Sekunden in eiskaltes DMEM, bevor Sie 15 μL der Zell-ECM-Mischung sammeln und in jede Vertiefung übertragen. Es ist eine bewährte Methode, Zell-ECM-Mischung Aliquots so herzustellen, dass nicht mehr als 6 hMMTs gleichzeitig ausgesät werden.
    7. Um die Gewebe zu säen, fügen Sie 15 μL Zell-ECM-Mischung (dh 150.000 Zellen) zu jeder einzelnen Vertiefung hinzu. Fügen Sie vorsichtig eine Zell-ECM-Mischung in die Mitte des ovalen Pools hinzu und vermeiden Sie es, die Pipettenspitze in den Boden des Brunnens zu drücken. Verteilen Sie dann mit zwei leichten Bewegungen die Zellsuspension hinter jedem Pfosten im Brunnen. Sobald die Oberfläche gleichmäßig mit der Zell-ECM-Suspension beschichtet ist, fahren Sie mit der nächsten Vertiefung fort.
      HINWEIS: Arbeiten Sie effizient, um eine vorzeitige Gelierung der Zell-ECM-Mischung im Röhrchen zu vermeiden, bevor alle Gewebe ausgesät sind. Bei der Aussaat der Bohrlöcher ist es äußerst wichtig, die Übertragung von Blasen zu vermeiden, da die Blase den Umbau des hMMT stört und das hMMT unbrauchbar macht.
    8. Legen Sie den Deckel auf die 10 cm große Kulturplatte mit den ausgesäten Vertiefungen und geben Sie ihn für ca. 5 min in einen 37 °C gewebekulturellen Inkubator.
      HINWEIS: Geben Sie das Mikrozentrifugenröhrchen mit dem Restzell-ECM-Gemisch zur Bestätigung des Gelpolymerisationsprozesses in den Inkubator.
    9. Nachdem die Zell-ECM-Mischung polymerisiert ist, werden 200 μL vorgewärmte hMMT-Aussaatmedien zu jeder MyoTACTIC-Vertiefung gegeben. Setzen Sie den Deckel der 10-cm-Schale wieder ein und geben Sie die MyoTACTIC-Plattenportionen innerhalb der 10-cm-Schüssel in den Inkubator zurück. Dieser Zeitpunkt wird als Tag -2 bezeichnet. Stören Sie das Gewebe bis zum nächsten Schritt nicht.
  4. Differenzierung von hMMTs
    1. Nach 2 Tagen Inkubation das hMMT-Saatmedium vorsichtig mit einer Pipette entfernen und durch 200 μL vorgewärmte Differenzierungsmedien ersetzen, die 2% Pferdeserum, 1% Pen/Streptokokken, 4% ACA (d. h. 2 mg/ml Endkonzentration aus einer Stammkonzentration von 50 mg/ml; % wird als v/v ausgedrückt) und 10 μg/ml humanes rekombinantes Insulin in DMEM enthalten. Dieser Zeitpunkt wird als Tag 0 der Differenzierung bezeichnet.
    2. Tauschen Sie danach jeden zweiten Tag die Hälfte der Medien mit frischen Differenzierungsmedien bis zum Tag 12 der Differenzierung, dem letzten Tag der Kultur, aus (Abbildung 2a).
      HINWEIS: Protokolldetails zur Herstellung von hMMTs unter Verwendung primärer menschlicher Myoblasten wurden an anderer Stelle veröffentlicht30. Wenn es Bedenken hinsichtlich der Zelllebensfähigkeit nach der Aussaat gibt, inkubieren Sie hMMTs mit Calcein und Propidiumiodid, um die Lebensfähigkeit zu quantifizieren.

4. Elektrische Stimulation und Analyse der hMMT-induzierten Nachauslenkung

  1. Richten Sie eine durchsichtige Boden-Glas- oder Kunststofftischhalterung an einem inversen Mikroskop ein und befestigen Sie eine Smartphone-Kamera mit einer Mikroskop-Kamerahalterung am Mikroskopokular. Es wird eine Phasenkontrastmikroskopie mit 10-facher Vergrößerung verwendet (Abbildung 3a).
    HINWEIS: Jedes invertierte Phasenkontrastmikroskop, das mit einem 10-fachen Vergrößerungsobjektiv ausgestattet ist, ist geeignet. Die PDMS-Brunnenkonstrukte werden aus der 10 cm großen Schüssel entfernt und direkt auf die klare Bodentischhalterung gelegt und somit zur Luft hin geöffnet. Sterilisieren Sie alle Oberflächen und Geräte mit 70% Ethanol und minimieren Sie den Verkehr in der Umgebung während des Experimentierens.
  2. Um die elektrischen Stimulationselektroden vorzubereiten, schneiden Sie ~ 30 cm verzinnten Kupferdraht. Dann, beginnend an der Nabe einer 25 G normalen Fasennadel, wickeln Sie ~ 10 cm des Drahtes fest um die obere Hälfte und lassen Sie ~ 20 cm überschüssigen Draht zurück. Wiederholen Sie dies für eine zweite Nadel und schneiden Sie dann die Nabe von jeder Nadel ab.
    HINWEIS: Der Draht muss um die Nadel fest sein, um sicherzustellen, dass er sich nicht bewegt, und der mit Draht umwickelte Teil der Elektrode darf das PDMS nicht berühren, da dies die Erzeugung elektrischer Felder behindern kann.
  3. Verbinden Sie das BNC-an-Krokodilclip-Anschlusskabel an einem Ausgangskanal am Wellenformgenerator und stellen Sie den Kanal für Rechteckimpulse mit 20% Tastverhältnis, 5 V Amplitude (elektrische Feldstärke von 10 V/cm) ein. Die Frequenz ändert sich zwischen 0,5 Hz und 20 Hz für Zuckungen bzw. Tetanuskontraktionen.
    HINWEIS: Die Einstellungen des Wellenformgenerators erfordern möglicherweise eine experimentspezifische Optimierung.
  4. Legen Sie einen MyoTACTIC-Plattenteil mit hMMTs auf das Mikroskoptisch und führen Sie jedes Elektrodenfasenende vorsichtig in das PDMS direkt hinter jedem Pfosten im ovalen Pool ein. Kleben Sie die 20 cm langen Abschnitte des überschüssigen Drahtes vorsichtig auf den Mikroskoptisch ab, so dass die Nadeln vertikal bleiben und ~ 10 cm jedes Drahtes für den Anschluss frei bleiben (Abbildung 3a).
    VORSICHT: Legen Sie niemals einen bloßen Finger über eines der Enden der Elektrode. Stellen Sie sicher, dass ein Fingerhut am Zeigefinger getragen wird, um beim Einführen in das PDMS leichten Druck auf die Elektrode auszuüben.
  5. Fokussieren Sie das Sichtfeld des Mikroskops auf einen von zwei Pfosten, so dass der Fokus an der Pfostenkante, die der Elektrode am nächsten ist, scharf ist. Sperren Sie dann den Fokus der Smartphone-Kamera auf den klarsten Bereich des Beitrags. Dies ist wichtig für die nachgelagerte Analyse, da eine Änderung des Fokus während der Aufzeichnung die Analyse beeinträchtigt.
  6. Verbinden Sie die freien Enden der abgeklebten Drähte über Krokodilklemmen mit dem Wellenformgenerator (Abbildung 3a).
  7. Starten Sie die Videoaufzeichnung auf der Smartphone-Kamera und schalten Sie dann den Kanalausgang ein, um die Stimulation zu initiieren. Induzieren Sie das hMMT, um 3 Zuckungen und 3 Tetanuskontraktionen zu durchlaufen, mit 2 Minuten Ruhe zwischen der Twitch- und Tetanus-Stimulationsserie.
  8. Schalten Sie den Kanalausgang aus, lösen Sie Krokodilklemmen von den verzinnten Kupferdrähten, entfernen Sie das Klebeband von den Drähten und wischen Sie jede Elektrode mit 70% Ethanol ab, bevor Sie sie in nachfolgende hMMT-Vertiefungen einführen. Wiederholen Sie den Vorgang aus Schritt 4.5 für alle hMMTs.
    HINWEIS: Begrenzen Sie die Zeit, die hMMTs außerhalb des Inkubators verbringen, indem Sie nicht mehr als 3 Gewebe gleichzeitig stimulieren. Wenn zusätzliche hMMTs innerhalb des MyoTACTIC-Plattenanteils noch analysiert werden müssen, geben Sie die Platte für 10 minuten in den Inkubator zurück, damit die hMMTs wieder auf 37 °C zurückkehren können.
  9. Um die Nachauslenkung zu analysieren, um die hMMT-Krafterzeugung zu berechnen, verwenden Sie das benutzerdefinierte Skript, das auf GitHub verfügbar gemacht wurde (https://github.com/gilbertlabcode/myoTACTIC). Befolgen Sie die Anweisungen in README.md, um das Skript einzurichten und zu starten, und öffnen Sie dann jedes Post-Tracking-Video, um die Kraftanalyse durchzuführen.
  10. Wählen Sie eine Region of Interest (ROI) entlang der Pfostenkante aus, die für die Verschiebung nachverfolgt werden soll. Drücken Sie die Eingabetaste, um den ROI zu bestätigen, und drücken Sie erneut die Eingabetaste, um das Skript auszuführen (Ergänzendes Video 1).
    HINWEIS: Große Ablenkungen führen dazu, dass der Tracker ausfällt. Wenn der Tracker während der Kontraktion ausfällt, kann die ROI-Größe erhöht werden, um das Tracking weniger empfindlich zu machen, aber die Verfolgung großer Ablenkungen zu ermöglichen. Drei Größen werden im Code bereitgestellt und können durch Anpassen der Skriptkommentare optimiert werden.
  11. Das Skript endet mit zwei Eingabeanforderungen. Geben Sie zunächst y ein, um zu bestätigen, dass das Video mehrere Kontraktionen enthielt. Geben Sie anschließend y (ja) oder n (nein) ein, um die Ergebnisse in eine zu exportieren. CSV-Datei (Supplemental Video 1).
  12. Stellen Sie sicher, dass die Ergebnisse nach der Ablenkung für jede Kontraktion als Verschiebung in Pixeln gemeldet werden. Konvertieren Sie Pixel in μm-Werte für die Einstellung für die 10-fache Vergrößerung des Mikroskops. Konvertieren Sie dann die Post-Displacement-Zahlen in absolute kontraktile Kräfte (μN), indem Sie die Werte (μm) mit dem Kraft-Weg-Umrechnungsfaktor von 2,36 μN / μm multiplizieren, was dem Verhältnis von 1:15 Härtungsmittel zu Monomer des in der MyoTACTIC-Herstellung30verwendeten PDMS entspricht.

5. Calcium-Transientenanalyse mittels elektrischer Stimulation

HINWEIS: Für Experimente zur Handhabung von Kalzium wurden immortalisierte Myoblasten mit dem MHCK7-GCAMP6-Reporter stabil transduziert, wie zuvor beschrieben11,12. Transduzierte Zellen wurden FACS-sortiert, um die positive Population zu erhalten, und dann zur Herstellung von hMMTs verwendet. Alternative Methoden für die Kalziumbildgebung wie die Verwendung von verhältnismetrischen Farbstoffen wie Fura-2 AM und Indo-1 oder die Fluoreszenzlebensdauerbildgebung von Kalziumindikatoren (z. B. Fluo-4 oder Oregon Green BAPTA1) können für unser System zugänglich sein.

  1. Richten Sie den Mikroskoptisch und die Stimulationsausrüstung (Elektroden, Wellenformgenerator usw.) wie zuvor in Schritt 4 beschrieben ein. Verwenden Sie für dieses Experiment eine 4-fache Vergrößerung.
    HINWEIS: Ein dunkler Raum und ein Epifluoreszenzmikroskop, das mit einer CCD-Kamera ausgestattet ist, werden benötigt.
  2. Starten Sie die Mikroskopbildgebungssoftware, wählen Sie den FITC-Filterkanal (blaues Licht) und wählen Sie die Filmaufnahmefunktion. Eingestellt bei einer Belichtung von 500 ms und einer Auflösung von 680 x 510 (Binning 2x2).
    HINWEIS: Die Bildgebungssoftware kann variieren und die Belichtung wird vom Benutzer manuell eingestellt. Achten Sie darauf, hMMT vor der Stimulation überexposition zu vermeiden. In Ruhe ist ein dunkler Gewebekontur/ -schatten mit spontaner Fluoreszenz normal, während ein klares Gewebebild überbelichtet ist (Supplemental Video 2). Stellen Sie sicher, dass die Belichtung für alle hMMTs innerhalb eines Experiments konsistent ist.
  3. Schließen Sie den Mikroskopverschluss und halten Sie den FITC-Kanal ausgeschaltet, bis Sie bereit sind, die Kalziumbehandlung aufzuzeichnen.
  4. Wenn alle Geräte und Software eingerichtet sind, rufen Sie den MyoTACTIC-Plattenteil mit den zu analysierenden hMMTs ab und legen Sie ihn direkt auf das Mikroskoptisch. Führen Sie dann die Elektroden wie zuvor in Schritt 4 beschrieben ein und verbinden Sie sie.
  5. Verwenden Sie das Hellfeld, um das Sichtfeld auf die Mitte des ausgewählten hMMT zu fokussieren. Schalten Sie dann die Lampe aus.
  6. Öffnen Sie den FITC-Kanalverschluss des Mikroskops, vergewissern Sie sich, dass blaues Licht eingeschaltet ist, und wählen Sie dann in der Software Filmaufnahme aus.
  7. Schalten Sie den Ausgang des Wellenformgenerators ein, um die elektrische Stimulation zu initiieren. Induzieren Sie die hMMT, um 8 Zuckungen und 8 Tetanuskontraktionen zu durchlaufen. Planen Sie 2 Minuten Ruhe zwischen der Twitch- und Tetanus-Stimulationsserie ein, während der sich der FITC-Verschluss in der geschlossenen Position befindet.
    HINWEIS: Erlauben Sie 10 s spontane Aktivität vor und nach der elektrischen Stimulation, um die minimale Fluoreszenz für Berechnungs- und Datenanalysezwecke aufzuzeichnen.
  8. Schalten Sie den Kanalausgang aus, lösen Sie Krokodilklemmen von den verzinnten Kupferdrähten, entfernen Sie das Band von den Drähten und wischen Sie jede Elektrode mit 70% Ethanol ab, bevor Sie sie in nachfolgende hMMT-Vertiefungen einführen. Wiederholte Stimulation und Aufnahmeverfahren für alle hMMTs.
  9. Speichern Sie Filme im TIFF-Dateiformat zur Analyse in ImageJ oder einer alternativen Imaging-Software.
    HINWEIS: Begrenzen Sie die Zeit, die hMMTs außerhalb des Inkubators verbringen, indem Sie nicht mehr als 3 Gewebe gleichzeitig stimulieren. Wenn zusätzliche hMMT innerhalb des MyoTACTIC-Plattenanteils noch analysiert werden muss, geben Sie das Gerät für 10 Minuten in den Inkubator zurück, damit die hMMTs wieder auf 37 °C zurückkehren können.
  10. Um die Transientendaten von Kalzium zu analysieren, öffnen Sie zuerst ImageJ. Wählen Sie Analysieren, dann Messungen festlegen, wählen Sie dann den grauen Mittelwert aus, und deaktivieren Sie alle anderen Optionen. Wenn Sie fertig sind, öffnen Sie ein Kalziumvideo (.tiff) (Ergänzendes Video 2).
  11. Skizzieren Sie den Rand der Mikrobearbeitung mit einem Polygonauswahlwerkzeug und speichern Sie diesen Bereich als ROI (Supplemental Video 2). Wählen Sie im Fenster ROI-Manager unter Mehr die Option Multi Measure aus und messen Sie die Fluoreszenzintensität für alle Datei-Slices in einer Zeile pro Slice (Ergänzendes Video 2).
  12. Kopieren Sie alle Messungen, einschließlich der Scheibennummer (Frame), in eine Tabelle und vergleichen Sie die Fluoreszenzintensität jeder Scheibe mit der minimalen spontanen Fluoreszenzintensität aus der Datei mit ΔF/F0 = (Fsofort - FMinimum)/ FMinimum (Supplemental Video 2).
  13. Berechnen Sie die Zeit für jedes Bild, indem Sie die Bildgeschwindigkeit der Filmaufnahme mit der Slice-Zahl (Frame) multiplizieren und ΔF/F0 gegen die Zeit für die hMMT-Kalzium-Transientenreaktion auf Stimulation darstellen (Supplemental Video 2).
  14. Wählen Sie das Peak-Calcium-Transientensignal für jede der 6 aufeinanderfolgenden Kontraktionen und Durchschnittswerte, um die relative mittlere Peak-Fluoreszenzintensitätsänderung jedes hMMT zu berechnen (Supplemental Video 2).
    HINWEIS: Schließen Sie Daten, die sich aus der ersten Zuckungskontraktion ergeben, immer aus der Gesamtanalyse aus. Eine Tabelle mit dem Titel "Calcium Handling Template.xlsx" wurde auf GitHub (https://github.com/gilbertlabcode/Calcium-Handling-Template-) bereitgestellt, um die hMMT-Calcium-Transientenanalyse zu erleichtern. Ausfüllbare Zellen, in denen Werte und Eingaben eingegeben werden sollen, sind grau hervorgehoben. Stellen Sie sicher, dass Sie die Peak-Auswahlzahlen anpassen, da dies nur ein Leitfaden zur Unterstützung der Peak-Auswahl ist (Supplemental Video 2).

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Ergebnisse

Beschrieben sind Hierin Verfahren zum Gießen einer 96-Well-PDMS-basierten MyoTACTIC-Kulturplattform aus einer PU-Form, zur Herstellung von Arrays von hMMT-Replikgeweben und zur Analyse von zwei Aspekten der hMMT-Funktion innerhalb der Kulturvorrichtung -Krafterzeugung und Calciumhandhabung. Abbildung 1 bietet einen schematischen Überblick über die Vorbereitung von MyoTACTIC-Kulturbohrungen vor der hMMT-Aussaat. PDMS ist ein weit verbreitetes Polymer auf Silikonbasis, das leicht geformt werde...

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Diskussion

Dieses Manuskript beschreibt Methoden zur Herstellung und Analyse eines 3D-hMMT-Kulturmodells, das auf Studien der grundlegenden Muskelbiologie, Krankheitsmodellierung oder für die Prüfung von Kandidatenmolekülen angewendet werden kann. Die MyoTACTIC-Plattform ist kostengünstig, einfach herzustellen und benötigt eine relativ kleine Anzahl von Zellen, um Skelettmuskel-Mikrogewebe herzustellen. hMMTs, die innerhalb der MyoTACTIC-Kulturplattform gebildet werden, bestehen aus ausgerichteten, mehrkernigen und quergestreiften ...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.

Danksagungen

Wir danken Mohammad Afshar, Haben Abraha, Mohsen Afshar-Bakooshli und Sadegh Davoudi für ihren Beitrag zur Erfindung der MyoTACTIC-Kulturplattform und zur Etablierung der hier beschriebenen Herstellungs- und Analysemethoden. HL erhielt Mittel aus einem Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) Training Program in Organ-on-a-Chip Engineering and Entrepreneurship Scholarship und einem University of Toronto Wildcat Graduate Scholarship. PMG ist der Canada Research Chair in Endogenous Repair und erhielt für diese Studie Unterstützung vom Ontario Institute for Regenerative Medicine, dem Stem Cell Network und von Medicine by Design, einem Canada First Research Excellence Program. Schematische Diagramme wurden mit BioRender.com erstellt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,9% Kochsalzlösung, sterileHausmarke101010 mL Aliquots der Lösung werden hergestellt und bei 4° gelagert; C
25G NadelBD, Medstore, Universität Toronto2548-CABD305127
6-Aminocapronsäure, ≥ 99% (Titration), PulverSigma - AldrichA2504-100GEine Stammlösung von 50 mg / ml wird durch Auflösen von 5 mg 6-Aminocapronsäurepulver in 100 mL autoklaviertem, destilliertem Wasser erzeugt. Die Lösung wird vakuumfiltriert und 10 mL Aliquots werden bei 4° gelagert; C
6,35 mm ID SchlauchVWR60985-528
AB1167 Myoblast Cell LineInstitut de Myologie (Paris, Frankreich)
ArbiträrsignalgeneratorRigolDG1022Z
Basalmembranextrakt (Geltrex)Thermo Fisher ScientificA14132-02Gelagert als Aliquots von 50 & Mikro; L oder 100 µ L bei -80°; C
Tisch-VakuumkammerSigma - AldrichD2672
BNC auf Aligator Clip-KabelBestellt bei Amazon
Culture PlasticsSarstedtEnthält Kulturplatten, serologische Pipetten usw
DimethylsulfoxidSigma - AldrichD8418-250ML
DPBS, Pulver, kein Kalzium, kein MagnesiumThermo Fisher Scientific
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1X)Gibco11995-065Hierbei handelt es sich um ein DMEM mit hohem Glukosegehalt und L-Glutamin und Natriumpyruvat
Fetales RinderserumFisher Scientific10437028
Fibrinogen aus RinderplasmaSigma - AldrichF8630-5GAliquots im Bereich von 7 - 10 mg Fibrinogenpulver werden hergestellt und bei -20 ° C gelagert. C
Filtropur Spritzenfilter, 0,22 μm PorengrößeSarstedt83.1826.001
PferdeserumGibco16050-122
Humanes rekombinantes InsulinSigma - Aldrich91077CStammlösung ist 100X und wird durch Auflösen von 1 mg humanem rekombinantem Insulin in 1 mL DMEM und 1 & Mikro hergestellt; L von NaOH 10N. Die Lösung wird filtriert und als 1 mL Aliquote bei 4 μg gelagert; C
BilderfassungssoftwareOlympuscellSens Dimension
BildverarbeitungssoftwareNational Institutes of HealthImageJ
Isotemp OfenThermo Fisher Scientific201
MikroskopOlympusIX83
Mikroskop - KamerahalterungLabcamLabcam für iPhoneBei Amazon bestellt
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)Gibco15140-122
Einwegspritzen aus Kunststoff, 1ccBD2606-309659
Einwegspritzen aus Kunststoff, 50ccBD2612-309653
Pluronic F-127, Pulver, BioReagenzSigma - AldrichP2443-250GEine 5%ige Stammlösung von Pluronsäure wird hergestellt, indem 5 g Pluronsäurepulver in 100 ml gekühltem, autoklaviertem, destilliertem Wasser aufgelöst werden. Die Lösung wird vakuumfiltriert und 10 mL Aliquots werden bei 4° gelagert; C
Polydimethylsiloxane (Sylgard 184 Silikonelastomer Kit)Dow4019862Kits sind auch bei Thermo Fisher Scientific, Sigma - Aldrich usw. erhältlich.
Polyurethan-Negativformim Haus
TrennmittelMann Release Technologies200
Drehschieber-VakuumpumpeEdwardsA65401906
SkalpellAlmedic, Medstore, Universität von Toronto2586-M36-0100
Einschneidige RasierklingeVWR55411-050
Skelettmuskelzelle Basal MediumPromocellC-2326030 mL Aliquote werden erzeugt und bei 4°C gelagert.
Wachstumsmedium für Skelettmuskelzellen (gebrauchsfertig)PromocellC-2306042 mL Aliquots werden erzeugt und bei 4 °C gelagert.
Smartphone (iPhone)AppleSE
Standard Duty TrockenvakuumpumpeWelch2546B-01
SterilisationsbeutelAlliance211-SCM2
FingerhutIgegeBestellt bei Amazon
Thrombin aus menschlichem PlasmaSigma - AldrichT6884-250UN100 Einheiten Thrombin werden in 1 ml einer 0,1%igen BSA-Lösung gelöst. 10 & Mikro; L-Aliquots werden bei -20°C zubereitet und gelagert.
Verzinnter KupferdrahtArcoB8871K48Bestellt bei Amazon
Trypan Blue Solution, 0,4 %Thermo Scientific15250061
Trypsin-EDTA, 0,25 %Thermo FIsher Scientific25200072
Vakuumkammer 2SP Bel-ArtF42027-0000
. 21600069

Referenzen

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