Bewertung funktioneller Metriken der Skelettmuskelgesundheit in Mikrobeschwerden der menschlichen Skelettmuskulatur

Die Skelettmuskulatur ist eines der am häufigsten vorkommenden Gewebe im menschlichen Körper und unterstützt wichtige Körperfunktionen wie Fortbewegung, Wärmehomöostase und Stoffwechsel¹. In der Vergangenheit wurden Tiermodelle und zweidimensionale (2D) Zellkultursysteme verwendet, um biologische Prozesse und Krankheitspathogenese sowie pharmakologische Verbindungen bei der Behandlung von Skelettmuskelerkrankungen zu untersuchen^2,3. Während Tiermodelle unser Wissen über die Skelettmuskulatur in Gesundheit und Krankheit stark verbessert haben, wurde ihre translationale Wirkung durch hohe Kosten, ethische Überlegungen und Unterschiede zwischen den Arten^{behindert 2,4}. Bei der Hinwendung zu menschlichen zellbasierten Systemen zur Untersuchung der Skelettmuskulatur sind 2D-Zellkultursysteme aufgrund ihrer Einfachheit günstig. Es gibt jedoch eine Einschränkung. Dieses Format versäumt es oft, die Zell-Zell- und Zell-extrazellulären Matrix-Interaktionen zu rekapitulieren, die natürlich im Körper auftreten^5,6. In den letzten Jahren haben sich dreidimensionale (3D) Skelettmuskelmodelle als leistungsfähige Alternative zu Ganzentiermodellen und herkömmlichen 2D-Kultursystemen herauskristallisiert, indem sie die Modellierung physiologisch und pathologisch relevanter Prozesse ex vivo^{ermöglichen 7,8}. Tatsächlich haben eine Vielzahl von Studien über Strategien zur Modellierung der menschlichen Skelettmuskulatur in einem bioartifiziellen 3D-Kulturformat^{berichtet 1}. Eine Einschränkung für viele dieser Studien besteht darin, dass die aktive Kraft nach der Entfernung des Muskelgewebes von den Kulturplattformen und der Befestigung an einem Kraftaufnehmer quantifiziert wird, was destruktiv ist und daher darauf beschränkt ist, als Endpunkt-Assay zu dienen^{9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 ,19,20,21}. Andere haben Kultursysteme entwickelt, die nicht-invasive Methoden zur Messung der Wirkkraft ermöglichen, aber nicht alle sind für Molekültestanwendungen mit hohem Gehalt geeignet^{7,8,9,10,14,18,22,23,24,25,26,27,28 ,29}.

Dieses Protokoll beschreibt eine detaillierte Methode zur Herstellung von Human Muscle Microtissues (hMMTs) in der Skelettmuskel (Myo) microTissue Array deviCe To Investigate forCe (MyoTACTIC) Plattform; ein 96-Well-Plate-Gerät, das die Massenproduktion von 3D-Skelettmuskel-Mikrogeweben³⁰unterstützt. Die MyoTACTIC-Plattenherstellungsmethode ermöglicht die Erzeugung einer 96-Well-Polydimethylsiloxan (PDMS)-Kulturplatte und aller entsprechenden Well-Merkmale in einem einzigen Gießschritt, wobei jede Vertiefung eine relativ kleine Anzahl von Zellen für die Bildung von Mikrogeweben benötigt. Mikrogewebe, die in MyoTACTIC gebildet werden, enthalten ausgerichtete, gestreifte und mehrkernige Myotuben, die von Gut zu Brunnen des Geräts reproduzierbar sind und bei Reifung auf chemische und elektrische Reize in situ reagieren können³⁰. Hierin werden die Technik zur Herstellung eines PDMS MyoTACTIC-Kulturplattengeräts aus einer Polyurethan (PU)-Replik, eine optimierte Methode zur Implementierung immortalisierter menschlicher myogener Vorläuferzellen zur Herstellung von hMMTs und die funktionelle Bewertung der technischen hMMT-Krafterzeugung und der Calciumhandhabungseigenschaften skizziert und diskutiert.

1. PDMS MyoTACTIC Plattenherstellung

HINWEIS: PDMS MyoTACTIC Plattenherstellung erfordert eine PU-Negativform, die wie zuvor beschrieben hergestellt werden kann³⁰. Die CAD-SolidWorks-Datei (Computer-Aided Design) für die MyoTACTIC-Plattenkonstruktion wurde auf GitHub (https://github.com/gilbertlabcode/MyoTACTIC-SolidWork-CAD-file) zur Verfügung gestellt.

1. Bereiten Sie ~ 110 g PDMS-Polymerlösung in einem Einweg-Kunststoffbecher im Verhältnis 1:15 von Monomer zu Härter unter Verwendung der Komponenten im Siliconelastomer-Kit vor. Rühren Sie die Polymerlösung für 2-3 min mit einer 5 ml serologischen Einwegpipette, bis sie vollständig gemischt und homogen ist.
   VORSICHT: Vermeiden Sie PDMS-Polymerlösungenkontakt mit Haut und Augen; und vermeiden Sie das Einatmen. Tragen Sie beim Umgang mit der flüssigen PDMS-Mischung immer einen Laborkittel und Einweghandschuhe und lesen Sie das Sicherheitsdatenblatt (SDB) für spezifische Sicherheitsprotokolle.
   HINWEIS: Schützen Sie geräteoberflächen (z. B. Waage, Tischplatte usw.) mit einer Einwegabdeckung im Falle eines Verschüttens von PDMS-Polymerlösungen.
2. Entgasen Sie die Mischung bei Raumtemperatur, indem Sie den Becher für ~ 30 minuten oder bis alle Blasen entfernt sind, in eine Tischvakuumkammer stellen, die an eine standardmäßige Trockenvakuumpumpe angeschlossen ist. Brechen Sie das Vakuum alle 5-10 Minuten, um die Entgasung zu unterstützen. Verwenden Sie ein leeres 50 ml Spritzenfass, um Luft zu tauchen und alle verbleibenden Blasen auf der Oberfläche der Polymermischung nach Bedarf auszublasen.
   HINWEIS: Ein Stück 6,35 mm ID-Schlauch kann zum Anschließen einer P1250-Pipettenspitze an den Lauf verwendet werden, um die Geschwindigkeit und Genauigkeit des Luftstroms zu verbessern.
3. Während die PDMS-Polymerlösung entgast wird, entfernen Sie alle pdMS-Reste, die an der PU-Negativform haften, indem Sie die Kanten und die Oberfläche vorsichtig mit einem trockenen Papiertuch abwischen. Verwenden Sie die auf 70-100 kPag eingestellte Druckluft, um die verbleibenden feinen Partikel zu entfernen.
   HINWEIS: Schützen Sie die PU-Negativform vor Beschädigung und Partikelansammlung, indem Sie sie in einen verschließbaren Plastikbeutel legen und in einer Schublade aufbewahren, die vor dem Laborverkehr geschützt ist.
4. Legen Sie die PU-Form in eine chemische Haube, die mit einer Einwegabdeckung geschützt wurde. Stellen Sie die Form horizontal auf ~75° und besprühen Sie die aktive Oberfläche mit einer gleichmäßigen Schicht Trennmittel. Besprühen Sie die Form von oben nach unten, dann von links nach rechts, während Sie die Dose 15-20 cm von der Form halten und eine flüssige Hin- und Herbewegung verwenden. Drehen Sie die Form um 180 ° und wiederholen Sie das Sprühen, dann lassen Sie die PU-Form für 10-15 min in der chemischen Haube sitzen, um zu trocknen.
   VORSICHT: Stellen Sie sicher, dass Trennmittel in einem chemischen Abzug verwendet wird, vermeiden Sie den Kontakt mit Haut und Augen und lesen Sie das Sicherheitsdatenblatt (SDB) für spezifische Sicherheitsprotokolle
   HINWEIS: Ein dünner Film muss die aktive Oberfläche vollständig bedecken, aber im nächsten Schritt kann eine übermäßige Beschichtung auf das PDMS übertragen werden, was sich wiederum negativ auf die hMMT-Aussaat auswirken kann. Die Oberfläche sollte sich glatt anfühlen, aber nicht nass.
5. Gießen Sie 100 g PDMS gleichmäßig in die PU-Form und legen Sie sie in eine Vakuumkammer, die mit einer Drehschieber-Vakuumpumpe verbunden ist. Entgasen Sie die PDMS-gefüllte Form für ~ 45 minuten und brechen Sie die Vakuumdichtung alle 5-10 Minuten für die ersten 20 Minuten, um den Prozess zu beschleunigen. Lassen Sie es in der Vakuumkammer, bis die PDMS-Mischung vollständig frei von allen Blasen ist.
   HINWEIS: Eine Drehschieber-Vakuumpumpe wird verwendet, um ein niedrigeres Vakuum zu erreichen und die für diesen Schritt erforderliche Zeit zu reduzieren. Die Entgasung des PDMS-gefüllten Werkzeugs kann mit der Tischvakuumkammer und der standardmäßigen Trockenvakuumpumpe durchgeführt werden, jedoch ist die Zeit, um die Mischung aller Blasen zu entleeren, länger. Wesentlich ist die Entfernung aller Blasen aus der PDMS-Polymerlösung, insbesondere in den Regionen, die dazu bestimmt sind, hMMT-Verankerungspfosten zu werden. Blasen in dieser Region führen zu Ankerbruch, dem Verlust von Kulturbrunnen und wiederum dazu, dass ein kleines Stück PDMS in der Form verkeilt bleibt.
6. Die entgaste PDMS-gefüllte PU-Form in einen 65 °C heißen Ofen geben und über Nacht inkubieren, um den flüssigen Gummi auszuhärten.
7. Entfernen Sie die ausgehärtete PDMS-Positivplatte aus dem Ofen und kühlen Sie die Platte bei Raumtemperatur für mindestens 30 min ab.
8. Lösen Sie mit einem klingenlosen Skalpell ausgehärtetes PDMS vorsichtig von der PU-Form, indem Sie die Rückseite des Griffs zwischen dem PDMS und den Wänden der Form führen. Beginnen Sie entlang der oberen Kante und trennen Sie alle 4 Seiten, bevor Sie auf die Basis der Form drücken und diesen Teil ablösen. Dieser Schritt ist abgeschlossen, wenn die Rückseite des Griffs reibungslos zwischen dem PDMS und allen 4 Wänden der PU-Form verläuft.
   HINWEIS: Arbeiten Sie langsam und vorsichtig mit dem klingenlosen Skalpell, um zu verhindern, dass die PU-Form reißt oder das PDMS zerreißt. Dieser Schritt sollte 15-20 Minuten dauern.
9. Verwenden Sie ausgehend von einem Ende das klingenlose Skalpell, um den Rand des PDMS anzuheben und die Finger zwischen der ausgehärteten PDMS-Kulturplatte und der PU-Form zu arbeiten. Drücken Sie dann mit beiden Händen die Finger weiter unter die Platte und schälen Sie sich langsam nach oben und aus der PU-Form.
   HINWEIS: Arbeiten Sie langsam und verwenden Sie beide Hände, um den Teller gleichmäßig zu schälen. Minimieren Sie das Biegen, um die Wahrscheinlichkeit eines Ankerbruchs zu verringern. Dieser Schritt sollte 5-10 Minuten dauern.
10. Verwenden Sie eine einschneidige Rasierklinge, um die Platte in Gruppen von 6 ± 2 MyoTACTIC-Vertiefungen (Abbildung 1) für Gewebeaussaatzwecke zu schneiden. Legen Sie vollständige MyoTACTIC-Platten oder Plattenportionen in einen Instrumentensterilisationsbeutel und Autoklaven für einen 25-minütigen Trockenzyklus (20 Minuten Sterilisationszeit und 5 Minuten Trocknungszeit) bei 120 ° C und 100-140 kPag.

2. Kultur von immortalisierten menschlichen Myoblasten-Vorläuferzellen

HINWEIS: Die in diesem Protokoll verwendeten immortalisierten Myoblasten wurden vom Institut de Myologie (Paris, Frankreich)³¹bezogen.

1. Erhalten Sie eine Durchstechflasche mit gefrorenen Zellen aus dem flüssigen Stickstoff-Dewar und tauen Sie die Durchstechflasche in einem 37 °C warmen Wasserbad (in weniger als 1 minute) schnell auf. Die Zellen werden in einer Dichte von 7,5 x 10⁵ Zellen pro 1 ml Gefriermedium eingefroren, das zu 90% aus fötalem Rinderserum (FBS) und 10% Dimethylsulfoxid (DMSO) besteht.
2. Geben Sie den Inhalt der Durchstechflasche vorsichtig in ein konisches 15-ml-Röhrchen mit 9 ml vorgewärmtem Waschmedium, bestehend aus 89% DMEM 1x, 10% FBS und 1% Pen/Strep, um das DMSO zu verdünnen. Drehen Sie das 15 mL konische Rohr bei 400 x g für 10 min und saugen Sie dann das Medium ab, wobei Sie darauf achten, das Zellpellet zu vermeiden.
3. Resuspendieren Sie das Pellet in 1 ml Wachstumsmedium, bestehend aus 84% Skelettmuskelzell-Basalmedium mit Skelettmuskelzell-Wachstumsmedium-Ergänzungsmischung, 15% FBS und 1% Pen / Streptokokken, und übertragen Sie es dann in ein 50 ml konisches Röhrchen mit 29 ml Wachstumsmedien.
4. 10 mL Medien mit etwa 2,5 x 10⁵ Zellen werden in eine 100 mm x 20 mm große Zellkulturschale überführt. Wiederholen Sie diesen Schritt mit den verbleibenden 20 ml der Zelllösung. Anschließend werden Zellkulturschalen in einen befeuchteten Zellkultur-Inkubator mit 37 °C und 5%_{CO2 überführt.}
5. Aktualisieren Sie die Kulturmedien jeden zweiten Tag. Kultivieren Sie die Zellen, bis sie ~ 70% -80% Konfluenz erreichen (typischerweise 4-5 Tage), an welchem Punkt die Zellen für die Aussaat vorbereitet sind. 1,5 x 10⁵ Zellen werden benötigt, um jedes hMMT zu erzeugen. Passieren Sie daher die Zellen nach Bedarf, um die erforderliche Anzahl von Zellen zu erreichen.
   HINWEIS: Die immortalisierten Myoblasten-Vorläuferzelllinien sollten niemals 80% Konfluenz überschreiten, bevor Zellen in MyoTACTIC-Vertiefungen ausgesät, die Zellen weitergegeben oder Gefrierlager vorbereitet werden. hMMTs, die aus Zellen hergestellt werden, die 80% Konfluenz überschritten haben, erreichen oft keine kontraktile Reife. Passaging-Verfahren sind identisch mit den unten in Schritt 3 beschriebenen Methoden.

3. Aussaat von hMMTs mit MyoTACTIC

1. Vorbereitung von MyoTACTIC-Kulturtöpfen und Reagenzien für die hMMT-Aussaat.
   HINWEIS: Dieses Protokoll enthält spezifische Details, um 6 hMMTs zu erzeugen.
   1. 2-3 h vor der Zellaussaat eine 6 Well MyoTACTIC Plattenportion in eine 10 cm große Zellkulturschale geben. Bereiten Sie jede einzelne MyoTACTIC-Kultur gut vor, indem Sie 100 μL einer 5% igen pluronic F-127-Lösung in jede Vertiefung geben. Legen Sie den Deckel auf die 10 cm Kulturschale, tragen Sie Paraffin auf, um den Raum zwischen der 10 cm Schale und dem Deckel zu versiegeln, und legen Sie dann die 10 cm Platte mit dem MyoTACTIC-Teil in eine Zentrifuge, die mit einem Plattenspinner-Adapter ausgestattet ist.
      HINWEIS: Wenn kein Zentrifugenplatten-Spinneradapter verfügbar ist, kann eine p20-Pipettenspitze verwendet werden, um Blasen hinter den Pfosten vorsichtig zu entfernen, wodurch sichergestellt wird, dass die gesamte Kulturoberfläche gleichmäßig beschichtet ist.
   2. Zentrifugiere bei 1.550 x g für 1 min, um alle Blasen in Kulturbrunnen, insbesondere hinter den Pfosten, zu entfernen. Die 10 cm große Zellkulturschale mit der MyoTACTIC-Plattenportion mit Pluronic F-127-Lösung bei 4 °C aufbewahren, bis die Zellen für die Aussaat vorbereitet sind.
      HINWEIS: Die pluronic F-127-Beschichtung kann für nur 2 h bis 24 h aufgetragen werden. Zum Beispiel können Brunnen am Ende des Tages mit Pluronic F-127-Lösung gefüllt werden, um sie am nächsten Tag zu verwenden. Überschreiten Sie nicht 24 h, da dies negative Auswirkungen auf den hMMT-Umbau hat und kein gesundes Gewebe bildet, das die kontraktile Reife erreicht.
   3. Einen 50 μL Basalmembranextrakt Aliquot und einen 10 μL Thrombin Aliquot (100 U/ml Stammlösung) auf Eis in der Kulturhaube langsam auftauen.
      HINWEIS: Gefrieren Sie die Aliquots des Basalmembranextrakts nicht erneut ein. Sie sind für den einmaligen Gebrauch. Thrombin-Aliquots sind wiederverwendbar und frieren daher nach Gebrauch bis zu 5 Mal wieder ein.
   4. ~ 7 mg pulverisiertes Fibrinogen in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen einwiegen und dann in die Zellkulturhaube überführen. 700 μL 0,9% (gew./vol) NaCl-Lösung in Wasser (oder Salzlösung) zugeben, um eine 10 mg/ml Endkonzentrationslösung zu erhalten. Fibrinogen nicht zum Auflösen vorwirbeln, sondern das Röhrchen für 3-5 min in einen 37 °C Zellkultur-Inkubator geben.
   5. Entfernen und streichen Sie das Röhrchen vorsichtig, dann pulsieren Sie die gelöste Lösung in einer Tisch-Mini-Zentrifuge (Mikrofuge) und kehren Sie zur Kulturhaube zurück. Filtrieren Sie die Fibrinogenlösung mit einer 1 ml Spritze, die mit einem 0,22 μm Spritzenfilter ausgestattet ist. Übertragen Sie die gelöste Fibrinogenlösung zusammen mit dem Basalmembranextrakt und den Thrombin-Aliquots auf Eis.
   6. Bereiten Sie schließlich das hMMT-Aussaatmedium vor, das nach dem Aussaaten der Gewebe in die Kulturtöpfe eingeführt wird. Dieses Medium enthält Skelettmuskelzell-Basalmedium, ergänzt mit 20% FBS, 1% P/S und 3% 6-Aminocapronsäure (ACA; 1,5 mg/ml Endkonzentration wird durch Verdünnung aus einer 50 mg/ml Stammlösung erreicht; % wird als v/v ausgedrückt). Vorwärmen Sie das Medium vor Gebrauch bei 37 °C vor.
2. Vorbereitung von Zellen für die hMMT-Aussaat.
   1. Sammeln Sie die Zellkulturplatten aus dem Kulturinkubator. Saugen Sie das Medium von jeder Platte ab und waschen Sie die Zellen dann einmal mit D-PBS, indem Sie 5 ml D-PBS in jede Kulturplatte geben. Als nächstes aspirieren Sie das D-PBS und lösen Sie die Zellen, indem Sie 1 ml 0,25% Trypsin-EDTA in jede Kulturschale geben. Für 3 Min. in den Zellkultur-Inkubator geben.
   2. Halten Sie das Trypsin an, indem Sie 3 ml Waschmedium (89% von 1x DMEM + 10% FBS + 1% Pen / Strep) zur Kulturschale geben. Die Zelllösung wird in ein konisches Röhrchen mit geeigneter Größe überführt und dann die Zellen durch Zentrifugieren bei 400 x g für 10 min pelletiert. Aspirieren Sie die Medien und achten Sie darauf, das Zellpellet zu vermeiden. Dann resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml des Waschmediums.
   3. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und Trypanblaufarbstoff unter Hellfeldmikroskopie.
      Wenn Sie mehrere Zellplatten verwenden, ist diese Zellsuspension sehr konzentriert. Verdünnen Sie zellsuspensionen, bevor Sie nach Bedarf zählen.
   4. Da jedes Gewebe 150.000 Zellen benötigt, die in 15 μL der extrazellulären Matrix (ECM) -Mischung resuspendiert werden, werden 900.000 Zellen in 90 μL ECM-Mischung für 6 Gewebe benötigt. Um den Zell-ECM-Lösungsverlust zu berücksichtigen, der während des Herstellungsprozesses aufgrund von Blasenbildung oder Pipettenverlust auftritt, bereiten Sie eine zusätzliche Zell-ECM-Mischung vor (dh 8 Gewebe oder 1.200.000 Zellen in 120 μL ECM). Übertragen Sie das Volumen der Zellsuspension mit 1.200.000 Zellen in ein neues konisches Rohr. Erhöhen Sie das Volumen auf 10 ml mit Waschmedium und drehen Sie es bei 400 x g für 10 min.
   5. Während sich die Zellen drehen, bereiten Sie 150 μL ECM-Mischung in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen nach dem folgenden Rezept vor. Zuerst 60 μL DMEM (40% Volumen), dann 60 μL Fibrinogen 10 mg/ml Lösung (40% Volumen) und schließlich 30 μL Kellermembranextrakt (20% Volumen) hinzufügen. Lagern Sie die ECM-Mischung bis zum Gebrauch auf Eis.
      HINWEIS: Verwenden Sie immer Spitzen, die bei -20 °C vorgekühlt sind, wenn Sie mit Lösungen arbeiten, die Basalmembranextrakt enthalten. ECM-Mischung enthält 4 mg/ml Fibrinogen.
3. Aussaat von hMMTs
   1. Sammeln Sie das konische Rohr, das die abgesponnenen Zellen enthält, und saugen Sie die Medien ab, wobei Sie darauf achten, das Zellpellet zu vermeiden. Streichen Sie kräftig mit einem behandschuhten Finger über das Ende der Röhre, um das Pellet zu entfernen, und fahren Sie fort, bis das Pellet als Zellschlamm erscheint.
      HINWEIS: Es ist wichtig, so viele Waschmedien wie möglich abzusaugen, um sicherzustellen, dass die Zell-ECM-Suspension die gewünschte Verdünnung aufweist. Verwenden Sie bei Bedarf eine Pipette, um die verbleibenden Waschmedien zu entfernen.
   2. 120 μL der ECM-Lösung in das Röhrchen mit dem Zellpellet überführen. Pipettieren Sie auf und ab, um die Zellen innerhalb des ECM gründlich zu resuspendieren, um eine einzelne Zellsuspension zu erzeugen. Pipettieren Sie langsam und vorsichtig, um das Einbringen von Blasen zu vermeiden, die das Arbeitsvolumen reduzieren würden. Legen Sie dann die Zell-ECM-Lösung bis zum Gebrauch auf Eis.
   3. Holen Sie MyoTACTIC-Plattenportionen mit pluronic F-127 beschichteten MyoTACTIC-Vertiefungen aus dem 4 °C-Kühlschrank und legen Sie die 10 cm große Schale mit den MyoTACTIC-Vertiefungen auf einen Eisbeutel in der Zellkulturhaube.
   4. Aspirieren Sie die Pluronic F-127-Lösung aus jeder Vertiefung. Das PDMS ist porös und saugt die pluronic F-127-Lösung auf, insbesondere wenn die Platten mit einer Zentrifuge heruntergesponnen wurden. Lassen Sie die restliche Pluronic F-127-Lösung freisetzen und setzen Sie sich auf dem Boden des Bohrlochs ab, indem Sie die Vertiefungen 5 Minuten lang ruhen lassen und dann erneut absaugen.
      HINWEIS: Verwenden Sie eine Pasteurpipette mit einer p1250-Spitze am Ende und einer p200-Spitze über der p1250-Spitze, wenn Sie die Pluronic F-127-Lösung ansaugen. Dies verbessert die Präzision, um ein versehentliches Absaugen der Pfostenstrukturen zu verhindern. Vermeiden Sie es, den ovalen poolförmigen Zellsaatbereich am Boden des Bohrlochs mit der Pipette abzukratzen, da dies die Pluronic F-127-Beschichtung stört und den hMMT-Selbstorganisationsprozess stört. Die richtige Technik besteht darin, die Pipettenspitze direkt über den ovalen Pool zu bewegen, während die Pluronic F-127-Lösung abgesaugt wird.
   5. Pipettieren Sie die Zell-ECM-Suspension vorsichtig, um alle Zellen, die möglicherweise auf den Boden der Röhre gesunken sind, wieder zu verstopfen. Anschließend werden 105 μL Zell-ECM-Suspension in ein frisches, vorgekühltes 1,5-ml-Röhrchen gegeben. Achten Sie darauf, das Rohr in der Nähe der Oberseite zu greifen, um zu verhindern, dass sich die Lösung erwärmt.
   6. 0,84 μL der 100 U/ml Thrombin-Stammlösung in die 105 μL Zell-ECM-Suspension gegeben werden, um eine Endkonzentration von 0,2 U/mg Fibrinogen zu erhalten. Pipettieren Sie schnell, vorsichtig und gründlich, um zu mischen, während Sie die Einführung von Blasen vermeiden.
      HINWEIS: Thrombin initiiert die schnelle Umwandlung von Fibrinogen in ein Fibringerinnsel. Daher gibt es nur eine begrenzte Zeit, um die Gewebe bei Thrombinzugabe auszusäen. Um eine vorzeitige Gerinnung zu vermeiden, bevor das Zell-ECM-Gemisch in die Kulturtöpfe überführt wird, stellen Sie eine p20-Pipette auf 15 μL, bevor Sie das Thrombin hinzufügen. Verwenden Sie vorgekühlte Spitzen oder tauchen Sie die Pipettenspitze für einige Sekunden in eiskaltes DMEM, bevor Sie 15 μL der Zell-ECM-Mischung sammeln und in jede Vertiefung übertragen. Es ist eine bewährte Methode, Zell-ECM-Mischung Aliquots so herzustellen, dass nicht mehr als 6 hMMTs gleichzeitig ausgesät werden.
   7. Um die Gewebe zu säen, fügen Sie 15 μL Zell-ECM-Mischung (dh 150.000 Zellen) zu jeder einzelnen Vertiefung hinzu. Fügen Sie vorsichtig eine Zell-ECM-Mischung in die Mitte des ovalen Pools hinzu und vermeiden Sie es, die Pipettenspitze in den Boden des Brunnens zu drücken. Verteilen Sie dann mit zwei leichten Bewegungen die Zellsuspension hinter jedem Pfosten im Brunnen. Sobald die Oberfläche gleichmäßig mit der Zell-ECM-Suspension beschichtet ist, fahren Sie mit der nächsten Vertiefung fort.
      HINWEIS: Arbeiten Sie effizient, um eine vorzeitige Gelierung der Zell-ECM-Mischung im Röhrchen zu vermeiden, bevor alle Gewebe ausgesät sind. Bei der Aussaat der Bohrlöcher ist es äußerst wichtig, die Übertragung von Blasen zu vermeiden, da die Blase den Umbau des hMMT stört und das hMMT unbrauchbar macht.
   8. Legen Sie den Deckel auf die 10 cm große Kulturplatte mit den ausgesäten Vertiefungen und geben Sie ihn für ca. 5 min in einen 37 °C gewebekulturellen Inkubator.
      HINWEIS: Geben Sie das Mikrozentrifugenröhrchen mit dem Restzell-ECM-Gemisch zur Bestätigung des Gelpolymerisationsprozesses in den Inkubator.
   9. Nachdem die Zell-ECM-Mischung polymerisiert ist, werden 200 μL vorgewärmte hMMT-Aussaatmedien zu jeder MyoTACTIC-Vertiefung gegeben. Setzen Sie den Deckel der 10-cm-Schale wieder ein und geben Sie die MyoTACTIC-Plattenportionen innerhalb der 10-cm-Schüssel in den Inkubator zurück. Dieser Zeitpunkt wird als Tag -2 bezeichnet. Stören Sie das Gewebe bis zum nächsten Schritt nicht.
4. Differenzierung von hMMTs
   1. Nach 2 Tagen Inkubation das hMMT-Saatmedium vorsichtig mit einer Pipette entfernen und durch 200 μL vorgewärmte Differenzierungsmedien ersetzen, die 2% Pferdeserum, 1% Pen/Streptokokken, 4% ACA (d. h. 2 mg/ml Endkonzentration aus einer Stammkonzentration von 50 mg/ml; % wird als v/v ausgedrückt) und 10 μg/ml humanes rekombinantes Insulin in DMEM enthalten. Dieser Zeitpunkt wird als Tag 0 der Differenzierung bezeichnet.
   2. Tauschen Sie danach jeden zweiten Tag die Hälfte der Medien mit frischen Differenzierungsmedien bis zum Tag 12 der Differenzierung, dem letzten Tag der Kultur, aus (Abbildung 2a).
      HINWEIS: Protokolldetails zur Herstellung von hMMTs unter Verwendung primärer menschlicher Myoblasten wurden an anderer Stelle veröffentlicht³⁰. Wenn es Bedenken hinsichtlich der Zelllebensfähigkeit nach der Aussaat gibt, inkubieren Sie hMMTs mit Calcein und Propidiumiodid, um die Lebensfähigkeit zu quantifizieren.

4. Elektrische Stimulation und Analyse der hMMT-induzierten Nachauslenkung

1. Richten Sie eine durchsichtige Boden-Glas- oder Kunststofftischhalterung an einem inversen Mikroskop ein und befestigen Sie eine Smartphone-Kamera mit einer Mikroskop-Kamerahalterung am Mikroskopokular. Es wird eine Phasenkontrastmikroskopie mit 10-facher Vergrößerung verwendet (Abbildung 3a).
   HINWEIS: Jedes invertierte Phasenkontrastmikroskop, das mit einem 10-fachen Vergrößerungsobjektiv ausgestattet ist, ist geeignet. Die PDMS-Brunnenkonstrukte werden aus der 10 cm großen Schüssel entfernt und direkt auf die klare Bodentischhalterung gelegt und somit zur Luft hin geöffnet. Sterilisieren Sie alle Oberflächen und Geräte mit 70% Ethanol und minimieren Sie den Verkehr in der Umgebung während des Experimentierens.
2. Um die elektrischen Stimulationselektroden vorzubereiten, schneiden Sie ~ 30 cm verzinnten Kupferdraht. Dann, beginnend an der Nabe einer 25 G normalen Fasennadel, wickeln Sie ~ 10 cm des Drahtes fest um die obere Hälfte und lassen Sie ~ 20 cm überschüssigen Draht zurück. Wiederholen Sie dies für eine zweite Nadel und schneiden Sie dann die Nabe von jeder Nadel ab.
   HINWEIS: Der Draht muss um die Nadel fest sein, um sicherzustellen, dass er sich nicht bewegt, und der mit Draht umwickelte Teil der Elektrode darf das PDMS nicht berühren, da dies die Erzeugung elektrischer Felder behindern kann.
3. Verbinden Sie das BNC-an-Krokodilclip-Anschlusskabel an einem Ausgangskanal am Wellenformgenerator und stellen Sie den Kanal für Rechteckimpulse mit 20% Tastverhältnis, 5 V Amplitude (elektrische Feldstärke von 10 V/cm) ein. Die Frequenz ändert sich zwischen 0,5 Hz und 20 Hz für Zuckungen bzw. Tetanuskontraktionen.
   HINWEIS: Die Einstellungen des Wellenformgenerators erfordern möglicherweise eine experimentspezifische Optimierung.
4. Legen Sie einen MyoTACTIC-Plattenteil mit hMMTs auf das Mikroskoptisch und führen Sie jedes Elektrodenfasenende vorsichtig in das PDMS direkt hinter jedem Pfosten im ovalen Pool ein. Kleben Sie die 20 cm langen Abschnitte des überschüssigen Drahtes vorsichtig auf den Mikroskoptisch ab, so dass die Nadeln vertikal bleiben und ~ 10 cm jedes Drahtes für den Anschluss frei bleiben (Abbildung 3a).
   VORSICHT: Legen Sie niemals einen bloßen Finger über eines der Enden der Elektrode. Stellen Sie sicher, dass ein Fingerhut am Zeigefinger getragen wird, um beim Einführen in das PDMS leichten Druck auf die Elektrode auszuüben.
5. Fokussieren Sie das Sichtfeld des Mikroskops auf einen von zwei Pfosten, so dass der Fokus an der Pfostenkante, die der Elektrode am nächsten ist, scharf ist. Sperren Sie dann den Fokus der Smartphone-Kamera auf den klarsten Bereich des Beitrags. Dies ist wichtig für die nachgelagerte Analyse, da eine Änderung des Fokus während der Aufzeichnung die Analyse beeinträchtigt.
6. Verbinden Sie die freien Enden der abgeklebten Drähte über Krokodilklemmen mit dem Wellenformgenerator (Abbildung 3a).
7. Starten Sie die Videoaufzeichnung auf der Smartphone-Kamera und schalten Sie dann den Kanalausgang ein, um die Stimulation zu initiieren. Induzieren Sie das hMMT, um 3 Zuckungen und 3 Tetanuskontraktionen zu durchlaufen, mit 2 Minuten Ruhe zwischen der Twitch- und Tetanus-Stimulationsserie.
8. Schalten Sie den Kanalausgang aus, lösen Sie Krokodilklemmen von den verzinnten Kupferdrähten, entfernen Sie das Klebeband von den Drähten und wischen Sie jede Elektrode mit 70% Ethanol ab, bevor Sie sie in nachfolgende hMMT-Vertiefungen einführen. Wiederholen Sie den Vorgang aus Schritt 4.5 für alle hMMTs.
   HINWEIS: Begrenzen Sie die Zeit, die hMMTs außerhalb des Inkubators verbringen, indem Sie nicht mehr als 3 Gewebe gleichzeitig stimulieren. Wenn zusätzliche hMMTs innerhalb des MyoTACTIC-Plattenanteils noch analysiert werden müssen, geben Sie die Platte für 10 minuten in den Inkubator zurück, damit die hMMTs wieder auf 37 °C zurückkehren können.
9. Um die Nachauslenkung zu analysieren, um die hMMT-Krafterzeugung zu berechnen, verwenden Sie das benutzerdefinierte Skript, das auf GitHub verfügbar gemacht wurde (https://github.com/gilbertlabcode/myoTACTIC). Befolgen Sie die Anweisungen in README.md, um das Skript einzurichten und zu starten, und öffnen Sie dann jedes Post-Tracking-Video, um die Kraftanalyse durchzuführen.
10. Wählen Sie eine Region of Interest (ROI) entlang der Pfostenkante aus, die für die Verschiebung nachverfolgt werden soll. Drücken Sie die Eingabetaste, um den ROI zu bestätigen, und drücken Sie erneut die Eingabetaste, um das Skript auszuführen (Ergänzendes Video 1).
    HINWEIS: Große Ablenkungen führen dazu, dass der Tracker ausfällt. Wenn der Tracker während der Kontraktion ausfällt, kann die ROI-Größe erhöht werden, um das Tracking weniger empfindlich zu machen, aber die Verfolgung großer Ablenkungen zu ermöglichen. Drei Größen werden im Code bereitgestellt und können durch Anpassen der Skriptkommentare optimiert werden.
11. Das Skript endet mit zwei Eingabeanforderungen. Geben Sie zunächst y ein, um zu bestätigen, dass das Video mehrere Kontraktionen enthielt. Geben Sie anschließend y (ja) oder n (nein) ein, um die Ergebnisse in eine zu exportieren. CSV-Datei (Supplemental Video 1).
12. Stellen Sie sicher, dass die Ergebnisse nach der Ablenkung für jede Kontraktion als Verschiebung in Pixeln gemeldet werden. Konvertieren Sie Pixel in μm-Werte für die Einstellung für die 10-fache Vergrößerung des Mikroskops. Konvertieren Sie dann die Post-Displacement-Zahlen in absolute kontraktile Kräfte (μN), indem Sie die Werte (μm) mit dem Kraft-Weg-Umrechnungsfaktor von 2,36 μN / μm multiplizieren, was dem Verhältnis von 1:15 Härtungsmittel zu Monomer des in der MyoTACTIC-Herstellung³⁰verwendeten PDMS entspricht.

5. Calcium-Transientenanalyse mittels elektrischer Stimulation

HINWEIS: Für Experimente zur Handhabung von Kalzium wurden immortalisierte Myoblasten mit dem MHCK7-GCAMP6-Reporter stabil transduziert, wie zuvor beschrieben^11,12. Transduzierte Zellen wurden FACS-sortiert, um die positive Population zu erhalten, und dann zur Herstellung von hMMTs verwendet. Alternative Methoden für die Kalziumbildgebung wie die Verwendung von verhältnismetrischen Farbstoffen wie Fura-2 AM und Indo-1 oder die Fluoreszenzlebensdauerbildgebung von Kalziumindikatoren (z. B. Fluo-4 oder Oregon Green BAPTA1) können für unser System zugänglich sein.

1. Richten Sie den Mikroskoptisch und die Stimulationsausrüstung (Elektroden, Wellenformgenerator usw.) wie zuvor in Schritt 4 beschrieben ein. Verwenden Sie für dieses Experiment eine 4-fache Vergrößerung.
   HINWEIS: Ein dunkler Raum und ein Epifluoreszenzmikroskop, das mit einer CCD-Kamera ausgestattet ist, werden benötigt.
2. Starten Sie die Mikroskopbildgebungssoftware, wählen Sie den FITC-Filterkanal (blaues Licht) und wählen Sie die Filmaufnahmefunktion. Eingestellt bei einer Belichtung von 500 ms und einer Auflösung von 680 x 510 (Binning 2x2).
   HINWEIS: Die Bildgebungssoftware kann variieren und die Belichtung wird vom Benutzer manuell eingestellt. Achten Sie darauf, hMMT vor der Stimulation überexposition zu vermeiden. In Ruhe ist ein dunkler Gewebekontur/ -schatten mit spontaner Fluoreszenz normal, während ein klares Gewebebild überbelichtet ist (Supplemental Video 2). Stellen Sie sicher, dass die Belichtung für alle hMMTs innerhalb eines Experiments konsistent ist.
3. Schließen Sie den Mikroskopverschluss und halten Sie den FITC-Kanal ausgeschaltet, bis Sie bereit sind, die Kalziumbehandlung aufzuzeichnen.
4. Wenn alle Geräte und Software eingerichtet sind, rufen Sie den MyoTACTIC-Plattenteil mit den zu analysierenden hMMTs ab und legen Sie ihn direkt auf das Mikroskoptisch. Führen Sie dann die Elektroden wie zuvor in Schritt 4 beschrieben ein und verbinden Sie sie.
5. Verwenden Sie das Hellfeld, um das Sichtfeld auf die Mitte des ausgewählten hMMT zu fokussieren. Schalten Sie dann die Lampe aus.
6. Öffnen Sie den FITC-Kanalverschluss des Mikroskops, vergewissern Sie sich, dass blaues Licht eingeschaltet ist, und wählen Sie dann in der Software Filmaufnahme aus.
7. Schalten Sie den Ausgang des Wellenformgenerators ein, um die elektrische Stimulation zu initiieren. Induzieren Sie die hMMT, um 8 Zuckungen und 8 Tetanuskontraktionen zu durchlaufen. Planen Sie 2 Minuten Ruhe zwischen der Twitch- und Tetanus-Stimulationsserie ein, während der sich der FITC-Verschluss in der geschlossenen Position befindet.
   HINWEIS: Erlauben Sie 10 s spontane Aktivität vor und nach der elektrischen Stimulation, um die minimale Fluoreszenz für Berechnungs- und Datenanalysezwecke aufzuzeichnen.
8. Schalten Sie den Kanalausgang aus, lösen Sie Krokodilklemmen von den verzinnten Kupferdrähten, entfernen Sie das Band von den Drähten und wischen Sie jede Elektrode mit 70% Ethanol ab, bevor Sie sie in nachfolgende hMMT-Vertiefungen einführen. Wiederholte Stimulation und Aufnahmeverfahren für alle hMMTs.
9. Speichern Sie Filme im TIFF-Dateiformat zur Analyse in ImageJ oder einer alternativen Imaging-Software.
   HINWEIS: Begrenzen Sie die Zeit, die hMMTs außerhalb des Inkubators verbringen, indem Sie nicht mehr als 3 Gewebe gleichzeitig stimulieren. Wenn zusätzliche hMMT innerhalb des MyoTACTIC-Plattenanteils noch analysiert werden muss, geben Sie das Gerät für 10 Minuten in den Inkubator zurück, damit die hMMTs wieder auf 37 °C zurückkehren können.
10. Um die Transientendaten von Kalzium zu analysieren, öffnen Sie zuerst ImageJ. Wählen Sie Analysieren, dann Messungen festlegen, wählen Sie dann den grauen Mittelwert aus, und deaktivieren Sie alle anderen Optionen. Wenn Sie fertig sind, öffnen Sie ein Kalziumvideo (.tiff) (Ergänzendes Video 2).
11. Skizzieren Sie den Rand der Mikrobearbeitung mit einem Polygonauswahlwerkzeug und speichern Sie diesen Bereich als ROI (Supplemental Video 2). Wählen Sie im Fenster ROI-Manager unter Mehr die Option Multi Measure aus und messen Sie die Fluoreszenzintensität für alle Datei-Slices in einer Zeile pro Slice (Ergänzendes Video 2).
12. Kopieren Sie alle Messungen, einschließlich der Scheibennummer (Frame), in eine Tabelle und vergleichen Sie die Fluoreszenzintensität jeder Scheibe mit der minimalen spontanen Fluoreszenzintensität aus der Datei mit ΔF/F₀ = (F_sofort - F_Minimum)/ F_Minimum (Supplemental Video 2).
13. Berechnen Sie die Zeit für jedes Bild, indem Sie die Bildgeschwindigkeit der Filmaufnahme mit der Slice-Zahl (Frame) multiplizieren und ΔF/F₀ gegen die Zeit für die hMMT-Kalzium-Transientenreaktion auf Stimulation darstellen (Supplemental Video 2).
14. Wählen Sie das Peak-Calcium-Transientensignal für jede der 6 aufeinanderfolgenden Kontraktionen und Durchschnittswerte, um die relative mittlere Peak-Fluoreszenzintensitätsänderung jedes hMMT zu berechnen (Supplemental Video 2).
    HINWEIS: Schließen Sie Daten, die sich aus der ersten Zuckungskontraktion ergeben, immer aus der Gesamtanalyse aus. Eine Tabelle mit dem Titel "Calcium Handling Template.xlsx" wurde auf GitHub (https://github.com/gilbertlabcode/Calcium-Handling-Template-) bereitgestellt, um die hMMT-Calcium-Transientenanalyse zu erleichtern. Ausfüllbare Zellen, in denen Werte und Eingaben eingegeben werden sollen, sind grau hervorgehoben. Stellen Sie sicher, dass Sie die Peak-Auswahlzahlen anpassen, da dies nur ein Leitfaden zur Unterstützung der Peak-Auswahl ist (Supplemental Video 2).

Beschrieben sind Hierin Verfahren zum Gießen einer 96-Well-PDMS-basierten MyoTACTIC-Kulturplattform aus einer PU-Form, zur Herstellung von Arrays von hMMT-Replikgeweben und zur Analyse von zwei Aspekten der hMMT-Funktion innerhalb der Kulturvorrichtung -Krafterzeugung und Calciumhandhabung. Abbildung 1 bietet einen schematischen Überblick über die Vorbereitung von MyoTACTIC-Kulturbohrungen vor der hMMT-Aussaat. PDMS ist ein weit verbreitetes Polymer auf Silikonbasis, das leicht geformt werden kann, um komplexe Bauelemente herzustellen32. Ein PDMS-basiertes Protokoll wurde entwickelt, um eine unbegrenzte Anzahl von 96-Well-Kulturgeräten aus einer hergestellten negativen PU-Form30 zu gießen. Die fertig ausgehärtete PDMS-Positivplatte ist flexibel und kann mit Hilfe einer einschneidigen Rasierklinge einfach in kleinere Funktionseinheiten geschnitten werden (Abbildung 1). Dies ermöglicht es dem Benutzer, das Gerät zu skalieren, um die hMMT-Replikatanforderungen zu erfüllen, die für sein experimentelles Design spezifisch sind. Diese kleineren Funktionseinheiten sind auch von Vorteil, um eine Einschränkung der Arbeit mit einem ECM-Gerüst zu überwinden, das schnell polymerisiert, wie z. B. Fibrinhydrogele, indem die Anzahl der Vertiefungen leicht auf die Zellsaatgeschwindigkeit des Benutzers abgestimmt wird. Darüber hinaus ist PDMS leicht autoklavierbar und kann auf unbestimmte Zeit gelagert werden. Schließlich kann aus logistischer Sicht eine vollständige MyoTACTIC-Platte von jedem Standard-96-Well-Plattendeckel abgedeckt werden, und die Abmessung und das Profil der MyoTACTIC-Plattenportionen sind für die Inkubation innerhalb einer 10-cm-Kulturplatte geeignet, um die Sterilität der hMMT-Kultur sicherzustellen. Die pluronic F-127-Lösungsbeschichtung vor der Zellaussaat dient einer doppelten Rolle, indem sie ein zusätzliches Maß für die Kulturbrunnensterilisation bereitstellt und als nichtionisches Tensid die Zelladhäsion zugunsten eines gleichmäßigen Zell-ECM-Umbaus verhindert (Abbildung 1).

Wenn die immortalisierte myogene Vorläuferzellpopulation experimentierbereit ist, werden die Zellen in einem Hydrogel eingekapselt, das aus Fibrinogen und Basalmembranextrakt besteht. Die Zell-ECM-Mischung wird dann gleichmäßig in den ovalen Pool am Boden jedes MyoTACTIC-Brunnens abgeschieden, und dann über einen 14-tägigen Kulturzeitraum organisieren sich die Zellen räumlich selbst über diese beiden vertikalen Pfosten, um ein 3D-Mikrogewebe zu bilden, das mit einem Bett aus ausgerichteten, mehrkernigen, gestreiften Myotuben bevölkert ist, die Aspekten der nativen Gewebeorganisation ähneln(Abbildung 2a, g,h). Während des Umbauprozesses wird eine einachsige Spannung zwischen den beiden Verankerungspunkten erzeugt, die den Selbstorganisationsprozess des Gewebes leitet, um wiederum die Bildung eines kompakten Gewebes voranzutreiben. Während der Differenzierungsphase bleibt die Breite der hMMTs, die aus Myoblasten von gesunden Patienten aufgebaut sind, ziemlich konstant. Bei Fehlern, die den hMMT-Umbau beeinträchtigen, geht diese Einheitlichkeit jedoch verloren (Abbildung 2a-f ), wodurch diese einfache Metrik für die Bewertung der hMMT-Qualitätskontrolle nützlich ist. Zum Beispiel kann eine übereifrige Vermischung der Zelle - ECM-Suspension zur Bildung von Blasen führen. Blasen, die auf das MyoTACTIC-Bohrloch übertragen wurden, behindern den Umbau von hMMT. In solchen Fällen verdrängen Blasen einige oder alle Myoblasten aus dem von der Blase besetzten Bereich und bilden schließlich eine Spalte im endgültigen hMMT(Abbildung 2b;siehe roter Pfeil). Ein weiteres Beispiel bezieht sich auf die Integrität der Pluronic F-127-Beschichtung in den Bohrlöchern. Pluronic F-127 ist ein nichtionisches Tensid, das verhindert, dass Zellen am MyoTACTIC-Brunnen haften. Wenn die Beschichtung während der Aspiration abgekratzt wird, haften Myoblasten an der Oberfläche der MyoTACTIC-Vertiefungen, bilden neue Verankerungspunkte und führen zu Myotuben, die nicht über die beiden Pfosten ausgerichtet sind (Abbildung 2c). Zusätzliche Fehler können auch zu einer abweichenden hMMT-Umgestaltung führen, wie in Abbildung 2d-f. Die Zellvitalität nach der Aussaat kann auch mit Calcein / Propidiumiodid-basierten Färbeassays bewertet werden. Wenn diese technischen Fehler vermieden werden, werden hMMTs von einem Bett aus ausgerichteten und mehrkernigen Myröhren gefüllt, die sich über die Länge jedes hMMT erstrecken (Abbildung 2g). Die Myotubes sind ziemlich einheitlich in der Größe über ihre Länge und zwischen verschiedenen hMMTs(Abbildung 2h-i). Myotuben sind durch das Vorhandensein von Sarkomerstreifen gekennzeichnet, die durch Immunfärbung für sarkomerische α - Actinin (SAA; Abbildung 2h).

Funktionelle Eigenschaften können auch in hMMTs untersucht werden, die etwa 7 Tage der Differenzierung beginnen. Der Versuchsaufbau zur Durchführung dieser funktionellen Studien ist in Abbildung 3adargestellt. Der Aufbau der Mikroskopie ist auf einem Vibraplane-Tisch abgebildet. Dies ist jedoch nicht erforderlich, um funktionelle Untersuchungen abzuschließen. In funktionellen Studien werden Elektroden, die wie im Abschnitt elektrische Stimulation des Protokolls beschrieben erzeugt werden, in das PDMS eingeführt, so dass sich Die Elektroden hinter den Pfosten befinden. Es ist wichtig, vor dem Einsetzen der Elektrode eine gute Visualisierung der Postregion zu haben, da die Notwendigkeit des erneuten Einsetzens zu einer Verschiebung des Gewebes vom Pfosten führen kann. Das richtige Einsetzen der Elektroden ist ebenfalls wichtig, um einen scharfen Fokus des Pfostens zu erhalten, so dass die Post-Ablenkung anschließend mit dem Python-Skript verfolgt werden kann. Abbildung 3b zeigt eine repräsentative Verschiebung des MyoTACTIC Well Plate Posts als Reaktion auf eine elektrische Stimulation mit niedriger (Zuckung, 0,5 Hz) und hoher (Tetanus, 20Hz) Frequenz hMMT. Die Quantifizierung der Nachverschiebung kann verwendet werden, um die induzierte Kontraktionskraft von hMMTs zu berechnen (Abbildung 3c). Kombiniert man diese Information mit der hMMT-Querschnittsfläche, so kann die spezifische Kraft30bestimmt werden. Darüber hinaus spielen Kalziumtransienten eine wichtige Rolle bei der Muskelkontraktion. Die stabile Transduktion von Skelettmuskelmyoblasten mit einem genetisch kodierten Calciumindikator wie GCaMP612,30 ,33,34, ermöglicht die Live-Überwachung der Calciumtransienten12,30,34. Calciumtransienten wurden unter Verwendung des oben beschriebenen elektrischen Stimulationsaufbaus analysiert, um Tag 12 hMMTs zu stimulieren, die mit immortalisierten Myoblasten erzeugt wurden, die den MHCK7-GCAMP6-Reporter exprimieren (Abbildung 4a), und quantifiziert als mittlere Spitzenfluoreszenzintensität während der elektrischen Stimulation mit niedriger (Zuckung, 0,5 Hz) und hoher (Tetanus, 20 Hz) Frequenz (Abbildung 4b). Es wird beobachtet, dass die hMMT-Calcium-Handling-Eigenschaften, die in verschiedenen Experimenten gemessen wurden, relativ konsistent sind (Abbildung 4b). Quantifizierungsmethoden für die Nachablenkung und die Handhabung von Kalzium werden in Ergänzendes Video 1 und Ergänzendes Video 2 beschrieben.

Abbildung 1: Vorbereitung der MyoTACTIC PDMS-Platte vor der hMMT-Aussaat. Die als MyoTACTIC bezeichnete 96-Well-Plattform wird zunächst durch Aushärtung von Polydimethylsiloxan (PDMS) in einer negativen Polyurethan (PU)-Form hergestellt. Die PDMS-basierte Kulturplattform wird dann vorsichtig aus der negativen PU-Form geschält. In einer akademischen Umgebung wird das PDMS-Gerät dann in kleinere Einheiten geschnitten, die 6 ± 2 funktionelle Vertiefungen enthalten. Diese Vertiefungen werden dann in einen Sterilisationsbeutel gegeben, autoklaviert und bis zum Gebrauch gelagert. Bis zu einem Tag vor Gebrauch wird die gewünschte Anzahl von Geräteportionen in eine 10 cm große Kulturplatte gegeben und Pluronic F-127 in jede Vertiefung gegeben. Der 10 cm Geschirrdeckel wird hinzugefügt, der Rand wird mit Parafilm versiegelt, bevor die Platte bei 4° für 2-24 h inkubiert wird.

Abbildung 2: MyoTACTIC unterstützt die hMMT-Selbstorganisation und die Bildung von ausgerichteten Myotuben. (a) (oben) Schematische Zeitleiste der hMMT-Selbstorganisation und der anschließenden Myotube-Reifung über einen 14-tägigen Kulturzeitraum. (unten) Repräsentative 4x-Phasenkontrastbilder zur Veranschaulichung der Kinetik der Selbstorganisation der immortalisierten Myoblasten über die beiden vertikalen Pfosten, die zur Bildung eines 3D-hMMT führen. Maßstabsbalken, 500 μm. (b-f) Repräsentative 4x Phasenkontrastbilder von hMMTs am Tag 12 der Differenzierung, die hMMT-Ergebnisse zeigen, die durch (b) eine Blase innerhalb der Zelle - ECM zum Zeitpunkt der Aussaat (roter Pfeil zeigt auf Blase, um hMMT-Schäden zu induzieren), (c) falsche Aspiration der pluronic F-127-Lösungsbeschichtung und (d-f ) hMMT-Umbau, der eine unsachgemäße ECM-Gelierung, mangelnde ACA-Aktivität in Kulturmedien, unsachgemäße Pflege der Myoblasten-Elternlinie usw. signalisieren kann. Maßstabsbalken, 500 μm. (g) Repräsentativ gefliestes und abgeflachtes konfokales Bild eines Day 12 hMMT, aufgenommen bei 10-facher Vergrößerung. hMMTs werden direkt in der PDMS-Form fixiert, dann vorsichtig entfernt und zur Färbung in eine 96-Well-Kulturplatte gegeben. Sarkomerisches α-Actinin (SAA) in Magenta und Hoechst 33342 nuklearer Gegenfleck in Cyangezeigt. Maßstabsbalken, 500 μm. (h) Repräsentatives konfokales Bild eines Tages 12 hMMT bei 40-facher Vergrößerung. hMMT-Myotuben und -Kerne werden durch Immunfärbung für SAA (Magenta) und Gegenfärbung mit Hoechst 33342 (Cyan) visualisiert. Maßstabsbalken, 50 μm. (i) Punktdiagrammdiagramm des mittleren hMMT-Myotubendurchmessers am Tag 12 der Differenzierung. Werte werden als Mittelwert ± SEM angegeben. n = 8 hMMTs aus 3 biologischen Replikaten, unterschieden durch Symbolformen, wobei mindestens 30 Myotuben pro hMMT analysiert werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: In-situ-Messung der kontraktilen Kraft innerhalb der MyoTACTIC-Plattform. (a) Darstellung der elektrischen Stimulationsanordnung (links). Obwohl in diesem Setup abgebildet, ist ein Vibraplane-Tisch nicht erforderlich. Eine Smartphone-Kamera und eine Halterung wurden am Okular eines inversen Mikroskops angebracht, das mit einer Fluoreszenzlampe für die Videoaufnahmen von hMMTs elektrischen Stimulations-Postverschiebungen ausgestattet war (links). 25 G-Nadeln wurden mit verzinnten Kupferdrähten umwickelt (unten rechts), mit einem BNC-zu-Krokodilklemmen-Anschlusskabel (oben rechts) verbunden und an einem beliebigen Wellenformgenerator befestigt. Die Platzierung der Elektroden während der elektrischen Stimulation ist unten rechts dargestellt. ( b) Repräsentative Momentaufnahmen aus Post-Deflection-Videos, die am Tag 12 der Differenzierung von hMMTs aufgenommen wurden. Videos wurden mit 10-facher Vergrößerung aufgenommen. Durchgezogene weiße vertikale Linien zeigen die Post-Platzierung, wenn hMMTs entspannt sind, während gepunktete weiße vertikale Linien die Postverschiebung nach hoher (Tetanus 20 Hz) oder niedriger (0,5 Hz) Frequenzstimulation zeigen. Maßstabsbalken, 100 μm. (c) Punktdiagramm der mittleren hMMT-Zuckung (0,5 Hz)- und Tetanus (20 Hz)-induzierten kontraktilen Kraft am Tag 12 der Differenzierung. Die Werte werden als Mittelwert ± SEM angegeben. n = 9 hMMTs aus 3 biologischen Replikaten, unterschieden durch Symbolformen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: In-situ-Messung der Calcium-Handhabung innerhalb der MyoTACTIC-Plattform. (a) Repräsentative Bilder aus einer Videoaufnahme mit 4-facher Vergrößerung von spontanen GCaMP6+ Calcium-Transienten und Calcium-Transienten als Reaktion auf elektrische Stimulation mit niedriger (Zuckungskontraktion, 0,5 Hz) und hoher (Tetanuskontraktion, 20 Hz). hMMTs werden durch eine gepunktete gelbe Linie umrissen. Maßstabsbalken, 200 μm. (b) Punktdiagramm, das die Quantifizierung der mittleren Spitzenfluoreszenzintensität pro hMMT nach niedriger (Zuckungskontraktion, 0,5 Hz) und hoher (Tetanuskontraktion, 20 Hz) Frequenz elektrischer Stimulation zeigt. Die Werte werden als Mittelwert ± SEM angegeben. n = 9 hMMTs aus 3 biologischen Replikaten, unterschieden durch Symbolformen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzendes Video 1: Demonstration von Methoden zur Analyse von Post-Deflection-Daten. Ein repräsentatives Video der Post-Deflection-Analyse an Tag 12 der Differenzierung, das vom benutzerdefinierten Skript während der Tetanusstimulation verfolgt wird. Zuerst wird die ROI-Größe direkt im Post-Tracking-Skript ausgewählt. Als nächstes wird das Video geöffnet, indem Sie die Wiedergabeschaltfläche auswählen, um das Skript auszuführen. Ein scharf fokussierter Bereich des Beitrags wird als ROI ausgewählt und die blaue Postverfolgungsbox wird platziert. Enter wird gedrückt, um ROI zu sperren, und erneut gedrückt, um das Skript auszuführen. "y" wird als Antwort auf die Aufforderung "Multiple contraction video? [J/N]", dann wird 'n' als Antwort auf die Aufforderung "Post-Speicherorte exportieren als .csv-Datei? [J/N]". Die Postablenkung als relative Verschiebung in Pixeln ist die endgültige Ausgabe. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

Ergänzendes Video 2: Demonstration von Methoden zur Analyse von GCaMP6-Calciumtransientendaten. Ein repräsentatives Video der Epifluoreszenz-Calcium-Handling-Analyse an Tag 12 der Differenzierung während der Tetanusstimulation. Zuerst wurde ein Video von Kalziumtransienten (gespeichert als eine Reihe von TIFF-Bildern) in ImageJ geöffnet und der Benutzer hat durch Frames navigiert, bis das hMMT sichtbar ist. Anschließend wird die erforderliche Analysemessung "mittlerer Grauwert" bestätigt und die hMMT mit dem polygonalen Zeichenwerkzeug umrissen. Diese Gliederung wird als Interessensgebiet gespeichert und die Fluoreszenzintensität jedes Videoschnitts wird mit Multi-Measure analysiert. Diese Messungen werden in die Tabelle "Calcium Handling Template" kopiert, wobei Rahmendaten und transiente Calcium-Peak-Werte ausgefüllt und bestätigt werden. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.