Ensaio in vitro de alta produtividade usando organoides tumorais derivados do paciente

Linhas celulares de câncer humano são amplamente aceitas para estudar a biologia do câncer e avaliar agentes anticancerígenos. No entanto, essas linhas celulares não necessariamente preservam as características originais de seu tecido de origem porque sua morfologia, mutação genética e perfil de expressão genética podem mudar durante a cultura por longos períodos. Além disso, a maioria dessas linhas celulares são cultivadas em uma monocamada ou usadas como xenoenxertos murinas, nenhuma das quais representam fisicamente tecido tumoral^1,2. Assim, a eficácia clínica dos agentes anticancerígenos pode não ser a mesma observada nas linhas celulares cancerosas. Portanto, sistemas in vitro, como ensaios ex vivo usando xenoenxertos tumorais derivados do paciente ou organoides tumorais derivados do paciente (PDOs) e modelos de esferoides tumorais que reproduzem com precisão a estrutura e a função dos tecidos tumorais, foram desenvolvidos. Evidências crescentes sugerem que esses modelos predizem a resposta dos pacientes aos agentes anticancerígenos por serem diretamente comparáveis ao tecido cancerígeno correspondente. Estes sistemas in vitro foram estabelecidos para diferentes tipos de tecido tumoral, e sistemas associados de ensaio de alto rendimento (HTS) para rastreamento de medicamentos também foram desenvolvidos^3,4,5,6,7. Culturas organoides ex vivo heterogêneas de tumores primários obtidos de pacientes ou xenoenxertos tumorais derivados do paciente ganharam considerável tração nos últimos anos devido à sua facilidade de cultura e capacidade de manter a complexidade das células no tecido estromal^8,9,10. Espera-se que esses modelos melhorem a compreensão da biologia do câncer e facilitem a avaliação da eficácia da droga in vitro.

Uma série de novos PDOs foram recentemente criados a partir de diferentes tipos de tecido tumoral, designado como F-PDO, sob o Projeto de Pesquisa Translacional de Fukushima. Os PDOs formam grandes aglomerados celulares com uma morfologia semelhante à do tumor de origem e podem ser cultivados por mais de seis^{meses 11}. A histologia comparativa e análises abrangentes de expressão genética mostraram que as características dos PDOs estão próximas às de seus tecidos tumorais de origem, mesmo após o crescimento prolongado em condições culturais. Além disso, foi estabelecido um HTS adequado para cada tipo de PDO em placas de 96 poços e 384 poços. Estes ensaios foram utilizados para avaliar vários agentes moleculares e anticorpos. Aqui, a quimioterapia padrão (paclitaxel e carboplatina) utilizada para câncer endometrial foi avaliada utilizando-se F-PDOs derivados de um paciente que não respondeu ao paclitaxel e à carboplatina. Assim, a atividade inibitória de crescimento celular do paclitaxel e da carboplatina contra este PDO foi fraca (IC₅₀: >10 μM). Além disso, pesquisas anteriores relataram que a sensibilidade de alguns F-PDOs a agentes quimioterápicos e agentes moleculares são consistentes com a eficácia clínica^11,12,13. Finalmente, foram analisadas alterações na estrutura de ordem superior dos PDOs causadas por agentes anticancerígenos utilizando-se um sistema de análise celular tridimensional^12,13. Os resultados da avaliação de agentes anticancerígenos utilizando um HTS baseado em PDO são comparáveis aos resultados clínicos obtidos para esses agentes. Aqui, é apresentado um protocolo para um HTS mais simples e preciso que pode ser usado para avaliar a potência dos agentes anticancerígenos e a imunoterapia utilizando os modelos PDO.

Todos os experimentos envolvendo materiais derivados do homem foram realizados sob a Declaração de Helsinque e aprovados antecipadamente pelo comitê de ética da Universidade Médica de Fukushima (números de aprovação 1953 e 2192; datas de aprovação 18 de março de 2020 e 26 de maio de 2016, respectivamente). O consentimento informado por escrito foi obtido de todos os pacientes que forneceram os espécimes clínicos utilizados neste estudo.

1. Cultura de PDOs

NOTA: Os F-PDOs formam aglomerados celulares que exibem uma variedade de morfologias heterogêneas e crescem na cultura de suspensão(Figura 1). Além disso, os F-PDOs podem ser cultivados por mais de 6 meses e podem ser criopreservados para uso futuro.

1. Descongelamento de PDOs armazenados (dia 0)
   1. PDOs de degelo e sementes (por exemplo, RLUN007, adenocarcinoma pulmonar) no dia 0(Figura 1). Primeiro, adicione 15 mL de meio para PDOs (ver Tabela de Materiais) contendo 1% de suplemento B-27 e 30 ng/mL de fator de crescimento epidérmico a um tubo de centrífuga estéril de 50 mL.
   2. Depois de remover o frasco congelado do armazenamento de nitrogênio líquido, agitar suavemente os PDOs em um banho de água de 37 °C por 2 min. Em seguida, retire o frasco do banho de água, limpe o frasco com 70% de etanol e, em seguida, mova o frasco para um armário de segurança biológica.
   3. Transfira o conteúdo do frasco para o tubo contendo 15 mL de meio para PDOs. Misture os PDOs e o médio, em tubos suavemente para cima e para baixo cinco vezes com uma pipeta de transferência de 3 mL. Centrifugar o tubo a 200 x g por 3 min a ~25 °C e descartar o supernatante. Resuspenque a pelota PDO em 5 mL de meio fresco e transfira para um frasco de²⁵ cm 2 (ver Tabela de Materiais)com tubulação suave. Finalmente, cultura os PDOs em uma incubadora a 37 °C em 5% DE CO₂.
2. Troque o meio duas vezes por semana (dias 3-7). Centrifugar a suspensão PDO para precipitar os aglomerados celulares e substituir 4 mL do meio (80% de volume). Resuspende as células no meio fresco.
   NOTA: A maioria do RLUN007 aparece como aglomerados celulares de 100-500 μm de diâmetro. Quando a cor do fenol vermelho no meio mudar para amarelo, como mostrado na Figura 1A,substitua o meio com mais frequência. Se o meio ficar amarelo no dia seguinte à substituição, e cada aglomerado de células se fundir para formar aglomerados maiores que são > 500 μm de diâmetro, a passagem em uma proporção dividida de 1:2.
3. Subcultura (dias 8 a 28) de PDOs
   NOTA: Dada a dificuldade de realmente medir o número de células únicas, o tempo de passagem é determinado com base em uma densidade de aglomerado celular apropriada e no tamanho da pelota PDO após a centrifugação(Figura 1B). No caso do RLUN007, o volume da pelota PDO atinge 30 μL (densidade saturada em frascos de 25 cm²⁾ aproximadamente 2 semanas após o descongelamento.
   1. Para a transferência de um frasco de²⁵ cm 2 para dois frascos^{de 25} cm 2 (P1), transfira a suspensão PDO para um tubo de centrífuga e centrífuga a 200 x g por 2 min a aproximadamente 25 °C. Estime o volume da pelota PDO e descarte o supernascedor. Resuspenda a pelota PDO usando uma pipeta de 5 mL em 5 mL de meio fresco. Pipeta suavemente para cima e para baixo cinco vezes em baixa velocidade. Em seguida, transfira metade do volume da suspensão PDO (2,5 mL) em dois frascos e adicione 2,5 mL de meio fresco a cada frasco. Cultura as células a 37 °C em 5% DE CO₂.
   2. Para a transferência de dois frascos de²⁵ cm 2 para um frasco de 75 cm² (P2), transfira a suspensão PDO de dois frascos em dois tubos de centrífuga e centrifugar o PDO a 200 x g por 2 min a aproximadamente 25 °C. Em seguida, estime o volume da pelota PDO e resuspense a pelota em 2,5 mL de meio fresco (por tubo). Depois disso, misture a suspensão PDO em um tubo com o outro e transfira-a para um frasco de 75 cm² contendo 10 mL de meio fresco. Cultura as células a 37 °C em 5% DE CO₂. Transfira os PDOs subculturados de dois frascos^{de 25} cm 2 para um frasco de 75 cm² aproximadamente 1 semana após a primeira passagem(Figura 1C).

2. Inibição do crescimento HTS

NOTA: A atividade inibitória de crescimento de agentes anticancerígenos contra PDOs é avaliada pela medição do conteúdo ATP intracelular, conforme mostrado na Figura 2. Esta etapa é realizada utilizando um kit de ensaio de viabilidade celular disponível comercialmente (ver Tabela de Materiais).

1. No dia 0, cultura os PDOs (por exemplo, RLUN007) em frascos até que um número adequado de aglomerados celulares estejam disponíveis para o ensaio. Um dia antes da semeadura, transfira a suspensão PDO de um frasco de 75 cm² para um tubo de 15 mL e centrífuga a 200 x g por 2 min para medir o volume de pelotas PDO. Em seguida, resuspenque a pelota PDO em 15 mL de meio fresco e transfira-a de volta para um frasco de 75 cm^2. Cultura as células a 37 °C em 5% DE CO₂.
   NOTA: O volume de pelotas PDO necessário depende da taxa de diluição de cada PDO e do número de placas de 384 poços utilizadas para o ensaio. Para rlun007, é necessário um volume de 200 μL de pelotas celulares para semeadura em dez placas de 384 poços.
2. No dia 1 (24h após a troca do meio), pique os PDOs utilizando equipamento de fragmentação e dispersão celular (ver Tabela de Materiais) com um porta-filtro contendo um filtro de malha de 70 μm. Em seguida, diluir 15 mL da suspensão PDO em 10x. Semente 40 μL da suspensão PDO em micropla placas de fixação ultra-baixa de 384 poços (fundo redondo) (ver Tabela de Materiais) utilizando um dispensador de suspensão celular (ver Tabela de Materiais).
   NOTA: Para agrupamentos de células de picar, recomenda-se o uso do equipamento de fragmentação e dispersão celular comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais).
3. Às 24 horas após a semeadura (dia 2), trate os PDOs com 0,04 μL de soluções de agente de teste nas faixas de concentração final de 20 μM a 1,0 nM (10 diluições seriais) utilizando um manipulador líquido (ver Tabela de Materiais).
4. No dia 8 (144 h após o tratamento da substância de teste), adicione reagente de medição ATP intracelular aos poços de teste. Misture as placas usando uma batedeira e incubar por 10 min a 25 °C. Meça o conteúdo ATP intracelular como luminescência usando um leitor de placas (ver Tabela de Materiais).
5. Para calcular a viabilidade celular, divida a quantidade de ATP nos poços de teste por aquele nos poços de controle contendo o veículo, com o fundo subtraído. Para calcular a taxa de crescimento ao longo de 6 dias, divida a quantidade de ATP nos poços de controle do veículo por que no controle do veículo poços 24 horas após a semeadura.
6. Calcule os valores de concentração inibitória de 50% (IC₅₀) e área sob a curva (AUC) a partir das curvas dose-resposta utilizando o software de análise de dados biológicos (ver Tabela de Materiais). O fator Z é um parâmetro inagável que varia de 1 (separação infinita) a <0, definido como Z = 1 - (3σc+ + + 3σc-) / |μc+ - μc-|, onde σc+, σc-, μc+, e μc- são os desvios padrão (σ) e as médias (μ) dos controles alto (c+) e baixo (c−)¹⁴, respectivamente.

3. HTS com sistema de colheita celular e imagem para inibição de crescimento

NOTA: Se houver um grande desvio (quando o coeficiente de variação [CV] no ensaio for superior a 20%) nos dados usando o protocolo 2, PDOs de tamanho selecionado podem ser semeados em placas de 96 ou 384 poços usando um sistema de coleta e imagem celular(Figura 2). O protocolo é o mesmo descrito nas etapas 2.1 e 2.2 na seção anterior. Esta etapa é realizada utilizando um sistema de coleta e imagem de células disponíveis comercialmente (ver Tabela de Materiais).

1. No primeiro dia, defina uma microplacão esferoide de fixação ultra-baixa de 384 poços com 40 μL de média/bem como uma placa de destino no sistema de captação e imagem de células.
2. Encha a câmara de colheita (ver Tabela de Materiais) com 6 mL de cultura média e centrífuga a 1.500 x g por 2 min para remover bolhas de ar. Adicione os PDOs suspensos no médio (volume de pelotas PDO, 4 μL) à câmara de colheita e coloque no sistema.
3. Fique na câmara por pelo menos 1 minuto, seguido de dispersão, para que os aglomerados celulares se instalem no fundo da câmara; em seguida, realizar a varredura da câmara.
4. Defina o tamanho de colheita para 140-160 μm (área 15.386-20.000 μm²) no sistema para seleção automática de clusters celulares. Em seguida, verifique a qualidade dos clusters celulares selecionados nas imagens digitalizadas e transfira dez clusters de células por poço usando dicas de colheita (ver Tabela de Materiais) na placa de destino.
5. Realize as etapas do protocolo a partir da etapa 2.3 em diante.

4. HTS para citotoxicidade celular dependente de anticorpos

NOTA: Esta etapa é realizada utilizando-se um sistema comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais),que é um instrumento de medição de impedância elétrica. É usado para avaliar a citólise dos PDOs por citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) com anticorpos monoclonais e células assassinas naturais (NK)(Figura 3). As células NK são produzidas a partir de células mononucleares de sangue periféricos usando o kit de produção de células NK (ver Tabela de Materiais),seguindo as instruções do fabricante.

1. Medição da atividade do ADCC
   1. No dia 0, cubra uma placa de 96 poços (ver Tabela de Materiais) com 50 μL de solução de fibronectina de 10 μg/mL (0,5 μg/well) a 4 °C durante a noite.
   2. No primeiro dia, após a remoção da solução de fibronectina, adicione 50 μL do meio de cultura a cada poço para medir a impedância de fundo.
   3. Antes da semeadura, adicione 5 mL de reagente de dissociação de cultura celular (ver Tabela de Materiais) aos PDOs (RLUN007: 100 μL da pelota PDO em um frasco de 75 cm²⁾ e incubar em uma incubadora de CO₂ a 37 °C por 20 minutos para dispersar os PDOs. Para parar a trippsinização, adicione 5 mL de média, centrífuga e remova o reagente de dissociação. Enxágüe os PDOs com meio fresco e filtre através de um coador de células de 40 μm (ver Tabela de Materiais).
   4. Conte o número de células usando um analisador de viabilidade celular (ver Tabela de Materiais).
   5. Transfira a suspensão PDO para um reservatório e misture usando um pipettor multicanal. Adicione a suspensão PDO em poços a 5 x 10⁴ células/bem em uma placa de 96 poços. Cada poço contém um volume final de 100 μL. Em seguida, coloque a placa em um armário de segurança biológica a aproximadamente 25 °C por 30 min.
   6. Transfira a placa para o instrumento em uma incubadora de CO₂ a 37 °C. Alterações recordes nos sinais de impedância a cada 15 minutos como o índice celular.
   7. Descongele as células NK em um banho de água de 37 °C no mesmo dia da semeadura do PDO. Transfira as células do frasco para um tubo de 15 mL contendo 10 mL de média para células NK (ver Tabela de Materiais) e centrífuga a 300 x g por 5 min a aproximadamente 25 °C. Descarte o supernatante e resuspenque a pelota da célula em 10 mL de meio fresco. Após a contagem celular, ajuste a densidade celular para 1 x 10⁶ células/mL e transfira para um frasco de 75 cm^2. Cultura as células NK em uma incubadora de CO₂ de 5% a 37 °C.
   8. No dia 2, prepare as soluções de anticorpos (soro fisiológico tamponado com fosfato) em 10 vezes a concentração final em placas estéreis de fundo V de 96 poços.
   9. Remova 60 μL de médio de cada poço e adicione 10 μL de solução trastuzumab ou cetuximab (10 μg/mL, 1 μg/mL e 0,1 μg/mL) aos PDOs. Transfira as placas de volta para o instrumento em uma incubadora e regise o índice celular por 1h.
   10. Transfira a suspensão da célula NK para um tubo de 50 mL e conte o número da célula. Centrifugar as células a 300 x g por 5 min e ajustar a densidade celular NK para 1 x 10⁶ células/mL e 2 x 10⁶ células/mL com o meio para os PDOs.
   11. Adicione 50 μL de suspensão celular NK às células do efeito (NK) a uma razão celular alvo (RLUN007) de 1:1 ou 2:1. As concentrações finais dos anticorpos são 1 μg/mL, 0,1 μg/mL e 0,01 μg/mL. Mantenha a placa a aproximadamente 25 °C por 15 min e devolva as placas ao instrumento.
2. Coleta e análise de dados
   1. Converta o índice celular em valores por cento de citolise usando software de análise (ver Tabela de Materiais).
   2. A porcentagem de citolise refere-se à porcentagem de células-alvo mortas por células NK versus células-alvo (PDOs) apenas como um controle. Subtrair os índices celulares dos poços contendo apenas células NK do índice dos poços amostrais em cada ponto de tempo. Normalize cada valor para o índice celular imediatamente antes da adição de anticorpos. Converta o índice celular normalizado em por cento citolise usando a seguinte equação: % citolise = (1 - índice celular normalizado [poços amostrais]) / índice celular normalizado (poços sozinhos) x 100.

Um HTS altamente preciso foi desenvolvido utilizando PDOs e microplatas de 384 poços para avaliar agentes anticancerígenos, e o desenvolvimento de um HTS para cada PDO foi relatado anteriormente10,11,12,13. O desempenho do HTS foi avaliado pelo cálculo dos CVs e do fator Z'. O fator Z é um método amplamente aceito para validação da qualidade e desempenho do ensaio, e o ensaio é adequado para HTS se esse valor for >0,514. Os pontos de controle datum no ensaio da placa de 384 poços utilizando RLUN007 apresentaram pouca variabilidade, com valores cv de 5,8% e fatores Z calculados de 0,83, como mostrado na Figura 4. Esses resultados indicam que este ensaio tem alto desempenho para HTS. Investigar a sensibilidade dos PDOs aos agentes anticancerígenos usando HTS, a inibição do crescimento foi avaliada por meio de inibidores do receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR) (afatinib, erlotinib, gefitinib, lapatinib, osimertinib e rociletinib) e paclitaxel, que são tratamentos clínicos padrão para câncer de pulmão de células não pequenas, e mitomicina C como controle positivo. Os valores IC50 e AUC dos agentes anticancerígenos para cada PDO são mostrados na Figura 4. O RLUN007 apresentou alta sensibilidade (IC50 < 2 μM, AUC < 282) para todos os inibidores de EGFR e outros agentes anticancerígenos. Curvas sigmoid calculadas para todos os dados indicaram que a atividade inibitória de crescimento dos agentes anticancerígenos poderia ser medida com precisão.

O sistema de coleta e imagem celular é usado quando os dados variam significativamente usando a metodologia acima. O sistema de captação e imagem de células, que escolhe os aglomerados celulares com precisão sem danificá-los, permite ensaios precisos de HTS alinhando o tamanho do cluster celular para excluir detritos celulares do sistema de ensaio. Quando o sistema não foi utilizado, o valor do CV foi de 26,0% e o valor do fator Z foi de 0,23 (dados não apresentados). No entanto, os valores do fator CV e Z foram melhorados em 6,4% e 0,81, respectivamente, utilizando-se o sistema.

Para investigar a citólise dos PDOs com atividade do ADCC utilizando o instrumento de medição de impedância elétrica, que monitora o número, a morfologia e a fixação das células por uma longa duração, foram avaliadas alterações nos sinais de impedância usando rlun007 tratados com os anticorpos (trastuzumab e cetuximabe) e células NK como células de efeito em uma placa de 96 poços. Em comparação com o controle composto apenas por células-alvo, a citolise percentual aumentou com o tempo. Atingiu 45% ou 75% após 6h em uma razão E:T de 1:1 (Figura 5A, C) ou 2:1 ( Figura5B,D) sem os anticorpos. A citolise mediada por células NK utilizando trastuzumabe foi de aproximadamente 60% e 90% em uma razão de 1:1 (Figura 5A, 1 μg/mL) e 2:1(Figura 5B, 1 μg/mL), respectivamente, a 6 h. Em contraste, o cetuximabe teve um impacto dependente de dose na citolise mediada por células NK (Figura 5C, D). Na maior concentração de cetuximabe, rlun007 foram destruídos a 90% e 100% em uma razão de 1:1 e 2:1, respectivamente (Figura 5C,D). O efeito do trastuzumabe foi mais fraco que o do cetuximabe, com apenas 60% de citotoxicidade. Esses resultados indicam que o sistema de ensaio PDO pode avaliar a atividade do ADCC usando tecnologia baseada em impedância em tempo real.

Figura 1: Pontos críticos para a cultura PDO. (A) Mudança de cor no meio. (B) Medição da quantidade de PDOs do tamanho da pelota, forrando um tubo de centrífuga contendo os PDOs com tubos marcados em níveis de densidade de PDO de 50-200 μL.(C). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Resumo do protocolo usado para criar um sistema de ensaio de alta taxa usando microplacos de 384 poços. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Resumo do protocolo para ensaio de alto rendimento da atividade do ADCC. ADCC, citotoxicidade celular dependente de anticorpos; NK, assassino natural. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Sistema de ensaio de alto rendimento para inibição de crescimento com agentes anticancerígenos. Curva de dose-resposta de RLUN007 para agentes anticancerígenes. Os PDOs picados foram semeados em placas de 384 poços. Estes foram tratados por 6 dias com dez concentrações diferentes de agentes anticancerígenos (entre 10 μM e 1,5 nM). Os dados representam a média ± desvio padrão dos experimentos triplicados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Ensaio de alto rendimento para a atividade do ADCC. (A,B) Trastuzumab. (C,D) Cetuximab. (A,C) Uma razão de 1:1 de RLUN007 para células efetivas. (B,D) Citólise com uma razão de RLUN007: células effectoras de 1:2. A atividade foi medida 12 h após a adição das células effectoras. Os dados são apresentados como o desvio padrão ± médio de três amostras de réplica. ADCC, citotoxicidade celular dependente de anticorpos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Fujifilm Wako Bio Solutions Corporation é uma subsidiária da Fujifilm Wako Pure Chemicals, dona comercial da mídia F-PDO e F-PDO por transferência de licença.