Artigo de método

Fluormetria de varredura nano-diferencial para triagem em descoberta de chumbo baseada em fragmentos

6.6K vistas

⸱

DOI:

10.3791/62469

⸱

16 de maio de 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Oncode Institute and Division of Biochemistry, the Netherlands Cancer Institute, 2Institute for Organic Chemistry and Chemical Biology, Center for Biomolecular Magnetic Resonance (BMRZ), Johann Wolfgang Goethe-University

Neste artigo

Resumo

Monitorar mudanças na temperatura de fusão de uma proteína alvo (ou seja,ensaio de mudança térmica, TSA) é um método eficiente para triagem de bibliotecas de fragmentos de algumas centenas de compostos. Apresentamos um protocolo TSA implementando fluoremetria nano-diferencial assistida por robótica (nano-DSF) para monitorar fluorescência triptofano intrínseca e dispersão de costas leves para triagem de fragmentos.

Resumo

Os ensaios de mudança térmica (TSAs) examinam como a temperatura de fusão (Tm) de uma proteína alvo muda em resposta a mudanças em seu ambiente (por exemplo,composição tampão). A utilidade da TSA, e especificamente da Fluormetria de Varredura Nano-Diferencial (nano-DSF), foi estabelecida ao longo dos anos, tanto para encontrar condições que ajudem a estabilizar uma proteína específica quanto para olhar para ligaduras, monitorando mudanças no aparente Tm. Este artigo apresenta uma triagem eficiente da biblioteca de fragmentos Diamond-SGC-iNEXT Poised (768 compostos) pelo uso de nano-DSF, monitorando Tm para identificar potencial ligação de fragmentos. Os pré-requisitos relativos à qualidade e concentração de proteínas para a realização de experimentos nano-DSF são brevemente delineados seguidos de um protocolo passo-a-passo que usa um dispensador robótico nano-litro comumente usado em laboratórios de biologia estrutural para preparar as amostras necessárias em placas de 96 poços. O protocolo descreve como as misturas de reagentes são transferidas para os capilares necessários para medições nano-DSF. Além disso, este artigo fornece protocolos para medir a desnaturação térmica (monitoramento da fluorescência triptofano intrínseca) e agregação (monitoramento da re dispersão da luz) e as etapas subsequentes para transferência e análise de dados. Finalmente, são discutidos experimentos de triagem com três diferentes alvos proteicos para ilustrar o uso desse procedimento no contexto de campanhas de descoberta de chumbo. O princípio geral do método descrito pode ser facilmente transferido para outras bibliotecas de fragmentos ou adaptado a outros instrumentos.

Introdução

Programas de descoberta de drogas geralmente começam através da triagem de compostos químicos para sua capacidade de interagir e/ou modificar a função de alvos de drogas, na maioria das vezes proteínas. Os chamados "hits" que são encontrados nessas telas, estabelecem as bases para a descoberta de novos leads e candidatos ao desenvolvimento, e para a maioria das novas drogas que estão sendo licenciadas nos dias de hoje. A disponibilidade de métodos de alto rendimento é, portanto, indispensável para selecionar um enorme número de alvos disponíveis com um grande número de compostos diferentes para identificar rapidamente sua ligação apertada ou sua capacidade de modular uma função específica do alvo. Depois que os hits são identificados, as combinações de alvo de sucesso mais promissoras são empurradas para um extenso pipeline de desenvolvimento de drogas usando outras tecnologias, muitas vezes caras e demoradas, para entender "relações estrutura-atividade" (SAR).

Abordagens de biologia estrutural, como as oferecidas pelos programas de acesso financiados pela UE "Infraestrutura para NMR, EM e raios-X para Pesquisa Translacional" (iNEXT) e seu atual sucessor iNEXT-Discovery, são frequentemente usados para estudar as interações de numerosos compostos em detalhes extremos, melhorando a afinidade e as propriedades farmacológicas dos hits iniciais por tipicamente várias rodadas de química sintética1. Compostos de chumbo que emergem dessas campanhas "de hit to lead" tornam-se candidatos ao desenvolvimento e entram em estudos pré-clínicos. A metodologia de triagem molecular bem desenvolvida pode ser classificada em duas abordagens, a descoberta de chumbo baseada em ligante (LBLD) e a descoberta de chumbo baseada em fragmentos (FBLD). Nas campanhas lbld, receptores de proteína são rastreados com alguns milhares de ligantes escolhidos a dedo (com base na estrutura de ligantes naturais ou na estrutura do alvo), ou com muitas dezenas de milhares de compostos em bibliotecas de ligantes semelhantes a drogas que cobrem uma grande porção de espaço químico.

Geralmente, os compostos são testados para sua atividade inibitória em um ensaio de atividade, normalmente monitorando uma função enzimática. Nas campanhas do FBLD2,3,4,5, no entanto, algumas centenas de compostos que são tipicamente menores do que as drogas (100-200 Dalton) são testados por sua capacidade de ligar o alvo diretamente, sem o uso de um ensaio de atividade. Essa ligação pode interferir na atividade-alvo e pode ser medida por muitos métodos biofísicos que relatam diretamente sobre a capacidade dos fragmentos de se ligarem ao alvo, ou por métodos estruturais como cristalografia de raios-X6 e espectroscopia de ressonância magnética nuclear7, e, mais recentemente, também microscopia crio-elétron. Quando fragmentos se ligam em diferentes locais próximos uns dos outros na proteína, os diferentes fragmentos de ligação de baixa afinidade podem ser racionalmente combinados quimicamente para criar um pequeno conjunto de leads que podem ser estudados com mais detalhes. Isso frequentemente resulta em compostos mais potentes e de maior afinidade, e essa metodologia começou a produzir moléculas importantes com potencial clínico. A escolha de uma biblioteca de fragmentos "ideal" que explora grupos químicos de forma eficiente tem sido uma área ativa de pesquisa por muitos anos8,9,10.

Enquanto a ênfase inicial era na cobertura de espaço químico completo, a atenção subsequente foi focada em permitir que a combinação química a jusante de fragmentos para produzir compostos de chumbo. Tal pesquisa levou às chamadas bibliotecas "equilibradas". Estes contêm fragmentos com pelo menos um grupo funcional que permitem um acompanhamento rápido e barato da química sintética para um progresso eficiente no estudo do SAR. Uma das atividades catalisadas pelo iNEXT foi atualizar a biblioteca equilibrada desenvolvida por pesquisadores do Consórcio de Origem de Luz de Diamante e Genômica Estrutural. Esse esforço combinado resultou na biblioteca DSi-Poised11, que também foi validada dentro do iNEXT12. Mais tarde, esta biblioteca foi alinhada com a disponibilidade de compostos no Banco de Dados REAL da Enamine Ltd., uma organização de pesquisa química e produtora de grandes coleções de blocos de construção e bibliotecas compostas para triagem. O DSi-Poised já está disponível para compra, mas também está disponível em muitos laboratórios parceiros iNEXT-Discovery para projetos de triagem de fragmentos suportados.

A cristalografia de raios-X de ponta e as tecnologias de biologia estrutural NMR têm suas vantagens e desvantagens para o FBLD. Ambos requerem amostras de alvo isoladas e produzem os detalhes atômicos de alta resolução necessários para o FBLD. No entanto, cristais são necessários para a cristalografia de raios-X, e os fragmentos se ligam a cavidades nas regiões proteicas bem ordenadas que não estão envolvidas na construção da rede de cristal tridimensional. A solução NMR frequentemente produz diferentes hits da cristalografia de raios-X, pois não é afetada pelo ambiente cristalino e é boa em detectar a ligação também em regiões proteicas parcialmente ordenadas. No entanto, embora os experimentos de NMR baseados em ligante sejam relativamente rápidos, eles ainda requerem uma quantidade substancial de tempo e material e podem ser feitos rotineiramente apenas para alvos ou domínios de proteínas relativamente pequenos. Para fins de priorização de compostos para experimentos cristalográficos ou de RMN, foram utilizadas abordagens biofísicas13,14,15.

Como os protocolos de instrumentação e computacionais recentes permitem uma triagem cristalográfica eficiente para o FBLD, determinando estruturas e analisando ~1.000 fragmentos de forma muito eficiente, essa priorização tornou-se menos essencial na pesquisa baseada em raios-X. Para a NMR, no entanto, continua sendo desejável usar experimentos mais baratos e rápidos para priorizar a triagem da biblioteca e economizar tempo de instrumentos em equipamentos de ponta. Ao mesmo tempo, o uso de uma combinação de tecnologias essencialmente diferentes pode fornecer confirmação independente de eventos vinculativos, ou mesmo hits adicionais que não são captados empregando apenas o método cristalografia ou NMR. Técnicas cristalográficas e de RMM exigem equipamentos muito caros e muitas vezes só podem ser feitas em instalações externas dedicadas com a ajuda de especialistas locais e altamente qualificados. Além disso, a análise adequada dos resultados também exige alta expertise. Embora programas como o iNEXT e o iNEXT-Discovery estejam democratizando o acesso a tais instalações16,foi reconhecido que a triagem fBLD barata, rápida e de alto rendimento por outros métodos pode incentivar programas de rastreamento de drogas em uma gama muito mais ampla de laboratórios. Tais resultados podem então ser usados como uma indicação para construir colaborações com químicos medicinais, e para priorizar os experimentos de triagem mais caros para os compostos mais promissores se as instalações de RMR e cristalografia imporem restrições ao número de compostos que podem ser examinados.

O TSA forma um método biofísico rápido, eficiente e relativamente barato e acessível17 que pode ser usado para a triagem FBLD. Tem sido usado em várias configurações, desde ajudar a encontrar condições de proteína estáveis para ensaios de cristalização18, até encontrar compostos que se ligam a alvos específicos nas células19. Os TSAs também têm sido usados para medir as constantes de dissociação para ligantes que ligam proteínas-alvo, pois a ligação de ligantes muitas vezes leva a alterações na estabilidade térmica. Em todos os TSAs, a mudança na temperatura de desnaturação de uma proteína (sua estabilidade) é medida em função de um lento aumento de temperatura. Uma maneira eficiente de seguir a desinaturação da proteína no aquecimento é pelo DSF ou Thermofluor, que quantifica a fluorescência saciando um corante hidrofóbico (tipicamente Sypro Orange) após interação com regiões hidrofóbicas expostas de proteína que se desdobra devido ao aumento da temperatura.

Nano-DSF normalmente refere-se à medição da estabilidade térmica da proteína na ausência de corantes externos. Um dos primeiros instrumentos que ofereceram essa possibilidade foi o OPTIM1000 que mede um amplo espectro de intensidade de luz, bem como a dispersão de luz de uma amostra. Esta máquina permitiu a medição simultânea do desdobramento da proteína (tipicamente após a fluorescência do triptofano) e a agregação de proteínas (como as nanopartículas formadas resultam em um aumento da dispersão de luz em ~400 nm). Posteriormente, o Prometeu introduziu o uso de retroescamento para medir a agregação e detecção sensível do sinal de fluorescência, permitindo a triagem de baixas concentrações proteicas com boa sensibilidade20. A seção a seguir descreve como Prometeu foi usado para demonstrar um protocolo de triagem de fragmentos para detectar acertos para diferentes alvos proteicos. Uma breve introdução sobre a qualidade e quantidade de proteínas esperadas é seguida por um protocolo passo-a-passo para preparar, realizar e analisar os experimentos de triagem de fragmentos. Os resultados de triagem de três proteínas foram mostrados como exemplos de dados obtidos como parte das colaborações iNEXT-Discovery.

Protocolo

NOTA: As proteínas utilizadas em experimentos nano-DSF devem ser puras (>95%) e homogêneas como julgadas pela eletroforese gel de sódio dodecylsulfate-poliacrilamida gel. Antes de realizar a tela de fragmentos, a estabilidade das proteínas deve ser determinada em várias condições de tampão. Uma baixa resistência iônica, baixo tampão de sal que interfere minimamente com a proteína deve ser usado para não afetar sua interação direta com os fragmentos. Os buffers normalmente usados neste protocolo para verificação da estabilidade são mostrados na Tabela Suplementar S1. A concentração da proteína que precisa ser usada para este experimento como solução de estoque é tipicamente de 0,2 mg mL-1. Para a triagem de toda a biblioteca DSi-Poised (768 compostos), é necessário um total de ~12 mL de proteína dessa concentração, um total de ~2,5 mgs. A biblioteca DSi-Poised utilizada nesses experimentos foi fornecida em formato de 96 poços(Figura 1). A concentração dos fragmentos foi ajustada para 100 mM em dimetilsulfoxida v/v de 20% v/v (DMSO). Deve-se notar que o protocolo de mistura descrito aqui resulta em baixas concentrações finais de DMSO de 0,4% v/v; embora isso seja muito improvável de afetar a estabilidade da proteína, o efeito do DMSO deve ser verificado para cada nova proteína.

figure-protocol-1
Figura 1: Os tipos de placas utilizadas para estes experimentos. (A) placa inferior U. (B) placa de 96 poços. (C) Uma visão de close-up da placa de 96-bem mostrando o subwell 1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

1. Preparação da placa

  1. Retire uma placa de fragmento do congelador -20 °C/-80 °C e deixe descongelar à temperatura ambiente, com agitação suave em um shaker de bancada. Centrifugar a placa a 500 × g por 30 s para coletar quaisquer gotas grudando na lateral dos poços.
    NOTA: Como a biblioteca de fragmentos está disponível dissolvida em DMSO-d6 (ponto de fusão 19 °C), é essencial garantir que cada composto esteja completamente descongelado e solubilizado.
  2. Leve uma placa de cristalização MRC 2-well(Figura 1A), e pipeta 14,7 μL da solução de estoque de proteínas em cada sub-poço. Para isso de forma eficiente, mantenha a proteína em um reservatório de reagente(Tabela de Materiais),e utilize uma pipeta multicanal para dispensação(Figura 2A,B).
    NOTA: Para a biblioteca DSi-Poised, dependendo do formato, nem todos os poços da placa de 96 poços contêm compostos. Normalmente, as linhas A, H e as colunas 1, 12 estão preenchidas com DMSO. Assim, as linhas A, H e as colunas 1, 12 não devem ser preenchidas com proteína, pois esses poços não conterão fragmentos no final da próxima etapa; apenas o DMSO será transferido para lá pelo robô. Observe que as linhas e colunas vazias diferem em algumas placas.

figure-protocol-2
Figura 2: Contorno do procedimento de triagem de fragmentos. (A) Utilizando um reservatório de pipeta e reagente multicanal para dispensar a proteína. (B) Dispensando a proteína na placa de 96 poços. (C) Distribuição de fragmentos pelo robô dispensador. (D) Carregar a proteína nos capilares. (E) Gaveta mostrando o suporte capilar. (F) Visão de close-up do titular capilar. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-protocol-3
Figura 3: Visão geral do equipamento utilizado nestes experimentos. (A) Robô nanodispenser usado para distribuição de fragmentos. As posições da placa são indicadas. (B) Interface do programa para definir uma nova placa. (C) Interface do programa de dispensação. (D) O programa de dispensação utilizado para dispensar os fragmentos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Nano-dispensação de fragmentos pelo robô Mosquito

  1. Verifique o tipo de placa em que os fragmentos são fornecidos(Tabela de Materiais).
  2. Verifique as definições de fragmentos e placas de proteína no Mosquito.
    1. Ligue o nanodispenser(Figura 3A). Certifique-se de que não há obstáculos ao redor dos componentes móveis.
    2. Abra a interface gráfica do usuário, clique na guia Configuração e em Configuração de Deck,verifique se o tipo de placa em que os compostos são fornecidos e aquele em que a proteína foi transferida na seção 1 já estão presentes na lista das placas disponíveis. Se não, clique em Opções| Placas e criar uma nova definição de placa preenchendo os valores corretos para o tipo De propriedade (Figura 3B).
      NOTA: Estes valores para a placa MRC de 2 poços e a placa de 96 poços utilizados neste experimento são mostrados na Tabela Suplementar S2 e Tabela Suplementar S3, respectivamente.
  3. O programa de dispensação
    1. Na guia Configuração, especifique as posições da placa sob configuração de deck.
      NOTA: O Mosquito usado neste experimento tem duas posições de placa no convés. A posição 1 é definida como a placa de origem, e a posição 2 é a placa de destino.
    2. Usando o menu suspenso, escolha placa inferior Greiner U para a posição 1 e placa mrc 2-well para a Posição 2 ( Figura2C). Guarde o protocolo.
  4. Distribuição de fragmentos
    1. Coloque a placa de fragmento na Posição 1 e a placa de proteína na Posição 2 do deck(Figura 3A).
    2. Na guia Protocolo (Figura 3D),clique em Arquivo e escolha o protocolo salvo na seção 2.3 para dispensar os fragmentos. Definir o volume dos fragmentos a serem dispensados; usar 0,3 μL. Para uma placa típica, onde as colunas 1 e 12 não contenham fragmentos, defina o local Iniciar para a coluna 2 e o local final para a coluna 11. Em algumas placas, se as colunas 2 ou 11 estiverem vazias, use as colunas 3 e 10 como valores de início e fim, respectivamente.
      NOTA: Por causa da configuração do Mosquito, apenas colunas podem ser ignoradas, não linhas; para as linhas, o mosquito vai pipeta DMSO. Certifique-se de que a opção Mudar a ponta seja selecionada como Sempre,para não contaminar cruzadamente a biblioteca de fragmentos.
    3. Clique em Executar para iniciar o programa. Depois de dispensar, que leva ~2 min, é concluído, remova a proteína e as placas de fragmento do robô, e sele-as de volta com um filme de vedação adesivo. Centrifufique brevemente a placa de proteína (500 × g, 30 s) para coletar quaisquer gotas grudando nas laterais dos poços antes de prosseguir para a próxima etapa.

3. Medição de nano-DSF

NOTA: Uma descrição detalhada sobre a realização de TSAs usando o Prometheus NT.48 foi publicada anteriormente20. Pontos importantes no contexto da triagem de fragmentos são mencionados aqui.

  1. Inspeção da placa antes da medição
    1. Inspecione visualmente os poços da placa de proteína para precipitação que possa ter ocorrido devido à adição dos fragmentos. Se a precipitação for observada em muitos poços, reduza a concentração dos fragmentos e repita o experimento.
      NOTA: Recomenda-se manter a placa de proteína em temperatura ambiente; os fragmentos tendem a ficar insolúveis a temperaturas mais baixas.
  2. Preparando o Prometeu
    1. Ligue o instrumento Prometeu. Na tela sensível ao toque, pressione a Gaveta Aberta para acessar o módulo de carregamento capilar do instrumento. Remova a tira magnética do módulo de carga e limpe o espelho com etanol para remover qualquer falha de poeira.
  3. Transferência da placa de fragmentos de proteína para capilares
    NOTA: Esta etapa envolve a transferência da amostra de proteína/fragmento misto de cada poço na placa proteica para os capilares para uso com o Prometeu. Para isso, embora o tipo capilar padrão seja tipicamente utilizado, é possível usar os capilares de alta sensibilidade para concentrações de proteínas muito baixas.
    1. Coloque a placa de proteína e os capilares ao lado do instrumento para ter fácil acesso ao módulo de carregamento capilar.
    2. Pegue um capilar, segure-o em uma extremidade, e toque a solução na placa de proteína com a extremidade do capilar para transferir a amostra por ação capilar. Use sempre luvas, e certifique-se de não tocar no capilar no meio, pois as impurezas (por exemplo,partículas de poeira) das luvas afetariam a medição.
    3. Coloque o capilar na posição designada do suporte, certificando-se de que está devidamente alinhado e centrado.
    4. Repetir as etapas 3.3.2 e 3.3.3, preenchendo assim todas as posições no módulo de carga. Carregue todos os capilares que você precisará para medição.
      NOTA: Para uma única corrida, um máximo de 48 capilares podem ser carregados.
    5. No final, coloque a tira magnética em cima dos capilares para mantê-los no lugar, e pressione Close Drawer para iniciar o experimento.
  4. Realize o experimento nano-DSF
    1. Escaneamento de fluorescência
      1. Abra o aplicativo Prometheus PR. ThermControl, e criar um novo projeto clicando em Iniciar nova sessão usando o nome ProteinName_ScreenName_PlateNumber. Primeiro, faça uma varredura de descoberta para detectar a fluorescência das amostras.
        NOTA: Os níveis de fluorescência devem ser idealmente acima de 3.000 contagens para cada amostra. Não serão mensuradas amostras com fluorescência acima do limite de saturação do instrumento (20.000 contagens).
      2. Altere o sinal de fluorescência das amostras ajustando o Poder de Excitação do laser(Figura 4).
    2. Desnaturação térmica
      1. Clique na guia Desarmamento. Para realizar o experimento, defina a Temperatura Inicial para 20 °C, a Temperatura Final para 95 °C e a Inclinação de Temperatura para 1 °C min-1. Clique em Iniciar a medição.
    3. Anotando o experimento
      1. Após o início dos experimentos, clique na guia Anotação e Resultados. Anote cada capilar, dando-lhe uma placa única e um número bem.
        NOTA: Por exemplo, o 1B2 capilar corresponderia à placa 1 e bem B2. Nesta guia, colunas extras podem ser adicionadas para o experimento, por exemplo,nome da proteína, tampão, concentração de proteínas. Após o término do experimento, os resultados também são exibidos nesta guia. Este é um bom momento para fazer uma pausa no final do dia; os experimentos ocorrem durante a noite, os resultados podem ser coletados no dia seguinte.
    4. Visualização e exportação de dados
      1. Após o término do experimento, clique na guia Melting Scan para ver as curvas de fusão e dispersão das amostras. Para exportar os resultados em uma planilha, clique na guia Melting Scan, clique em Exportare escolha Dados Processados de Exportação no menu suspenso.

figure-protocol-4
Figura 4: Ajustando o sinal depoder de excitação e fluorescência. (A) Com 80% de potência de excitação, o sinal de fluorescência para a maioria das amostras está além do limite de saturação. (B) O sinal de fluorescência é reduzido a níveis mensuráveis, diminuindo a potência de excitação para 60%. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Iteração

  1. Repita as etapas 1-3 para realizar 16 corridas em toda a biblioteca Enamina de 768 compostos (16 × 48 = 768).
  2. Como a medição de cada placa leva ~1,5 h para ser concluída, complete a anotação (3.4.3) e prepare a próxima placa de fragmentos de proteínas repetindo passos nas seções 1 e 2.
    NOTA: Em um dia de trabalho típico, 4-6 placas podem ser medidas, dependendo da experiência. A exibição de toda a biblioteca DSi pode ser concluída em um total de 3-4 dias.

5. Análise de dados

  1. Examinando os dados gerados
    1. Uma vez concluída a cada execução, clique na guia Anotações e Resultados para exibir os resultados. Para cada amostra, concentre-se em dois valores calculados que são mais importantes nesta visão geral: 1) A temperatura de início de dispersão(Início #1 para Dispersão), que indica a temperatura no início de eventos de dispersão de amostras aumentadas e é característica de agregação; 2) o valor Tm (Inflection Point #1 para Ratio) extraído da razão entre eventos de fluorescência em 330 e 350 nm-valores que normalmente correspondem às mudanças máximas da fluorescência do triptofano após alterações em seu ambiente.
    2. Certifique-se de verificar a dispersão e as curvas de fusão para cada capilar na guia Melting Scan para ter certeza de que esses valores são confiáveis.
  2. Exportação e inspeção para uma planilha
    1. Exporte os dados de todas as diferentes corridas para inspeção para um software de planilha, conforme descrito em 3.4.4, e para criar tabelas e gráficos de visão geral. Clique nas várias Folhas no arquivo da planilha para anotar as informações em cada folha.
      1. Na folha visão geral, observe que cada linha corresponde a um experimento. Ao longo de uma visão geral dos parâmetros (por exemplo,temperatura inicial e final), observe os valores calculados para o Tm e o início de dispersão (ver 5,1 acima para nomes e explicação, e arquivos suplementares 1 e 2, por exemplo). Como o software calcula dois ou mais valores Tm (Inflection Point #1 e #2 para Ratio) para algumas amostras, olhe para a curva de transição de fusão para determinar qual dos valores Tm está correto.
      2. Na folha Proporção, observe que cada coluna corresponde a uma amostra e cada linha aos dados lidos a cada etapa de temperatura. Observe os valores de contagem de fluorescência correspondentes a cada etapa de temperatura e use-os para traçar as curvas de fusão para amostras específicas, plotando a coluna de temperatura contra a coluna de contagem de fluorescência. Observe que os dados da Razão (primeiro derivado), 330 nm, 330 nm (primeiro derivado), 350 nm, 350 nm (primeiro derivado) são usados para calcular a razão e seu primeiro derivado (que tem um máximo na taxa máxima de variação) em um formato semelhante.
      3. Observe dados semelhantes para dispersão na folha de dispersão. Gere a curva de dispersão para cada amostra, plotando a coluna de temperatura contra a coluna de dispersão. Procure a Folha para a primeira derivada de dispersão.
  3. Criando e validando uma visão geral global para todos os fragmentos
    1. Depois de verificar os valores Tm corretos para os fragmentos, combine as colunas Sample ID e Inflexction point of 330/350 nm ratio (Tm) de todas as execuções em um único novo arquivo de resultado, copiando essas colunas de cada execução.
    2. Use o valor médio de Tm da proteína nativa (tipicamente calculada ao longo de dez corridas) e subtraia-a dos valores Tm de cada amostra, para obter o ΔTm. Classifique os resultados sobre ΔTm em ordem descendente para identificar as amostras que resultam na maior mudança.
    3. Divida os fragmentos em lixeiras dependendo do turno ΔTm e gere uma tabela de frequência para toda a biblioteca plotando o ΔTm para cada lixeira contra o número de fragmentos(Figura 5). Para conveniência, mostre o eixo representando o número de fragmentos na escala de log. Bin a amostra com ΔTm ±1, e adapte as outras caixas a cada corrida para ajustar o número de outliers empiricamente.

Resultados

Uma tela cheia da biblioteca DSi-Poised (768 fragmentos) foi realizada em três proteínas de interesse médico, ou seja, o kinetochore externo Altamente Expresso em Proteína Cancer 1 (Hec1, ou Ndc80), o domínio de repetição de tetraricopeptida (TPR) regulatório do eixo monopolar quinase 1 (Mps1), e o SARS-CoV-2 3C-like protease, Nsp5, que se equilibra fora do c-terminus da réplica poliina em 11 locais. As condições tampão escolhidas para cada proteína, bem como a concentração de proteínas e Tm das proteínas, são mostradas na Tabela Suplementar S4.

figure-results-1
Figura 5: Distribuição de frequência da mudança na temperatura de fusão (ΔTm) para as três proteínas, Hec1, Mps1 e Nsp5, apresentadas neste estudo como resultados representativos. Abreviaturas: Hec1 = Altamente Expressa em Câncer 1 proteína; Mps1 = fuso monopolar quinase 1; Nsp5 = SARS-CoV-2 3C-like protease. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os resultados das três triagens utilizando o protocolo descrito acima, exibidos como a distribuição de frequência da alteração em Tm versus o número de fragmentos, são mostrados na Figura 5. Esses lotes foram gerados conforme descrito na seção 5.3 do protocolo, traçando a frequência da alteração observada em Tm. O significado da mudança precisa ser definido de forma subjetiva para cada projeto diferente, conforme descrito na seção de discussão abaixo. Valores negativos indicam uma redução da temperatura de fusão na presença de um fragmento, um valor positivo um aumento em Tm. A partir dessas parcelas, é fácil observar que, para Nsp5, todos os fragmentos têm um efeito desestabilizador, enquanto para Hec1 e Mps1, tanto os acertos estabilizadores quanto desestabilizadores são observados. Isso pode ser esperado e será discutido.

Discussão

Este protocolo descreve um método de throughput médio a alto para triagem de bibliotecas de fragmentos usando alguns instrumentos de medição e robótica comum. Telas como as descritas neste protocolo podem ser realizadas rotineiramente pelo NKI Protein Facility em Amsterdã, por exemplo, como um serviço iNEXT-Discovery, muitas vezes até mesmo gratuitamente para usuários após o aplicativo de proposta e revisão por pares. Nesses casos, a biblioteca DSi-Poised pode ser fornecida pela instalação, mas o uso de outras bibliotecas também pode ser discutido no contexto de cada diferente aplicativo de usuário e contrato de serviço. A escolha dos instrumentos neste protocolo representa soluções práticas para muitos laboratórios, mas não deve ser considerada como padrão-ouro. Métodos livres de rótulos são recomendados para medir a estabilidade térmica da proteína alvo para triagem de fragmentos, em vez de métodos que usam rótulos ambientalmente sensíveis para detectar desdobramentos em um termociclador de reação de cadeia de polimerase de transcrição reversa.

Métodos livres de rótulos, como o aqui apresentado usando o instrumento Prometeu, têm algumas vantagens: eles usam baixas quantidades de proteína, muitas vezes algumas porções de magnitude menor; podem ser usados para medir simultaneamente a dispersão da amostra e, assim, a agregação; e os rótulos utilizados para detectar desdobramentos em outras abordagens podem interagir de forma diferente com cada fragmento, resultando em artefatos de medição. Este protocolo foi descrito no contexto do robô Mosquito, que permite a pipetação de um volume muito pequeno de amostra (0,3 μL) que não pode ser feito manualmente. O Mosquito é um robô popular, presente em muitos laboratórios que trabalham em projetos de biologia estrutural e descoberta de drogas; no entanto, o protocolo pode claramente usar abordagens alternativas para pipetação de baixo volume.

Bibliotecas de fragmentos contêm compostos dissolvidos no DMSO. Um dos desafios iniciais é encontrar a concentração ideal de DMSO na qual a proteína permanece estável, e os compostos permanecem solúveis. Isso envolve a realização das medições em várias concentrações de DMSO para determinar as condições ideais para a triagem. A proteína para fragmentação utilizada aqui resulta em concentrações de DMSO de 0,2%; a maioria das proteínas são bastante estáveis nessas condições. A quantidade de proteína necessária para a realização da triagem para a biblioteca de 768 compostos é ~2-3 mg no total, pois as medidas são tipicamente realizadas em baixas concentrações proteicas (0,2 mg mL-1). Trabalhar com concentrações relativamente baixas de proteínas não só reduz os custos de produção de proteínas, mas também reduz as chances de precipitação proteica. A baixa concentração proteica não afeta a detecção de ligação de fragmentos, pois a concentração dos fragmentos no experimento é de ~2 mM, permitindo também adutores fracos serem identificados.

Como a detecção de transição de fusão nesses experimentos é baseada na intensidade da fluorescência, um aspecto crítico é determinar o poder de excitação do laser para realizar as medições. A interação dos compostos com a proteína pode (i) não ter efeito sobre sua fluorescência intrínseca, (ii) resultar em saciedo, ou (iii) aumentar sua fluorescência intrínseca. Além disso, trabalhar com baixas concentrações proteicas significa que a contagem de fluorescência para a proteína nativa seria baixa. O poder de excitação, portanto, deve ser ajustado de tal forma que a maioria das amostras possa ser medida. O perfil de dispersão de cada corrida fornece informações importantes sobre os efeitos de agregação que podem ser desencadeados pela adição de qualquer fragmento. Além disso, o efeito da temperatura sobre a solubilidade composta também pode ser visto no perfil de dispersão.

Inesperadamente, para muitos compostos, observou-se que a dispersão realmente diminuiu com o aumento da temperatura(Figura 6). Por isso, é importante olhar tanto para a curva de transição de fusão quanto para o perfil de dispersão que acompanha para decidir sobre a confiabilidade de cada experimento, especialmente para aqueles fragmentos que são considerados candidatos a medições mais exigentes por cristalografia de raios-X ou espectroscopia de NMR, ou mesmo considerados como hits para a química de seguimento. Uma limitação específica do método para fins de triagem de fragmentos é que muitos fragmentos na biblioteca DSi-Poised têm fluorescência intrínseca significativa, às vezes até mesmo além do limite de saturação do detector, e, portanto, estes não podem ser adequadamente rastreados para ligação de alvo mesmo com baixo poder de excitação. Outro ponto a ser observado para este método é que ele só pode ser usado com proteínas contendo resíduos de triptofano.

figure-discussion-1
Figura 6: Efeito da temperatura sobre a solubilidade composta. Curva de transição de fusão e perfil de dispersão de Hec1 com dois compostos diferentes. (A) O perfil de dispersão mostra que, para esta amostra, a solubilidade não é afetada pela temperatura. (B) O perfil de dispersão mostra que a solubilidade desta amostra aumenta com o aumento da temperatura. A curva de transição de fusão neste caso, portanto, não é confiável. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Uma questão aberta é o que deve ser considerado como uma mudança significativa em Tm, não do ponto de vista matemático, mas do ponto de vista prático: que mudança em Tm é importante considerar como indicativo de vinculação de um ligante a uma proteína? Nestes exemplos, são observadas mudanças inferiores a 1 °C para 74% dos fragmentos para hec1 vinculante, 66% para Mps1 e 53% para Nsp5. Considerando 1 °C como "mudança significativa" dificilmente proporcionaria hits dignos de prosseguir pela química de seguimento. Nos gráficos de visão geral(Figura 5),foram consideradas caixas de 1, 2, 5 ou mais de 5 graus de tm shift, positivas ou negativas. Isso requer modificação de acordo com cada caso específico para dar uma boa visão geral e permitir a tomada de decisões informadas, determinando o próximo passo. Notavelmente, para algumas proteínas, tanto a estabilização quanto a desesflação do alvo foram observadas dependendo dos fragmentos considerados. Ambos os eventos são interessantes, pois ambos podem ser o resultado da ligação de fragmentos, e ambos podem levar a uma boa molécula de acompanhamento para manipular o comportamento proteico.

Uma pergunta final permanece, ou seja, "o que define um sucesso útil?". Na verdade, a resposta depende da situação específica. Por exemplo, para o Hec1, todos os fragmentos que estabilizam a proteína em mais de 2 graus ou a desestabilizam por mais de 5 foram comunicados aos nossos colaboradores de química, que projetaram novas moléculas com base nesses golpes. Para o Nsp5, no entanto, os hits mais deses estabilizadores foram comunicados aos nossos colaboradores da NMR para confirmar os hits derivados de nanoDSF com experimentos NMR. Em outras palavras, os resultados de triagem obtidos a partir deste protocolo devem ser analisados com cautela e de forma dependente do contexto, tomando decisões informadas com base na questão específica e metodologia circundante. De qualquer forma, o método descrito aqui é uma abordagem complementar às metodologias existentes, como o raio-X e a triagem baseada em NMR, que pode visar confirmar, priorizar ou dar novas ideias para campanhas químicas.

Tabela Suplementar S1: Lista de tampões utilizados para a triagem de proteínas. Abreviaturas: HEPES = 4-(2-hidroxitila)-1-piperazineethanethanesulfonic ácido; DTT = dithiothreitol; MOBS = 4-(N-morpholino)ácido butanesulfônico. Clique aqui para baixar esta Tabela.

Tabela Suplementar S2: Propriedades para placa mrc 2-well para uso com robô nanodispenser. Por favor clique aqui para baixar esta Tabela.

Tabela suplementar S3: Propriedades para placa de fundo V de 96 poços para uso com robô nanodispenser. Clique aqui para baixar esta Tabela.

Tabela Suplementar S4: O tampão, concentração de proteínas e Tm das proteínas discutidas em resultados representativos. Abreviaturas: DTT = dithiothreitol; Hec1 = Altamente Expresso em Câncer 1 proteína; Mps1 = fuso monopolar quinase 1; Nsp5 = SARS-CoV-2 3C-like protease. Clique aqui para baixar esta Tabela.

Arquivo Suplementar 1: Parâmetros de visão geral-dadosde exemplo. Por favor, clique aqui para baixar este Arquivo.

Arquivo Suplementar 2: Valores Tm e ΔTm para dados de exemplo de 406 fragmentos. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Divulgações

Não há revelações.

Agradecimentos

"Este trabalho beneficiou-se do acesso ao NKI Protein Facility, um centro Instruct-ERIC. O apoio financeiro foi fornecido pelo iNEXT, número do projeto 653706, e o iNEXT-Discovery, número do projeto 871037, financiado pelo programa Horizon 2020 da Comissão Europeia".

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
ClearVue SheetsMolecular Dimensionsfilme de vedação adesivo para placa de proteína
CORNING 6570 Fita de vedação de alumínioCORNINGFilme de vedação adesivo para placa de fragmento
DSi biblioteca equilibradade enaminacontendo 768 compostos usados neste estudo
Elisa Reagent ReserviorThermoFisher Scientific15075Reagente reagente usado para pipetar a proteína
Greiner round (U) placasCat. Não.  650201Fragmentos fornecidos nestas placas
Mosquito tipo X1sptlabtechParte nr- 3019-0003Dispensador de nanolitros
Placa de cristalização MRC de 2 poçosMRC96T-PS
Catálogo Nanotemper nº PR001 (+ Óptica de Detecção de Agregação, catálogo nº PR-AGO)nanoDSF e retroespalhamento de luz
Prometheus Tipo capilar padrãoCatálogo PR-C002
TX-1000Centrífuga termocientíficapara placas
Biblioteca de fragmentos inferiores Pierce ELISA Reagentes Reservatórios Pierce Prometheus Catálogo de capilares de alta sensibilidade PR-C006 Prometheus NT.48 nanoDSF

Referências

  1. Hoffer, L., Muller, C., Roche, P., Morelli, X. Chemistry-driven hit-to-lead optimization guided by structure-based approaches. Molecular Informatics. 37 (9-10), 1800059(2018).
  2. Lamoree, B., Hubbard, R. E. Current perspectives in fragment-based lead discovery (FBLD). Essays in Biochemistry. 61 (5), 453-464 (2017).
  3. Ress, D. C., Congreve, M., Murray, C. W., Carr, R. Fragment-based lead discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 3 (8), 660-672 (2004).
  4. Carr, R. A. E., Congreve, M., Murray, C. W., Rees, D. C. Fragment-based lead discovery: Leads by design. Drug Discovery Today. 10 (14), 987-992 (2005).
  5. Bradley, A. R., et al. The SGC beyond structural genomics: Redefining the role of 3D structures by coupling genomic stratification with fragment-based discovery. Essays in Biochemistry. 61 (5), 495-503 (2017).
  6. Davies, T. G., Tickle, I. J. Fragment screening using X-ray crystallography. Topics in Current Chemistry. 317, 33-59 (2012).
  7. Ma, R., Wang, P., Wu, J., Ruan, K. Process of fragment-based lead discovery - A perspective from NMR. Molecules. 21 (7), 854(2016).
  8. Troelsen, N. S., Clausen, M. H. Library design strategies to accelerate fragment-based drug discovery. Chemistry. 26 (50), 11391-11403 (2020).
  9. Shi, Y., von Itzstein, M. How size matters: Diversity for fragment library design. Molecules. 24 (15), 2838(2019).
  10. Taylor, A., Doak, B. C., Scanlon, M. J. Design of a fragment-screening library. Methods in Enzymology. 610, 97-115 (2018).
  11. Cox, O. B., et al. A poised fragment library enables rapid synthetic expansion yielding the first reported inhibitors of PHIP(2), an atypical bromodomain. Chemical Science. 7, 2322-2330 (2016).
  12. Sreeramulu, S., et al. NMR quality control of fragment libraries for screening. Journal of Biomolecular NMR. 74 (10-11), 555-563 (2020).
  13. Pfaff, S. J., Chimenti, M. S., Kelly, M. J. S., Arkin, M. R. Biophysical methods for identifying fragment-based inhibitors of protein-protein interactions. Methods in Molecular Biology. 1278, 587-613 (2015).
  14. Fattori, D., Squarcia, A., Bartoli, S. Fragment-based approach to drug lead discovery: Overview and advances in various techniques. Drugs in R & D. 9 (4), 217-227 (2008).
  15. Winter, A., et al. Biophysical and computational fragment-based approaches to targeting protein-protein interactions: Applications in structure-guided drug discovery. Quarterly Reviews of Biophysics. 45 (4), 383-426 (2012).
  16. Boelens, R., et al. iNEXT: a European facility network to stimulate translational structural biology. FEBS Letters. 592 (12), 1909-1917 (2018).
  17. Zhang, R., Monsma, F. Fluorescence-based thermal shift assays. Current Opinion in Drug Discovery and Development. 13 (4), 389-402 (2010).
  18. Boivin, S., Kozak, S., Meijers, R. Optimization of protein purification and characterization using Thermofluor screens. Protein Expression and Purification. 91 (2), 192-206 (2013).
  19. Martinez Molina, D., Nordlund, P. The cellular thermal shift assay: a novel biophysical assay for in situ drug target engagement and mechanistic biomarker studies. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 141-161 (2016).
  20. Bruce, D., Cardew, E., Freitag-Pohl, S., Pohl, E. How to stabilize protein: stability screens for thermal shift assays and nano differential scanning fluorimetry in the Virus-X Project. Journal of Visualized Experiments JoVE. (144), e58666(2019).

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

Ensaio de Deslocamento T rmicoTriagem de FragmentosEstabilidade ProteicaLiga o de LigantesTemperatura de Fus oCarregamento CapilarDesnatura o ProteicaBiblioteca de Fragmentos

Artigos relacionados