Summary
Här presenterar vi tillverkningsprotokollet för en organisk laddningsmodulerad fälteffekttransistor (OCMFET)-baserad enhet för in vitro cellulär interfacing. Enheten, som kallas en mikro OCMFET-matris, är en flexibel, billig och referensfri enhet, vilket möjliggör övervakning av elektriska och metaboliska aktiviteter i elektroaktiva cellkulturer.
Abstract
Modern elektrofysiologi har ständigt drivits av den parallella utvecklingen av alltmer sofistikerade verktyg och material. I sin tur har upptäckter på detta område drivit tekniska framsteg i en fram och tillbaka-process som slutligen bestämde de imponerande prestationerna under de senaste 50 åren. De mest använda enheterna som används för cellulär samverkan (nämligen mikroelektrodmatriser och mikroelektroniska enheter baserade på transistorer) uppvisar dock fortfarande flera begränsningar som hög kostnad, materialens styvhet och närvaron av en extern referenselektrod. För att delvis övervinna dessa problem har det skett en utveckling inom ett nytt vetenskapligt område som kallas organisk bioelektronik, vilket resulterat i fördelar som lägre kostnad, bekvämare material och innovativa tillverkningstekniker.
Flera intressanta nya organiska enheter har föreslagits under det senaste decenniet för att bekvämt samverka med cellkulturer. Detta dokument presenterar protokollet för tillverkning av enheter för cellulära interfacing baserat på den organiska laddningsmodulerade fält-effekt transistor (OCMFET). Dessa enheter, som kallas mikro OCMFET-matriser (MOAs), kombinerar fördelarna med organisk elektronik och de speciella egenskaperna hos OCMFET för att förbereda transparenta, flexibla och referensfria verktyg med vilka det är möjligt att övervaka både de elektriska och metaboliska aktiviteterna hos kardiomyocyter och nervceller in vitro, vilket möjliggör en multiparametrisk utvärdering av elektrogena cellmodeller.
Introduction
In vivo-övervakning av elektroaktiva celler, såsom nervceller och kardiomyocyter, representerar ett giltigt och kraftfullt tillvägagångssätt i grundläggande forskningsapplikationer för den mänskliga hjärnan, funktionella anslutningsstudier, farmakologi och toxikologi. De verktyg som vanligtvis används för sådana studier är huvudsakligen baserade på mikroelektrodmatriser (MEA) 1,2,3,4,5 och allt effektivare fälteffektenheter (FEDs)6,7,8,9,10,11,12 . Dessa två familjer av enheter tillåter realtidsövervakning och stimulering av den elektriska aktiviteten hos nervceller och kardiomyocyter och kännetecknas vanligtvis av robusthet, användarvänlighet och tillförlitlighet. Dessa funktioner gör MEA och FEDs till guldstandarden för elektrofysiologiska applikationer, som för närvarande används för att samverka med vanliga cellulära kulturer, organotypiska hjärnskivor och tredimensionella organoider13,14,15,16. Trots deras utbredda användning och deras imponerande egenskaper uppvisar MEA och FEDs vissa begränsningar som hög kostnad, materialens styvhet och närvaron av en vanligtvis skrymmande referenselektrod, som måste placeras i mätvätskemiljön och är nödvändig för korrekt drift av enheterna.
För att utforska alternativa lösningar för cellulär samverkan har mycket arbete gjorts under det senaste decenniet i studier av elektroniska enheter baserade på organiska material och innovativa tillverkningstekniker17. Bland de flera organiska enheter som studerats för att ta itu med de ovannämnda begränsningarna har en märklig organisk transistor som kallas OCMFET nyligen föreslagits som ett giltigt alternativ till MEA och FEDs18. Förutom de standardfunktioner som erbjuds av den organiska elektroniktekniken, såsom billiga material och tillverkningstekniker, optimala mekaniska och kemiska egenskaper, optisk transparens och biokompatibilitet, erbjuder OCMFET också en ultrahög laddningskänslighet (på grund av sin dubbelportade struktur) utan behov av en extern referenselektrod. Dessutom har denna organiska sensor den anmärkningsvärda förmågan att känna av olika analyt/fysiska parametrar, beroende på den specifika funktionaliseringen av dess avkänningsområde, som är separerat från transistorområdet19,20. Alla dessa funktioner kan bekvämt utnyttjas för förvärv av olika parametrar inom en cellulär kultur. I synnerhet, förutom att kunna upptäcka den neuronala / hjärt elektriska aktiviteten, är det också möjligt att utnyttja den ultrahöga pH känsligheten som erbjuds av ocmfET: s märkliga dubbel-gated struktur genom att använda en enkel fysisk funktionalisering21 för att tillförlitligt övervaka de små lokala pH-variationer som orsakas av cellulär metabolisk aktivitet.
Vid in vitro-cellbiosensing är övervakningen av cellulär metabolisk aktivitet en kraftfull indikator på kulturens tillstånd och kan användas för att bedöma det cellulära svaret på olika stimuli, såsom läkemedelsadministration och elektrisk stimulering22,23. Dessutom, i det specifika fallet med neurala applikationer, övervakning av både elektriska och metabola aktiviteter är av stort intresse, särskilt inom farmakologi och toxikologi24. Med avsikten att bekvämt ta itu med kraven på modern in vitro elektrofysiologi samtidigt som den erbjuder alla fördelar med OCMFET, har en enhet som heter Micro OCMFET Array (MOA) nyligen introducerats. MOA är en OCMFET-baserad matris med specialiserade avkänningsområden speciellt utformade för in vitro cellulär interfacing, vilket möjliggör multiparametrisk analys av elektrogena celler kulturer. I synnerhet har två MOA-kanaler större avkänningsområden för att maximera sin känslighet och kan selektivt funktionaliseras för att övervaka specifika parametrar av intresse, till exempel pH-variationerna i odlingsmediet. De andra OCMFETs i strukturen fungerar som extracellulära elektriska aktivitetssensorer. Figur 1 visar strukturen hos en 16-kanalig MOA. Denna förmåga, i kombination med avsaknaden av en extern referenselektrod, gör MOA till ett mycket intressant verktyg för in vitro-applikationer. Detta arbete presenterar steg-för-steg tillverkning protokollet av en multisensing MOA för in vitro detektion av elektriska och metabola aktiviteter av nervceller och kardiomyocyter. Figur 2 visar de viktigaste tillverkningsstegen, de material som används och enhetens struktur.
Protocol
Alla tillämpliga internationella, nationella och/eller institutionella riktlinjer för vård och användning av djur följdes. Alla ansträngningar gjordes för att minska antalet djur för projektet och för att minimera deras lidande.
1. Förberedelse av utvecklingslösningen, etsningslösningarna, den organiska halvledarlösningen och de fotolitografiska maskerna
- Förbered utvecklingslösningen genom att späda NaOH pellets i avjoniserat vatten med en koncentration av 175 mM.
OBS: Detta är en exoterm reaktion. Om en plastbehållare används, fortsätt att omröra behållaren tills alla pellets är helt upplösta. - Förbered titanetsningslösningen genom att späda fluorvätesyra (HF) i avjoniserat vatten (1 del av koncentrerat 48% HF, 49 delar avjoniserat vatten).
VARNING: Fluorvätesyra kan lätt tränga in i huden och orsaka allvarliga skador på djupa vävnadslager. Snabb neutralisering av HF är nödvändig för att förhindra vävnadsförstörelse, som kan fortsätta i dagar och leda till allvarlig skada eller till och med död. Riskerna med HF beror på koncentrationen och varaktigheten av kontakten med syran. Använd endast under en rökhuv med en ansiktssköld. Dubbel gloving rekommenderas också starkt. - Förbered guldetsningslösningen genom att blanda jod, kaliumjodid och avjoniserat vatten (för 250 g lösning, använd 200 ml avjoniserat vatten, 20 g KI, 5 g I2). Rör om lösningen i rumstemperatur i 1 h och låt den vila över natten före användning.
- Förbered halvledarlösningen genom att lösa upp 6,13-bis (triisopropylsilylethynyl) pentacen (TIPS Pentacene) i anisole (1% i vikt) och försiktigt röra om i 2 h på en kokplatta vid 80 °C.
OBS: Fortsätt att omröra denna lösning. Använd bärnstensfärgade glasflaskor och/eller förvara dem i svagt ljus. - Förbered önskad fotolitografisk maskuppsättning med en vektorgrafikprogramvara. Förbered 5 masker för hela processen: masken för mönstra av de flytande grindarna (FGs); Masken för öppnandet av vias och avkänningsområdena för de elektrofysiologiska inspelningarna. Masken för självjusteringsprocessen. Masken för mönstra av källan, dräneringen och kontrollportens toppkontakt. och masken för plasmaaktivering av pH-kanalerna.
OBS: Beroende på den nödvändiga upplösningen och den specifika fotolitografiska inställningen kan olika typer av masker användas. När det gäller de föreslagna anordningarna (som har en maximal sidoupplösning på 40 μm) har enkla flexibla plastmasker köpts i en lokal fotokopibutik.
2. Val och beredning av substrat
- Skär en 6 x 6 cm2 kvadrat av 250 μm polyetenteeftalat (PET) från ett orört PET-ark.
OBS: Börja med ett något större substrat än den slutliga enheten för att ha tillräckligt stora marginaler för att möjliggöra manipulering med vanliga labb pincett utan att skada den. - Inspektera substratet med ett optiskt mikroskop för att utesluta närvaron av djupa spår och repor. Välj noggrant de mindre repiga substraten eftersom större brister kan leda till att den slutliga enheten misslyckas.
- Skölj PET-substraten med aceton, isopropylalkohol och avjoniserat vatten (i denna ordning) och torka dem med hjälp av kväveströmmar. Förvara underlagen i rena petriskålar/behållare av ren plast.
3. FG: titandeposition
- Förrengöra substratet med plasmasyre (30 s vid 100 W) och placera dem på substrathållaren inuti den termiska förångarens vakuumkammare.
- Placera 60 mg titan i degeln, stäng slutaren och pumpa ner avdunstningskammaren tills den når en vakuumnivå som är lägre än 10-6 Torr. Öka förångarens kraft tills degeln lyser rött och vänta i 30 s. Öppna slutaren, öka effekten till 60% (eller tills degeln lyser ljusvitt) och vänta i 60 s. Stäng slutaren och stäng av strömmen.
- Ta bort substraten från förångaren; rengör dem med aceton, isopropylalkohol och avjoniserat vatten; och torka dem med hjälp av strömmar av kväve. Utför en andra syreplasmabehandling (60 s vid 200 W) för att oxidera titanytan något.
4. FG-mönstrar
- Placera ett substrat i taget på spinnkaven som placeras inuti en rökhuv. Sätt in 4 ml fotoresist på substratet med hjälp av en engångsplastpipett. Använd följande spinnbeläggningsparametrar för att erhålla ett 2 μm tjockt fotoresistskikt: spinnhastighet: 3000 rpm; spinntid: 45 s; accelerationstid: 0,5 s; retardationstid: 0,5 s.
- Mjukbaka fotoresisten genom att placera substratet på en kokplatta (70 °C i 5 min). Förvara substratet i en aluminiumfolielindad Petri-skål/plastbehållare för att undvika direkt ljusexponering.
OBS: Undvik den föreslagna baktemperaturen (100 °C i 50 s) för att förhindra substratdeformation. Att baka vid en lägre temperatur under en längre tid säkerställer dock goda resultat. - Placera enheten i en bromograf och placera den fotolitografiska plastmasken med önskad FG-layout på substratet. Exponera för ultraviolett (UV) ljus från toppen i 1 min och ta försiktigt bort masken, var noga med att minimera maskens laterala rörelser över substratet för att undvika repor.
- Doppa substratet i 5 s i en glasbehållare fylld med utvecklingslösningen (steg 1.1). Skölj den snabbt i avjoniserat vatten och torka den under kväve. Använd ett optiskt mikroskop för att leta efter underutvecklade/överutvecklade fläckar i substratet. Upprepa nedsänkningen av substratet i utvecklingen av lösningen vid underutveckling.
- Etsa den exponerade titanen genom att sänka den i titanetsningslösningen (steg 1.2) i 15 s, skölj den med avjoniserat vatten och torka den med kväve. Inspektera substratet optiskt och ta bort fotoresisten med aceton. Skölj substratet med isopropylalkohol och avjoniserat vatten och torka det med kväve.
5. Gate dielektrisk deposition
- Förbered parylenbeläggningens nedfallskammare genom att fördela 2 ml av vidhäftningspromotorn (silan - 3-(trimetoxisilyl)propylmetarylat) på deponeringskammarens väggar med hjälp av en laboratorieservett. Placera 300 mg Parylen C-dimer (motsvarande en slutlig tjocklek på 150 nm) på Parylen-beläggeren. Ställ in det lägre tryckvärdet på 7 mbar och det högre tryckvärdet till 10 mbar. Efter nedfallet rengör du substraten med aceton, isopropylalkohol och avjoniserat vatten och torka dem med kväve.
6. Öppnande av OCMFET:s avkänningsområden för registrering och bildning av vias för elektrisk aktivitet för att få tillgång till FGs baksida
- Sätt in fotoresisten på substraten med samma parametrar i steg 4.1 och 4.2.
- Placera anordningen i en bromograf och placera den fotolitografiska plastmasken på substratet för vias (cirkulära öppningar med en diameter av 50 μm över avkänningsområdena och 100 x 100 μm2 öppningar över FGs bort från avkänningsområdena (kallas reservkontakt av FGs i figur 1 och figur 2)) under ett stereoskopiskt mikroskop för att förbättra inriktningsprecisionen. Exponera för UV-ljus från toppen i 1 min och ta försiktigt bort masken, var noga med att minimera maskens laterala rörelser över substratet för att undvika repor.
OBS: Vias på sidan av FGs bort från avkänningsområdet (visas som tillbakakontakt av FGs i figur 1 och figur 2) är nödvändiga för kontakt under karakteriseringen av transistorn. Dessutom kan det vara mycket användbart för olika typer av funktionaliseringar att ha elektrisk tillgång till generaldirektoraten (t.ex. elektrodposition). - Utveckla fotoresisten som tidigare beskrivits i steg 4.4. Exponera substratet med den mönstrade fotoresisten (som fungerar som en mask här) för syreplasma (180 s vid 200 W) för att avlägsna Parylen C från avkänningsområdena.
OBS: Etsningshastigheten för Parylen C i en isotrop plasmarengörare vid 200 W är cirka 90 nm/min. En liten överetsning utförs för att ytterligare rengöra avkänningsområdena. Fotoresisten är också etsad under processen. Dess tjocklek (2 μm) är dock mycket högre än parylen C. - Placera substraten i en glasbehållare fylld med aceton inuti ultraljudsbadet i 10 s för att ta bort fotoresisten helt. Skölj substraten med aceton, isopropylalkohol och vatten och torka dem med kväve.
OBS: Att använda ultraljudsbehandling istället för att bara skölja substrat med aceton är avgörande för att förhindra oönskad vikning och ompositionering av Parylen C fragment på ytan av avkänningsområdena.
7. Självjustering av källa och avlopp med FG
- Sätt in fotoresisten på substraten med samma parametrar i steg 4.1 och 4.2. Placera enheten i en bromograf och placera på substratet en fotolitografisk plastmask med enkla svarta rektanglar som helt täcker transistorns områden. Exponera för UV-ljus i 1 min från både toppen och botten, och ta försiktigt bort masken, var noga med att minimera maskens laterala rörelser över substratet för att undvika repor.
OBS: Med dubbelsidig exponering fungerar FGs som fotolitografiska masker med avseende på den nedre exponeringen, medan närvaron av den övre masken säkerställer att endast fotoresisten som finns på transistorernas kanal förblir oexponerad. - Utveckla fotoresisten som tidigare beskrivits i steg 4.4.
8. Gulddeponering, kanalbildning och mönskning av källor, avlopp och kontrollportar
- Rengör substraten med en skonsam plasmabehandling (30 s vid 30 W) för att främja vidhäftningen av metallen på Parylen C och placera dem på substrathållaren inuti den termiska förångarens vakuumkammare.
- Placera 30 mg guld i degeln, stäng slutaren och pumpa ner avdunstningskammaren tills den når 10-5 Torr. Öka förångarens kraft tills degeln lyser rött och vänta i 30 s. Öppna slutaren, öka effekten till 40% (eller tills degeln lyser ljust vitt), vänta i 60 s, stäng slutaren och sänk strömmen.
- Placera substraten i en acetonbehållare inuti ultraljudsbadet i 10 s för att lyfta av fotoresisten och därmed ta bort guldet från transistorernas kanal. Skölj substraten med aceton, isopropylalkohol och vatten och torka dem med kväve. Sätt in fotoresisten på substraten med samma parametrar i steg 4.1 och 4.2.
- Placera enheten i en bromograf och placera på substratet en fotolitografisk plastmask med önskade källor, avlopp och kontrollportlayout. Exponera för UV-ljus i 1 min uppifrån och ta försiktigt bort masken, var noga med att minimera maskens laterala rörelser över substratet för att undvika repor.
- Utveckla fotoresisten enligt beskrivningen i steg 4.4. Etsa det exponerade guldet genom att sänka det i guldetsningslösningen (steg 1.3) i 10 s, skölj det med avjoniserat vatten och torka ut det med kväve. Inspektera substratet optiskt och ta bort fotoresisten med aceton. Skölj med isopropylalkohol och avjoniserat vatten och torka det med kväve.
9. Nedfall och aktivering av Parylen C för pH-avkänning
- Sätt in fotoresisten på substraten med samma parametrar i steg 4.1 och 4.2.
- Placera enheten i en bromograf och placera på substratet en fotolitografisk plastmask med öppningar som motsvarar OCMFET:s pH-avkänningsområden. Exponera för UV-ljus i 1 min uppifrån och ta försiktigt bort masken, var noga med att minimera maskens laterala rörelser över substratet för att undvika repor.
- Utveckla fotoresisten enligt beskrivningen i steg 4.4. Skydda hela enheten, med undantag för pH-avkänningsområdena, med polyimidisoleringstejp (se materialtabellen). Deponera ett skikt på 500 nm parylen C (motsvarande 1 g Parylen C-dimer) på substratet med samma parametrar som beskrivs i steg 5.1.
OBS: Den totala Parylen C-tjockleken på pH-avkänningsområdena är 650 nm. Ingen silan krävs för detta vittnesmål. - Ta försiktigt bort polyimidisoleringstejpen. Utsätt substratet för syreplasma (5 min och 30 s vid 200 W) för att aktivera Parylen C på OCMFET:s pH-avkänningsområden.
OBS: Polyimidisoleringstejpen är nödvändig här för att begränsa Parylen C-nedfallet. Faktum är att en enkel lyftning med fotoresisten inte ger positiva resultat på grund av den nästan pinhole-fria karaktären hos den konforma beläggningen som erhållits med Parylene C. - Placera substraten i en acetonbehållare inuti ultraljudsbadet i 10 s för att helt ta bort fotoresisten. Skölj substraten med aceton och isopropylalkohol (inget vatten) och torka dem med kväve.
10. Halvledardeponering, odlingskammareplacering och slutlig utskärning av enheten från PET
- Placera underlagen på en kokplatta vid 50 °C. Kasta en droppe (1 μL) halvledarlösning (steg 1.4) på varje kanalområde, täck hela substratet med lock och låt det torka ut under en kemisk huva i 30 minuter.
- Förbered odlingskammaren genom att trycka en akryllonitril butadien styrenring med en inre radie på 15 mm, en tjocklek av 1 mm och en höjd av 7 mm med en 3D-skrivare. Limma odlingskammaren på den centrala delen av substratet med hjälp av polydimethylsiloxan (förhållandet mellan härdningsmedlet: 15 viktprocent). Klipp ut enheten från PET antingen manuellt eller med hjälp av en laserskärare.
11. Elektrisk karakterisering av transistorer
- Karakterisera varje transistor med hjälp av en källmeter18,19,20,21 (se materialförteckningen).
OBS: Både ut- och inmatningsegenskaperna bör mätas för att extrapolera transistorernas parametrar (främst bärarnas rörlighet, tröskelspänning, ION/IOFF-förhållande och subthreshold-lutning).
Representative Results
Potentialen hos MOA har validerats här för både elektriska aktivitetsregistreringar och metabolisk aktivitetsövervakning. Den exakta uppskattningen av enhetens förmåga att upptäcka extracellulära åtgärdspotentialer baserades på en grundlig karakterisering med råtta kardiomyocyter kulturer (särskilt i primära råtta kardiomyocyter mätt vid 8 dagar in vitro [DIV])18. Figur 3A visar en komplett MOA med 16 OCMFETs. Det översta infällt visar ett exempel på en sammanflöde råtta kardiomyocytkultur som följer ytan av MOA. För att belysa deras hälsa har cellerna immunostained för sarkommeteriska proteinet, tropomyosin, efter inspelningssessionen. Det nedre infällda visar en enda kardiomyocytsignal mätt med en OCMFET.
Intressant nog kan enheten upptäcka spontan elektrisk aktivitet och den aktivitet som induceras vid administrering av olika kemikalier, vilket visas i figur 3B. Denna validering var avgörande för att visa genomförbarheten av att använda denna metod för elektrogena cell interfacing. På grund av matriskonfigurationen tillät MOA också rekonstruktion av hjärtsignalens förökningshastighet, vilket visade systemets lämplighet för studier av cellulära nätverk (figur 3C). För ytterligare validering för att bestämma den faktiska detektionsgränsen för enheten testades MOA också med striatala nervceller (21 DIV)18, med intressanta resultat när det gäller signalamplitud och tillförlitligheten hos inspelningarna. Som framgår av figur 3D skulle OCMFET kunna förstärka neuronala fältpotentialer med anmärkningsvärd stabilitet och visa signal-till-brus-förhållanden (SNRS) på upp till 3,2 (i samma intervall som för SNR som erhållits med standard MEAs25). Inspelningsinställningen bestod av anpassad flerkanalselektronik för transistorförskjutningen och signalläsningen och konditionering. Varje kanal för den elektriska inspelningen har ett första steg bestående av en I/V-omvandlare med ett 1 MΩ återkopplingsmotstånd och ett 150 Hz-1,3 kHz bandpassfilter med en spänningsvinst på 110. För alla presenterade mätningar var transistorerna partiska med VDS = VGS = -1 V. A/D-konverteringen och datavisualiseringen och lagringen utfördes med hjälp av en dataförvärvstavla (se tabellen över material). Alla mätsessioner genomfördes i en Faraday-bur för att minimera det elektriska, miljömässiga bullret på systemet.
Som tidigare nämnts, genom att utnyttja den enkla fysiska funktionalisering som presenteras i protokollet, var det möjligt att förbereda mycket känsliga pH-sensorer med ett supernernstian svar. På grund av den presenterade tillverkningsmetoden kan dessa pH-enheter integreras i en MOA och användas för att övervaka de små pH-variationer som induceras av den metaboliska aktiviteten hos primära hippocampal råtta nervceller26. I synnerhet, vilket framgår av figur 4, var endast en av de två OCMFET som är avsedda för lågfrekvent avkänning selektivt funktionaliserad för att visa genomförbarheten av metoden. Denna selektiva funktionalisering tillät utvärderingen av svaret från de två OCMFET på kemiskt inducerade metaboliska variationer: i synnerhet kan ett högt metaboliskt tillstånd erhållas med bikukulin (BIC), en hämmare av GABA A-receptorer27, medan ett lågt metaboliskt tillstånd kan induceras genom tillsats av tetrodotoxin (TTX), som så småningom orsakar cellulär död28 . Inspelningsinställningen bestod av samma anpassade flerkanalselektronik som användes för elektroniska aktivitetsmätningar.
Till skillnad från det tidigare fallet användes två dedikerade kanaler för att registrera de långsamma variationer som framkallas av cellulära metabolisk aktivitet. Varje kanal bestod av en enkel krets bestående av två huvudblock: en I/V-omvandlare med ett 1 MΩ feedbackmotstånd och ett lågpassfilter med en cut-off-frekvens på 10 Hz. Transistorerna var partiska med VDS = VGS = -1 V, och alla mätningar utfördes inuti en Faraday bur för att minimera påverkan av externt brus på inspelningarna (detta är en särskilt viktig aspekt med tanke på de låga strömfluktuationer som induceras av cellulär metabolisk aktivitet). Under experimenten upprätthölls kulturerna i ett lågbuffrat odlingsmedium, och hela systemet placerades i en kontrollerad miljö (37 °C och ett kontinuerligt CO2/luftflöde). Som förväntat kunde endast strömmen för den pH-känsliga OCMFET moduleras genom tillsats av 25 μM BIC. Detta bekräftades ytterligare av induktion av den aktuella variationen genom motsvarande variation av cellulära metabolisk aktivitet.
Samma experiment upprepades efter tillsats av 10 μM TTX, vilket resulterade i en gradvis avmattning av cellulära metabolismen. Efter tillägget av TTX visade varken pH-känslig OCMFET eller pH-okänslig något svar, vilket visade effekten av metoden. Dessa resultat visar effektiviteten av den föreslagna funktionaliseringen och dess relativa stabilitet i upp till 2 veckor. En viktig slutsats som kan dras från de föreslagna experimenten (både den elektriska aktiviteten och den metaboliska aktiviteten) är att det är möjligt att förbereda olika typer av sensorer genom att selektivt funktionalisera olika OCMFET inom samma odlingsområde. Denna aspekt representerar en icke-trivial prestation i biosensing för cellulära applikationer eftersom det är avgörande för bättre karakterisering av komplexiteten hos dessa biologiska system att kunna övervaka olika parametrar inom samma cellkultur.
Bild 1: Ovanifrån av en 16-kanals MOA för metabolisk och elektrisk övervakning av elektroaktiva celler. Skalstreck = 1 cm. Förkortningar: OCMFET = organiska laddningsmodulerade fälteffekttransistorer; FG = flytande grind; S/D = källa/avlopp; MOA = micro OCMFET-matris. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: Huvudsakliga tillverkningssteg i en MOA för metabolisk och elektrisk övervakning av elektroaktiva celler. (A och B) Den förångade Ti-filmen mönstras med hjälp av en standardfotograferingsprocess för att förbereda ocmfetets flytande port. C) Nedfall av 15 nm Parylen C. Detta lager, tillsammans med den inhemska Tioxiden, fungerar som transistorernas port dielektrisk. (D och E) Parylen C-skiktet mönstras med hjälp av plasmasyrebehandling. Ett mönstrat fotoresistskikt används för att selektivt exponera avkänningsområdena för de elektriska inspelningarna och de flytande grindens ryggkontakter. (F) Mönstra av Au-toppkontakterna, nämligen källan, avloppet, kontrollporten och den flytande portkontakten. En självjusteringsteknik används för att förbättra enhetens elektriska prestanda. (G-I) Deponering av det andra lagret av Parylen C på avkänningsområdet för OCMFET för metabolisk aktivitet övervakning. Efter exponeringen av syrgasplasma kommer detta skikt att fungera som det pH-känsliga membranet (J). (K) Tvärsnitt av en komplett MOA (med material) efter deponeringen av den organiska halvledaren (TIPS Pentacene) och kulturkammarens positionering. Förkortningar: OCMFET = organiska laddningsmodulerade fälteffekttransistorer; FG = flytande grind; S/D = källa/avlopp; MOA = micro OCMFET-matris; CG = kontrollgrind; PET = polyetentereftalat; Par C = Parylen C; TIPS = 6,13-bis(triisopropylsilylethynyl) pentacen; ABS = akrylitril butadien styren. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 3: Cellulära elektriska aktivitetsinspelningar med en MOA. (A) En sammanflödeskultur av råttkardiomyocyter (8 DIV) som håller sig till ytan av en MOA, fixerad efter en inspelningssession och immunstained för sarkommet protein, tropomyosin (övre infälld). Botten infälld: exempel på en enda kardiomyocytsignal mätt med en OCMFET. Skalstång = 150 μm. (B) Kemisk justering av den elektriska aktiviteten hos en kardiomyocytkultur. Aktiviteten acceleration resulterade från tillägg av 100 mM noradrenalin, medan undertryckande resulterade från tillägg av 100 mM verapamil. Vänster: slagfrekvensmodulering; höger: statistik över 5 OCMFETs-genomsnitt och standardavvikelse: spike-count på 4 min basal (129 ± 4,6), noradrenalin-medierad (280 ± 28,6) och verapamil-medierad aktivitet (15 ± 1,9). C) Rekonstruktion av förökningen av en hjärtsignal. Höger: rasterdiagram av kulturens spontana aktivitet som indikerar spridningen av signalen från plats 14 till plats 41 (höger). D) Verkan av striatala celler från råttembryon (21 DIV). Denna siffra har ändrats från 18. Förkortningar: OCMFET = organisk laddningsmodulerad fälteffekttransistor; MOA = micro OCMFET-matris; NE = noradrenalin; VER = verapamil; DIV = dagar in vitro. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 4: Inspelningar av metabolisk aktivitet med en MOA. Svar från (A) pH-känsliga och (B) pH-okänsliga kanaler i en MOA tillsatsen av 25 μM BIC före och efter tillsats av 10 μM TTX. Efter TTX-tillägget blir beteendet hos den pH-känsliga kanalen liknande det för den pH-okänsliga. I synnerhet kan ingen aktuell variation observeras efter BIC-tillägget på grund av TTX-inducerad cellulär död. C) MOA för inspelningar av metabolisk aktivitet. PH-känsliga och pH-okänsliga OCMFETs beskrivs i grönt respektive rött. Infälld: friska hippocampala nervceller odlade på enheten efter 15 DIV. Skala bar = 50 μm. Denna siffra har ändrats från 26. Förkortningar: OCMFET = organisk laddningsmodulerad fälteffekttransistor; MOA = micro OCMFET-matris; BIC = bikukulin; TTX = tetrodotoxin; DIV = dagar in vitro. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Discussion
Till skillnad från tidigare metoder för tillverkning av OCMFET för cellulära applikationer18,29, är den föreslagna metoden speciellt utformad för att förbereda MOAs som samtidigt kan upptäcka elektrisk och metabolisk cellulär aktivitet. Dessutom har detta tillvägagångssätt för att uppnå pH-känslighet fördelen att det är förenligt med standardtillverkningsprotokoll och innebär ingen kemisk modifiering av avkänningsområdet (denna aspekt säkerställer biokompatibiliteten hos hela enheten). pH-känsligheten uppnås med samma material som används som en grind dielektrisk (dvs. den biokompatibla Parylen C), vilket gör detta tillvägagångssätt snabbt och reproducerbart.
Slutresultatet av denna metod är ett flexibelt, transparent, billigt och multisensing organiskt verktyg för in vitro-cellulära applikationer. Det faktum att detta kan erhållas med hjälp av en enda transistorstruktur och en enkel fysisk modifiering av avkänningsområdet bidrar till de fördelar som användningen av organiska elektroniska material och metoder erbjuder. Eftersom ocmfet-flyttningsprincipen inte strikt beror på det specifika halvledar- eller FG-materialet kan hela processen ändras och skalas upp beroende på den specifika tillämpningen.
En kritisk aspekt av den föreslagna tekniken är relaterad till reproducerbarheten av plasma aktivering teknik. För att uppnå konsekventa resultat måste både Parylen C-tjockleken och dess etsningshastighet kontrolleras. Frekvent kalibrering av Parylen C-deponeringsprocessen och plasmarengöraren är absolut nödvändiga. Andra kritiska aspekter, som också bidrar till processens reproducerbarhet, är noggrann hantering av enheten och nedfallet av den organiska halvledaren. En enkel drop-casting teknik användes här, som i sig utgör reproducerbarhet begränsningar. För att minimera dessa problem, som beskrivs i protokollsteg 10.1, bör samma mängd halvledarlösning användas varje gång, och lösningsmedelsavdunstning bör standardiseras så mycket som möjligt. Att hålla en konstant temperatur med hjälp av en värmeplatta och täcka substratet efter varje droppdeposition hjälper till att bromsa avdunstningsprocessen. För att ytterligare minimera detta problem kan depositionstekniken (t.ex. med hjälp av en bläckstråleutskriftsmetod) bytas30.
En begränsning av det föreslagna protokollet härrör från arten av funktionaliseringen av OCMFET för pH-avkänning. Stabiliteten hos pH-sensorerna är begränsad till några veckor26. Stabilitetsfönstret i det föreslagna tillvägagångssättet är dock tillräckligt stort för att täcka de standardinkubationstider som behövs för neuronal odlingstillväxt (2-3 veckor). Andra typer av avkänningsområdesfunktionalisering bör övervägas för längre experiment. Tillverkningsprotokollet använder en dedikerad backkontakt, vilket ger elektrisk åtkomst till FGs. Denna kontakt, som lämnas flytande under enhetens normala drift, kan utnyttjas för enhetens elektriska karakterisering och funktionalisering av avkänningsområdena med olika tekniker (t.ex. elektrodposition).
Denna procedur representerar ett bekvämt sätt att förbereda en multiavkänningsenhet för cellulära applikationer utan behov av expansiva material eller renrumsanläggningar. Trots prestanda- och stabilitetsbegränsningar på grund av anställning av en organisk halvledare och fysisk (inte kemisk) funktionalisering av avkänningsområdet, kan liknande metoder användas för att förbereda billiga (och potentiellt disponibla), mekaniskt flexibla och optiskt transparenta sensorer och biosensorer, vilket kan ge forskare inom cellbiologi, vävnadsteknik och neurovetenskap nya specialiserade verktyg för att studera cellulära system in vitro.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att deklarera.
Acknowledgments
Författarna erkänner finansiering från EU:s forsknings- och innovationsprogram Horisont 2020 inom ramen för bidragsavtal nr 882897-Search&Rescue-projektet och PON-projektet "TEX-STYLE" ARS01_00996, PNR 2015-2020.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | Sigma Aldrich | 440159 | |
| 3D printer Makerbot Replicator 2x | Makerbot | https://www.makerbot.gr/. Estimated price: 2k-3k euros. | |
| ABS filament | |||
| Anisole | Sigma Aldrich | 296295 | |
| Bromograph model Hellas | Bungard | https://www.bungard.de/. Estimated price: 1k-2k euros. | |
| Gold | Local seller | ||
| Hydrofluoric acid | Sigma Aldrich | 695068 | |
| Iodine | Sigma Aldrich | 207772 | |
| Kapton tape | polyimide insulation tape | ||
| Laser cutter VLS2.30 | Universal Laser Systems | https://www.ulsinc.com/it. Estimated price: 20k euros. | |
| Multichannel Systems acquisition board | www.multichannelsystems.com | ||
| NaOH pellets | Sigma Aldrich | 567530 | |
| Parylene C dimer | SCS special coating systems coating | ||
| PDMS Silgard 184 | Sigma Aldrich | 761036 | |
| PDS 2010 LABCOATER 2 Parylene Deposition System | SCS special coating systems | https://scscoatings.com/. Estimated price: 50k euros | |
| PET film biaxially oriented (thickness 0.25 mm) | Goodfellow | ES301450 | |
| Petri dishes | |||
| Plasma cleaner Gambetti "Tucano" | Gambetti | https://www.gambetti.it/. Estimated price: 20k euros. | |
| Positive photoresist AZ1518 | MicroChemicals | ||
| Potassium iodide KI | Sigma Aldrich | 221945 | |
| Source Meter 2636 | Keithley | https://it.farnell.com/. Estimated price: 18k euros | |
| Spin coater unit | Ossila | https://www.ossila.com/. Estimated price: 2.5k euros. | |
| Stereoscopic microscope SMZ745T | Nikon | https://www.microscope.healthcare.nikon. com/. Estimated price: 2k-3k euros. |
|
| Thermal evaporator unit | |||
| TIPS pentacene (6,13-Bis(triisopropylsilylethynyl)-pentacene) | Sigma Aldrich | 716006 | |
| Titanium wire | Goodfellow | TI005129 | |
| Ultrasonic bath | Falc Instruments | https://www.falcinstruments.it/. Estimated price: 1k euro. |
References
- Hubel, D. H. Tungsten microelectrode for recording from single units. Science. 125 (3247), 549-550 (1957).
- Verzeano, M., Negishi, K., Angeles, L. Neuronal activity in cortical and thalamic networks. A study with multiple microelectrodes. Journal of General Physiology. 43 (6), 177-195 (1960).
- Thomas, C. A. Jr, Springer, P. A., Loeb, G. E., Berwald-Netter, Y., Okun, L. M. A miniature microelectrode array to monitor the bioelectric activity of cultured cells. Experimental Cell Research. 74 (1), 61-66 (1972).
- Grattarola, M., Martinoia, S. Modeling the neuron-microtransducer junction: from extracellular to patch recording. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 40 (1), 35-41 (1993).
- Wallace, K., Strickland, J. D., Valdivia, P., Mundy, W. R., Shafer, T. J. A multiplexed assay for determination of neurotoxicant effects on spontaneous network activity and viability from microelectrode arrays. NeuroToxicology. 49, 79-85 (2015).
- Bergveld, P. Development, operation, and application of the tool for electrophysiology. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 19 (5), 342-351 (1972).
- Bergveld, P., Wiersma, J., Meertens, H. Extracellular potential recordings by means of a field effect transistor without gate metal, called OSFET. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 23 (2), 136-144 (1976).
- Fromherz, P., Offenhausser, A., Vetter, T., Weis, J. A neuron-silicon junction: a Retzius cell of the leech on an insulated-gate field-effect transistor. Science. 252 (5010), 1290-1293 (1991).
- Martinoia, S., et al. Development of ISFET array-based microsystems for bioelectrochemical measurements of cell populations. Biosensors and Bioelectronics. 16 (9-12), 1043-1050 (2001).
- Heer, F., et al. CMOS microelectrode array for the monitoring of electrogenic cells. Biosensors and Bioelectronics. 20 (2), 358-366 (2004).
- Berdondini, L., et al. Active pixel sensor array for high spatio-temporal resolution electrophysiological recordings from single cell to large scale neuronal networks. Lab on a Chip. 9 (18), 2644-2651 (2009).
- Maccione, A., et al. Multiscale functional connectivity estimation on low-density neuronal cultures recorded by high-density CMOS micro electrode arrays. Journal of Neuroscience Methods. 207 (2), 161-171 (2012).
- Kibler, A. B., Jamieson, B. G., Durand, D. M. A high aspect ratio microelectrode array for mapping neural activity in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 204 (2), 296-305 (2012).
- Frega, M., Tedesco, M., Massobrio, P., Pesce, M., Martinoia, S. Network dynamics of 3D engineered neuronal cultures: a new experimental model for in-vitro electrophysiology. Scientific Reports. 4, 5489 (2014).
- Zuo, L., Yu, S., Briggs, C. A., Kantor, S., Pan, J. Y. Design and fabrication of a three-dimensional multi-electrode array for neuron electrophysiology. Journal of Biomechanical Engineering. 139 (12), (2017).
- Spanu, A., et al. A three-dimensional micro-electrode array for in-vitro neuronal interfacing. Journal of Neural Engineering. 17 (3), 036033 (2020).
- Spanu, A., Martines, L., Bonfiglio, A. Interfacing cells with organic transistors: a review of in vitro and in vivo applications. Lab on a Chip. 21 (5), 795-820 (2021).
- Spanu, A., et al. An organic transistor-based system for reference-less electrophysiological monitoring of excitable cells. Scientific Reports. 5, 8807 (2015).
- Viola, F. A., Spanu, A., Ricci, P. C., Bonfiglio, A., Cosseddu, P. Ultrathin, flexible and multimodal tactile sensors based on organic field-effect transistors. Scientific Reports. 8, 8073 (2018).
- Napoli, C., et al. Electronic detection of DNA hybridization by coupling organic field-effect transistor-based sensors and hairpin-shaped probes. Sensors. 18 (4), 990 (2018).
- Spanu, A., et al. A reference-less pH sensor based on an organic field effect transistor with tunable sensitivity. Organic Electronics. 48, 188-193 (2017).
- Lundgaard, I., et al. Direct neuronal glucose uptake heralds activity-dependent increases in cerebral metabolism. Nature Communications. 6, 6807 (2015).
- Zhang, Y. S., et al. Multisensor-integrated organs-on-chips platform for automated and continual in situ monitoring of organoid behaviors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), 2293-2302 (2017).
- Yu, H., et al. A novel design of multifunctional integrated cell-based biosensors for simultaneously detecting cell acidification and extracellular potential. Biosensors and Bioelectronics. 24 (5), 1462-1468 (2009).
- Maccione, A., et al. A novel algorithm for precise identification of spikes in extracellularly recorded neuronal signals. Journal of Neuroscience Methods. 177 (1), 241-249 (2009).
- Spanu, A., Tedesco, M. T., Martines, L., Martinoia, S., Bonfiglio, A. An organic neurophysiological tool for neuronal metabolic activity monitoring. APL Bioengineering. 2 (4), 046105 (2018).
- Díaz-García, C. M., et al. Neuronal stimulation triggers neuronal glycolysis and not lactate uptake. Cell Metabolism. 26 (2), 361-374 (2017).
- Xie, Y., Dengler, K., Zacharias, E., Wilffert, B., Tegtmeier, F. Effects of the sodium channel blocker tetrodotoxin (TTX) on cellular ion homeostasis in rat brain subjected to complete ischemia. Brain Research. 652 (2), 216-224 (1994).
- Caboni, A., Orgiu, E., Barbaro, M., Bonfiglio, A. Flexible organic thin-film transistors for pH monitoring. IEEE Sensors Journal. 9 (12), 1963-1970 (2009).
- Fraboni, B., Bonfiglio, A., Basiricò, L. Inkjet printing of transparent, flexible, organic transistors. Thin Solid Films. 520, 1291-1294 (2011).
