Summary
כאן, אנו מציגים את פרוטוקול הייצור של מכשיר טרנזיסטור בעל אפקט שדה אורגני המופנן בטעינה (OCMFET) להתמשואות תאית במבחנה . המכשיר, הנקרא מערך מיקרו OCMFET, הוא מכשיר גמיש, בעלות נמוכה ונקני ייחוס, שיאפשר ניטור של הפעילות החשמלית והמטבולית של תרביות תאים אלקטרואקטיביים.
Abstract
אלקטרופיזיולוגיה מודרנית מונעת כל הזמן על ידי פיתוח מקביל של כלים וחומרים מתוחכמים יותר ויותר. תגליות בתחום הובילו להתקדמות טכנולוגית בתהליך הלוך ושוב שבסופו של דבר קבע את ההישגים המרשימים של 50 השנים האחרונות. עם זאת, המכשירים המועסקים ביותר המשמשים להתממשקות תאית (כלומר, מערכי המיקרו-קטרודה והמכשירים המיקרו-אלקטרורוניים המבוססים על טרנזיסטורים) עדיין מציגים מספר מגבלות כגון עלות גבוהה, קשיחות החומרים ונוכחות של אלקטרודה התייחסות חיצונית. כדי להתגבר חלקית על בעיות אלה, היו התפתחויות בתחום מדעי חדש שנקרא ביואלקטרוניקה אורגנית, וכתוצאה מכך יתרונות כגון עלות נמוכה יותר, חומרים נוחים יותר וטכניקות ייצור חדשניות.
כמה מכשירים אורגניים חדשים ומעניינים הוצעו במהלך העשור האחרון כדי להתממשק בנוחות עם תרביות תאים. מאמר זה מציג את הפרוטוקול לייצור מכשירים להתמשכות תאית בהתבסס על טרנזיסטור אפקט שדה (OCMFET) המופנן בטעינה אורגנית. התקנים אלה, הנקראים מערכי מיקרו OCMFET (MOAs), משלבים את היתרונות של אלקטרוניקה אורגנית ואת התכונות המוזרות של OCMFET כדי להכין כלים שקופים, גמישים ונקני ייחוס שבהם ניתן לפקח הן על הפעילות החשמלית והן על הפעילויות המטבוליות של קרדיומיוציטים ונוירונים במבחנה, ובכך לאפשר הערכה רב-פרמטרית של מודלים של תאים אלקטרוגניים.
Introduction
ניטור In vivo של תאים אלקטרואקטיביים, כגון נוירונים וקרדיומיוציטים, מייצג גישה תקפה ועוצמתית ביישומי מחקר בסיסיים למוח האנושי, מחקרי קישוריות תפקודית, פרמקולוגיה וטוקסיקולוגיה. הכלים המועסקים בדרך כלל למחקרים כאלה מבוססים בעיקר על מערכי מיקרו-ectrode (MEAs) 1,2,3,4,5 והתקנים יעילים וחזקים יותר ויותר של אפקטי שדה (FEDs)6,7,8,9,10,11,12 . שתי משפחות אלה של מכשירים מאפשרות ניטור וגירוי בזמן אמת של הפעילות החשמלית של נוירונים וקרדיומיוציטים ומאופיינות בדרך כלל בחוסן, קלות שימוש ואמינות. תכונות אלה הופכות את MEAs ו- FEDs לתקן הזהב עבור יישומים אלקטרופיזיולוגיים, המועסקים כיום כדי להתממשק עם תרביות תאיות סטנדרטיות, פרוסות מוח אורגנוטיפיות ואורגנוידים תלת-ממדיים13,14,15,16. למרות השימוש הנרחב שלהם ואת התכונות המרשימות שלהם, MEAs ו FEDs להציג כמה מגבלות כגון עלות גבוהה, קשיחות של החומרים, ואת נוכחותה של אלקטרודה התייחסות מגושם בדרך כלל, אשר צריך להיות ממוקם בסביבת נוזל המדידה והוא הכרחי להפעלה נכונה של המכשירים.
כדי לבחון פתרונות חלופיים להתממשקות סלולרית, הושקע בעשור האחרון מאמץ רב בחקר מכשירים אלקטרוניים המבוססים על חומרים אורגניים וטכניקות ייצור חדשניות17. בין מספר מכשירים אורגניים שנחקרו כדי לטפל במגבלות הנ"ל, טרנזיסטור אורגני מוזר בשם OCMFET הוצע לאחרונה כחלופה תקפה ל- MEAs ו- FEDs18. בנוסף למאפיינים הסטנדרטיים המוצעים על ידי טכנולוגיית האלקטרוניקה האורגנית, כגון חומרים בעלות נמוכה וטכניקות ייצור, תכונות מכניות וכימיות אופטימליות, שקיפות אופטית ואופציה ביולוגית, ה- OCMFET מציע גם רגישות לטעינה גבוהה במיוחד (בשל המבנה הכפול שלו) ללא צורך באלקטרודה התייחסות חיצונית. יתר על כן, חיישן אורגני זה יש את היכולת המדהימה של חישה שונה אנליטה / פרמטרים פיזיים, בהתאם לפונקציונליזציה הספציפית של אזור החישה שלה, אשר מופרד מאזור הטרנזיסטור19,20. כל התכונות האלה ניתן לנצל בנוחות לרכישת פרמטרים שונים בתוך תרבות הסלולר. בפרט, בנוסף ליכולת לזהות את הפעילות החשמלית העצבית/לבבית, ניתן גם לנצל את הרגישות הגבוהה במיוחד ל- pH המוצעת על ידי המבנה הכפול המוזר של OCMFET באמצעות פונקציונליזציה פיזית פשוטה21 כדי לפקח באופן אמין על וריאציות ה- pH המקומיות הקלות הנגרמות על ידי פעילות מטבולית תאית.
ב- in vitro cell biosensing, ניטור הפעילות המטבולית התאית הוא אינדיקטור רב עוצמה למצב התרבות וניתן להשתמש בו כדי להעריך את התגובה התאית לגירויים שונים, כגון מתן תרופות וגירוי חשמלי22,23. יתר על כן, במקרה הספציפי של יישומים עצביים, ניטור הן את הפעילות החשמלית והן את הפעילות המטבולית הוא עניין רב, במיוחד בפרמקולוגיה וטוקסיקולוגיה24. מתוך כוונה לטפל בנוחות בדרישות האלקטרופיזיולוגיה המודרנית במבחנה ובמקביל להציע את כל היתרונות של OCMFET, הוכנס לאחרונה התקן בשם מערך Micro OCMFET (MOA). MOA הוא מערך מבוסס OCMFET עם אזורי חישה מיוחדים שתוכננו במיוחד עבור התממשקות הסלולר במבחנה, המאפשר ניתוח רב-פרמטרי של תרביות תאים אלקטרוגניים. בפרט, שני ערוצי MOA יש אזורי חישה גדולים יותר כדי למקסם את הרגישות שלהם והוא יכול להיות פונקציונלי באופן סלקטיבי כדי לפקח על פרמטרים ספציפיים של עניין, כגון וריאציות pH של מדיום התרבות. OCMFETs האחרים במבנה לפעול כמו חיישני פעילות חשמלית חוץ תאית. איור 1 מציג את המבנה של MOA 16 ערוצים. יכולת זו, בשילוב עם היעדר אלקטרודה התייחסות חיצונית, הופך את MOA כלי מעניין מאוד עבור יישומי מביה חוץ. עבודה זו מציגה את פרוטוקול הייצור שלב אחר שלב של MOA רב-רגישות לגילוי במבחנה של הפעילויות החשמליות והמטבוליות של נוירונים וקרדיומיוציטים. איור 2 מציג את שלבי הייצור העיקריים, החומרים המשמשים ואת מבנה המכשיר.
Protocol
כל ההנחיות הבינלאומיות, הלאומיות ו/או המוסדיות הרלוונטיות לטיפול ולשימוש בבעלי חיים בוצעו. נעשו כל המאמצים לצמצם את מספר בעלי החיים בפרויקט ולמזער את סבלם.
1. הכנת הפתרון המתפתח, פתרונות החריטה, פתרון המוליכים למחצה האורגני והמסכות הפוטו-אתוגרפיות
- הכן את הפתרון המתפתח על ידי דילול כדורי NaOH במים deionized בריכוז של 175 mM.
הערה: זוהי תגובה אקסותרמית. אם נעשה שימוש במיכל פלסטיק, המשיכו להרגיז את המיכל עד שכל הכדורים יתמוססו לחלוטין. - הכן את פתרון חריטת הטיטניום על ידי דילול חומצה הידרופלואורית (HF) במים שעברו דה-יוינוזציה (חלק אחד של 48% HF מרוכז, 49 חלקים של מים שעברו דה-יוינו).
אזהרה: חומצה הידרופלואורית יכולה לחדור בקלות לעור ולגרום נזק חמור לשכבות רקמות עמוקות. נטרול מהיר של HF יש צורך למנוע הרס רקמות, אשר עשוי להימשך ימים וכתוצאה מכך פציעה חמורה או אפילו מוות. הסיכונים הקשורים HF תלויים בריכוז ומשך המגע עם החומצה. יש להשתמש רק מתחת למכסה המנוע באמצעות מגן פנים. מומלץ מאוד גם לבלום את ההשתובפות הכפולה. - הכן את פתרון חריטת הזהב על ידי ערבוב יוד, אשלגן יודיד, ומים deionized (עבור 250 גרם של פתרון, להשתמש 200 מ"ל של מים deionized, 20 גרם של KI, 5 גרם של I2). מערבבים את הפתרון בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת ומשאירים אותו נח למשך הלילה לפני השימוש.
- הכן את פתרון המוליכים למחצה על ידי המסת 6,13-bis (triisopropylsilylethynyl) פנטצן (טיפים Pentacene) אניזול (1% במשקל) ובערבב בעדינות במשך 2 שעות על צלחת חמה ב 80 °C (80 °F).
הערה: המשך להסעיר פתרון זה. יש להשתמש בבקבוקוני זכוכית ענבר ו/או לאחסן אותם בתנאי תאורה חלשה. - הכן את ערכת המסכות הפוטו-ליתוגרפית הרצויה עם תוכנה גרפית וקטורית. מכינים 5 מסכות לכל התהליך: המסכה לתבנית השערים הצפים (FGs); המסכה לפתיחת הוויה ואזורי חישה להקלטות האלקטרופיזיולוגיות; המסיכה לתהליך היישור העצמי; המסכה לתבנית המקור, ניקוז ובקרה מגע העליון של שער; והמסכה להפעלת הפלזמה של ערוצי ה- pH.
הערה: בהתאם לרזולוציה הדרושה ולהגדרה הפוטו-ליתוגרפית הספציפית, ניתן להשתמש בסוגים שונים של מסיכות. במקרה של המכשירים המוצעים (שיש להם רזולוציה רוחבית מקסימלית של 40 מיקרומטר), מסכות פלסטיק גמישות פשוטות נקנו בחנות צילום מקומית.
2. בחירת מצע והכנה
- חותכים 6 x 6 cm2 מרובע של 250 מיקרומטר פוליאתילן טרפתלט (PET) מגיליון PET טהור.
הערה: התחל עם מצע מעט גדול יותר מהמכשיר הסופי כדי שיהיו לו שוליים רחבים מספיק כדי לאפשר מניפולציה עם פינצטה סטנדרטית במעבדה מבלי לפגוע בו. - בדוק את המצע באמצעות מיקרוסקופ אופטי כדי לא לכלול את נוכחותם של חריצים עמוקים ושריטות. בחר בקפידה את המצעים השרוטים פחות כמו פגמים גדולים יותר עלול להוביל לכישלון של המכשיר הסופי.
- לשטוף את מצע PET עם אצטון, אלכוהול איזופרופיל, ומים deionized (בסדר זה) ולייבש אותם באמצעות זרמים של חנקן. יש לאחסן את המצעים בכלי פטרי /מיכלי פלסטיק נקיים.
3. פ"ג: תצהיר טיטניום
- יש לנקות מראש את המצעים בחמצן פלזמה (30 s ב-100 W) ולהניח אותם על מחזיק המצע בתוך תא הוואקום של המאייד התרמי.
- מניחים 60 מ"ג טיטניום בכור ההיתוך, סוגרים את התריס ומשאבים את תא האידוי עד שהוא מגיע לרמת ואקום נמוכה מ-10-6 טור. להגביר את כוחו של המאייד עד כור ההיתוך זוהר אדום ולחכות 30 s. פתחו את התריס, הגבירו את הכוח ל-60% (או עד שהכור ההיתוך יזהר לבן בוהק), והמתינו ל-60 מעלות. סגור את התריס ותנמיך את החשמל.
- הסר את המצעים מהמתנד; לנקות אותם באמצעות אצטון, אלכוהול איזופרופיל, ומים deionized; ולייבש אותם באמצעות זרמים של חנקן. בצע טיפול פלזמה חמצן שני (60 s ב 200 W) כדי לחמצן מעט את פני השטח טיטניום.
4. דפוסי FG
- מניחים מצע אחד בכל פעם על מעיל הספין המונח בתוך מכסה המנוע. הפקד 4 מ"ל של פוטורסיסט על המצע באמצעות פיפטה פלסטיק חד פעמי. השתמש בפרמטרים הבאים של ציפוי ספין כדי להשיג שכבה פוטורסיסטית בעובי 2 מיקרומטר: מהירות ספין: 3000 סל"ד; זמן ספין: 45 s; זמן האצה: 0.5 s; זמן ההאטה: 0.5 s.
- רך לאפות את photoresist על ידי הצבת המצע על צלחת חמה (70 °C (70 °C במשך 5 דקות). יש לאחסן את המצע בתוך צלחת פטרי/מיכל פלסטיק עטופה בנייר אלומיניום כדי למנוע חשיפה ישירה לאור.
הערה: הימנע טמפרטורת האפייה המוצעת (100 °C (50 °F) כדי למנוע עיוות מצע. עם זאת, אפייה בטמפרטורה נמוכה יותר לזמן רב יותר מבטיחה תוצאות טובות. - מניחים את המכשיר בברומוגרף וממקמו את מסכת הפלסטיק עם פריסת FG הרצויה על המצע. יש לחשוף לאור אולטרה סגול (UV) מלמעלה למשך דקה אחת, ולהסיר בזהירות את המסכה, תוך הקפדה על מזעור התנועות לרוחב של המסכה מעל המצע כדי למנוע גירוד.
- לצלול את המצע עבור 5 s במיכל זכוכית מלא הפתרון המתפתח (שלב 1.1). לשטוף אותו במהירות במים deionized ולייבש אותו תחת חנקן. השתמש במיקרוסקופ אופטי כדי לחפש כתמים לא מפותחים/מפותחים מדי במצע. חזור על הטבילה של המצע בפיתוח פתרון במקרה של פיתוח.
- לחרוט את הטיטניום החשוף על ידי טביעה אותו בתמיסת תחריט טיטניום (שלב 1.2) במשך 15 s, לשטוף אותו עם מים deionized, ולייבש אותו באמצעות חנקן. בדוק אופטית את המצע והסר את הפוטורסיסט באמצעות אצטון. שוטפים את המצע עם אלכוהול איזופרופיל ומים דה-יוניזציה, ומייבשים אותו עם חנקן.
5. תצהיר דיאלקטרי בשער
- הכן את תא התצהיר של מעיל פארילן על ידי הפצת 2 מ"ל של מקדם הידבקות (סילאן - 3-(trimethoxysilyl)פרופיל מתכרילט) על קירות תא התצהיר באמצעות מגבון מעבדה. מניחים 300 מ"ג של דימר פארילן C (המתאים לעובי הסופי של 150 ננומטר) על מעיל פארילן. הגדר את ערך הלחץ הנמוך ל- 7 מ"ר ואת ערך הלחץ הגבוה יותר ל- 10 מ"ר. לאחר התצהיר, לנקות את המצעים עם אצטון, אלכוהול איזופרופיל, ומים deionized, ולייבש אותם עם חנקן.
6. פתיחת אזורי חישה של OCMFET להקלטת פעילות חשמלית ויצירת דרך כדי לגשת לחלק האחורי של FGs
- הפקד את photoresist על המצעים באמצעות אותם פרמטרים של שלבים 4.1 ו 4.2.
- הניחו את המכשיר בברומוגרף והנחו את המסכה הפוטוליתוגרפית מפלסטיק על המצע של הוויה (פתחים עגולים בקוטר של 50 מיקרומטר מעל אזורי חישה ופתחי 100 x 100 מיקרומטר 2 מעל ה- FGs הרחק מאזורי החינוי (המכונים מגע אחורי של ה- FGs באיור 1 ואיור 2)) תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי לשיפור דיוק היישור. לחשוף לאור UV מלמעלה במשך 1 דקות, בזהירות להסיר את המסכה, דואג למזער את התנועות לרוחב של המסכה מעל המצע כדי למנוע גירוד זה.
הערה: הוויות בצד ה-FGs הרחק מאזור החישה (המוצגות כמגע אחורי של FGs באיור 1 ובאיור 2) נחוצות למגע במהלך אפיון הטרנזיסטור. יתר על כן, לאחר גישה חשמלית FGs עשוי להיות מאוד שימושי עבור סוגים שונים של פונקציונליזציה (למשל, אלקטרודות). - לפתח את photoresist כפי שתואר בעבר בשלב 4.4. לחשוף את המצע עם photoresist בדוגמת (אשר פועל כמו מסכה כאן) לפלסמת חמצן (180 s ב 200 W) כדי להסיר את פארילן C מאזורי החישה.
הערה: קצב החריטה של פארילן C במנקה פלזמה איזוטרופי ב 200 W הוא כ 90 ננומטר / דקה. תחריט יתר קל מבוצע כדי לנקות עוד יותר את אזורי החישה. גם הצלם חרוט במהלך התהליך. עם זאת, עוביו (2 מיקרומטר) הוא הרבה יותר גבוה מזה של פארילן C. - מניחים את המצעים לתוך מיכל זכוכית מלא אצטון בתוך האמבטיה הקולית במשך 10 s כדי להסיר את photoresist לחלוטין. לשטוף את המצעים עם אצטון, אלכוהול איזופרופיל, מים ולייבש אותם עם חנקן.
הערה: באמצעות sonication במקום פשוט שטיפה המצעים עם אצטון הוא חיוני כדי למנוע קיפול לא רצוי ותצהיר מחדש של שברי פארילן C על פני השטח של אזורי החישה.
7. יישור עצמי של מקור וניקוז עם FG
- הפקד את photoresist על המצעים באמצעות אותם פרמטרים של שלבים 4.1 ו 4.2. מניחים את המכשיר בברומוגרף ומניחים על המצע מסכה פוטוליתוגרפית מפלסטיק עם מלבנים שחורים פשוטים המכסים לחלוטין את אזורי הטרנזיסטור. לחשוף לאור UV במשך 1 דקות הן מלמעלה והן מלמטה, ולהסיר בזהירות את המסכה, דואג למזער את התנועות לרוחב של המסכה מעל המצע כדי למנוע גירוד זה.
הערה: עם החשיפה הדו-צדדית, ה- FGs פועלים כמסכות פוטוליתוגרפיות ביחס לחשיפה התחתונה, בעוד נוכחות המסכה העליונה מבטיחה שרק הפוטורסיסט הנוכחי בערוץ הטרנזיסטורים יישאר ללא חשיפה. - לפתח את photoresist כפי שתואר בעבר בשלב 4.4.
8. תצהיר זהב, היווצרות ערוץ ודפוס של המקורות, הניקוזים ושערי הבקרה
- נקו את המצעים בעזרת טיפול פלזמה עדין (30 s at 30 W) כדי לקדם את הידבקות המתכת על פארילן C ומניחים אותם על מחזיק המצע בתוך תא הוואקום של המאייד התרמי.
- מניחים 30 מ"ג זהב בכור ההיתוך, סוגרים את התריס ומשאבים את תא האידוי עד שהוא מגיע ל-10-5 טור. להגביר את כוחו של המאייד עד כור ההיתוך זוהר אדום ולחכות 30 s. פתחו את התריס, הגבירו את הכוח ל-40% (או עד שהכור ההיתוך יזהר לבן בוהק), המתינו ל-60 מעלות, סגרו את התריס והנמיכו את החשמל.
- מניחים את המצעים לתוך מיכל אצטון בתוך האמבטיה הקולית במשך 10 s כדי להרים את photoresist, ובכך להסיר את הזהב מערוץ הטרנזיסטורים. לשטוף את המצעים עם אצטון, אלכוהול איזופרופיל, מים ולייבש אותם עם חנקן. הפקד את photoresist על המצעים באמצעות אותם פרמטרים של שלבים 4.1 ו 4.2.
- מניחים את המכשיר בברומוגרף וממקמים על המצע מסכה פוטוליטוגרפית מפלסטיק עם המקורות הרצויים, ניקוז ופריסת שער בקרה. לחשוף לאור UV במשך 1 דקות מלמעלה, ולהסיר בזהירות את המסכה, דואג למזער את התנועות לרוחב של המסכה מעל המצע כדי למנוע גירוד זה.
- לפתח את photoresist כמתואר בשלב 4.4. חורפים את הזהב החשוף על ידי טביעתה בתמיסת תחריט הזהב (שלב 1.3) למשך 10 s, שוטפים אותו במים דה-תיוניים ומייבשים אותו באמצעות חנקן. בדוק אופטית את המצע והסר את הפוטורסיסט באמצעות אצטון. יש לשטוף עם אלכוהול איזופרופיל ומים מתועדים ולייבש אותו עם חנקן.
9. תצהיר והפעלה של פארילן C עבור חישת pH
- הפקד את photoresist על המצעים באמצעות אותם פרמטרים של שלבים 4.1 ו 4.2.
- הניחו את המכשיר בברומוגרף והתמקמו על המצע מסכה פוטוליתוגרפית מפלסטיק עם פתחים המתאימים לאזורי חישת ה- pH של OCMFETs. לחשוף לאור UV במשך 1 דקות מלמעלה, ולהסיר בזהירות את המסכה, דואג למזער את התנועות לרוחב של המסכה מעל המצע כדי למנוע גירוד זה.
- לפתח את photoresist כמתואר בשלב 4.4. הגן על ההתקן כולו, למעט אזורי חישת החומציות, באמצעות סרט בידוד פולימיד (עיין בטבלת החומרים). הפקד שכבה של 500 ננומטר של פארילן C (המתאים ל- 1 גרם של דימר פארילן C) על המצע באמצעות אותם פרמטרים המתוארים בשלב 5.1.
הערה: עובי Parylene C הכולל באזורי חישת ה- pH הוא 650 ננומטר. אין צורך בסילאן לתצהיר זה. - הסר בזהירות את סרט הבידוד פולימיד. לחשוף את המצע לפלסמת חמצן (5 דקות ו -30 s ב 200 W) כדי להפעיל את פארילן C על אזורי חישת pH של OCMFETs.
הערה: קלטת בידוד פולימיד יש צורך כאן כדי להגביל את התצהיר פארילן C. למעשה, המראה פשוטה באמצעות photoresist אינו נותן תוצאות חיוביות בשל האופי כמעט ללא חור סיכה של ציפוי קונפורמי המתקבל עם פארילן C. - מניחים את המצעים לתוך מיכל אצטון בתוך האמבטיה הקולית במשך 10 s כדי להסיר לחלוטין את photoresist. שוטפים את המצעים באצטון ובאלכוהול איזופרופיל (ללא מים) ומייבשים אותם בחנקן.
10. תצהיר מוליכים למחצה, הצבת תא פולחן, וגזרה סופית של המכשיר מן PET
- מניחים את המצעים על צלחת חמה ב 50 °C (50 °F). יש להטיל טיפה (1 μL) של תמיסת מוליכים למחצה (שלב 1.4) על כל אזור ערוץ, לכסות את כל המצע במכסה, ולתת לו להתייבש מתחת למכסה המנוע הכימי למשך 30 דקות.
- הכן את תא הפולחן על ידי הדפסת טבעת סטירן בוטאדין אקרילוניטרייל ברדיוס פנימי של 15 מ"מ, עובי של 1 מ"מ וגובה של 7 מ"מ עם מדפסת תלת-ממד. הדבק את תא הפולחן על החלק המרכזי של המצע באמצעות polydimethylsiloxane (יחס של סוכן הריפוי: 15% לפי משקל). חתוך את המכשיר מ PET באופן ידני או באמצעות חותך לייזר.
11. אפיון חשמלי של טרנזיסטורים
- אפיון כל טרנזיסטור באמצעות מד מקור18,19,20,21 (ראה טבלת החומרים).
הערה: יש למדוד הן את מאפייני היציאה והן את מאפייני הקלט כדי להסיק את הפרמטרים של הטרנזיסטורים (בעיקר הניידות של המובילים, מתח הסף, יחס ION/IOFF ושיפוע תת-קרקעי).
Representative Results
הפוטנציאל של משרד ההון אומת כאן הן להקלטות פעילות חשמלית והן לניטור פעילות מטבולית. ההערכה המדויקת של היכולות של המכשיר לזהות פוטנציאל פעולה חוץ תאי התבססה על אפיון יסודי עם תרביות קרדיומיוציטים של חולדות (במיוחד בקרדיומיוציטים של חולדות ראשיות שנמדדו ב-8 ימים במבחנה [DIV])18. איור 3A מציג MOA מלא עם 16 OCMFETs. ההשתתפות העליונה מראה דוגמה לתרבות קרדיומיוציט של חולדה מכנסת הנצמדת לפני השטח של משרד התחבורה. כדי להדגיש את בריאותם, התאים כבר חיסונים עבור חלבון סרקומרי, טרופומיוסין, לאחר ההקלטה. החדירה התחתונה מציגה אות קרדיומיוציט יחיד הנמדד עם OCMFET.
באופן מעניין, המכשיר יכול לזהות פעילות חשמלית ספונטנית ואת הפעילות המושרה עם ניהול של כימיקלים שונים, כפי שמוצג באיור 3B. אימות זה היה חיוני כדי להדגים את ההיתכנות של שימוש בגישה זו להתכווות תאים אלקטרוגניים. בשל תצורת המערך, משרד ההגנה התיר גם שחזור של מהירות ההתפשטות של אות הלב, ובכך הוכיח את התאמת המערכת לחקר רשתות סלולריות (איור 3C). לקבלת אימות נוסף כדי לקבוע את מגבלת הזיהוי בפועל של המכשיר, MOA נבדק גם עם נוירונים striatal (21 DIV)18, עם תוצאות מעניינות במונחים של משרעת האות ואת האמינות של ההקלטות. כפי שניתן לראות באיור 3D, ה-OCMFET יכול להגביר את פוטנציאל השדה העצבי ביציבות יוצאת דופן, ולהראות יחסי אות לרעש (SNRS) של עד 3.2 (באותו טווח כמו של SNRs המתקבלים עם MEAs25 סטנדרטי). מערך ההקלטה כלל אלקטרוניקה רב-ערוצית מותאמת אישית להטיית הטרנזיסטור וקריאת האות וההתניה. לכל ערוץ להקלטה החשמלית יש שלב ראשון המורכב מממיר קלט/וי עם נגד משוב 1 MΩ ומסנן פס 150 הרץ-1.3 קילו-הרץ עם רווח מתח של 110. עבור כל המדידות המוצגות, הטרנזיסטורים היו מוטים עם VDS = VGS = -1 V. המרת המז"פ וההדמיה וההמחשה החזותית של הנתונים בוצעו באמצעות לוח רכישת נתונים (עיין בטבלת החומרים). כל מפגשי המדידה נערכו בתוך כלוב פאראדיי כדי למזער את הרעש החשמלי והסביבתי במערכת.
כאמור, על ידי ניצול הפונקציונליזציה הפיזית הפשוטה המוצגת בפרוטוקול, ניתן היה להכין חיישני pH רגישים מאוד עם תגובה סופר נרנסטית. בגלל גישת הייצור המוצגת, התקני pH אלה יכולים להיות משולבים לתוך MOA ולהשתמש כדי לפקח על וריאציות pH קלות המושרה על ידי הפעילות המטבולית של נוירונים עכברוש ההיפוקמפוס העיקרי26. בפרט, כפי שמוצג באיור 4, רק אחד משני OCMFETs המוקדש חישה בתדר נמוך היה פונקציונלי באופן סלקטיבי כדי להדגים את היתכנות הגישה. פונקציונליזציה סלקטיבית זו אפשרה את ההערכה של התגובה של שני OCMFETs לווריאציות מטבוליות הנגרמות כימית: בפרט, מצב מטבולי גבוה ניתן להשיג באמצעות bicuculline (BIC), מעכב של קולטני GABA A27, בעוד מצב מטבולי נמוך יכול להיות מושרה על ידי תוספת של tetrodotoxin (TTX), אשר בסופו של דבר גורם למוות תאי28 . הגדרת ההקלטה כללה את אותם אלקטרוניקה רב-ערוצית מותאמת אישית המשמשת למדידות הפעילות האלקטרוניות.
שלא כמו במקרה הקודם, שני ערוצים ייעודיים שימשו לתיעוד הווריאציות האיטיות הנגרמות על ידי הפעילות המטבולית התאית. כל ערוץ כלל מעגל פשוט המורכב משני בלוקים עיקריים: ממיר I/V עם נגד משוב 1 MΩ ומסנן מעבר נמוך עם תדר ניתוק של 10 הרץ. הטרנזיסטורים היו מוטים עם VDS = VGS = -1 V, וכל המדידות בוצעו בתוך כלוב פאראדיי כדי למזער את ההשפעה של רעש חיצוני על ההקלטות (זהו היבט חשוב במיוחד בהתחשב בתנודות הנוכחיות הנמוכות הנגרמות על ידי הפעילות המטבולית התאית). במהלך הניסויים, התרבויות נשמרו במדיום תרבות נמוך חוצץ, ואת המערכת כולה הונחה בסביבה מבוקרת (37 °C (37 °C( ושטף CO2 / אוויר רציף). כצפוי, רק הזרם של OCMFET רגיש pH יכול להיות מווסת על ידי תוספת של 25 μM BIC. זה אושר עוד יותר על ידי אינדוקציה של וריאציה הנוכחית על ידי השונות המתאימה של הפעילות המטבולית התאית.
אותו ניסוי חזר על עצמו לאחר תוספת של 10 מיקרומטר TTX, אשר הביא להאטה הדרגתית של חילוף החומרים התאי. לאחר התוספת של TTX, לא OCMFET רגיש pH ולא pH-חסר רגישות הראו כל תגובה, ובכך להפגין את היעילות של הגישה. תוצאות אלה ממחישות את האפקטיביות של הפונקציונליזציה המוצעת ואת היציבות היחסית שלה עד שבועיים. מסקנה חשובה שניתן להסיק מהניסויים המוצעים (הן הפעילות החשמלית והן הפעילות המטבולית) היא שניתן להכין סוגים שונים של חיישנים על ידי תחשיב סלקטיבי של OCMFETs שונים באותו אזור פולחן. היבט זה מייצג הישג לא טריוויאלי ב- biosensing עבור יישומים סלולריים מכיוון שהיכולת לפקח על פרמטרים שונים באותה תרבית תאים חיונית לאפיון טוב יותר של המורכבות של מערכות ביולוגיות אלה.
איור 1: מבט עליון של MOA 16 ערוצים לניטור מטבולי וחשמלי של תאים אלקטרואקטיביים. סרגל קנה מידה = 1 ס"מ. קיצורים: OCMFETs = טרנזיסטורים אורגניים לאפקט שדה מווסתים בטעינה; FG = שער צף; S/D = מקור/ניקוז; MOA = מערך מיקרו OCMFET. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: שלבי ייצור עיקריים של MOA לניטור מטבולי וחשמלי של תאים אלקטרואקטיביים. (A ו- B) סרט Ti התאדה מעוצב באמצעות תהליך פוטוליתוגרפי סטנדרטי כדי להכין את השער הצף של OCMFETs. (ג) תצהיר של 15 ננומטר של פארילן C. שכבה זו, יחד עם תחמוצת Ti המקומית, משמשת כדיאלקטרי השער של הטרנזיסטורים. (D ו- E) שכבת פארילן C מעוצבת באמצעות טיפול בחמצן פלזמה. שכבה פוטורסיסטית בדוגמת משמשת לחשיפת אזורי חישה באופן סלקטיבי עבור ההקלטות החשמליות ואת המגעים האחוריים של השער הצף. (ו) דפוס של אנשי הקשר העליונים של Au, כלומר המקור, ניקוז, שער בקרה, וקשר אחורי שער צף. טכניקת יישור עצמי משמשת לשיפור הביצועים החשמליים של ההתקן. (ג-י)אני. תצהיר של השכבה השנייה של פארילן C על אזור החישה של OCMFETs לניטור פעילות מטבולית. לאחר החשיפה לפלזמת חמצן, שכבה זו תפעל כממברנה רגישה ל- pH (J). (K) חתך של MOA מלא (עם חומרים) לאחר התצהיר של המוליך למחצה האורגני (TIPS Pentacene) ואת מיקום תא התרבות. קיצורים: OCMFETs = טרנזיסטורים אורגניים לאפקט שדה מווסתים בטעינה; FG = שער צף; S/D = מקור/ניקוז; MOA = מערך מיקרו OCMFET; CG = שער בקרה; PET = פוליאתילן טרפתלט; Par C = פארילן C; טיפים = 6,13-bis (triisopropylsilylethynyl) פנטאצן; ABS = acrylonitrile butadiene styrene. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: הקלטות פעילות חשמלית תאית עם MOA. (A) תרבית מכנסת של קרדיומיוציטים של עכברושים (8 DIV) הנצמדת לפני השטח של MOA, קבועה לאחר הקלטה וחיסון לחלבון הסרקומרי, טרופומיוסין (inset עליון). תחתית: דוגמה של אות קרדיומיוציט יחיד נמדד עם OCMFET. סרגל קנה מידה = 150 מיקרומטר. (B) כוונון כימי של הפעילות החשמלית של תרבות קרדיומיוצייט. האצת הפעילות נבעה תוספת של 100 mM נוראדרנלין, בעוד דיכוי נבע תוספת של 100 mM verapamil. משמאל: אפנון תדירות פעימות; מימין: סטטיסטיקה על 5 OCMFETs-ממוצע סטיית תקן: ספייק-ספירה על 4 דקות של בזאל (129 ± 4.6), נוראדרנלין בתיווך (280 ± 28.6) ופעילות בתיווך verapamil (15 ± 1.9). (ג) שחזור של התפשטות אות לב. מימין: עלילת רסטר של הפעילות הספונטנית של התרבות המציינת את התפשטות האות מאתר 14 לאתר 41 (מימין). (D) פוטנציאל פעולה של תאים סטריאטליים מעובר חולדה (21 DIV). נתון זה שונה מ- 18. קיצורים: OCMFET = טרנזיסטור אפקט שדה מווסת מטען אורגני; MOA = מערך מיקרו OCMFET; NE = נוראדרנלין; VER = verapamil; DIV = ימים במבחנה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: הקלטות פעילות מטבולית עם משרד ההון. תגובה של הערוצים (A) רגישים ל- pH ו-(B) pH-לא רגישים של MOA לתוספת של 25 מיקרומטר BIC לפני ואחרי התוספת של 10 מיקרומטר של TTX. לאחר תוספת TTX, ההתנהגות של הערוץ הרגיש pH הופך להיות דומה לזה של pH-רגיש אחד. בפרט, אין וריאציה נוכחית ניתן לראות לאחר תוספת BIC עקב מוות תאי הנגרמת על ידי TTX. (ג) MOA להקלטות פעילות מטבולית. ה- OCMFETs הרגישים ל- pH וחסרי הרגישות ל- pH מסומנים בירוק ואדום, בהתאמה. Inset: נוירונים היפוקמפוס בריאים תרבית על המכשיר לאחר 15 DIV. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. נתון זה שונה מ- 26. קיצורים: OCMFET = טרנזיסטור אפקט שדה מווסת מטען אורגני; MOA = מערך מיקרו OCMFET; BIC = ביקולין; TTX = טטרודוטוקסין; DIV = ימים במבחנה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Discussion
שלא כמו שיטות קודמות לייצור OCMFETs עבור יישומים סלולריים18,29, השיטה המוצעת נועדה במיוחד להכין MOAs שיכול לזהות בו זמנית פעילות תאית חשמלית ומטבולית. יתר על כן, גישה זו להשגת רגישות pH יש את היתרון של להיות תואם עם פרוטוקולי ייצור סטנדרטיים ואינו כרוך כל שינוי כימי של אזור חישה (היבט זה מבטיח את תאימות ביולוגית של המכשיר כולו). רגישות ה- pH מושגת באמצעות אותו חומר המשמש כדיאלקטרי שער (כלומר, פארילן C התצייתי ביולוגית), מה שהופך גישה זו למהירה ו ניתנת לשחזור.
התוצאה הסופית של גישה זו היא כלי אורגני גמיש, שקוף, בעלות נמוכה ורב-חישה עבור יישומים סלולריים במבחנה . העובדה כי זה ניתן להשיג באמצעות מבנה טרנזיסטור יחיד ושינוי פיזי פשוט של אזור חישה מוסיף את היתרונות המוצעים על ידי שימוש בחומרים אלקטרוניים אורגניים ושיטות. יתר על כן, מכיוון שעקרון התמרה של OCMFET אינו תלוי אך ורק במוליך למחצה או בחומר FG הספציפי, ניתן לשנות את כל התהליך ולהדרג בהתאם ליישום הספציפי.
היבט קריטי של הטכניקה המוצעת קשור לשחזור של טכניקת הפעלת הפלזמה. כדי להשיג תוצאות עקביות, הן עובי פארילן C וקצב החריטה שלה חייב להיות נשלט. כיול תכוף של תהליך התצהיר של פארילן C ומנקה הפלזמה נחוצים לחלוטין. היבטים קריטיים נוספים, אשר תורמים גם לשחזור של התהליך, הם טיפול זהיר של המכשיר ואת התצהיר של המוליך למחצה האורגני. טכניקת יציקת טיפה פשוטה שימשה כאן, אשר באופן מהותי מציב מגבלות רבייה. כדי למזער בעיות אלה, כמתואר בשלב פרוטוקול 10.1, יש להשתמש באותה כמות של פתרון מוליכים למחצה בכל פעם, ויש לתקנן את אידוי הממס ככל האפשר. שמירה על טמפרטורה קבועה באמצעות צלחת חמה וכיסוי המצע לאחר כל תצהיר טיפה יעזור להאט את תהליך האידוי. כדי למזער עוד יותר בעיה זו, ניתן להחליף את טכניקת התצהיר (למשל, בשיטת הדפסת הזרקת דיו).
מגבלה של הפרוטוקול המוצע נובעת מאופי הפונקציונליזציה של OCMFET עבור חישת pH. היציבות של חיישני ה- pH מוגבלת למספר שבועות26. עם זאת, חלון היציבות של הגישה המוצעת גדול מספיק כדי לכסות את זמני הדגירה הסטנדרטיים הדרושים לצמיחת התרבות העצבית (2-3 שבועות). סוגים אחרים של פונקציונליזציה של אזור חישה יש לשקול עבור ניסויים ארוכים יותר. פרוטוקול הייצור משתמש במגע אחורי ייעודי, המאפשר גישה חשמלית ל- FGs. מגע זה, אשר נשאר צף במהלך הפעולה הרגילה של המכשיר, ניתן לנצל את האפיון החשמלי של המכשיר ואת הפונקציונליזציה של אזורי החישה באמצעות טכניקות שונות (למשל, אלקטרודות).
הליך זה מהווה דרך נוחה להכין מכשיר רב-חישה ליישומים סלולריים ללא צורך בחומרים נרחבים או במתקני חדר נקי. למרות מגבלות הביצועים והיציבות עקב העסקת מוליך למחצה אורגני ופונקציונליזציה פיזית (לא כימית) של אזור החישה, ניתן להשתמש בגישות דומות להכנת חיישנים וביוסנסורים בעלי עלות נמוכה (ופוטנציאלי חד פעמי), גמישים מבחינה מכנית ושקופים אופטית, שיכולים לספק לחוקרים בביולוגיה תאית, הנדסת רקמות ומדעי המוח כלים חדשניים מיוחדים לחקר מערכות תאיות במבחנה.
Disclosures
למחברים אין ניגודי אינטרסים להצהיר עליהם.
Acknowledgments
המחברים מכירים במימון מתוכנית המחקר והחדשנות Horizon 2020 של האיחוד האירופי במסגרת הסכם מענק מס ' 882897-חיפוש והצלה ופרויקט PON "TEX-STYLE" ARS01_00996, PNR 2015-2020.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | Sigma Aldrich | 440159 | |
| 3D printer Makerbot Replicator 2x | Makerbot | https://www.makerbot.gr/. Estimated price: 2k-3k euros. | |
| ABS filament | |||
| Anisole | Sigma Aldrich | 296295 | |
| Bromograph model Hellas | Bungard | https://www.bungard.de/. Estimated price: 1k-2k euros. | |
| Gold | Local seller | ||
| Hydrofluoric acid | Sigma Aldrich | 695068 | |
| Iodine | Sigma Aldrich | 207772 | |
| Kapton tape | polyimide insulation tape | ||
| Laser cutter VLS2.30 | Universal Laser Systems | https://www.ulsinc.com/it. Estimated price: 20k euros. | |
| Multichannel Systems acquisition board | www.multichannelsystems.com | ||
| NaOH pellets | Sigma Aldrich | 567530 | |
| Parylene C dimer | SCS special coating systems coating | ||
| PDMS Silgard 184 | Sigma Aldrich | 761036 | |
| PDS 2010 LABCOATER 2 Parylene Deposition System | SCS special coating systems | https://scscoatings.com/. Estimated price: 50k euros | |
| PET film biaxially oriented (thickness 0.25 mm) | Goodfellow | ES301450 | |
| Petri dishes | |||
| Plasma cleaner Gambetti "Tucano" | Gambetti | https://www.gambetti.it/. Estimated price: 20k euros. | |
| Positive photoresist AZ1518 | MicroChemicals | ||
| Potassium iodide KI | Sigma Aldrich | 221945 | |
| Source Meter 2636 | Keithley | https://it.farnell.com/. Estimated price: 18k euros | |
| Spin coater unit | Ossila | https://www.ossila.com/. Estimated price: 2.5k euros. | |
| Stereoscopic microscope SMZ745T | Nikon | https://www.microscope.healthcare.nikon. com/. Estimated price: 2k-3k euros. |
|
| Thermal evaporator unit | |||
| TIPS pentacene (6,13-Bis(triisopropylsilylethynyl)-pentacene) | Sigma Aldrich | 716006 | |
| Titanium wire | Goodfellow | TI005129 | |
| Ultrasonic bath | Falc Instruments | https://www.falcinstruments.it/. Estimated price: 1k euro. |
References
- Hubel, D. H. Tungsten microelectrode for recording from single units. Science. 125 (3247), 549-550 (1957).
- Verzeano, M., Negishi, K., Angeles, L. Neuronal activity in cortical and thalamic networks. A study with multiple microelectrodes. Journal of General Physiology. 43 (6), 177-195 (1960).
- Thomas, C. A. Jr, Springer, P. A., Loeb, G. E., Berwald-Netter, Y., Okun, L. M. A miniature microelectrode array to monitor the bioelectric activity of cultured cells. Experimental Cell Research. 74 (1), 61-66 (1972).
- Grattarola, M., Martinoia, S. Modeling the neuron-microtransducer junction: from extracellular to patch recording. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 40 (1), 35-41 (1993).
- Wallace, K., Strickland, J. D., Valdivia, P., Mundy, W. R., Shafer, T. J. A multiplexed assay for determination of neurotoxicant effects on spontaneous network activity and viability from microelectrode arrays. NeuroToxicology. 49, 79-85 (2015).
- Bergveld, P. Development, operation, and application of the tool for electrophysiology. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 19 (5), 342-351 (1972).
- Bergveld, P., Wiersma, J., Meertens, H. Extracellular potential recordings by means of a field effect transistor without gate metal, called OSFET. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 23 (2), 136-144 (1976).
- Fromherz, P., Offenhausser, A., Vetter, T., Weis, J. A neuron-silicon junction: a Retzius cell of the leech on an insulated-gate field-effect transistor. Science. 252 (5010), 1290-1293 (1991).
- Martinoia, S., et al. Development of ISFET array-based microsystems for bioelectrochemical measurements of cell populations. Biosensors and Bioelectronics. 16 (9-12), 1043-1050 (2001).
- Heer, F., et al. CMOS microelectrode array for the monitoring of electrogenic cells. Biosensors and Bioelectronics. 20 (2), 358-366 (2004).
- Berdondini, L., et al. Active pixel sensor array for high spatio-temporal resolution electrophysiological recordings from single cell to large scale neuronal networks. Lab on a Chip. 9 (18), 2644-2651 (2009).
- Maccione, A., et al. Multiscale functional connectivity estimation on low-density neuronal cultures recorded by high-density CMOS micro electrode arrays. Journal of Neuroscience Methods. 207 (2), 161-171 (2012).
- Kibler, A. B., Jamieson, B. G., Durand, D. M. A high aspect ratio microelectrode array for mapping neural activity in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 204 (2), 296-305 (2012).
- Frega, M., Tedesco, M., Massobrio, P., Pesce, M., Martinoia, S. Network dynamics of 3D engineered neuronal cultures: a new experimental model for in-vitro electrophysiology. Scientific Reports. 4, 5489 (2014).
- Zuo, L., Yu, S., Briggs, C. A., Kantor, S., Pan, J. Y. Design and fabrication of a three-dimensional multi-electrode array for neuron electrophysiology. Journal of Biomechanical Engineering. 139 (12), (2017).
- Spanu, A., et al. A three-dimensional micro-electrode array for in-vitro neuronal interfacing. Journal of Neural Engineering. 17 (3), 036033 (2020).
- Spanu, A., Martines, L., Bonfiglio, A. Interfacing cells with organic transistors: a review of in vitro and in vivo applications. Lab on a Chip. 21 (5), 795-820 (2021).
- Spanu, A., et al. An organic transistor-based system for reference-less electrophysiological monitoring of excitable cells. Scientific Reports. 5, 8807 (2015).
- Viola, F. A., Spanu, A., Ricci, P. C., Bonfiglio, A., Cosseddu, P. Ultrathin, flexible and multimodal tactile sensors based on organic field-effect transistors. Scientific Reports. 8, 8073 (2018).
- Napoli, C., et al. Electronic detection of DNA hybridization by coupling organic field-effect transistor-based sensors and hairpin-shaped probes. Sensors. 18 (4), 990 (2018).
- Spanu, A., et al. A reference-less pH sensor based on an organic field effect transistor with tunable sensitivity. Organic Electronics. 48, 188-193 (2017).
- Lundgaard, I., et al. Direct neuronal glucose uptake heralds activity-dependent increases in cerebral metabolism. Nature Communications. 6, 6807 (2015).
- Zhang, Y. S., et al. Multisensor-integrated organs-on-chips platform for automated and continual in situ monitoring of organoid behaviors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), 2293-2302 (2017).
- Yu, H., et al. A novel design of multifunctional integrated cell-based biosensors for simultaneously detecting cell acidification and extracellular potential. Biosensors and Bioelectronics. 24 (5), 1462-1468 (2009).
- Maccione, A., et al. A novel algorithm for precise identification of spikes in extracellularly recorded neuronal signals. Journal of Neuroscience Methods. 177 (1), 241-249 (2009).
- Spanu, A., Tedesco, M. T., Martines, L., Martinoia, S., Bonfiglio, A. An organic neurophysiological tool for neuronal metabolic activity monitoring. APL Bioengineering. 2 (4), 046105 (2018).
- Díaz-García, C. M., et al. Neuronal stimulation triggers neuronal glycolysis and not lactate uptake. Cell Metabolism. 26 (2), 361-374 (2017).
- Xie, Y., Dengler, K., Zacharias, E., Wilffert, B., Tegtmeier, F. Effects of the sodium channel blocker tetrodotoxin (TTX) on cellular ion homeostasis in rat brain subjected to complete ischemia. Brain Research. 652 (2), 216-224 (1994).
- Caboni, A., Orgiu, E., Barbaro, M., Bonfiglio, A. Flexible organic thin-film transistors for pH monitoring. IEEE Sensors Journal. 9 (12), 1963-1970 (2009).
- Fraboni, B., Bonfiglio, A., Basiricò, L. Inkjet printing of transparent, flexible, organic transistors. Thin Solid Films. 520, 1291-1294 (2011).
