Artigo de método

Imagem intravital longitudinal através de janelas de silicone claras

DOI:

10.3791/62757

⸱

5 de janeiro de 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Cold Spring Harbor Laboratory, 2Cold Spring Harbor Laboratory School of Biological Sciences, 3Koch Institute for Integrative Cancer Research, Massachusetts Institute of Technology, 4Medical Scientist Training Program, School of Medicine, Stony Brook University, 5Graduate Program in Pharmacology, Stony Brook University, 6Graduate Program in Genetics, Stony Brook University, 7Graduate Program in Biomedical Engineering, Stony Brook University, 8Department of Biomedical Engineering, Stony Brook University, 9Department of Pathology, University of Michigan

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uma abordagem é aqui apresentada para imagens intravitais de longo prazo usando janelas de silicone opticamente claras que podem ser coladas diretamente ao tecido/órgão de interesse e à pele. Essas janelas são mais baratas e mais versáteis do que outras atualmente utilizadas no campo, e a inserção cirúrgica causa inflamação e angústia limitadas aos animais.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A microscopia intravital (IVM) permite a visualização do movimento celular, divisão e morte na resolução unicelular. O IVM através de janelas de imagem cirurgicamente inseridas é particularmente poderoso porque permite a observação longitudinal do mesmo tecido durante dias a semanas. Janelas de imagem típicas compreendem uma mancha de vidro em uma estrutura metálica biocompatível suturada na pele do rato. Essas janelas podem interferir com a livre circulação dos camundongos, provocar uma forte resposta inflamatória e falhar devido a vidros quebrados ou suturas rasgadas, qualquer uma das quais pode exigir eutanásia. Para resolver essas questões, janelas para imagem de órgão abdominal de longo prazo e gland mamária foram desenvolvidas a partir de uma película fina de polidimtilsiloxano (PDMS), um polímero de silicone opticamente claro anteriormente usado para janelas de imagem craniana. Essas janelas podem ser coladas diretamente nos tecidos, reduzindo o tempo necessário para a inserção. O PDMS é flexível, contribuindo para sua durabilidade em camundongos ao longo do tempo — até 35 dias foram testados. A imagem longitudinal é a imagem da mesma região tecidual durante sessões separadas. Uma rede de aço inoxidável foi incorporada dentro das janelas para localização da mesma região, permitindo a visualização de processos dinâmicos (como a involução da glândula mamária) nos mesmos locais, com dias de diferença. Esta janela de silicone também permitiu o monitoramento de células cancerígenas únicas disseminadas que se desenvolvem em micro-metástases ao longo do tempo. As janelas de silicone utilizadas neste estudo são mais simples de inserir do que janelas de vidro emolduradas em metal e causam inflamação limitada dos tecidos imaged. Além disso, as grades incorporadas permitem o rastreamento direto da mesma região tecidual em sessões de imagem repetidas.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A microscopia intravital (IVM), a imagem de tecidos em animais anestesiados, oferece insights sobre a dinâmica dos eventos fisiológicos e patológicos na resolução celular em tecidos intactos. As aplicações dessa técnica variam bastante, mas o IVM tem sido fundamental no campo da biologia do câncer para ajudar a elucidar como as células cancerígenas invadem tecidos e metástases, interagem com o microambiente circundante e respondem a medicamentos 1,2,3. Além disso, o IVM tem sido fundamental para avançar na compreensão dos mecanismos complexos que regem as respostas imunológicas, fornecendo insights complementares às abordagens de perfil ex vivo (por exemplo, citometria de fluxo). Por exemplo, experimentos de imagem intravital revelaram detalhes sobre funções imunológicas no que se referem à migração celular e contato celular e ofereceram uma plataforma para quantificar a dinâmica espacial em resposta a lesões ou infecções 4,5,6,7. Muitos desses processos também podem ser estudados através de coloração histológica, mas apenas o IVM permite o rastreamento de mudanças dinâmicas. De fato, enquanto uma seção histológica oferece um instantâneo do tecido em um dado momento, a imagem intravital pode rastrear eventos intercelulares e subcelulares dentro do mesmo tecido ao longo do tempo. Em particular, o progresso na rotulagem de fluorescência e o desenvolvimento de repórteres moleculares permitiram que eventos moleculares se correlacionam com comportamentos celulares, como proliferação, morte, motilidade e interação com outras células ou a matriz extracelular. A maioria das técnicas de IVM são baseadas na microscopia de fluorescência, que devido à dispersão de luz, torna a imagem mais profunda desafiadora. O tecido de interesse, portanto, muitas vezes precisa ser exposto cirurgicamente com um procedimento muitas vezes invasivo e terminal. Assim, dependendo do local do órgão, o tecido pode ser imagedo continuamente por um período variando de poucos a 40 h8. Alternativamente, a inserção cirúrgica de uma janela permanente de imagem permite a imagem do mesmo tecido sequencialmente durante um período de dias até semanas 7,9.

O desenvolvimento de novas janelas de imagem tem sido destacado como uma necessidade tecnológica para melhorar ainda mais as abordagens de imagem intravital10. A janela de imagem intravital prototípica é um anel de metal contendo uma mancha de vidro presa à pele com suturas11. Interferências com a livre circulação, o acúmulo de exsudato e danos à tampa de vidro são problemas comuns vistos com o uso dessas janelas. Além disso, a janela prototípica requer produção especializada, e o procedimento cirúrgico pode exigir treinamento extensivo. Para resolver essas questões, o polidimtilsiloxano (PDMS), um polímero de silicone, que já foi usado em janelas cranianas para imagens de longo prazo no cérebro12, foi adaptado para uso em imagens de órgãos abdominais e glândulas mamárias. Aqui, é apresentado um método detalhado para a geração de janelas de silicone baseadas em PDMS, incluindo como lançar a janela em torno de uma grade de aço inoxidável para fornecer marcos para imagens repetidas das mesmas regiões teciduais. Além disso, é descrito um procedimento cirúrgico simples e sem pontos para inserir a janela sobre órgãos abdominais ou a glândula mamária. Esta nova abordagem supera alguns dos problemas mais comuns com janelas de imagem usadas atualmente e aumenta a acessibilidade de imagens intravitais longitudinais.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todos os procedimentos descritos foram realizados de acordo com as Diretrizes Cirúrgicas do Laboratório de Cold Spring Harbor e foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais no Laboratório de Cold Spring Harbor.

1. Fundição da janela de silicone

  1. Prepare o polímero de silicone (PDMS) misturando o elastômero base e o agente de cura em uma proporção de 10:1 (v/v).
  2. Lance uma janela depositando uma pequena quantidade de PDMS em uma superfície estéril e lisa e ajuste a relação volume-área para a espessura desejada.
    NOTA: O uso de 200 mg de solução de polímero para um círculo de 22 mm de diâmetro na tampa de uma tampa de 24 poços resulta em um bom comprometimento entre robustez da janela e clareza óptica.
  3. Opcional: Para fornecer marcos para imagens repetidas das mesmas regiões teciduais, pressione levemente uma grade de aço inoxidável no silicone depois que o PDMS estiver na superfície de fundição desejada.
  4. Para remover bolhas de ar, coloque a superfície revestida em um desiccador de vácuo por 45 minutos para desgas o polímero.
  5. Cure as janelas de silicone em um forno a 80 °C por 45 min.
  6. Marque o polímero nas bordas do molde e retire delicadamente as janelas curadas da superfície usada para fundir com fórceps.
  7. Antes da cirurgia, esterilize as janelas autoclaving.

2. Preparando o mouse para a inserção da janela de silicone

  1. Anestesiar o mouse em uma câmara de indução usando isoflurane de 4% (v/v). Mova o rato para uma almofada de aquecimento sobre a mesa cirúrgica, coloque o rato na máscara de nariz da anestesia e reduza a concentração de isoflurane para 2% para manutenção durante toda a cirurgia.
  2. Verifique a profundidade da anestesia beliscando os dedos dos membros traseiros. Não prossiga até que o mouse esteja inativo e não mostre a resposta reflexo do dedo do dedo do dedo.
  3. Aplique lubrificante oftálmico nos olhos para evitar que sequem e evitem traumas.
  4. Administrar analgesia preventiva (buprenorfina 0,05 mg/kg) subcutânea.
  5. Raspe o local cirúrgico e remova completamente o cabelo com um creme de depilação.
  6. Aplique solução povidone-iodo (10% v/v) e etanol (70% v/v) consecutivamente 3x para prevenir a infecção no local cirúrgico.

3. Inserir uma janela ventral para imagem no fígado; adaptável para outros órgãos abdominais (Figura 1)

  1. Coloque o mouse na posição supina.
  2. Faça uma incisão de 10 mm a partir do processo xifoide usando tesouras e fórceps estéreis.
  3. Remova uma seção de 1-1,5 cm2 da pele ao longo da linha média.
  4. Use um segundo par de tesouras estéreis e fórceps para remover uma seção do peritônio ligeiramente menor que a seção da pele.
  5. Opcional: Para visualizar uma porção maior do fígado, use cotonetes de algodão estéreis umedeados com soro fisiológico estéril para empurrar o fígado para baixo do diafragma revelando o ligamento falciforme ligando o fígado ao diafragma. Corte o ligamento tomando cuidado para não cortar a veia cava inferior.
  6. Retire o adesivo cirúrgico com uma seringa de 31 G, aplique uma pequena quantidade dele na superfície do fígado ao redor das bordas da área a ser imageda. Este adesivo cria uma vedação circular, deixando a área central intacta para imagens.
    ATENÇÃO: Limite o adesivo a pequenas gotículas formando um padrão circular ao redor da área de imagem. O tecido imediatamente em contato com o adesivo não pode ser imageado. Não é necessário secar o tecido antes de aplicar o adesivo.
    NOTA: Qualquer adesivo à base de cianoacrila pode ser usado com sucesso para este procedimento. O adesivo cirúrgico garante a esterilidade. Para procedimentos terminais, super colas de todos os fins produzem bons resultados.
  7. Posicione a janela usando fórceps e segure-a firmemente contra o fígado até que o adesivo seque (~2 min).
  8. Dobre as bordas da janela sob o peritônio.
  9. Com uma seringa, deposite uma pequena quantidade de adesivo cirúrgico nas bordas da janela que agora estão sob o peritônio. Empurre para baixo no peritônio com fórceps para fixá-lo na janela.
  10. Da mesma forma, deposite uma pequena quantidade de adesivo cirúrgico no peritônio antes de empurrar para baixo na pele com fórceps para fixá-lo ao peritônio.
    NOTA: Se realizada corretamente, uma área circular de tecido hepático deve agora ser visível através da janela.
  11. Aplique cola nas bordas da janela para criar uma borda que ajude a evitar que a pele cresça de volta sobre a janela.
    ATENÇÃO: Se o procedimento for realizado utilizando técnicas cirúrgicas estéreis e a janela é esterilizada antes da inserção, a vedação da ferida com adesivo cirúrgico é suficiente para evitar infecções. No entanto, a não observância de técnicas assépticas adequadas durante a inserção cirúrgica ou fechamento imperfeito pode levar a infecção aberta ou subclínica e secagem do tecido.

4. Inserir uma janela lateral para imagem no fígado; compatível com a injeção simultânea de células cancerígenas na veia portal (Figura 2)

  1. Coloque o mouse na posição de decúbito lateral esquerdo
  2. Faça uma incisão de 10 mm no flanco direito 3 mm abaixo do arco costal usando tesouras estéreis e fórceps.
  3. Remova uma seção de 1 cm2 da pele.
  4. Use um segundo par de tesouras estéreis e fórceps para remover uma seção do peritônio ligeiramente menor que a seção da pele.
  5. Retire o adesivo cirúrgico com uma seringa de 31 G, aplique uma pequena quantidade dele na superfície do fígado ao redor das bordas da área a ser imageda.
    ATENÇÃO: Limite o adesivo a pequenas gotículas formando um padrão circular ao redor da área de imagem. O tecido imediatamente em contato com o adesivo não pode ser imageado.
    NOTA: Qualquer adesivo à base de cianoacrila pode ser usado com sucesso para este procedimento. O adesivo cirúrgico garante a esterilidade. Para procedimentos terminais, super colas de todos os fins produzem bons resultados.
  6. Posicione a janela usando fórceps e segure-a firmemente contra o fígado até que o adesivo seque (~2 min).
  7. Dobre as bordas da janela sob o peritônio.
  8. Com uma seringa, deposite uma pequena quantidade de adesivo cirúrgico nas bordas da janela que agora estão sob o peritônio. Empurre para baixo no peritônio com fórceps para fixá-lo na janela.
  9. Da mesma forma, deposite uma pequena quantidade de adesivo cirúrgico no peritônio antes de empurrar para baixo na pele com fórceps para fixá-lo ao peritônio.
    NOTA: Se realizada corretamente, uma área circular de tecido hepático deve agora ser visível através da janela.
  10. Aplique cola nas bordas da janela para criar uma borda que ajude a evitar que a pele cresça de volta sobre a janela.
  11. Se for necessária uma injeção venosa de portal:
    1. Coloque o mouse na posição supina.
    2. Faça uma incisão de 10 mm começando pelo processo xiphoide na pele.
    3. Usando um segundo par de tesouras estéreis e fórceps, faça uma incisão de 10 mm no peritônio.
    4. Mergulhe dois cotonetes de algodão em soro fisiológico estéril.
    5. Use os cotonetes de algodão para puxar suavemente o intestino para a gaze estéril umedecida com soro fisiológico estéril, tomando cuidado para não torcer ou perturbar a orientação.
    6. Continue deslocando o intestino da cavidade abdominal até que a veia portal seja visível no lado direito do abdômen.
    7. Insira uma agulha de 31-33 G de 5 a 7 mm caudal até o ponto de entrada da veia portal no fígado, certificando-se de prosseguir dentro do vaso sanguíneo e não através dele.
    8. Injete lentamente as células cancerígenas (resuspended em 100 μL de PBS estéril).
      NOTA: Para este experimento, a linha de células cancerígenas pancreáticas de amurina (por exemplo, KPC-BL/6-1199) pode ser cultivada em mídia DMEM completa e 1 x 105 células injetadas em 100 μL de PBS estéril.
    9. Para evitar sangramento, logo após a retirada da agulha, aplique pressão suave no local da injeção com um pequeno pedaço de esponja cirúrgica por 1-2 min.
    10. Depois que a pressão for liberada, monitore o local por 1-2 min para garantir hemostasia.
    11. Usando cotonetes umedecidos, devolva o intestino para a cavidade abdominal seguindo a orientação fisiológica do órgão.
    12. Usando fórceps estéreis, insira a janela imediatamente sob o peritônio, no lado esquerdo da cavidade abdominal do camundongo.
    13. Sutura com suturas de seda 4-0 e grampo a incisão midline com clipes de aço inoxidável de 7 mm.
    14. Mova o mouse para a posição de decúbito lateral esquerdo
    15. Faça uma incisão de 10 mm no flanco direito 3 mm sob o arco costal através da pele usando tesouras estéreis e fórceps.
    16. Remova uma seção de 1 cm2 da pele ao redor da incisão.
    17. Use um segundo par de tesouras estéreis e fórceps para remover uma seção do peritônio ligeiramente menor que a seção da pele.
    18. Puxe a janela para o lugar sobre o fígado antes de colá-lo no lugar, como descrito sob os passos 4.8-4.10.

5. Inserir a janela para imagem no pâncreas (Figura 3)

  1. Coloque o mouse na posição de decúbito lateral direito.
  2. Faça uma incisão de 10 mm no flanco esquerdo 3 mm abaixo do arco costal usando tesouras estéreis e fórceps.
  3. Remova uma seção de 1 cm2 da pele ao redor da incisão.
  4. Use um segundo par de tesouras estéreis e fórceps para remover uma seção do peritônio ligeiramente menor que a seção da pele.
  5. Usando cotonetes de algodão estéreis encharcados com soro fisiológico estéril, puxe suavemente o baço para visualizar o pâncreas. Prossiga para reposicionar o pâncreas com os cotonetes umedecidos de algodão para tornar mais área de superfície visível através da incisão.
    NOTA: Neste ponto, as células cancerígenas do pâncreas podem ser injetadas ortotopicamente no pâncreas se fizer parte do projeto experimental.
  6. Retire o adesivo cirúrgico com uma seringa de 31 G, aplique uma pequena quantidade dele na superfície do pâncreas ao redor das bordas da área a ser imageda.
    ATENÇÃO: Limite o adesivo a pequenas gotículas formando um padrão circular ao redor da área de imagem. O tecido imediatamente em contato com o adesivo não pode ser imageado.
  7. Posicione a janela usando fórceps e segure-a firmemente contra o pâncreas até que o adesivo seque (~2 min).
  8. Dobre as bordas da janela sob o peritônio.
  9. Com uma seringa, deposite uma pequena quantidade de adesivo cirúrgico nas bordas da janela que agora estão sob o peritônio. Empurre para baixo no peritônio com fórceps para fixá-lo na janela.
  10. Da mesma forma, deposite uma pequena quantidade de adesivo cirúrgico no peritônio antes de empurrar para baixo na pele com fórceps para fixá-lo ao peritônio.
    NOTA: Se realizada corretamente, uma área circular de tecido do pâncreas deve agora ser visível através da janela.
  11. Aplique cola nas bordas da janela para criar uma borda que ajude a evitar que a pele cresça de volta sobre a janela.

6. Inserir a janela para imagem na glândula mamária (Figura 4)

  1. Coloque o mouse na posição supina.
  2. Faça uma incisão medial de 10 mm para um dos mamilos inguinais usando tesouras e fórceps estéreis.
  3. Remova uma seção de 0,5 cm2 da pele acima da glândula mamária.
  4. Use um segundo par de tesouras estéreis para separar cuidadosamente a glândula mamária da pele, espalhando a tesoura entre as duas superfícies para interromper a adesão.
    NOTA: Para facilitar a imagem da área da glândula mamária inguinal, tenha cuidado para dissecar uma porção de pele acima da glândula mamária, mas superior à perna traseira, para que a janela não limite a mobilidade do mouse.
  5. Retire o adesivo cirúrgico com uma seringa de 31 G, aplique uma pequena quantidade dela na superfície da glândula mamária ao redor das bordas da área a ser imageda.
    ATENÇÃO: Limite o adesivo a pequenas gotículas formando um padrão circular ao redor da área de imagem. O tecido imediatamente em contato com o adesivo não pode ser imageado.
  6. Posicione a janela usando fórceps e segure-a firmemente contra a glândula mamária até que o adesivo seque (~2 min).
    NOTA: Uma área circular de tecido da glândula mamária deve agora ser visível através da janela se realizada corretamente.
  7. Dobre as bordas da janela sob a pele.
  8. Com uma seringa, deposite uma pequena quantidade de adesivo cirúrgico nas bordas da janela que agora estão sob a pele. Empurre para baixo na pele com fórceps para prender a pele à janela.
  9. Aplique cola nas bordas da janela para criar uma borda que ajude a evitar que a pele cresça de volta sobre a janela.

7. Recuperação pós-cirúrgica

  1. Coloque o mouse em uma gaiola de recuperação limpa com amplo material de aninhamento, garantindo que parte da gaiola esteja descansando sobre uma almofada de aquecimento.
  2. Monitore o mouse continuamente até que ele esteja consciente e móvel.
  3. Se necessário, forneça uma dose adicional de analgésico 12 h após a dose preventiva.
    NOTA: Analgesia adicional é geralmente desnecessária, mas consulte um veterinário se o rato mostra sinais de angústia (como costas curvadas, pele despenteada ou interesse perdido em alimentos). Monitore o camundongo diariamente durante os primeiros 3 dias após a cirurgia para sinais de infecção ou outros efeitos adversos. Menos de 2% dos camundongos necessitam de atenção veterinária ou eutanásia, normalmente devido ao descolamento parcial da janela. É importante notar que para camundongos machos com janelas de imagem hepática ventral, lutar entre camundongos pode resultar em desprendimento das janelas. Isso é evitado por abrigar os ratos separadamente.

8. Imagem através da janela

  1. Anestesiar o mouse em uma câmara de indução usando isoflurane de 4% (v/v).
  2. Aplique lubrificante oftálmico nos olhos para evitar que sequem e evitem traumas.
  3. Mova o rato da câmara de indução para o estágio do microscópio. Coloque o rato na máscara do nariz da anestesia e reduza a concentração de isoflurane para aproximadamente 1-1,5% para anestesia de manutenção durante todo o procedimento de imagem.
  4. Coloque um sensor de almofada de pressão abaixo do mouse para monitorar a taxa de respiração e fixar o mouse ao palco usando fita cirúrgica macia.
  5. Insira um termômetro retal para monitorar a temperatura corporal durante toda a sessão de imagem.
  6. Ligue a almofada aquecida, monitorando o mouse de perto para garantir que a temperatura corporal não exceda os 37 °C.
  7. Utilize o software para monitorar a taxa de respiração do mouse. A taxa ideal é ~1 respiração/segundo. Ajuste a anestesia conforme necessário.
  8. Antes de cada sessão de imagem, limpe a janela de qualquer meio de imersão de lente residual e detritos, limpando-a suavemente com um cotonete mergulhado em 70% de etanol (v/v).
  9. Ao utilizar uma lente de imersão em água, aplique gel de ultrassom na janela, evitando bolhas.
    NOTA: A água destilada também pode ser usada, mas pode exigir reaplicação durante a imagem.
  10. Para encontrar a profundidade ideal para imagens, primeiro, localize a grade e coloque-a em foco.
  11. Determine a profundidade aproximada da imagem do tecido, definindo a parte inferior da grade para 0. Essas informações são necessárias para localizar o plano z correspondente em sessões de imagem subsequentes.
  12. Para identificar o mesmo local em várias sessões de imagem, utilize os quadrados na grade como ponto de referência. Durante a imagem, observe a orientação da grade e localização dentro da grade de cada campo de visão visualizada (por exemplo,2ª fileira do topo,4º quadrado da esquerda).
  13. Durante sucessivas sessões de imagem, use a grade para navegar de volta para áreas específicas da grade - e, portanto, campos de imagem.
  14. Após cada sessão de imagem, remova qualquer meio de imersão de lente residual e detritos limpando suavemente a janela com um cotonete mergulhado em 70% de etanol (v/v).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Imagens intravitais através de janelas de imagem podem ser usadas para observar, rastrear e quantificar uma ampla gama de eventos celulares e moleculares em resolução unicelular durante um período de horas a semanas. As características ideais para uma janela de imagem incluem: a) impacto limitado no bem-estar do camundongo e na fisiologia do tecido; b) durabilidade; c) simplicidade da inserção; e d) marcos claros para imagens repetidas da mesma região. O resultado é uma janela de silicone versátil e inerte que é facilmen...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As janelas de imagem intravital são ferramentas importantes para visualizar diretamente processos fisiológicos e patológicos na resolução celular à medida que se desdobram ao longo do tempo. O novo procedimento descrito para fundir e inserir janelas flexíveis de imagem de silicone em camundongos supera alguns dos problemas mais comuns com janelas de imagem usadas atualmente (exsudate, quebra e interferência com a mobilidade normal), proporciona segurança adicional para o rato e aumenta a acessibilidade desta técnica.

...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

M.E. é membro do conselho consultivo de pesquisa da brensocatib para a Insmed, Inc.; membro do conselho consultivo científico da Vividion Therapeutics, Inc.; um consultor da Protalix, Inc.; e detém ações da Agios Pharmaceuticals, Inc. D.A.T. é co-fundadora da Mestag Therapeutics, e está no conselho consultivo científico e detém ações da Mestag Therapeutics, Leap Therapeutics, Surface Oncology e Cygnal Therapeutics. Os outros autores não declaram interesses concorrentes.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos a Rob Eifert por sua ajuda na concepção e otimização das grades de aço inoxidável cortadas a laser. Este trabalho foi apoiado pelo Centro de Câncer da CSHL (P30-CA045508) e fundos para m.E. dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) (1R01CA2374135 e 5P01CA013106-49); CSHL e Northwell Health; a Fundação Família Thompson; Nade através da América; e uma bolsa da Fundação Simons para a CSHL. O M.S. foi apoiado pelo National Institute of General Medical Sciences Medical Scientist Training Program Training Award (T32-GM008444) e pelo National Cancer Institute of the NIH sob o prêmio número 1F30CA253993-01. L.M. é apoiado por uma Bolsa de Pós-Doutorado da Fundação James S. McDonnell. J.M.A. é o beneficiário de uma Bolsa de Pós-Doutorado do Instituto de Pesquisa do Câncer/Irvington (Prêmio CRI #3435). O D.A.T. é apoiado pelo Laboratório Dedicado da Fundação Lustgarten para Pesquisa de Câncer Pancreático e pela Thompson Family Foundation. Desenhos animados foram criados com Biorender.com.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Fita Cirúrgica de Pano Macio 3M Medipore3M70200770819
Sutura de Seda 4-0 PERMA HAND BLACK 1 x 18" RB-2Ethicon N267H
ACTB-ECFP camundongosJackson Laboratory22974
AEC Substrate Kit, Peroxidase (HRP), (3-amino-9-etilcarbazol)Vector Laboratories SK-4200
Cotonetes com álcoolBD 
Sistema de anestesiaMolecular Imaging Products Co.
Acqknowledge software e sensores BIOPACACK100W, ACK100M, TSD110
Betadine spray Camundongos LORIS109-08
c-fms-EGFP (MacGreen) CamundongosJackson Laboratory18549
C57BL/6JLaboratory664
CD45 Anticorpo Monoclonal (30-F11)Invitrogen14-0451-82
Anticorpo CD68Abcamab125212
Esponjas de gaze Curity Covidien
Donkey Anti-Goat IgG H& L (HRP) Abcamab6885
Burro Anti-Coelho IgG H& L (HRP) Abcamab97064
Burro Anti-Rato IgG H & L (HRP) Abcamab102182
Dow SYLGARD 184 Encapsulante de Silicone ClearElectron Microscopy Sciences24236-10Duas partes, proporção de mistura de 10:1
Vidro de Cobertura Redondo, Diâmetro de 8mm, Espessura #1.5 Eletrônica Microscopia Sciences72296-08
Ender-3 Pro impressora 3DShenzhen Creality 3D Technology Co., LTD
Cobertor aquecido infravermelho distanteKent ScientificRT-0520
Fc Receptor BlockerInnovex BiosciencesNB309
Fiji pacotehttps://imagej.net/software/fiji/
FluoroSpheres carboxilato, 0.04µ m, amarelo-verde (505/515)InvitrogenF8795
:BIOPAC Systems Inc.Os componentes juntos permitem monitorar os sinais vitais do camundongo durante a imagem e a aquisição de imagens na respiração do camundongo. Todos foram adquiridos de sistemas BIOPAC.
Acqknowledge software ACK100W, ACK100M
Módulo de Amp. Dif.DA100C
para pequenos animaisDTU200 
MP160 para Windows - SistemaMP160WSW 
MouseOx Plus 120V MOX-120V; 015000 
Almofada de Pressão TSD110 
GelfoamPfizer9031508Esponja de gelatina absorvível
Tesoura fina endurecidaFerramentas de Ciência Fina14090-11Dois pares; aço inoxidável, pontas afiadas
, ponta reta, 26 mm
de corte, 11 cm de comprimento
Mieloperoxidase/MPO Humano / Camundongo AnticorpoR & D SystemsAF3667
Esterilizador de esferas quentesFine Science Tools18000-45Ligue aproximadamente 30 min
antes de usar; esterilize as ferramentas a >200
° C por 30 s
Imaris de imersão www.bitplane.comBitplane
Immersol W 2010Zeiss444969-0000-000 
Seringas de Insulina com Agulha Ultra-Fina BD 6mm x 31G 1 mL/ccBD324912
Isoflurano (Fluriso)VetOne502017
Lycopersicon Esculentum (Tomate) Lectina (LEL, TL), DyLight® 594Vector Laboratories DL-1177-1
LysM-eGFP camundongoswww.mmrrc.org012039-MU
Micropinça de dissecaçãoRobozRS-5135Serrilhada, ligeira curva, largura da ponta de 0,8 mm; 4" de comprimento
Micropinça de dissecaçãoRobozRS-51531 x 2 dentes, ligeira curva, 0,8 mm de largura da ponta
, 4" de comprimento
MTS MiniBionix II 808MTS SystemsMáquina de ensaio de material servo-hidráulico
Sonda Neutrophil Elastase 680 FASTPerkinElmerNEV11169
NitrogenGeneral Welding Supply Corp.
Fornecimentode Soldagem Geral de Oxigênio Corp.
Filamento de ácido poliláticoHatchbox1,75 mm de diâmetro
ProLong Diamond Antifade MountantInvitrogenP36970
Pomada oftálmica PuralubeDechra NDC17033-211-38
Reflex 7 clipes de feridaRoboz SurgicalRS-9255
Grade de aço inoxidávelFotofabUma grade tem 0,200 polegadas de diâmetro, com um total de 52 quadrados de grade individuais que são 0,016 x 0,016 polegadas. Há 0,003 polegadas de espaço entre cada quadrado.   
Placas de Cultura de Tecidos Estéreis Tratadas com Superfíciede FB012929Fisher Scientificusada como superfície de cura para janelas de imagem
Microscópio Multifotônico TriM Scope A imagem LaVision BioTecfoi feita em um microscópio vertical de 2 fótons (Trimscope, LaVision BioTec) equipado com dois lasers Ti:Sapphire (Mai Tai e InSight, Spectra-Physics) e um oscilador paramétrico óptico. Os seguintes divisores de feixe dicróicos Longpass (Chroma) foram usados para direcionar o sinal para quatro tubos fotomultiplicadores:
T560LP
T665LPXXR
T495lxpr
Vetbond3M70200742529
VWR micro vidro de coberturaVWR48404-453
326895 Jackson de processamento de imagem Sistema de gating Sistema de Duplo Gating de análise Meio Tampa

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dondossola, E., et al. Intravital microscopy of osteolytic progression and therapy response of cancer lesions in the bone. Science Translational Medicine. 10 (452), (2018).
  2. Haeger, A., et al. Collective cancer invasion forms an integrin-dependent radioresistant niche. Journal of Experimental Medicine. 217 (1), 20181184(2020).
  3. Harper, K. L., et al. Mechanism of early dissemination and metastasis in Her2(+) mammary cancer. Nature. 540 (7634), 588-592 (2016).
  4. Eickhoff, S., et al. Robust anti-viral immunity requires multiple distinct T cell-dendritic cell interactions. Cell. 162 (6), 1322-1337 (2015).
  5. Engelhardt, J. J., et al. Marginating dendritic cells of the tumor microenvironment cross-present tumor antigens and stably engage tumor-specific T cells. Cancer Cell. 21 (3), 402-417 (2012).
  6. Sammicheli, S., et al. Inflammatory monocytes hinder antiviral B cell responses. Science Immunology. 1 (4), (2016).
  7. Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
  8. Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Preparation of mice for long-term intravital imaging of the mammary gland. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5562(2011).
  9. Ritsma, L., et al. Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy. Nature Protocols. 8 (3), 583-594 (2013).
  10. Pittet, M. J., Garris, C. S., Arlauckas, S. P., Weissleder, R. Recording the wild lives of immune cells. Science Immunology. 3 (27), (2018).
  11. Alieva, M., Ritsma, L., Giedt, R. J., Weissleder, R., van Rheenen, J. Imaging windows for long-term intravital imaging: General overview and technical insights. Intravital. 3 (2), 29917(2014).
  12. Heo, C., et al. A soft, transparent, freely accessible cranial window for chronic imaging and electrophysiology. Scientific Reports. 6, 27818(2016).
  13. Anderson, T. L. Fracture Mechanics: Fundamental and Applications. , CRC Press, Taylor & Francis Group. Florida. (2005).
  14. Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (73), e50088(2013).
  15. Sasmono, R. T., et al. A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse. Blood. 101 (3), 1155-1163 (2003).
  16. Cole, R. W., Jinadasa, T., Brown, C. M. Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control. Nature Protocols. 6 (12), 1929-1941 (2011).
  17. Sobolik, T., et al. Development of novel murine mammary imaging windows to examine wound healing effects on leukocyte trafficking in mammary tumors with intravital imaging. Intravital. 5 (1), 1125562(2016).
  18. Jacquemin, G., et al. Longitudinal high-resolution imaging through a flexible intravital imaging window. Science Advances. 7 (25), (2021).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

Microscopia IntravitalJanela de Imagem de SiliconeImagem LongitudinalJanela de PolidimetilsiloxanoImagem de Gl ndula Mam riaImagem de rg os AbdominaisRastreamento de C lulas ImunesImagem de C lulas Cancer genasInser o de Janela Cir rgicaVisualiza o de Tecidos

Artigos relacionados