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Artigo de método

Geração de Organoides cerebrais humanos para modelagem de doenças mitocondriais

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DOI:

10.3791/62756

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21 de junho de 2021

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1Department of General Pediatrics, Neonatology and Pediatric Cardiology, Duesseldorf University Hospital, Medical Faculty, Heinrich Heine University, 2Institute of Neurobiology, Heinrich Heine University, 3Berlin Institute for Medical Systems Biology (BIMSB), Max Delbrueck Center for Molecular Medicine (MDC), 4Seaver Autism Center for Research and Treatment, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 5Max Delbrueck Center for Molecular Medicine (MDC)

Neste artigo

Resumo

Descrevemos um protocolo detalhado para a geração de organoides cerebrais pluripotentes induzidos por células-tronco induzidos pelo homem e seu uso na modelagem de doenças mitocondriais.

Resumo

As doenças mitocondriais representam a maior classe de erros inatos do metabolismo e são atualmente incuráveis. Essas doenças causam defeitos neurodesenvolvimentistas cujos mecanismos subjacentes permanecem a ser elucidados. Um grande obstáculo é a falta de modelos eficazes recapitulando o comprometimento neuronal de início precoce visto nos pacientes. Os avanços na tecnologia de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) permitem a geração de organoides cerebrais tridimensionais (3D) que podem ser usados para investigar o impacto das doenças no desenvolvimento e organização do sistema nervoso. Pesquisadores, incluindo esses autores, introduziram recentemente organoides cerebrais humanos para modelar distúrbios mitocondriais. Este artigo relata um protocolo detalhado para a geração robusta de organoides cerebrais derivados do iPSC humanos e seu uso em perfis bioenergénicos mitocondrial e análises de imagens. Esses experimentos permitirão o uso de organoides cerebrais para investigar disfunções metabólicas e de desenvolvimento e podem fornecer informações cruciais para dissecar a patologia neuronal de doenças mitocondriais.

Introdução

As doenças mitocondriais representam a maior classe de erros inatos do metabolismo1. São causadas por mutações genéticas que interrompem diferentes processos mitocondriais, incluindo fosforilação oxidativa (OXPHOS)2, montagem da cadeia respiratória, dinâmica mitocondrial e transcrição ou replicação do DNA mitocondrial3. Tecidos com necessidades energéticas são particularmente afetados pela disfunção mitocondrial4. Assim, pacientes com doenças mitocondriais normalmente desenvolvem manifestações neurológicas precoces.

Atualmente, não há tratamentos disponíveis para crianças afetadas com doenças mitocondriais5. Um grande obstáculo para o desenvolvimento de medicamentos de doenças mitocondriais é a falta de modelos eficazes recapitulando o curso da doença humana6. Vários dos modelos animais atualmente estudados não apresentam os defeitos neurológicos presentes nos pacientes7. Assim, os mecanismos subjacentes à patologia neuronal das doenças mitocondriais ainda não são totalmente compreendidos.

Estudos recentes geraram iPSCs de pacientes afetados por doenças mitocondriais e usaram essas células para obter células neuronais específicas do paciente. Por exemplo, defeitos genéticos associados à doença mitocondrial, síndrome de Leigh, foram encontrados para causar aberrações em bioenergética celular8,9, síntese proteica10 e homeostase de cálcio9,11. Esses relatórios forneceram importantes pistas mecanicistas sobre o comprometimento neuronal que ocorre em doenças mitocondriais, abrindo caminho para a descoberta de medicamentos para essas doenças incuráveis12.

Culturas bidimensionais (2D), no entanto, não permitem a investigação da complexidade arquitetônica e da organização regional dos órgãos 3D13. Para isso, o uso de organoides cerebrais 3D derivados de iPSCs 14 específicos do paciente pode permitir que os pesquisadores obtenham informações importantes adicionais e, assim, ajudem a dissecar como as doenças mitocondriais impactam o desenvolvimento e a função do sistema nervoso15. Estudos que empregam organoides cerebrais derivados do IPSC para investigar doenças mitocondriais estão começando a descobrir os componentes neurodesenvolvimentista das doenças mitocondriais.

Organoides medulares portadores de mutações associadas à doença mitocondrial, encefalopatia mitocondrial, acidose láctica e síndrome de episódios semelhantes a acidente vascular cerebral (MELAS), apresentaram neurogênese defeituosa e diferenciação retardada do neurônio motor16. Organoides corticais derivados de pacientes com a doença mitocondrial, síndrome de Leigh, apresentaram tamanho reduzido, defeitos na geração de brotos epiteliais neurais e perda de arquitetura cortical17. Organoides cerebrais de pacientes com síndrome de Leigh mostraram que os defeitos da doença iniciam-se ao nível das células progenitoras neurais, que não podem se comprometer com o metabolismo mitocondrial, causando ramificação neuronal aberrante e morfogênese18. Assim, os progenitores neurais podem representar um alvo terapêutico celular para doenças mitocondriais, e estratégias que promovam sua função mitocondrial podem apoiar o desenvolvimento funcional do sistema nervoso.

O uso de organoides cerebrais pode ajudar a descobrir os componentes neurodesenvolvimentos de doenças mitocondriais. As doenças mitocondriais são consideradas principalmente como neurodegeneração de início precoce5. No entanto, defeitos neurodesenvolvimentais também estão presentes em pacientes afetados por doenças mitocondriais, incluindo atraso no desenvolvimento e comprometimento cognitivo19. Organoides cerebrais específicos do paciente podem ajudar a abordar esses aspectos e elucidar como doenças mitocondriais podem afetar o desenvolvimento cerebral humano. A disfunção mitocondrial também poderia desempenhar um papel patogênico em outras doenças neurológicas mais comuns, como a doença de Alzheimer, a doença de Parkinson e a doença de Huntington4. Assim, elucidar o impacto dos defeitos mitocondriais no neurodesenvolvimento usando organoides cerebrais também pode ser fundamental para o estudo dessas doenças. Este artigo descreve um protocolo detalhado para a geração de organoides cerebrais reprodutíveis que podem ser usados para a condução da modelagem de doenças mitocondriais.

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Protocolo

NOTA: O uso de iPSCs humanos pode exigir uma aprovação ética. Os iPSCs utilizados neste estudo foram derivados de indivíduos de controle saudável após aprovação ética local (#2019-681). Todos os procedimentos de cultura celular devem ser realizados sob uma capa de cultura celular estéril, desinfetando cuidadosamente todos os reagentes e consumíveis antes de serem transferidos sob o capô. Os iPSCs humanos usados para diferenciação devem ter um número de passagem abaixo de 50 para evitar possíveis aberrações genômicas que podem ocorrer após uma cultura extensiva. O estado pluripotente das células deve ser validado antes da geração organoide, por exemplo, monitorando a expressão de marcadores associados à pluripotência, como NANOG ou OCT4. Os testes de mycoplasma devem ser realizados semanalmente para garantir culturas livres de mycoplasma.

1. Geração de organoides cerebrais

  1. Cultura dos iPSCs humanos
    1. Cultura iPSCs humanos em condições livres de alimentadores em meio iPSC (ver a Tabela de Materiais) em placas revestidas de 6 poços e mantê-los em uma incubadora de cultura de tecido umidificado a 37 °C e 5% de CO2.
      NOTA: O transporte de células alimentador pode dificultar a diferenciação organoide. Passagem as células pelo menos uma vez em condições livres de alimentadores.
    2. Passar os iPSCs a 80% de confluência utilizando meio de desprendimento sem enzimas em proporções que variam de 1:4 a 1:12. Para aumentar a sobrevida celular, adicione 10 μM inibidor de proteínas associadas a Rho (ROCK) (Y27632) após cada divisão.
  2. Dissociar os iPSCs (80% de confluência)-Dia 0.
    1. Prepare o Meio de Diferenciação Cortical I (CDMI) (Tabela 1). Meio de IMC pré-guerra à temperatura ambiente (22-25 °C) antes de adicioná-lo às células.
    2. Lave os poços que contêm os iPSCs com soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS) para remover células mortas e detritos.
    3. Adicione 500 μL de Reagente Pré-caçado A (Tabela de Materiais) a cada poço e incubar por 5 min a 37 °C. Verifique sob o microscópio para garantir o desprendimento celular.
    4. Adicione 1 mL de meio iPSC para diluir o reagente A para neutralizar sua atividade.
    5. Use uma pipeta de 1000 μL para dissociar as células, pipetando para cima e para baixo e transfira a suspensão celular para um tubo de centrífuga de 15 mL.
    6. Centrifufique suavemente os iPSCs a 125 x g por 5 min a temperatura ambiente (22-25 °C).
    7. Aspire cuidadosamente o supernatante para evitar perturbar a pelota celular.
    8. Resuspende a pelota com 1 mL de CDMI para obter uma suspensão unicelular e conte o número do celular.
    9. Prepare o meio de semeadura com 9.000 iPSCs por 100 μL em CDMI suplementado com 20 μM inibidor de ROCHA, inibidor de 3 μM WNT-catenin (IWR1) e 5 μM SB431542.
    10. Adicione 100 μL de meio de semeadura por poço a uma placa de fundo v de 96 poços.
    11. Mantenha a placa em uma incubadora de cultura de tecido umidificado a 37 °C e 5% de CO2.
  3. Geração da neurosfera
    1. No primeiro dia, observe que agregados de células redondas (neuroferas) com bordas lisas definidas estão se formando. Note as células mortas ao redor dos agregados. Continue a cultura na incubadora a 37 °C e 5% de CO2.
    2. No dia 3, agitar a placa tocando nas laterais três vezes para desacopar células mortas.
    3. Adicione 100 μL de CDMI suplementado com inibidor de ROCK de 20 μM, 3 μM IWR1 e 5 μM SB431542 para cada poço.
    4. Devolva a placa à incubadora a 37 °C e 5% de CO2.
    5. No dia 6, remova cuidadosamente 80 μL do meio sobrenante de cada poço. Evite tocar na parte inferior do poço.
    6. Adicione 100 μL de CDMI suplementado com 3 μM IWR1 e 5 μM SB431542 a cada poço. Devolva a placa à incubadora a 37 °C e 5% de CO2.
    7. Repita os passos 5 e 6 a cada 3 dias até o dia 18.
  4. Transferência de neurosferas
    1. No dia 18, prepare o Cortical Diferenciação Médio II (CDMII) (Tabela 1) e adicione 10 mL a uma placa de cultura celular de apego ultra-baixa de 100 mm.
    2. Use uma pipeta de 200 μL com a ponta cortada para transferir as neurosferas redondas da placa de 96 poços para a placa de cultura celular de 100 mm ultra-baixa.
      NOTA: Seja gentil para evitar danificar as neurosferas, certificando-se de que a abertura da ponta é ampla o suficiente e que os agregados não são aspirados muito rapidamente.
    3. Remova 5 mL de meio da placa contendo as neurosferas e adicione 5 mL de CDMII fresco.
      NOTA: Este procedimento ajuda a reduzir a quantidade de meio CDMI que pode ter sido transportada a partir da transferência de neuroesferas.
    4. Coloque a placa em um agitador orbital a 70 rpm dentro de uma incubadora de cultura de tecido umidificado a 37 °C e 5% de CO2.
      NOTA: Inspecione visualmente as neurosferas no dia seguinte. Aumente a velocidade do agitador orbital se as neurosferas forem agrupadas ou anexadas à parte inferior da placa.
    5. A cada 3 dias, aspire cuidadosamente o meio supernante e substitua-o por CDMII fresco. Deixe uma pequena quantidade do meio para evitar que as neurosferas sequem.
    6. No dia 35, prepare o Meio de Diferenciação Cortical III (CDMIII) (Tabela 1).
      NOTA: O componente da matriz deve ser dissolvido em CDMIII frio.
    7. Aspire o meio da placa e adicione 10 mL de CDMIII frio.
      NOTA: É mais eficaz usar meio frio para que o componente matricial possa revestir os organoides sem formar aglomerados.
    8. Depois de mudar o meio, coloque a placa de volta em um agitador orbital a 70 rpm dentro de uma incubadora de cultura de tecido umidificado a 37 °C e 5% de CO2.
    9. Alterar o meio a cada 3-5 dias dependendo da taxa de crescimento, conforme indicado pela cor do meio.
    10. No dia 70, prepare o Meio de Diferenciação Cortical IV (CDMIV) (Tabela 1). Use o meio CDMIV até que a idade desejada dos organoides seja atingida. Durante este período, mantenha a placa em um agitador orbital a 70 rpm dentro de uma incubadora de cultura de tecido umidificado (37 °C e 5% de CO2).
    11. Mude o meio a cada 3-5 dias, dependendo da taxa de crescimento.

2. Imunostaining de organoides cerebrais

  1. Preparação tecidual
    1. Prepare 4% de solução paraformaldeída (PFA) e coloque-a sob um capô de segurança.
      NOTA: Use equipamentos de segurança pessoal ao manusear PFA.
    2. Colete organoides cerebrais e transfira-os suavemente com uma pipeta pasteur de plástico pasteur de 3 mL para uma placa de 6 poços cheia de PFA.
      NOTA: Use organoides com mais de 40 dias para permitir a visualização de estruturas com maior complexidade celular.
    3. Mantenha os organoides na solução PFA por 1h à temperatura ambiente.
    4. Remova cuidadosamente o PFA com uma pipeta Pasteur de plástico de 3 mL e lave os organoides fixos três vezes usando PBS.
    5. Armazene os organoides fixos a 4 °C em PBS até que use mais.
  2. Preparação de fatias organoides cerebrais
    1. Prepare uma solução de ágar de 3% e aqueça lentamente até liquefeito.
    2. Coloque o molde (a extremidade cortada de uma seringa de 10 mL) em um pedaço de papel filtro absorvente (lado liso para cima). Coloque uma gota de ágar sobre ele.
    3. Retire rapidamente um único organoide da placa de 6 poços com uma espátula e remova o PBS excessivo com papel filtro.
      NOTA: Tenha cuidado para não tocar diretamente no organoide com papel filtro.
    4. Coloque o organoide na gota de ágar.
    5. Repita este procedimento com até três organoides.
      NOTA: Trabalhe rápido para evitar a solidificação do ágar durante esta etapa.
    6. Reabastecer o molde com ágar até que todos os organoides estejam totalmente cobertos.
    7. Aguarde até que o ágar comece a solidificar e, em seguida, transfira suavemente todo o molde contendo os organoides, incluindo o papel do filtro absorvente, em um elemento de resfriamento.
      NOTA: Se um elemento de resfriamento não estiver disponível, armazene os organoides por alguns minutos em uma geladeira a 4 °C.
    8. Enquanto isso, prepare-se para o procedimento de corte: coloque uma lâmina de barbear (limpa com acetona e lavada com água dupla destilada) no suporte do vibratome, monte no banho e encha-a com PBS.
    9. Remova o molde do ágar (solidificado) e use um bisturi para aparar para formar um cubo.
    10. Conecte o cubo de ágar contendo os organoides na placa portadora do vibratome com gel adesivo (veja a Tabela de Materiais), e coloque-o no banho contendo PBS.
    11. Ajuste o vibratome (ver a Tabela de Materiais) para cortar fatias a uma espessura de 150 μm.
      NOTA: As configurações de vibratome (ângulo adequado, amplitude, frequência e velocidade da lâmina) podem ser semelhantes às usadas para cortar tecido cerebral fixo derivado de animais pós-natais precoces. No entanto, as configurações ideais dependem fortemente do tipo do vibratome e devem ser determinadas em um primeiro passo para evitar distorções ou até mesmo rasgar o tecido durante o corte.
    12. Inicie o procedimento de corte. Use uma pipeta de vidro ou uma espátula para transferir suavemente cada fatia recém-cortada em uma placa de 24 poços cheia de PBS.
    13. Armazene a placa contendo fatias a 4 °C (por até alguns dias) até que seja mais processamento.
    14. Transfira as fatias para fora da placa com uma pipeta de vidro ou uma espátula em slides de microscópio. Use um mínimo de 2 fatias por slide.
    15. Remova cuidadosamente o ágar e o excesso de PBS com uma seringa.
    16. Deixe as fatias secarem até que aderam aos slides.
      NOTA: Enquanto os slides do microscópio podem ser armazenados em câmaras plásticas cheias de PBS a 4 °C, elas devem ser manchadas o mais rápido possível após o procedimento de corte.
  3. Coloração imunohistoquímica
    1. Prepare a solução de bloqueio (Tabela 1).
    2. Use uma caneta PAP para desenhar uma borda hidrofóbica ao redor das fatias no slide para ajudar a manter todas as soluções nos slides.
    3. Adicione cuidadosamente a solução de bloqueio no slide e incubar por 1h à temperatura ambiente (22-25 °C). Para evitar destruir o tecido, não adicione a solução diretamente em cima das fatias.
    4. Aspire a solução de bloqueio e aplique o anticorpo primário desejado diluído na solução de bloqueio.
    5. Incubar o slide durante a noite em uma câmara umidificada a 4 °C.
    6. Enxágüe o slide três vezes com 1x PBS por 10 minutos cada.
    7. Incubar as fatias com o anticorpo secundário específico diluído na solução de bloqueio e realizar a coloração hoechst (1:2.500) por 1 h à temperatura ambiente no escuro.
      NOTA: Lembre-se de realizar controles negativos para confirmar que não há vinculação não específica ou auto-fluorescência.
    8. Enxágüe três vezes com 1x PBS por 10 min cada no escuro.
    9. Adicione uma gota de meio de montagem à fatia, coloque uma mancha de cobertura na borda da gota e coloque lentamente a tampa em direção à fatia para evitar bolhas de ar.
    10. Deixe o slide descansar durante a noite em temperatura ambiente. Aplique esmalte na borda do deslizamento para selar ainda mais o slide. Para armazenamento a longo prazo, armazene a 4 °C.
  4. Documentação de coloração
    1. Para digitalizar imagens grandes para costura, utilize um microscópio motorizado de campo largo ereto equipado com (ver a Tabela de Materiais para obter detalhes) um objetivo de alta qualidade; Conjunto de filtro DAPI (por exemplo, excitação (EX): 340-380 nm, espelho dicroico (DM): 400 nm, filtro de barreira (BA): 435-485 nm); conjunto de filtro isothiocyanato fluoresceína (por exemplo, EX: 465-495 nm, DM: 505 nm, BA: 515-555 nm); Conjunto de filtros Alexa594 (por exemplo, ET 575/40; T 600 LPXR; HC 623/24); câmera digital; software de aquisição de alto desempenho que permite costuras automatizadas e operações de pilha.
    2. Para o manuseio de imagens, use um programa de processamento de imagem capaz de gerar arquivos de tif de 8 bits, pontos de corte, ajustar contraste e brilho, mesclar os canais (por exemplo, azul, verde e vermelho) e adicionar barras de escala.
    3. Para digitalizar detalhes, use um microscópio de varredura a laser confocal motorizado equipado com um objetivo de alta qualidade, um laser UV (EX: 408 nm), um laser argon (EX: 488 nm), um laser Hélio-Neon (EX: 543), software de imagem para um microscópio confocal.
    4. Para o manuseio de imagens de detalhes, use um programa de processamento de imagens capaz de gerar projeções de intensidade máxima de pilhas z confocal (por exemplo, seções ópticas de 0,6 μm cada), gerando arquivos de tif de 8 bits, ajustando contraste e brilho, mesclando os canais (por exemplo, azul, verde e vermelho), adicionando barras de escala.
    5. Use um editor gráfico para organizar as figuras.

3. Perfil bioenergético de organoides cerebrais

  1. Preparação de organoides para perfil bioenergetic
    1. Prepare a solução papain e DNase seguindo o protocolo do fabricante.
    2. Transfira 3-5 organoides em uma placa de 6 poços. Lave-os duas vezes com PBS pré-armado.
    3. Adicione 2 mL de solução de papain ativado pré-armado contendo DNase. Usando uma lâmina, corte os organoides em pequenos pedaços.
    4. Coloque a placa em um agitador orbital a 27 rpm dentro de uma incubadora de cultura celular (a 37 °C, 5% de CO2) e incubar por 15-20 min.
      NOTA: O tempo de incubação depende do estágio organoide. Organoides em estágio inicial podem ser usados como são. Para organoides com mais de 3 meses, recomenda-se cortar os organoides em 2-3 peças antes da dissociação e incubar as peças a uma velocidade de balanço a 27 rpm por 15-20 min a 37 °C. Este procedimento pode ajudar a remover tecido necrosado que pode estar presente nos organoides em estágio posterior.
    5. Colete os tecidos digeridos em um tubo de 15 mL e adicione 5 mL de cultura organoide meio CDMIV (Tabela 1).
    6. Triturar o tecido com uma pipeta de plástico de 10 mL por pipetar para cima e para baixo 10-15 vezes. Deixe o tecido não dissociado se acalmar até o fundo do tubo.
    7. Transfira cuidadosamente a suspensão celular para um tubo de 15 mL, evitando quaisquer pedaços de tecido não dissociado. Filtre a solução através de um coador de células de 40 μm (por exemplo, tubos de fundo redondo de poliestireno com tampas de coador de células).
    8. Pelota as células por centrifugação a 300 x g por 5 min a temperatura ambiente.
    9. Avalie o número do celular e a qualidade usando o azul trypan.
    10. Emplaque o número desejado (~20.000/bem) das células em microplacos revestidos de 96 poços. Altere o médio 6-8 h após o revestimento para o meio neuronal (Tabela 1).
    11. Incubar a microplaca revestida de 96 poços em uma incubadora de CO2 (37 °C, 5% de CO2) durante 4 dias.
  2. Perfil bioenergésico
    1. No dia 3, após a replação das células dissociadas, adicione 200 μL de solução de calibração em cada poço da parte inferior da micropla placa de 96 poços, e coloque o cartucho de sensor verde superior sobre a microplacão hidratada.
      NOTA: Coloque o cartucho do sensor em cima da microplacão na orientação correta e certifique-se de que a solução calibrante cubra todos os sensores.
    2. Incubar a microplaca hidratada de 96 poços em uma incubadora não-CO2 a 37 °C durante a noite.
    3. Ligue o analisador para permitir que o instrumento se estabilize a 37 °C durante a noite.
    4. No dia 4, após a replação, inspecione a cultura organoide desassociada na microplacão de 96 poços sob o microscópio para garantir que as células apareçam como uma monocamada confluente.
    5. Prepare o médium de ensaio (Tabela 1).
    6. Remova o meio neuronal de todos os poços com uma pipeta sem tocar na parte inferior do poço para evitar danos celulares. Alternativamente, inverta cuidadosamente toda a placa e depois seque-a em papel limpo. Trabalhe rápido para evitar a morte celular.
    7. Lave as células duas vezes com 200 μL pré-armados de Assay Medium. Adicione o Assay Medium a um volume final de 180 μL por poço. Incubar a microplaca de 96 poços em uma incubadora não-CO2 a 37 °C por 1 h.
    8. Prepare 10 soluções μM de inibidores mitocondriais no meio Assay. Note que a concentração final após a injeção é de 1 μM.
    9. Carregue o cartucho do sensor colocado na microplacão hidratada com soluções 10x dos inibidores mitocondriais.
      1. Adicione 18 μL de inibidor mitocondrial 1 na porta A.
      2. Adicione 19,8 μL de inibidor mitocondrial 2 na porta B.
      3. Adicione 21,6 μL de inibidor mitocondrial 2 na porta C.
      4. Adicione 23,4 μL de inibidor mitocondrial 3 na porta D.
    10. Coloque o cartucho carregado na microplaca hidratada em uma incubadora não-CO2 a 37 °C até o início do ensaio.
    11. Configure um protocolo de execução no software do instrumento (Tabela 2).
    12. Pressione start. Pegue o cartucho carregado da incubadora não-CO2 e coloque-o no analisador para calibração.
      NOTA: Certifique-se de que a placa está inserida na orientação correta e sem a tampa.
    13. Quando a etapa de calibração terminar, remova a placa de calibração. Pegue a microplaca de 96 poços da incubadora não-CO2 e coloque-a no analisador. Clique em CONTINUAR para iniciar as medições.
    14. Quando a corrida estiver concluída, remova a microplacão de cultura celular de 96 poços do analisador e colete o meio de todos os poços sem perturbar as células.
      NOTA: O meio pode ser armazenado a -20 °C e usado posteriormente para medir a quantidade de lactato liberado pelas células no meio usando um kit de ensaio de lactato apropriado.
    15. Lave as células com 200 μL de 1x PBS em cada poço.
    16. Depois de remover o PBS, congele a placa a -20 °C.
      NOTA: A placa congelada pode ser usada para quantificar células, proteínas ou DNA em cada poço da microplacão. Essa quantificação será necessária para normalizar as taxas bioenergéticas obtidas. Siga as instruções do fabricante para ensaios de quantificação celular, proteína ou DNA.

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Resultados

O protocolo aqui descrito facilita a geração robusta de organoides redondos (Figura 1A). Os organoides gerados contêm neurônios maduros que podem ser visualizados usando marcadores proteicos específicos para axônios (SMI312) e dendritos (proteína associada a microtúbulos 2 (MAP2)) (Figura 1B). Os organoides maduros contêm não apenas células neuronais (MAP2 positivos), mas também células gliais (por exemplo, posi...

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Discussão

Este artigo descreve a geração reprodutível de organoides cerebrais derivados do iPSC humanos e seu uso para modelagem de doenças mitocondriais. O protocolo descrito aqui é modificado com base em um trabalho publicado anteriormente20. Uma grande vantagem do presente protocolo é que ele não requer a incorporação manual de cada organoide em uma matriz de andaimes. Na verdade, a solução matricial é simplesmente dissolvida no meio da cultura celular. Além disso, não há necessidade de empregar bioreato...

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Divulgações

Os autores não declaram interesses financeiros ou não financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Agradecemos a Miriam Bünning pelo apoio técnico. Reconhecemos o apoio da Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (PR1527/5-1 a A.P.), Spark e Berlin Institute of Health (BIH) (BIH Validation Funds to A.P.), the United Mitochondrial Disease Foundation (UMDF) (Leigh Syndrome International Consortium Grant to A.P.), University Hospital Duesseldorf (Forschungskommission UKD to A.P.), e o Ministério Federal alemão de Educação e Pesquisa (BMBF) (e: Bio jovem investigador conceder AZ 031L0211 a A.P.). O trabalho no laboratório da C.R.R. foi apoiado pelo DFG (FOR 2795 "Sinapses sob estresse", Ro 2327/13-1).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
2-mercaptoetanolGibco31350-010
Affinity DesignerSerif (Europe) LtdSoftware de layout; Editor de gráficos vetoriais
Alexa Fluor 488 burro anti-cobaiaSigma AldrichSAB4600033-250UL1:300
Alexa Fluor 488 burro anti-ratoThermo Fisher ScientificA-315711:300
Antimicina ASigma Aldrich1397-94-0
Anti-β-Tubulina III (TUJ-1)Sigma AldrichT85781:2000
Argônio LaserMelles GriotQualquer outro Laser, por exemplo, lasers de diodo emitindo 488 também
Ácido ascórbicoSigmaA92902
B-27 com Vitamina AGibco17504044
Ágar BactoBecton Dickinson3% em PBS, armazene a solução a -20 ° C
BDNFMiltenyi Biotec130-093-0811
cAMPSigmaD0627
Cell Star cultura de células placa de 6 poçosGreiner-Bio-One657160
Concentrado lipídico quimicamente definidoGibco11905031
microscópio confocal de varredura a laser C1Nikon Microscope SolutionsMicroscópio confocal modular sistema
Corning Matrigel Fator de Crescimento Reduzido (TFG) Matriz de membrana basal, sem fenol Sem vermelho, sem LDEVComponente Corning356231Matrix
Kit de ensaio de proliferação celular CyQUANTThermo FisherC7026
DMEM/F12ThermoFisher31330038
DMSOSigmaD2660-100ML
Burro anti-cabra Cy3Merck MilliporeAP180C1:300
Donkey anti-mouse Cy3Merck MilliporeAP192C1:300
Donkey anti-rabbit Cy3Merck MilliporeAP182C1:300
DPBSGibco14190250
DS-Q1Mc câmeraNikon Microscope Solutions
Eclipse 90i microscópio vertical de campo amploNikon Microscope Solutions
Microscópio vertical Eclipse E 600FNNikon Microscope Solutions
Microscópio invertido Eclipse Ts2Microsope Solutions
EZ-C1 Silver Version 3.91Nikon Microscope SolutionsSoftware de imagem para microscópio confocal
FCCPSigma Aldrich370-86-5
Soro Fetal BovinoGibco10270-106
GDNFMiltenyi Biotec130-096-291
Glasgow MEMGibco11710-035
Pipeta de vidro PasteurMarca747715Inverted
GlutamaxGibco35050-061
Helium-Neon LaserMelles GriotTodos os outros lasers, por exemplo, lasers de diodo emitindo 594 estão bem, também
HeparinaMerckH3149-25KU
HERACell 240i CO2 IncubadoraThermo Scientific51026331
Hoechst 33342InvitrogenH35701:2500
Imagem J 1.53cWayne Rasband Instituto Nacional de SaúdeSoftware de processamento de imagem
Injekt Solo 10 mL/ LuerBraun4606108V
Knockout Serum ReplacementGibco10828010
Laser (407 nm)CoerenteQualquer outro Laser, por exemplo, lasers de diodo emitindo 407 também está bem
Map2Synaptic SystemsNo. 1880041:1000
Maxisafe 2030i
MEM NEAAGibco11140-050
mTeSR PlusCentrífugaMultifuge X3R média iPSC85850
Detecção de Mycoplasma MycoAlert# LT07-218
Suplemento N2Gibco17502-048
TW)Neoject10016
NIS-Elements Aadvanced Research 3.2NikonSoftware de imagem
Oligomicina ASigma Aldrich75351
Orbital Shaker Heidolph Unimax 1010Heidolph543-12310-00
PAP PenSigmaZ377821-1EAPara desenhar barreira hidrofóbica em slides.
Kit de Sistema de Dissociação de PapaínaWorthingtonLK003150
ParaformaldeídoMerck8187154% em PBS, solução de loja a -20 ° C
Pipeta Pasteur 7mLVWR612-1681Graduada até 3 mL
Penicilina-EstreptomicinaGibco15140-122
Plan Apo VC 20x / 0.75 ar DIC N2  ∞/0.17 WD 1.0Nikon Microscope SolutionsDry Microscope
Objective Plan Apo VC 60x / 1.40 óleo DIC N2 ∞/0.17 WD 0.13Nikon Microscope SolutionsPlaca de
(100 mm)Greiner Bio-One664161
com tampa de filtro de células (5 mL)Falcon352235
Cloreto de potássioRoth6781.1
ProLong Glass Antifade MoutantInvitrogenP36980
Papel de filtro qualitativoVWR516-0813
Inibidor de RochasMerckSCM075
RotenoneSigma83-794
S100βAbcamAb111781:600
SB-431542Cayman Chemical Company13031
Lâminas de bisturiHeinz Herenz Hamburq1110918
SMI312Biolegend8379041:500
Bicarbonato de sódioMerck/Sigma31437-1kg-M
Cloreto de sódioRoth3957
Sódio dihidrogenofosfatoApplichem131965
Pyruvate de SódioGibco11360070
SOX2Santa Cruz BiotechnologySc-173201:100
Reagente de Dissociação de Células Accutase StemProGibco/StemProA1110501Reagent A
Super Glue GelUHU63261Gel adesivo
SuperFrost PlusVWR631-0108
Seringa para uso único (1 mL)BD Plastipak300015
TB2 ThermoblockBiometra
TC Placa 24 PoçosSarstedt83.3922
TC Placa 6 PoçosSarstedt83.392
TGFbeta3Miltenyi Biotec130-094-007
Capuz de Cultura de TecidosThermoFisher51032711
TOM20Santa Cruz BiotechnologySC-114151:200
Triton-XMerckX100-5ML
UltraPure 0.5M EDTAInvitrogen15575020
Vibratome Microm HM 650 VThermo ScientificProdução terminada, qualquer outro micrótomo ajustável também está bem.
Lâmina de Barbear Clássica Vibratome WilkinsonEspada Wilkinson70517470
Whatman BenchkoteMerck/Sigma28418852
Wnt Antagonista IEMD Millipore Corp3378738
XF 96 analisador de fluxo extracelularSeahorse Bioscience100737-101
XF Ensaio DMEM MédioSeahorse Bioscience103680-100
Solução Calibrante XFSeahorse Bioscience100840-000
XFe96 FluxPak (microplaca de 96 poços)Seahorse Bioscience102416-100
Nikon da Stemcell Technology Kit de 10325804 da Thermo Scientific Lonza para uso único (23G x 1" Petri de poliestireno de objetiva de microscópio de imersão em óleo Tubo de fundo redondo de poliestireno

Referências

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