Summary
Qui presentiamo il protocollo di fabbricazione di un dispositivo basato su transistor a effetto di campo modulato dalla carica organica (OCMFET) per l'interfacciamento cellulare in vitro . Il dispositivo, chiamato array micro OCMFET, è un dispositivo flessibile, a basso costo e senza riferimenti, che consentirà il monitoraggio delle attività elettriche e metaboliche delle colture cellulari elettroattive.
Abstract
La moderna elettrofisiologia è stata costantemente alimentata dallo sviluppo parallelo di strumenti e materiali sempre più sofisticati. A loro volta, le scoperte in questo campo hanno guidato il progresso tecnologico in un processo avanti e indietro che alla fine ha determinato gli impressionanti risultati degli ultimi 50 anni. Tuttavia, i dispositivi più utilizzati per l'interfacciamento cellulare (vale a dire, gli array di microelettrodi e i dispositivi microelettronici basati su transistor) presentano ancora diverse limitazioni come l'alto costo, la rigidità dei materiali e la presenza di un elettrodo di riferimento esterno. Per superare parzialmente questi problemi, ci sono stati sviluppi in un nuovo campo scientifico chiamato bioelettronica organica, con conseguenti vantaggi come costi inferiori, materiali più convenienti e tecniche di fabbricazione innovative.
Diversi nuovi interessanti dispositivi organici sono stati proposti nell'ultimo decennio per interfacciarsi comodamente con le colture cellulari. Questo documento presenta il protocollo per la fabbricazione di dispositivi per l'interfacciamento cellulare basati sul transistor organico ad effetto di campo modulato dalla carica (OCMFET). Questi dispositivi, chiamati micro OCMFET array (MOA), combinano i vantaggi dell'elettronica organica e le caratteristiche peculiari dell'OCMFET per preparare strumenti trasparenti, flessibili e senza riferimenti con i quali è possibile monitorare sia le attività elettriche che metaboliche di cardiomiociti e neuroni in vitro, consentendo così una valutazione multiparametrica di modelli cellulari elettrogenici.
Introduction
Il monitoraggio in vivo di cellule elettroattive, come neuroni e cardiomiociti, rappresenta un approccio valido e potente nelle applicazioni di ricerca fondamentale per il cervello umano, negli studi di connettività funzionale, nella farmacologia e nella tossicologia. Gli strumenti solitamente impiegati per tali studi si basano principalmente su array di microelettrodi (MEA)1,2,3,4,5 e dispositivi ad effetto di campo (FED) sempre più efficienti e potenti)6,7,8,9,10,11,12 . Queste due famiglie di dispositivi consentono il monitoraggio e la stimolazione in tempo reale dell'attività elettrica di neuroni e cardiomiociti e sono solitamente caratterizzate da robustezza, facilità d'uso e affidabilità. Queste caratteristiche rendono MEA e FED il gold standard per le applicazioni elettrofisiologiche, essendo attualmente impiegato per interfacciarsi con colture cellulari standard, fette di cervello organotipiche e organoidi tridimensionali13,14,15,16. Nonostante il loro uso diffuso e le loro caratteristiche impressionanti, MEA e FED presentano alcune limitazioni come l'alto costo, la rigidità dei materiali e la presenza di un elettrodo di riferimento solitamente ingombrante, che deve essere collocato nell'ambiente del liquido di misura ed è necessario per il corretto funzionamento dei dispositivi.
Per esplorare soluzioni alternative per l'interfacciamento cellulare, negli ultimi dieci anni sono stati investiti molti sforzi nello studio di dispositivi elettronici basati su materiali organici e tecniche di fabbricazione innovative17. Tra i numerosi dispositivi organici studiati per affrontare le suddette limitazioni, un peculiare transistor organico chiamato OCMFET è stato recentemente proposto come valida alternativa a MEA e FED18. Oltre alle caratteristiche standard offerte dalla tecnologia elettronica organica, come materiali a basso costo e tecniche di fabbricazione, proprietà meccaniche e chimiche ottimali, trasparenza ottica e biocompatibilità, l'OCMFET offre anche una sensibilità di carica ultra-elevata (grazie alla sua struttura a doppio gated) senza la necessità di un elettrodo di riferimento esterno. Inoltre, questo sensore organico ha la notevole capacità di rilevare diversi parametri analiti/fisici, a seconda della funzionalizzazione specifica della sua area di rilevamento, che è separata dall'area del transistor19,20. Tutte queste caratteristiche possono essere comodamente sfruttate per l'acquisizione di diversi parametri all'interno di una coltura cellulare. In particolare, oltre a poter rilevare l'attività elettrica neuronale/cardiaca, è anche possibile sfruttare l'altissima sensibilità al pH offerta dalla peculiare struttura a doppio gated dell'OCMFET utilizzando una semplice funzionalizzazione fisica21 per monitorare in modo affidabile le lievi variazioni di pH locale causate dall'attività metabolica cellulare.
Nel biorilevamento cellulare in vitro, il monitoraggio dell'attività metabolica cellulare è un potente indicatore dello stato della coltura e può essere utilizzato per valutare la risposta cellulare a vari stimoli, come la somministrazione di farmaci e la stimolazione elettrica22,23. Inoltre, nel caso specifico delle applicazioni neurali, il monitoraggio sia delle attività elettriche che metaboliche è di grande interesse, in particolare in farmacologia e tossicologia24. Con l'intento di soddisfare comodamente i requisiti della moderna elettrofisiologia in vitro e allo stesso tempo offrire tutti i vantaggi dell'OCMFET, è stato recentemente introdotto un dispositivo chiamato Micro OCMFET Array (MOA). Il MOA è un array basato su OCMFET con aree di rilevamento specializzate specificamente progettate per l'interfacciamento cellulare in vitro, che consente l'analisi multiparametrica di colture di cellule elettrogeniche. In particolare, due canali MOA hanno aree di rilevamento più grandi per massimizzare la loro sensibilità e possono essere funzionalizzati selettivamente per monitorare specifici parametri di interesse, come le variazioni di pH del terreno di coltura. Gli altri OMFET nella struttura agiscono come sensori di attività elettrica extracellulare. La Figura 1 mostra la struttura di un MOA a 16 canali. Questa capacità, unita all'assenza di un elettrodo di riferimento esterno, rende il MOA uno strumento molto interessante per applicazioni in vitro. Questo lavoro presenta il protocollo di fabbricazione passo-passo di un MOA multisensing per il rilevamento in vitro delle attività elettriche e metaboliche di neuroni e cardiomiociti. La Figura 2 mostra le principali fasi di fabbricazione, i materiali utilizzati e la struttura del dispositivo.
Protocol
Sono state seguite tutte le linee guida internazionali, nazionali e/o istituzionali applicabili per la cura e l'uso degli animali. Tutti gli sforzi sono stati fatti per ridurre il numero di animali per il progetto e per ridurre al minimo la loro sofferenza.
1. Preparazione della soluzione di sviluppo, delle soluzioni di incisione, della soluzione di semiconduttore organico e delle maschere fotolitografiche
- Preparare la soluzione di sviluppo diluendo i pellet naOH in acqua deionizzata ad una concentrazione di 175 mM.
NOTA: Questa è una reazione esotermica. Se si utilizza un contenitore di plastica, continuare ad agitare il contenitore fino a quando tutti i pellet non sono completamente sciolti. - Preparare la soluzione di incisione al titanio diluendo l'acido fluoridrico (HF) in acqua deionizzata (1 parte di HF concentrato al 48%, 49 parti di acqua deionizzata).
ATTENZIONE: L'acido fluoridrico può facilmente penetrare nella pelle, causando gravi danni agli strati dei tessuti profondi. La rapida neutralizzazione dell'HF è necessaria per prevenire la distruzione dei tessuti, che può continuare per giorni e provocare gravi lesioni o addirittura la morte. I rischi associati all'HF dipendono dalla concentrazione e dalla durata del contatto con l'acido. Utilizzare solo sotto una cappa aspirante utilizzando una visiera. Anche il doppio guanto è fortemente raccomandato. - Preparare la soluzione di incisione dell'oro mescolando iodio, ioduro di potassio e acqua deionizzata (per 250 g di soluzione, utilizzare 200 ml di acqua deionizzata, 20 g di KI, 5 g di I2). Mescolare la soluzione a temperatura ambiente per 1 ora e lasciarla riposare per una notte prima dell'uso.
- Preparare la soluzione a semiconduttore sciogliendo il pentacene 6,13-bis (triisopropilsililetil) (TIPS Pentacene) in anisolo (1% in peso) e mescolando delicatamente per 2 ore su una piastra calda a 80 °C.
NOTA: Continuare ad agitare questa soluzione. Utilizzare flaconcini di vetro ambrato e/o conservarli in condizioni di scarsa illuminazione. - Preparare il set di maschere fotolitografiche desiderato con un software di grafica vettoriale. Preparare 5 maschere per l'intero processo: la maschera per la modellazione dei cancelli galleggianti (FG); la maschera per l'apertura delle vie e le aree di rilevamento per le registrazioni elettrofisiologiche; la maschera per il processo di autoallineamento; la maschera per la modellazione della sorgente, dello scarico e del contatto superiore del cancello di controllo; e la maschera per l'attivazione plasmatica dei canali del pH.
NOTA: a seconda della risoluzione necessaria e della specifica configurazione fotolitografica, è possibile utilizzare diversi tipi di maschere. Nel caso dei dispositivi proposti (che hanno una risoluzione laterale massima di 40 μm), semplici maschere flessibili in plastica sono state acquistate in una copisteria locale.
2. Selezione e preparazione del substrato
- Tagliare un quadrato di 6 x 6 cm2 di polietilene tereftalato (PET) da 250 μm da un foglio di PET incontaminato.
NOTA: iniziare con un substrato leggermente più grande del dispositivo finale per avere margini abbastanza ampi da consentire la manipolazione con pinzette da laboratorio standard senza danneggiarlo. - Ispezionare il substrato con un microscopio ottico per escludere la presenza di scanalature profonde e graffi. Selezionare attentamente i substrati meno graffiati in quanto le imperfezioni più grandi possono portare al guasto del dispositivo finale.
- Risciacquare i substrati PET con acetone, alcool isopropilico e acqua deionizzata (in questo ordine) e asciugarli usando flussi di azoto. Conservare i substrati in piastre/contenitori di Petri di plastica pulita.
3. FG: deposizione di titanio
- Pre-pulire i substrati con ossigeno plasmatico (30 s a 100 W) e posizionarli sul supporto del substrato all'interno della camera a vuoto dell'evaporatore termico.
- Posizionare 60 mg di titanio nel crogiolo, chiudere l'otturatore e pompare verso il basso la camera di evaporazione fino a raggiungere un livello di vuoto inferiore a 10-6 Torr. Aumentare la potenza dell'evaporatore fino a quando il crogiolo si illumina di rosso e attendere 30 s. Apri l'otturatore, aumenta la potenza al 60% (o fino a quando il crogiolo si illumina di bianco brillante) e attendi 60 s. Chiudi l'otturatore e abbassa l'alimentazione.
- Rimuovere i substrati dall'evaporatore; pulirli usando acetone, alcool isopropilico e acqua deionizzata; e asciugarli usando flussi di azoto. Eseguire un secondo trattamento al plasma di ossigeno (60 s a 200 W) per ossidare leggermente la superficie in titanio.
4. Modellazione FG
- Posizionare un substrato alla volta sullo spin coater posto all'interno di una cappa aspirante. Depositare 4 mL di fotoresist sul substrato utilizzando una pipetta di plastica monouso. Utilizzare i seguenti parametri di rivestimento di centrifuga per ottenere uno strato fotoresistente di 2 μm di spessore: velocità di rotazione: 3000 rpm; tempo di rotazione: 45 s; tempo di accelerazione: 0,5 s; tempo di decelerazione: 0,5 s.
- Cuocere in modo morbido il fotoresist posizionando il substrato su una piastra calda (70 °C per 5 min). Conservare il substrato all'interno di una capsula di Petri avvolta in un foglio di alluminio / contenitore di plastica per evitare l'esposizione diretta alla luce.
NOTA: Evitare la temperatura di cottura suggerita (100 °C per 50 s) per evitare la deformazione del substrato. Tuttavia, la cottura a una temperatura più bassa per un tempo più lungo garantisce buoni risultati. - Posizionare il dispositivo in un bromografo e posizionare la maschera fotolitografica in plastica con il layout FG desiderato sul substrato. Esporre alla luce ultravioletta (UV) dall'alto per 1 minuto e rimuovere con attenzione la maschera, avendo cura di ridurre al minimo i movimenti laterali della maschera sul substrato per evitare di graffiarlo.
- Immergere il substrato per 5 s in un contenitore di vetro riempito con la soluzione in via di sviluppo (fase 1.1). Risciacquarlo rapidamente in acqua deionizzata e asciugarlo sotto azoto. Utilizzare un microscopio ottico per cercare punti sottosviluppati / sovrasviluppati nel substrato. Ripetere l'immersione del substrato nella soluzione di sviluppo in caso di sottosviluppo.
- Incidere il titanio esposto immergendolo nella soluzione di incisione in titanio (fase 1.2) per 15 s, sciacquarlo con acqua deionizzata e asciugarlo con azoto. Ispezionare otticamente il substrato e rimuovere il fotoresist usando l'acetone. Risciacquare il substrato con alcool isopropilico e acqua deionizzata e asciugarlo con azoto.
5. Deposizione dielettrica del cancello
- Preparare la camera di deposizione del rivestimento Parylene distribuendo 2 ml del promotore di adesione (silano - 3-(trimetosiglil)propil metacrilato) sulle pareti della camera di deposizione utilizzando una salvietta da laboratorio. Posizionare 300 mg di dimero Parylene C (corrispondenti ad uno spessore finale di 150 nm) sul rivestimento Parylene. Impostare il valore di pressione inferiore su 7 mbar e il valore di pressione più alto su 10 mbar. Dopo la deposizione, pulire i substrati con acetone, alcool isopropilico e acqua deionizzata e asciugarli con azoto.
6. Apertura delle aree di rilevamento dell'OCMFET per la registrazione dell'attività elettrica e la formazione delle vie per accedere al retro dei FG
- Depositare il fotoresist sui substrati utilizzando gli stessi parametri dei passaggi 4.1 e 4.2.
- Posizionare il dispositivo in un bromografo e posizionare la maschera fotolitografica in plastica sul substrato per le vie (aperture circolari con un diametro di 50 μm sulle aree di rilevamento e aperture di 100 x 100 μm2 sopra i FG lontano dalle aree di rilevamento (denominate contatto posteriore dei FG in Figura 1 e Figura 2)) sotto un microscopio stereoscopico per migliorare la precisione di allineamento. Esporre alla luce UV dall'alto per 1 min, e rimuovere con cura la maschera, avendo cura di ridurre al minimo i movimenti laterali della maschera sul substrato per evitare di graffiarla.
NOTA: Le vie sul lato dei FG lontano dall'area di rilevamento (mostrate come contatto posteriore dei FG in Figura 1 e Figura 2) sono necessarie per il contatto durante la caratterizzazione del transistor. Inoltre, avere accesso elettrico ai FG può essere molto utile per diversi tipi di funzionalizzazione (ad esempio, elettrodeposizione). - Sviluppare il fotoresist come descritto in precedenza nel passaggio 4.4. Esporre il substrato con il fotoresist modellato (che qui funge da maschera) al plasma di ossigeno (180 s a 200 W) per rimuovere il Parylene C dalle aree sensibili.
NOTA: La velocità di incisione di Parylene C in un pulitore al plasma isotropo a 200 W è di circa 90 nm/min. Viene eseguita una leggera incisione eccessiva per pulire ulteriormente le aree di rilevamento. Il fotoresist viene anche inciso durante il processo. Tuttavia, il suo spessore (2 μm) è molto più alto di quello del Parylene C. - Posizionare i substrati in un contenitore di vetro pieno di acetone all'interno del bagno ad ultrasuoni per 10 s per rimuovere completamente il fotoresist. Risciacquare i substrati con acetone, alcool isopropilico e acqua e asciugarli con azoto.
NOTA: L'uso della sonicazione invece di risciacquare semplicemente i substrati con acetone è fondamentale per prevenire il ripiegamento indesiderato e la ri-deposizione di frammenti di Parylene C sulla superficie delle aree sensibili.
7. Autoallineamento della sorgente e dello scarico con l'FG
- Depositare il fotoresist sui substrati utilizzando gli stessi parametri dei passaggi 4.1 e 4.2. Posizionare il dispositivo in un bromografo e posizionare sul substrato una maschera fotolitografica in plastica con semplici rettangoli neri che coprono completamente le aree del transistor. Esporre alla luce UV per 1 minuto sia dalla parte superiore che da quella inferiore e rimuovere con cura la maschera, avendo cura di ridurre al minimo i movimenti laterali della maschera sul substrato per evitare di graffiarla.
NOTA: Con l'esposizione bifacciale, le FG fungono da maschere fotolitografiche rispetto all'esposizione inferiore, mentre la presenza della maschera superiore assicura che solo il fotoresist presente sul canale dei transistor rimanga non esposto. - Sviluppare il fotoresist come descritto in precedenza nel passaggio 4.4.
8. Deposizione dell'oro, formazione del canale e modellazione delle sorgenti, degli scarichi e delle porte di controllo
- Pulire i substrati con un delicato trattamento al plasma (30 s a 30 W) per favorire l'adesione del metallo sul Parylene C e posizionarli sul supporto del substrato all'interno della camera a vuoto dell'evaporatore termico.
- Posizionare 30 mg di oro nel crogiolo, chiudere l'otturatore e pompare la camera di evaporazione fino a raggiungere 10-5 Torr. Aumentare la potenza dell'evaporatore fino a quando il crogiolo si illumina di rosso e attendere 30 s. Apri l'otturatore, aumenta la potenza al 40% (o fino a quando il crogiolo si illumina di bianco brillante), attendi 60 s, chiudi l'otturatore e abbassa l'alimentazione.
- Posizionare i substrati in un contenitore di acetone all'interno del bagno ad ultrasuoni per 10 s per sollevare il fotoresiste, rimuovendo così l'oro dal canale dei transistor. Risciacquare i substrati con acetone, alcool isopropilico e acqua e asciugarli con azoto. Depositare il fotoresist sui substrati utilizzando gli stessi parametri dei passaggi 4.1 e 4.2.
- Posizionare il dispositivo in un bromografo e posizionare sul substrato una maschera fotolitografica di plastica con le sorgenti, gli scarichi e il layout del cancello di controllo desiderati. Esporre alla luce UV per 1 minuto dall'alto e rimuovere con cura la maschera, avendo cura di ridurre al minimo i movimenti laterali della maschera sul substrato per evitare di graffiarlo.
- Sviluppare il fotoresist come descritto nel passaggio 4.4. Incidere l'oro esposto immergendolo nella soluzione di incisione dell'oro (fase 1.3) per 10 s, risciacquarlo con acqua deionizzata e asciugarlo con azoto. Ispezionare otticamente il substrato e rimuovere il fotoresist usando l'acetone. Risciacquare con alcool isopropilico e acqua deionizzata e asciugarlo con azoto.
9. Deposizione e attivazione del Parylene C per il rilevamento del pH
- Depositare il fotoresist sui substrati utilizzando gli stessi parametri dei passaggi 4.1 e 4.2.
- Posizionare il dispositivo in un bromografo e posizionare sul substrato una maschera fotolitografica di plastica con aperture corrispondenti alle aree di rilevamento del pH degli OMFET. Esporre alla luce UV per 1 minuto dall'alto e rimuovere con cura la maschera, avendo cura di ridurre al minimo i movimenti laterali della maschera sul substrato per evitare di graffiarlo.
- Sviluppare il fotoresist come descritto nel passaggio 4.4. Proteggere l'intero dispositivo, ad eccezione delle aree di rilevamento del pH, con nastro isolante in poliimmide (vedere la Tabella dei materiali). Depositare uno strato di 500 nm di Parylene C (corrispondente a 1 g di dimero di Parylene C) sul substrato utilizzando gli stessi parametri descritti al punto 5.1.
NOTA: lo spessore totale di Parylene C sulle aree di rilevamento del pH è di 650 nm. Non è richiesto alcun silano per questa deposizione. - Rimuovere con attenzione il nastro isolante in poliimmide. Esporre il substrato al plasma di ossigeno (5 min e 30 s a 200 W) per attivare il Parylene C sulle aree di rilevamento del pH degli OCFET.
NOTA: Il nastro isolante in poliimmide è qui necessario per limitare la deposizione di Parylene C. Infatti, un semplice decollo utilizzando il fotoresist non dà risultati positivi a causa della natura quasi priva di fori stenopeici del rivestimento conforme ottenuto con Parylene C. - Posizionare i substrati in un contenitore di acetone all'interno del bagno ad ultrasuoni per 10 s per rimuovere completamente il fotoresist. Risciacquare i substrati con acetone e alcool isopropilico (senza acqua) e asciugarli con azoto.
10. Deposizione di semiconduttori, posizionamento della camera di coltura e ritaglio finale del dispositivo dal PET
- Posizionare i substrati su una piastra calda a 50 °C. Gettare una goccia (1 μL) di soluzione di semiconduttore (fase 1.4) su ciascuna area del canale, coprire l'intero substrato con un coperchio e lasciarlo asciugare sotto un cappuccio chimico per 30 minuti.
- Preparare la camera di coltura stampando un anello di acrilonitrile butadiene stirene con un raggio interno di 15 mm, uno spessore di 1 mm e un'altezza di 7 mm con una stampante 3D. Incollare la camera di coltura sulla parte centrale del substrato utilizzando polidimetilsilossano (rapporto tra l'agente polimerizzante: 15% in peso). Estrarre il dispositivo dal PET manualmente o utilizzando una taglierina laser.
11. Caratterizzazione elettrica dei transistor
- Caratterizzare ogni transistor utilizzando un sourcemeter18,19,20,21 (vedi la Tabella dei Materiali).
NOTA: sia le caratteristiche di uscita che quelle di ingresso devono essere misurate per estrapolare i parametri dei transistor (principalmente la mobilità delle portanti, la tensione di soglia, il rapporto ION/IOFF e la pendenza della sottosoglia).
Representative Results
Il potenziale del MOA è stato convalidato qui sia per le registrazioni dell'attività elettrica che per il monitoraggio dell'attività metabolica. La stima precisa delle capacità del dispositivo di rilevare potenziali d'azione extracellulari si è basata su una caratterizzazione approfondita con colture di cardiomiociti di ratto (in particolare nei cardiomiociti primari di ratto misurati a 8 giorni in vitro [DIV])18. La Figura 3A mostra un MOA completo con 16 OMFET. L'inserto superiore mostra un esempio di una coltura di cardiomiociti di ratto confluente che aderisce alla superficie del MOA. Per evidenziare la loro salute, le cellule sono state immunocolorate per la proteina sarcomerica, la tropomiosina, dopo la sessione di registrazione. L'inserto inferiore mostra un singolo segnale cardiomiocitario misurato con un OCMFET.
È interessante notare che il dispositivo potrebbe rilevare l'attività elettrica spontanea e l'attività indotta dalla somministrazione di diverse sostanze chimiche, come mostrato nella Figura 3B. Questa convalida è stata fondamentale per dimostrare la fattibilità dell'utilizzo di questo approccio per l'interfacciamento elettrogenico delle celle. A causa della configurazione dell'array, il MOA ha anche permesso la ricostruzione della velocità di propagazione del segnale cardiaco, dimostrando così l'idoneità del sistema per lo studio delle reti cellulari (Figura 3C). Per un'ulteriore validazione per determinare l'effettivo limite di rilevazione del dispositivo, il MOA è stato testato anche con neuroni striatali (21 DIV)18, con risultati interessanti in termini di ampiezza del segnale e affidabilità delle registrazioni. Come si vede nella Figura 3D, l'OCMFET potrebbe amplificare i potenziali del campo neuronale con notevole stabilità, mostrando rapporti segnale-rumore (SNRS) fino a 3,2 (nello stesso intervallo di quello degli SNR ottenuti con MEA standard25). La configurazione della registrazione consisteva in un'elettronica multicanale personalizzata per la polarizzazione del transistor e la lettura e il condizionamento del segnale. Ogni canale per la registrazione elettrica ha un primo stadio costituito da un convertitore I/V con un resistore di feedback da 1 MΩ e un filtro passa-banda da 150 Hz-1,3 kHz con un guadagno di tensione di 110. Per tutte le misurazioni presentate, i transistor sono stati polarizzati con VDS = VGS = -1 V. La conversione A/D e la visualizzazione e memorizzazione dei dati sono state eseguite utilizzando una scheda di acquisizione dati (vedi tabella dei materiali). Tutte le sessioni di misurazione sono state condotte all'interno di una gabbia di Faraday per ridurre al minimo il rumore elettrico e ambientale sul sistema.
Come accennato in precedenza, sfruttando la semplice funzionalizzazione fisica presentata nel protocollo, è stato possibile preparare sensori di pH altamente sensibili con una risposta supernernstiana. Grazie all'approccio di fabbricazione presentato, questi dispositivi di pH potrebbero essere integrati in un MOA e utilizzati per monitorare le lievi variazioni di pH indotte dall'attività metabolica dei neuroni primari del ratto ippocampale26. In particolare, come mostrato nella Figura 4, solo uno dei due OMFET dedicati al rilevamento a bassa frequenza è stato funzionalizzato selettivamente per dimostrare la fattibilità dell'approccio. Questa funzionalizzazione selettiva ha permesso di valutare la risposta dei due OMFET alle variazioni metaboliche indotte chimicamente: in particolare, un elevato stato metabolico può essere ottenuto utilizzando la bicucullina (BIC), un inibitore dei recettori GABA A27, mentre un basso stato metabolico può essere indotto dall'aggiunta di tetrodotossina (TTX), che alla fine causa la morte cellulare28 . La configurazione della registrazione consisteva nella stessa elettronica multicanale personalizzata utilizzata per le misurazioni elettroniche dell'attività.
A differenza del caso precedente, sono stati utilizzati due canali dedicati per registrare le lente variazioni indotte dall'attività metabolica cellulare. Ogni canale era costituito da un semplice circuito composto da due blocchi principali: un convertitore I/V con un resistore di feedback da 1 MΩ e un filtro passa-basso con una frequenza di cut-off di 10 Hz. I transistor sono stati polarizzati con VDS = VGS = -1 V, e tutte le misurazioni sono state effettuate all'interno di una gabbia di Faraday per minimizzare l'impatto del rumore esterno sulle registrazioni (questo è un aspetto particolarmente importante considerando le basse fluttuazioni di corrente indotte dall'attività metabolica cellulare). Durante gli esperimenti, le colture sono state mantenute in un terreno di coltura a basso buffer e l'intero sistema è stato collocato in un ambiente controllato (37 °C e un flusso continuo di CO2/aria). Come previsto, solo la corrente dell'OCMFET sensibile al pH potrebbe essere modulata con l'aggiunta di 25 μM BIC. Ciò è stato ulteriormente confermato dall'induzione della variazione attuale dalla corrispondente variazione dell'attività metabolica cellulare.
Lo stesso esperimento è stato ripetuto dopo l'aggiunta di 10 μM TTX, che ha comportato un graduale rallentamento del metabolismo cellulare. A seguito dell'aggiunta del TTX, né l'OCMFET sensibile al pH né quello insensibile al pH hanno mostrato alcuna risposta, dimostrando così l'efficacia dell'approccio. Questi risultati dimostrano l'efficacia della funzionalizzazione proposta e la sua relativa stabilità fino a 2 settimane. Un'importante conclusione che si può trarre dagli esperimenti proposti (sia l'attività elettrica che l'attività metabolica) è che è possibile preparare diversi tipi di sensori funzionalizzando selettivamente diversi OCFET all'interno della stessa area di coltivazione. Questo aspetto rappresenta un risultato non banale nel biosensing per applicazioni cellulari perché essere in grado di monitorare diversi parametri all'interno della stessa coltura cellulare è fondamentale per una migliore caratterizzazione della complessità di quei sistemi biologici.
Figura 1: Vista dall'alto di un MOA a 16 canali per il monitoraggio metabolico ed elettrico delle cellule elettroattive. Barra della scala = 1 cm. Abbreviazioni: OCMFET = transistor a effetto di campo modulati con carica organica; FG = cancello galleggiante; S/D = sorgente/scarico; MOA = matrice micro OCMFET. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Principali fasi di fabbricazione di un MOA per il monitoraggio metabolico ed elettrico delle cellule elettroattive. (A e B) Il film ti evaporato è modellato utilizzando un processo fotolitografico standard per preparare il cancello galleggiante degli OMFET. C) Deposizione di 15 nm di Parylene C. Questo strato, insieme all'ossido di Ti nativo, funge da dielettrico gate dei transistor. (D ed E) Lo strato di Parylene C è modellato utilizzando il trattamento con ossigeno plasmatico. Uno strato fotoresiste modellato viene utilizzato per esporre selettivamente le aree di rilevamento per le registrazioni elettriche e i contatti posteriori del cancello flottante. (F) Modellazione dei contatti Au top, vale a dire la sorgente, lo scarico, il cancello di controllo e il contatto posteriore del cancello galleggiante. Una tecnica di autoallineamento viene utilizzata per migliorare le prestazioni elettriche del dispositivo. (G-I) Deposizione del secondo strato di Parylene C sull'area di rilevamento degli OCFET per il monitoraggio dell'attività metabolica. Dopo l'esposizione al plasma di ossigeno, questo strato agirà come membrana sensibile al pH (J). (K) Sezione trasversale di un MOA completo (con materiali) dopo la deposizione del semiconduttore organico (TIPS Pentacene) e il posizionamento della camera di coltura. Abbreviazioni: OCMFET = transistor a effetto di campo modulati con carica organica; FG = cancello galleggiante; S/D = sorgente/scarico; MOA = array micro OCMFET; CG = cancello di controllo; PET = polietilene tereftalato; Par C = Parylene C; TIPS = 6,13-bis(triisopropylsilylethynyl) pentacene; ABS = acrilonitrile butadiene stirene. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Registrazioni dell'attività elettrica cellulare con un MOA. (A) Una coltura confluente di cardiomiociti di ratto (8 DIV) aderenti alla superficie di un MOA, fissata dopo una sessione di registrazione e immunocolorata per la proteina sarcomerica, la tropomiosina (inserto superiore). Inserto inferiore: esempio di un singolo segnale cardiomiocitario misurato con un OCMFET. Barra della scala = 150 μm. (B) Sintonizzazione chimica dell'attività elettrica di una coltura di cardiomiociti. L'accelerazione dell'attività è il risultato dell'aggiunta di 100 mM di noradrenalina, mentre la soppressione è risultata dall'aggiunta di 100 mM verapamil. A sinistra: modulazione di frequenza battente; a destra: statistiche su 5 OCMFET-deviazione media e standard: spike-count su 4 min di attività basale (129 ± 4,6), noradrenalina-mediata (280 ± 28,6) e verapamil-mediata (15 ± 1,9). (C) Ricostruzione della propagazione di un segnale cardiaco. A destra: trama raster dell'attività spontanea della coltura che indica la propagazione del segnale dal sito 14 al sito 41 (a destra). (D) Potenziali d'azione delle cellule striatali dell'embrione di ratto (21 DIV). Questa cifra è stata modificata da 18. Abbreviazioni: OCMFET = transistor ad effetto di campo modulato con carica organica; MOA = array micro OCMFET; NE = noradrenalina; VER = verapamil; DIV = giorni in vitro. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Registrazioni dell'attività metabolica con un MOA. Risposta dei canali (A) sensibili al pH e (B) insensibili al pH di un MOA all'aggiunta di 25 μM BIC prima e dopo l'aggiunta di 10 μM di TTX. Dopo l'aggiunta di TTX, il comportamento del canale sensibile al pH diventa simile a quello di quello insensibile al pH. In particolare, nessuna variazione di corrente può essere osservata dopo l'aggiunta di BIC a causa della morte cellulare indotta da TTX. (C) MOA per le registrazioni dell'attività metabolica. Gli OCMFET sensibili al pH e quelli sensibili al pH sono delineati rispettivamente in verde e rosso. Inserto: neuroni ippocampali sani coltivati sul dispositivo dopo 15 DIV. Barra di scala = 50 μm. Questa cifra è stata modificata da 26. Abbreviazioni: OCMFET = transistor ad effetto di campo modulato con carica organica; MOA = array micro OCMFET; BIC = bicucullina; TTX = tetrodotossina; DIV = giorni in vitro. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Discussion
A differenza dei metodi precedenti per la fabbricazione di OCMFET per applicazioni cellulari18,29, il metodo proposto è specificamente progettato per preparare MOA in grado di rilevare contemporaneamente l'attività cellulare elettrica e metabolica. Inoltre, questo approccio per ottenere la sensibilità al pH ha il vantaggio di essere compatibile con i protocolli di fabbricazione standard e non comporta alcuna modifica chimica dell'area di rilevamento (questo aspetto garantisce la biocompatibilità dell'intero dispositivo). La sensibilità al pH è ottenuta utilizzando lo stesso materiale utilizzato come dielettrico di gate (cioè il Parylene C biocompatibile), rendendo questo approccio veloce e riproducibile.
Il risultato finale di questo approccio è uno strumento organico flessibile, trasparente, a basso costo e multisensente per applicazioni cellulari in vitro . Il fatto che ciò possa essere ottenuto utilizzando una singola struttura a transistor e una semplice modifica fisica dell'area di rilevamento si aggiunge ai vantaggi offerti dall'uso di materiali e metodi elettronici organici. Inoltre, poiché il principio di trasduzione dell'OCMFET non dipende strettamente dal semiconduttore specifico o dal materiale FG, l'intero processo può essere modificato e potenziato a seconda dell'applicazione specifica.
Un aspetto critico della tecnica proposta è legato alla riproducibilità della tecnica di attivazione del plasma. Per ottenere risultati coerenti, è necessario controllare sia lo spessore del Parylene C che la sua velocità di incisione. La calibrazione frequente del processo di deposizione di Parylene C e del detergente al plasma è assolutamente necessaria. Altri aspetti critici, che contribuiscono anche alla riproducibilità del processo, sono l'attenta manipolazione del dispositivo e la deposizione del semiconduttore organico. Qui è stata utilizzata una semplice tecnica di drop-casting, che pone intrinsecamente limiti di riproducibilità. Per ridurre al minimo questi problemi, come descritto nel passaggio 10.1 del protocollo, è necessario utilizzare ogni volta la stessa quantità di soluzione a semiconduttore e l'evaporazione del solvente deve essere standardizzata il più possibile. Mantenere una temperatura costante utilizzando una piastra calda e coprendo il substrato dopo ogni deposizione di goccioline aiuterà a rallentare il processo di evaporazione. Per ridurre ulteriormente questo problema, la tecnica di deposizione (ad esempio, utilizzando un metodo di stampa a getto d'inchiostro) potrebbe essere commutata30.
Una limitazione del protocollo proposto deriva dalla natura della funzionalizzazione dell'OCMFET per il rilevamento del pH. La stabilità dei sensori di pH è limitata a poche settimane26. Tuttavia, la finestra di stabilità dell'approccio proposto è sufficientemente ampia da coprire i tempi di incubazione standard necessari per la crescita della coltura neuronale (2-3 settimane). Altri tipi di funzionalizzazione dell'area di rilevamento dovrebbero essere considerati per esperimenti più lunghi. Il protocollo di fabbricazione utilizza un contatto posteriore dedicato, che consente l'accesso elettrico ai FG. Questo contatto, che viene lasciato fluttuare durante il normale funzionamento del dispositivo, può essere sfruttato per la caratterizzazione elettrica del dispositivo e la funzionalizzazione delle aree di rilevamento utilizzando diverse tecniche (ad esempio, elettrodeposizione).
Questa procedura rappresenta un modo conveniente per preparare un dispositivo multi-sensing per applicazioni cellulari senza la necessità di materiali espansivi o strutture per camere bianche. Nonostante le limitazioni di prestazioni e stabilità dovute all'impiego di un semiconduttore organico e alla funzionalizzazione fisica (non chimica) dell'area di rilevamento, approcci simili potrebbero essere utilizzati per preparare sensori e biosensori a basso costo (e potenzialmente usa e getta), meccanicamente flessibili e otticamente trasparenti, che possono fornire ai ricercatori in biologia cellulare, ingegneria tissutale e neuroscienze nuovi strumenti specializzati per lo studio dei sistemi cellulari in vitro.
Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.
Acknowledgments
Gli autori riconoscono il finanziamento del programma di ricerca e innovazione Horizon 2020 dell'Unione europea nell'ambito della convenzione di sovvenzione n. 882897-Search&Rescue e del progetto PON "TEX-STYLE" ARS01_00996, PNR 2015-2020.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | Sigma Aldrich | 440159 | |
| 3D printer Makerbot Replicator 2x | Makerbot | https://www.makerbot.gr/. Estimated price: 2k-3k euros. | |
| ABS filament | |||
| Anisole | Sigma Aldrich | 296295 | |
| Bromograph model Hellas | Bungard | https://www.bungard.de/. Estimated price: 1k-2k euros. | |
| Gold | Local seller | ||
| Hydrofluoric acid | Sigma Aldrich | 695068 | |
| Iodine | Sigma Aldrich | 207772 | |
| Kapton tape | polyimide insulation tape | ||
| Laser cutter VLS2.30 | Universal Laser Systems | https://www.ulsinc.com/it. Estimated price: 20k euros. | |
| Multichannel Systems acquisition board | www.multichannelsystems.com | ||
| NaOH pellets | Sigma Aldrich | 567530 | |
| Parylene C dimer | SCS special coating systems coating | ||
| PDMS Silgard 184 | Sigma Aldrich | 761036 | |
| PDS 2010 LABCOATER 2 Parylene Deposition System | SCS special coating systems | https://scscoatings.com/. Estimated price: 50k euros | |
| PET film biaxially oriented (thickness 0.25 mm) | Goodfellow | ES301450 | |
| Petri dishes | |||
| Plasma cleaner Gambetti "Tucano" | Gambetti | https://www.gambetti.it/. Estimated price: 20k euros. | |
| Positive photoresist AZ1518 | MicroChemicals | ||
| Potassium iodide KI | Sigma Aldrich | 221945 | |
| Source Meter 2636 | Keithley | https://it.farnell.com/. Estimated price: 18k euros | |
| Spin coater unit | Ossila | https://www.ossila.com/. Estimated price: 2.5k euros. | |
| Stereoscopic microscope SMZ745T | Nikon | https://www.microscope.healthcare.nikon. com/. Estimated price: 2k-3k euros. |
|
| Thermal evaporator unit | |||
| TIPS pentacene (6,13-Bis(triisopropylsilylethynyl)-pentacene) | Sigma Aldrich | 716006 | |
| Titanium wire | Goodfellow | TI005129 | |
| Ultrasonic bath | Falc Instruments | https://www.falcinstruments.it/. Estimated price: 1k euro. |
References
- Hubel, D. H. Tungsten microelectrode for recording from single units. Science. 125 (3247), 549-550 (1957).
- Verzeano, M., Negishi, K., Angeles, L. Neuronal activity in cortical and thalamic networks. A study with multiple microelectrodes. Journal of General Physiology. 43 (6), 177-195 (1960).
- Thomas, C. A. Jr, Springer, P. A., Loeb, G. E., Berwald-Netter, Y., Okun, L. M. A miniature microelectrode array to monitor the bioelectric activity of cultured cells. Experimental Cell Research. 74 (1), 61-66 (1972).
- Grattarola, M., Martinoia, S. Modeling the neuron-microtransducer junction: from extracellular to patch recording. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 40 (1), 35-41 (1993).
- Wallace, K., Strickland, J. D., Valdivia, P., Mundy, W. R., Shafer, T. J. A multiplexed assay for determination of neurotoxicant effects on spontaneous network activity and viability from microelectrode arrays. NeuroToxicology. 49, 79-85 (2015).
- Bergveld, P. Development, operation, and application of the tool for electrophysiology. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 19 (5), 342-351 (1972).
- Bergveld, P., Wiersma, J., Meertens, H. Extracellular potential recordings by means of a field effect transistor without gate metal, called OSFET. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 23 (2), 136-144 (1976).
- Fromherz, P., Offenhausser, A., Vetter, T., Weis, J. A neuron-silicon junction: a Retzius cell of the leech on an insulated-gate field-effect transistor. Science. 252 (5010), 1290-1293 (1991).
- Martinoia, S., et al. Development of ISFET array-based microsystems for bioelectrochemical measurements of cell populations. Biosensors and Bioelectronics. 16 (9-12), 1043-1050 (2001).
- Heer, F., et al. CMOS microelectrode array for the monitoring of electrogenic cells. Biosensors and Bioelectronics. 20 (2), 358-366 (2004).
- Berdondini, L., et al. Active pixel sensor array for high spatio-temporal resolution electrophysiological recordings from single cell to large scale neuronal networks. Lab on a Chip. 9 (18), 2644-2651 (2009).
- Maccione, A., et al. Multiscale functional connectivity estimation on low-density neuronal cultures recorded by high-density CMOS micro electrode arrays. Journal of Neuroscience Methods. 207 (2), 161-171 (2012).
- Kibler, A. B., Jamieson, B. G., Durand, D. M. A high aspect ratio microelectrode array for mapping neural activity in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 204 (2), 296-305 (2012).
- Frega, M., Tedesco, M., Massobrio, P., Pesce, M., Martinoia, S. Network dynamics of 3D engineered neuronal cultures: a new experimental model for in-vitro electrophysiology. Scientific Reports. 4, 5489 (2014).
- Zuo, L., Yu, S., Briggs, C. A., Kantor, S., Pan, J. Y. Design and fabrication of a three-dimensional multi-electrode array for neuron electrophysiology. Journal of Biomechanical Engineering. 139 (12), (2017).
- Spanu, A., et al. A three-dimensional micro-electrode array for in-vitro neuronal interfacing. Journal of Neural Engineering. 17 (3), 036033 (2020).
- Spanu, A., Martines, L., Bonfiglio, A. Interfacing cells with organic transistors: a review of in vitro and in vivo applications. Lab on a Chip. 21 (5), 795-820 (2021).
- Spanu, A., et al. An organic transistor-based system for reference-less electrophysiological monitoring of excitable cells. Scientific Reports. 5, 8807 (2015).
- Viola, F. A., Spanu, A., Ricci, P. C., Bonfiglio, A., Cosseddu, P. Ultrathin, flexible and multimodal tactile sensors based on organic field-effect transistors. Scientific Reports. 8, 8073 (2018).
- Napoli, C., et al. Electronic detection of DNA hybridization by coupling organic field-effect transistor-based sensors and hairpin-shaped probes. Sensors. 18 (4), 990 (2018).
- Spanu, A., et al. A reference-less pH sensor based on an organic field effect transistor with tunable sensitivity. Organic Electronics. 48, 188-193 (2017).
- Lundgaard, I., et al. Direct neuronal glucose uptake heralds activity-dependent increases in cerebral metabolism. Nature Communications. 6, 6807 (2015).
- Zhang, Y. S., et al. Multisensor-integrated organs-on-chips platform for automated and continual in situ monitoring of organoid behaviors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), 2293-2302 (2017).
- Yu, H., et al. A novel design of multifunctional integrated cell-based biosensors for simultaneously detecting cell acidification and extracellular potential. Biosensors and Bioelectronics. 24 (5), 1462-1468 (2009).
- Maccione, A., et al. A novel algorithm for precise identification of spikes in extracellularly recorded neuronal signals. Journal of Neuroscience Methods. 177 (1), 241-249 (2009).
- Spanu, A., Tedesco, M. T., Martines, L., Martinoia, S., Bonfiglio, A. An organic neurophysiological tool for neuronal metabolic activity monitoring. APL Bioengineering. 2 (4), 046105 (2018).
- Díaz-García, C. M., et al. Neuronal stimulation triggers neuronal glycolysis and not lactate uptake. Cell Metabolism. 26 (2), 361-374 (2017).
- Xie, Y., Dengler, K., Zacharias, E., Wilffert, B., Tegtmeier, F. Effects of the sodium channel blocker tetrodotoxin (TTX) on cellular ion homeostasis in rat brain subjected to complete ischemia. Brain Research. 652 (2), 216-224 (1994).
- Caboni, A., Orgiu, E., Barbaro, M., Bonfiglio, A. Flexible organic thin-film transistors for pH monitoring. IEEE Sensors Journal. 9 (12), 1963-1970 (2009).
- Fraboni, B., Bonfiglio, A., Basiricò, L. Inkjet printing of transparent, flexible, organic transistors. Thin Solid Films. 520, 1291-1294 (2011).
