Summary
Her presenterer vi fabrikasjonsprotokollen til en organisk ladningsmodulert felteffekttransistor (OCMFET)-basert enhet for in vitro cellulær grensesnitt. Enheten, kalt en mikro OCMFET-matrise, er en fleksibel, rimelig og referansefri enhet, som vil muliggjøre overvåking av de elektriske og metabolske aktivitetene til elektroaktive cellekulturer.
Abstract
Moderne elektrofysiologi har hele tiden blitt drevet av den parallelle utviklingen av stadig mer sofistikerte verktøy og materialer. I sin tur har funn på dette feltet drevet teknologisk fremgang i en frem og tilbake-prosess som til slutt bestemte de imponerende prestasjonene de siste 50 årene. Imidlertid presenterer de mest brukte enhetene som brukes til cellulær grensesnitt (nemlig mikroelektrode-arrayene og mikroelektroniske enheter basert på transistorer) fortsatt flere begrensninger som høye kostnader, materialets stivhet og tilstedeværelsen av en ekstern referanseelektrode. For delvis å overvinne disse problemene har det vært utviklinger i et nytt vitenskapelig felt kalt organisk bioelektronikk, noe som resulterer i fordeler som lavere kostnader, mer praktiske materialer og innovative fabrikasjonsteknikker.
Flere interessante nye organiske enheter har blitt foreslått i løpet av det siste tiåret for å enkelt koble seg til cellekulturer. Dette dokumentet presenterer protokollen for fabrikasjon av enheter for cellulær grensesnitt basert på den organiske ladningsmodulerte felteffekttransistoren (OCMFET). Disse enhetene, kalt micro OCMFET arrays (MOAs), kombinerer fordelene med organisk elektronikk og de særegne egenskapene til OCMFET for å forberede gjennomsiktige, fleksible og referanseløse verktøy som det er mulig å overvåke både de elektriske og metabolske aktivitetene til kardiomyocytter og nevroner in vitro, og dermed tillate en multiparametrisk evaluering av elektrogene cellemodeller.
Introduction
In vivo overvåking av elektroaktive celler, som nevroner og kardiomyocytter, representerer en gyldig og kraftig tilnærming i grunnleggende forskningsapplikasjoner for den menneskelige hjerne, funksjonelle tilkoblingsstudier, farmakologi og toksikologi. Verktøyene som vanligvis brukes til slike studier er hovedsakelig basert på mikroelektrode arrays (MEAs)1,2,3,4,5 og stadig mer effektive og kraftige felteffektenheter (FEDs)6,7,8,9,10,11,12 . Disse to familiene av enheter tillater sanntidsovervåking og stimulering av nevroners elektriske aktivitet og kardiomyocytter og er vanligvis preget av robusthet, brukervennlighet og pålitelighet. Disse funksjonene gjør MEAer og FEDs til gullstandarden for elektrofysiologiske applikasjoner, som for tiden brukes til grensesnitt med standard cellulære kulturer, organotypiske hjerneskiver og tridimensionale organoider13,14,15,16. Til tross for deres utbredte bruk og deres imponerende egenskaper, presenterer MEAer og FEDer noen begrensninger som høye kostnader, materialets stivhet og tilstedeværelsen av en vanligvis stor referanseelektrode, som må plasseres i målevæskemiljøet og er nødvendig for riktig drift av enhetene.
For å utforske alternative løsninger for cellulær grensesnitt har det det siste tiåret blitt investert mye arbeid i studiet av elektroniske enheter basert på organiske materialer og innovative fabrikasjonsteknikker17. Blant de flere organiske enhetene som er studert for å adressere de nevnte begrensningene, har en merkelig organisk transistor kalt OCMFET nylig blitt foreslått som et gyldig alternativ til MEAer og FEDs18. I tillegg til standardfunksjonene som tilbys av den organiske elektronikkteknologien, for eksempel billige materialer og fabrikasjonsteknikker, optimale mekaniske og kjemiske egenskaper, optisk gjennomsiktighet og biokompatibilitet, tilbyr OCMFET også en ultrahøy ladefølsomhet (på grunn av sin dobbeltporterte struktur) uten behov for en ekstern referanseelektrode. Videre har denne organiske sensoren den bemerkelsesverdige evnen til å registrere forskjellige analytt / fysiske parametere, avhengig av den spesifikke funksjonaliseringen av sensorområdet, som er skilt fra transistorområdet19,20. Alle disse funksjonene kan enkelt utnyttes for oppkjøp av forskjellige parametere i en cellulær kultur. Spesielt, i tillegg til å kunne oppdage den nevronale / hjerte elektriske aktiviteten, er det også mulig å utnytte den ultrahøye pH-følsomheten som tilbys av den særegne dobbeltportede strukturen til OCMFET ved å bruke en enkel fysisk funksjonalisering21 for pålitelig å overvåke de små lokale pH-variasjonene forårsaket av cellulær metabolsk aktivitet.
Ved in vitro-celle-biosensing er overvåking av cellulær metabolsk aktivitet en kraftig indikator på kulturens tilstand og kan brukes til å vurdere cellulær respons på ulike stimuli, for eksempel legemiddeladministrasjon og elektrisk stimulering22,23. Videre, i det spesifikke tilfellet av nevrale applikasjoner, overvåke både elektriske og metabolske aktiviteter er av stor interesse, spesielt i farmakologi og toksikologi24. Med den hensikt å enkelt adressere kravene til moderne in vitro elektrofysiologi, samtidig som den tilbyr alle fordelene med OCMFET, har en enhet som heter Micro OCMFET Array (MOA) nylig blitt introdusert. MOA er et OCMFET-basert array med spesialiserte sensorområder spesielt designet for in vitro cellulær interfacing, noe som muliggjør multiparametrisk analyse av elektrogene cellekulturer. Spesielt har to MOA-kanaler større sensorområder for å maksimere følsomheten og kan selektivt funksjonaliseres for å overvåke spesifikke interesseparametere, for eksempel pH-variasjonene i kulturmediet. De andre OCMFETene i strukturen fungerer som ekstracellulære elektriske aktivitetssensorer. Figur 1 viser strukturen til en 16-kanals MOA. Denne evnen, kombinert med fravær av en ekstern referanseelektrode, gjør MOA til et veldig interessant verktøy for in vitro-applikasjoner. Dette arbeidet presenterer den trinnvise fabrikasjonsprotokollen til en multisenserende MOA for in vitro-deteksjon av nevroners elektriske og metabolske aktiviteter og kardiomyocytter. Figur 2 viser de viktigste fabrikasjonstrinnene, materialene som brukes, og enhetsstrukturen.
Protocol
Alle gjeldende internasjonale, nasjonale og/eller institusjonelle retningslinjer for pleie og bruk av dyr ble fulgt. Alle anstrengelser ble gjort for å redusere antall dyr til prosjektet og for å minimere deres lidelse.
1. Utarbeidelse av utviklingsløsningen, etseløsningene, den organiske halvlederløsningen og fotolittografiske masker
- Forbered utviklingsløsningen ved å fortynne NaOH-pellets i deionisert vann i en konsentrasjon på 175 mM.
MERK: Dette er en eksotermisk reaksjon. Hvis en plastbeholder brukes, fortsett å røre beholderen til alle pellets er helt oppløst. - Forbered titanetsingsløsningen ved å fortynne hydrofluorsyre (HF) i deionisert vann (1 del konsentrert 48% HF, 49 deler deionisert vann).
FORSIKTIG: Hydrofluorsyre kan lett trenge inn i huden og forårsake alvorlig skade på dype vevslag. Rask nøytralisering av HF er nødvendig for å forhindre vevsødeleggelse, noe som kan fortsette i flere dager og føre til alvorlig skade eller til og med død. Risikoen forbundet med HF er avhengig av konsentrasjonen og varigheten av kontakten med syren. Brukes kun under en avtrekkshette med ansiktsskjerm. Dobbel gloving anbefales også sterkt. - Forbered gulletsingsløsningen ved å blande jod, kaliumjodid og deionisert vann (for 250 g løsning, bruk 200 ml deionisert vann, 20 g KI, 5 g I2). Rør oppløsningen ved romtemperatur i 1 time og la den hvile over natten før bruk.
- Forbered halvlederløsningen ved å oppløse 6,13-bis(triisopropylsilylethynyl) pentacene (TIPS Pentacene) i anisol (1% i vekt) og rør forsiktig i 2 timer på en varm plate ved 80 °C.
MERK: Fortsett å agitere denne løsningen. Bruk gule hetteglass og/eller oppbevar dem under dårlige lysforhold. - Forbered ønsket fotolitografisk maskesett med en vektorgrafikkprogramvare. Forbered 5 masker for hele prosessen: masken for mønsteret av de flytende portene (FGs); masken for åpning av vias og sensorområdene for elektrofysiologiske opptak; masken for selvjusteringsprosessen; masken for mønsteret av kilden, drenering og kontrollport toppkontakt; og masken for plasmaaktivering av pH-kanalene.
MERK: Avhengig av nødvendig oppløsning og det spesifikke fotolittografiske oppsettet, kan forskjellige typer masker brukes. Når det gjelder de foreslåtte enhetene (som har en maksimal lateral oppløsning på 40 μm), er enkle plastfleksible masker kjøpt hos en lokal fotokopibutikk.
2. Substratvalg og forberedelse
- Klipp en 6 x 6 cm2 firkant på 250 μm polyetylentereftalat (PET) fra et uberørt PET-ark.
MERK: Start med et litt større substrat enn den endelige enheten for å ha brede nok marginer til å tillate manipulering med standard lab pinsett uten å skade den. - Inspiser substratet med et optisk mikroskop for å utelukke tilstedeværelsen av dype spor og riper. Velg forsiktig de mindre ripede substratene, da større ufullkommenheter kan føre til feil på den endelige enheten.
- Skyll PET-substratene med aceton, isopropylalkohol og deionisert vann (i denne rekkefølgen) og tørk dem ved hjelp av strømmer av nitrogen. Oppbevar underlagene i rene Petri-retter/beholdere av plast.
3. FG: titanavsetning
- Forrens substratene med plasmaoksygen (30 s ved 100 W) og legg dem på underlagsholderen inne i vakuumkammeret til den termiske fordamperen.
- Plasser 60 mg titan i digelen, lukk lukkeren og pump ned fordampningskammeret til det når et vakuumnivå lavere enn 10-6 Torr. Øk fordamperens kraft til digelen lyser rødt og vent i 30 s. Åpne lukkeren, øk strømmen til 60 % (eller til digelen lyser hvitt), og vent i 60 s. Lukk lukkeren og skru ned strømmen.
- Fjern substratene fra fordamperen; rengjør dem ved hjelp av aceton, isopropylalkohol og deionisert vann; og tørk dem ved hjelp av strømmer av nitrogen. Utfør en ekstra oksygenplasmabehandling (60 s ved 200 W) for å oksidere titanoverflaten litt.
4. FG-mønster
- Plasser ett underlag om gangen på spincoateren plassert inne i en avtrekkshette. Deponer 4 ml fotoresist på underlaget ved hjelp av en engangs plastpipette. Bruk følgende spinnbeleggparametere for å oppnå et 2 μm tykt fotoresistlag: spinnhastighet: 3000 rpm; spinn tid: 45 s; akselerasjonstid: 0,5 s; retardasjonstid: 0,5 s.
- Stek fotoresisten mykt ved å plassere substratet på en varm plate (70 °C i 5 minutter). Oppbevar substratet inne i en petriskål/plastbeholder i aluminiumsfolie for å unngå direkte lyseksponering.
MERK: Unngå den foreslåtte steketemperaturen (100 °C i 50 s) for å forhindre deformasjon av underlag. Baking ved lavere temperatur i lengre tid sikrer imidlertid gode resultater. - Plasser enheten i en bromografi og plasser den fotolitografiske plastmasken med ønsket FG-layout på underlaget. Utsett for ultrafiolett (UV) lys fra toppen i 1 min, og fjern masken forsiktig, pass på å minimere maskens laterale bevegelser over underlaget for å unngå å skrape den.
- Dypp substratet i 5 s i en glassbeholder fylt med utviklingsløsningen (trinn 1.1). Skyll det raskt i deionisert vann og tørk det under nitrogen. Bruk et optisk mikroskop for å se etter underutviklede/overutviklede flekker i underlaget. Gjenta nedsenkingen av substratet i å utvikle løsning i tilfelle underutvikling.
- Ets den eksponerte titanen ved å senke den ned i titanetsingsløsning (trinn 1.2) i 15 s, skyll den med deionisert vann og tørk den med nitrogen. Kontroller substratet optisk og fjern fotoresisten ved hjelp av aceton. Skyll substratet med isopropylalkohol og deionisert vann, og tørk det med nitrogen.
5. Gate dielektrisk avsetning
- Forbered avsetningskammeret til Parylene coater ved å distribuere 2 ml av adhesjonspromotoren (silan - 3-(trimethoxysilyl)propylmetakrylat) på avsetningskammerveggene ved hjelp av en laboratorieserviett. Plasser 300 mg parylen C-dimmer (tilsvarende en endelig tykkelse på 150 nm) på Parylenfrakkeren. Sett den lavere trykkverdien til 7 mbar og den høyere trykkverdien til 10 mbar. Etter avsetningen rengjør substratene med aceton, isopropylalkohol og deionisert vann, og tørk dem med nitrogen.
6. Åpning av sensorområdene på OCMFET for elektrisk aktivitetsregistrering og dannelse av vias for å få tilgang til baksiden av FG-ene
- Deponer fotoresisten på underlagene ved hjelp av de samme parametrene i trinn 4.1 og 4.2.
- Plasser enheten i en bromografi og plasser plastfotolitografisk maske på underlaget for vias (sirkulære åpninger med en diameter på 50 μm over sensorområdene og 100 x 100 μm2 åpninger over FG-ene vekk fra sensoriske mikroskop for å forbedre tilbakekontakten til FG-ene i figur 1 og figur 2)) under et stereoskopisk mikroskop for å forbedre justeringspresisjonen. Utsett for UV-lys fra toppen i 1 min, og fjern masken forsiktig, pass på å minimere maskens sidebevegelser over underlaget for å unngå å skrape den.
MERK: Viaene på siden av FG-ene bort fra sensorområdet (vist som tilbakekontakt av FG-er i figur 1 og figur 2) er nødvendige for kontakt under karakteriseringen av transistoren. Videre kan det å ha elektrisk tilgang til FG-ene være svært nyttig for ulike typer funksjonalisering (f.eks. elektrodeposisjon). - Utvikle fotoresisten som tidligere beskrevet i trinn 4.4. Utsett substratet med den mønstrede fotoresisten (som fungerer som en maske her) for oksygenplasma (180 s ved 200 W) for å fjerne Parylen C fra sensorområdene.
MERK: Etsehastigheten til Parylen C i en isotrop plasmarenser ved 200 W er ca. 90 nm/min. En liten overets utføres for å rense sensorområdene ytterligere. Fotoresisten er også etset under prosessen. Imidlertid er tykkelsen (2 μm) mye høyere enn parylen C. - Plasser substratene i en glassbeholder fylt med aceton inne i ultralydbadet i 10 s for å fjerne fotoresisten helt. Skyll substratene med aceton, isopropylalkohol og vann og tørk dem med nitrogen.
MERK: Bruk av sonikering i stedet for bare å skylle substratene med aceton er avgjørende for å forhindre uønsket folding og re-avsetning av Parylene C-fragmenter på overflaten av sensorområdene.
7. Selvjustering av kilde og avløp med FG
- Deponer fotoresisten på underlagene ved hjelp av de samme parametrene i trinn 4.1 og 4.2. Plasser enheten i en bromografi og plasser den på substratet en fotolitografisk plastmaske med enkle svarte rektangler som helt dekker transistorens områder. Utsett for UV-lys i 1 min fra både toppen og bunnen, og fjern masken forsiktig, pass på å minimere maskens sidebevegelser over underlaget for å unngå å skrape den.
MERK: Med den dobbeltsidige eksponeringen fungerer FG-ene som fotolittografiske masker med hensyn til bunneksponeringen, mens tilstedeværelsen av toppmasken sikrer at bare fotoresisten som er tilstede på transistorenes kanal forblir ueksponert. - Utvikle fotoresisten som tidligere beskrevet i trinn 4.4.
8. Gullavsetning, kanaldannelse og mønster av kilder, avløp og kontrollporter
- Rengjør substratene med en skånsom plasmabehandling (30 s ved 30 W) for å fremme vedheft av metallet på Parylen C og plasser dem på substratholderen inne i vakuumkammeret til den termiske fordamperen.
- Plasser 30 mg gull i digelen, lukk lukkeren og pump ned fordampningskammeret til det når 10-5 Torr. Øk fordamperens kraft til digelen lyser rødt og vent i 30 s. Åpne lukkeren, øk strømmen til 40 % (eller til digelen lyser hvitt), vent i 60 s, lukk lukkeren og skru ned strømmen.
- Plasser substratene i en acetonbeholder inne i ultralydbadet i 10 s for å løfte av fotoresisten, og fjern dermed gullet fra transistorenes kanal. Skyll substratene med aceton, isopropylalkohol og vann og tørk dem med nitrogen. Deponer fotoresisten på underlagene ved hjelp av de samme parametrene i trinn 4.1 og 4.2.
- Plasser enheten i en bromografi og plasser den på underlaget en fotolitografisk plastmaske med de ønskede kildene, avløpene og kontrollportoppsettet. Utsett for UV-lys i 1 min fra toppen, og fjern masken forsiktig, pass på å minimere maskens sidebevegelser over underlaget for å unngå å skrape den.
- Utvikle fotoresisten som beskrevet i trinn 4.4. Ets det eksponerte gullet ved å senke det ned i gulletsingsløsning (trinn 1.3) i 10 s, skyll det med deionisert vann og tørk det ut ved hjelp av nitrogen. Kontroller substratet optisk og fjern fotoresisten ved hjelp av aceton. Skyll med isopropylalkohol og deionisert vann og tørk det med nitrogen.
9. Avsetning og aktivering av Parylen C for pH-sensing
- Deponer fotoresisten på underlagene ved hjelp av de samme parametrene i trinn 4.1 og 4.2.
- Plasser enheten i en bromografi og plasser den på substratet en fotolitografisk plastmaske med åpninger som tilsvarer pH-sensorområdene på OCMFETs. Utsett for UV-lys i 1 min fra toppen, og fjern masken forsiktig, pass på å minimere maskens sidebevegelser over underlaget for å unngå å skrape den.
- Utvikle fotoresisten som beskrevet i trinn 4.4. Beskytt hele enheten, bortsett fra pH-sensorområdene, med polyimidisolasjonstape (se materialtabellen). Deponer et lag på 500 nm parylen C (tilsvarende 1 g parylen C-dimer) på underlaget ved hjelp av de samme parametrene som er beskrevet i trinn 5.1.
MERK: Den totale Parylen C-tykkelsen på pH-sensorområdene er 650 nm. Ingen silan er nødvendig for denne avsetningen. - Fjern forsiktig polyimidisolasjonsbåndet. Utsett substratet for oksygenplasma (5 min og 30 s ved 200 W) for å aktivere Parylen C på pH-sensorområdene i OCMFETs.
MERK: Polyimidisolasjonstapen er nødvendig her for å begrense Parylen C-avsetningen. Faktisk gir en enkel løfting ved hjelp av fotoresisten ikke positive resultater på grunn av den nesten pinholefrie naturen til det konforme belegget oppnådd med Parylene C. - Plasser substratene i en acetonbeholder inne i ultralydbadet i 10 s for å fjerne fotoresisten helt. Skyll substratene med aceton og isopropylalkohol (ikke vann) og tørk dem med nitrogen.
10. Halvlederavsetning, modningskammerplassering og endelig utskjæring av enheten fra PET
- Plasser underlagene på en kokeplate ved 50 °C. Legg en dråpe (1 μL) halvlederløsning (trinn 1.4) på hvert kanalområde, dekk hele underlaget med et lokk, og la det tørke ut under en kjemisk hette i 30 minutter.
- Forbered kulturingskammeret ved å skrive ut en akrylitril butadienstyrenring med en indre radius på 15 mm, en tykkelse på 1 mm og en høyde på 7 mm med en 3D-skriver. Lim modningskammeret på den sentrale delen av substratet ved hjelp av polydimetylsiloksan (forholdet mellom herdemiddelet: 15% etter vekt). Klipp ut enheten fra PET enten manuelt eller ved hjelp av en laserkutter.
11. Elektrisk karakterisering av transistorer
- Karakteriser hver transistor ved hjelp av et kildemeter18,19,20,21 (se materialtabellen).
MERK: Både utgangen og inngangsegenskapene bør måles for å ekstrapolere transistorenes parametere (hovedsakelig transportørenes mobilitet, terskelspenning, ION/ IOFF-forhold og subthreshold helling).
Representative Results
Potensialet i MOA er validert her for både elektriske aktivitetsopptak og metabolsk aktivitetsovervåking. Den nøyaktige beregningen av enhetens evner til å oppdage ekstracellulære virkningspotensialer var basert på en grundig karakterisering med rotte kardiomyocytter kulturer (spesielt i primær rotte kardiomyocytter målt ved 8 dager in vitro [DIV])18. Figur 3A viser en komplett MOA med 16 OCMFETs. Den øverste innfellingen viser et eksempel på en konfluent rotte kardiomyocyttkultur som holder seg til overflaten av MOA. For å markere helsen har cellene blitt immunostert for det sarkomeriske proteinet, tropomyosin, etter innspillingsøkten. Den nederste innfellingen viser et enkelt kardiomyocyttsignal målt med en OCMFET.
Interessant nok kan enheten oppdage spontan elektrisk aktivitet og aktiviteten som er indusert ved administrering av forskjellige kjemikalier, som vist i figur 3B. Denne valideringen var avgjørende for å demonstrere muligheten for å bruke denne tilnærmingen for elektrogen celleinterfacing. På grunn av matrisekonfigurasjonen tillot MOA også rekonstruksjon av forplantningshastigheten til hjertesignalet, og demonstrerte dermed systemets egnethet for studiet av mobilnettverk (figur 3C). For ytterligere validering for å bestemme den faktiske deteksjonsgrensen for enheten, ble MOA også testet med striatale nevroner (21 DIV)18, med interessante resultater når det gjelder signalamplitude og påliteligheten til opptakene. Som vist i figur 3D, kan OCMFET forsterke nevronale feltpotensialer med bemerkelsesverdig stabilitet, og viser signal-til-støy-forhold (SNRS) på opptil 3,2 (i samme område som for SNRs oppnådd med standard MEAs25). Opptaksoppsettet besto av tilpasset flerkanalsellektronikk for transistorbias og signalavlesning og kondisjonering. Hver kanal for det elektriske opptaket har en første fase bestående av en I / V-omformer med en 1 MΩ feedback motstand og et 150 Hz-1,3 kHz bandpassfilter med en spenningsøkning på 110. For alle presenterte målinger var transistorene partisk med VDS = VGS = -1 V. A/D-konverteringen og datavisualiseringen og lagringen ble utført ved hjelp av et datainnsamlingskort (se materialfortegnelsen). Alle måleøktene ble utført inne i et Faraday-bur for å minimere den elektriske miljøstøyen på systemet.
Som tidligere nevnt, ved å utnytte den enkle fysiske funksjonaliseringen som ble presentert i protokollen, var det mulig å forberede svært følsomme pH-sensorer med en supernernstian respons. På grunn av den presenterte fabrikasjonstilnærmingen kan disse pH-enhetene integreres i en MOA og brukes til å overvåke de små pH-variasjonene som er indusert av den metabolske aktiviteten til primære hippocampal rotte nevroner26. Spesielt, som vist i figur 4, ble bare en av de to OCMFETene dedikert til lavfrekvent sensing selektivt funksjonalisert for å demonstrere gjennomførbarheten av tilnærmingen. Denne selektive funksjonaliseringen tillot evalueringen av responsen til de to OCMFETene til kjemisk induserte metabolske variasjoner: spesielt en høy metabolsk tilstand kan oppnås ved hjelp av bikukulin (BIC), en hemmer av GABA A-reseptorer27, mens en lav metabolsk tilstand kan induseres ved tilsetning av tetrodtoksin (TTX), som til slutt forårsaker cellulær død28 . Opptaksoppsettet besto av den samme tilpassede flerkanalsellektronikken som ble brukt til de elektroniske aktivitetsmålingene.
I motsetning til det forrige tilfellet ble to dedikerte kanaler brukt til å registrere de langsomme variasjonene som ble indusert av den cellulære metabolske aktiviteten. Hver kanal besto av en enkel krets som består av to hovedblokker: en I / V-omformer med en 1 MΩ feedback-motstand og et lavpassfilter med en avskjæringsfrekvens på 10 Hz. Transistorene var partiske med VDS = VGS = -1 V, og alle målingene ble utført inne i et Faraday-bur for å minimere virkningen av ekstern støy på opptakene (dette er et spesielt viktig aspekt med tanke på de lave strømsvingningene forårsaket av cellulær metabolsk aktivitet). Under forsøkene ble kulturene opprettholdt i et lavbufret kulturmedium, og hele systemet ble plassert i et kontrollert miljø (37 °C og en kontinuerlig CO2/luftfluks). Som forventet kan bare strømmen til den pH-sensitive OCMFET moduleres ved tilsetning av 25 μM BIC. Dette ble ytterligere bekreftet av induksjonen av den nåværende variasjonen av den tilsvarende variasjonen av den cellulære metabolske aktiviteten.
Det samme eksperimentet ble gjentatt etter tilsetning av 10 μM TTX, noe som resulterte i en gradvis reduksjon av cellulær metabolisme. Etter tillegg av TTX viste verken pH-sensitive OCMFET eller pH-ufølsomme noen respons, og viste dermed effekten av tilnærmingen. Disse resultatene viser effektiviteten av den foreslåtte funksjonaliseringen og dens relative stabilitet i opptil 2 uker. En viktig konklusjon som kan trekkes fra de foreslåtte forsøkene (både den elektriske aktiviteten og den metabolske aktiviteten) er at det er mulig å forberede forskjellige typer sensorer ved selektivt å funksjonalisere forskjellige OCMFETs innenfor samme dyrkingsområde. Dette aspektet representerer en ikke-triviell prestasjon i biosensing for cellulære applikasjoner fordi det å kunne overvåke forskjellige parametere innenfor samme cellekultur er avgjørende for bedre karakterisering av kompleksiteten til disse biologiske systemene.
Figur 1: Sett ovenfra for en 16-kanals MOA for metabolsk og elektrisk overvåking av elektroaktive celler. Skalastang = 1 cm. Forkortelser: OCMFETs = organiske ladningsmodulerte felteffekttransistorer; FG = flytende port; S/D = kilde/avløp; MOA = micro OCMFET-matrise. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Hovedfabrikasjonstrinnene i en MOA for metabolsk og elektrisk overvåking av elektroaktive celler. (A og B) Den fordampede Ti-filmen er mønstret ved hjelp av en standard fotolittografisk prosess for å forberede den flytende porten til OCMFETs. (C) Avsetning på 15 nm parylen C. Dette laget, sammen med det innfødte Ti-oksidet, fungerer som transistorenes port dielektriske. (D og E) Parylen C-laget er mønstret ved hjelp av plasmaoksygenbehandling. Et mønstret fotoresistlag brukes til selektivt å eksponere sensorområdene for de elektriske opptakene og de flytende portkontaktene. (F) Mønster av Au-toppkontaktene, nemlig kilde, avløp, kontrollport og flytende port tilbake kontakt. En selvjusteringsteknikk brukes til å forbedre enhetens elektriske ytelse. (G-I) Avsetning av det andre laget av Parylen C på sensing området av OCMFETs for metabolsk aktivitet overvåking. Etter oksygenplasmaeksponeringen vil dette laget fungere som pH-sensitiv membran (J). (K) Tverrsnitt av en komplett MOA (med materialer) etter avsetning av den organiske halvlederen (TIPS Pentacene) og kulturkammerposisjoneringen. Forkortelser: OCMFETs = organiske ladningsmodulerte felteffekttransistorer; FG = flytende port; S/D = kilde/avløp; MOA = micro OCMFET-matrise; CG = kontrollport; PET = polyetylentereftalat; Par C = Parylen C; TIPS = 6,13-bis(triisopropylsilylethynyl) pentacene; ABS = akryllonitril butadien styren. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Cellulære elektriske aktivitetsopptak med en MOA. (A) En sammenfallende kultur av rottekardiomyocytter (8 DIV) som holder seg til overflaten av en MOA, festet etter en opptaksøkt og immunostert for sarkomerisk protein, tropomyosin (øvre innsett). Bunninnsats: Eksempel på et enkelt kardiomyocyttsignal målt med en OCMFET. Skalastang = 150 μm. (B) Kjemisk tuning av den elektriske aktiviteten til en kardiomyocyttkultur. Aktivitetsakselerasjonen skyldes tilsetning av 100 mM noradrenalin, mens undertrykkelse resulterte i tilsetning av 100 mM verapamil. Venstre: slå frekvensmodulering; høyre: statistikk over 5 OCMFETs-gjennomsnitt og standardavvik: spike-count på 4 min basal (129 ± 4,6), norepinefrinmediert (280 ± 28,6) og verapamil-mediert aktivitet (15 ± 1,9). (C) Rekonstruksjon av forplantning av et hjertesignal. Høyre: rasterplott av kulturens spontane aktivitet som indikerer forplantning av signalet fra sted 14 til sted 41 (høyre). (D) Virkningspotensialer for striatale celler fra rotteembryo (21 DIV). Dette tallet er endret fra 18. Forkortelser: OCMFET = organisk ladningsmodulert felteffekttransistor; MOA = micro OCMFET-matrise; NE = noradrenalin; VER = verapamil; DIV = dager in vitro. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Metabolske aktivitetsopptak med en MOA. Respons fra de (A) pH-sensitive og (B) pH-ufølsomme kanalene til en MOA tilsetning av 25 μM BIC før og etter tilsetning av 10 μM TTX. Etter TTX-tillegget blir oppførselen til den pH-sensitive kanalen lik den for den pH-ufølsomme. Spesielt kan ingen nåværende variasjon observeres etter BIC-tillegget på grunn av TTX-indusert cellulær død. (C) MOA for metabolske aktivitetsopptak. De pH-sensitive og pH-ufølsomme OCMFETene er skissert i henholdsvis grønt og rødt. Innfelt: sunne hippocampale nevroner dyrket på enheten etter 15 DIV. Skala bar = 50 μm. Dette tallet er endret fra 26. Forkortelser: OCMFET = organisk ladningsmodulert felteffekttransistor; MOA = micro OCMFET-matrise; BIC = bicuculline; TTX = tetrodotoxin; DIV = dager in vitro. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
I motsetning til tidligere metoder for fabrikasjon av OCMFETs for cellulære applikasjoner18,29, er den foreslåtte metoden spesielt designet for å forberede MOAer som samtidig kan oppdage elektrisk og metabolsk cellulær aktivitet. Videre har denne tilnærmingen for å oppnå pH-følsomhet fordelen av å være kompatibel med standard fabrikasjonsprotokoller og innebærer ingen kjemisk modifikasjon av sensorområdet (dette aspektet sikrer biokompatibiliteten til hele enheten). pH-følsomheten oppnås ved hjelp av det samme materialet som brukes som en port dielektrisk (dvs. den biokompatible Parylen C), noe som gjør denne tilnærmingen rask og reproduserbar.
Det endelige resultatet av denne tilnærmingen er et fleksibelt, gjennomsiktig, rimelig og multisensing organisk verktøy for in vitro mobilapplikasjoner. Det faktum at dette kan oppnås ved hjelp av en enkelt transistorstruktur og en enkel fysisk modifikasjon av sensorområdet, legger til fordelene ved bruk av organiske elektroniske materialer og metoder. Videre, fordi transduksjonsprinsippet til OCMFET ikke strengt avhenger av det spesifikke halvleder- eller FG-materialet, kan hele prosessen endres og oppskalers avhengig av den spesifikke applikasjonen.
Et kritisk aspekt av den foreslåtte teknikken er relatert til reproduserbarheten av plasmaaktiveringsteknikken. For å oppnå konsistente resultater må både Parylen C-tykkelsen og etsehastigheten kontrolleres. Hyppig kalibrering av Parylene C-avsetningsprosessen og plasmarenseren er absolutt nødvendig. Andre kritiske aspekter, som også bidrar til prosessens reproduserbarhet, er forsiktig håndtering av enheten og avsetningen av den organiske halvlederen. En enkel drop-casting teknikk ble brukt her, som iboende utgjør reproduserbarhetsbegrensninger. For å minimere disse problemene, som beskrevet i protokolltrinn 10.1, bør samme mengde halvlederløsning brukes hver gang, og fordampning av løsningsmidlet bør standardiseres så mye som mulig. Å holde en konstant temperatur ved hjelp av en varm plate og dekke substratet etter hver dråpeavsetning vil bidra til å bremse fordampningsprosessen. For å minimere dette problemet ytterligere, kan avsetningsteknikken (f.eks. ved hjelp av en blekkskriverutskriftsmetode) byttes30.
En begrensning av den foreslåtte protokollen stammer fra arten av funksjonaliseringen av OCMFET for pH-sensing. Stabiliteten til pH-sensorene er begrenset til noen uker26. Stabilitetsvinduet til den foreslåtte tilnærmingen er imidlertid tilstrekkelig stort til å dekke standard inkubasjonstider som trengs for nevronkulturvekst (2-3 uker). Andre typer sensing områdefunksjonalisering bør vurderes for lengre eksperimenter. Fabrikasjonsprotokollen bruker en dedikert ryggkontakt, noe som gir elektrisk tilgang til FG-ene. Denne kontakten, som er flytende under normal drift av enheten, kan utnyttes for elektrisk karakterisering av enheten og funksjonalisering av sensorområdene ved hjelp av forskjellige teknikker (f.eks. elektrodeposisjon).
Denne prosedyren representerer en praktisk måte å forberede en flerregistreringsenhet for mobilapplikasjoner uten behov for ekspansive materialer eller renromsfasiliteter. Til tross for ytelses- og stabilitetsbegrensningene på grunn av ansettelsen av en organisk halvleder og fysisk (ikke kjemisk) funksjonalisering av sensorområdet, kan lignende tilnærminger brukes til å forberede billige (og potensielt disponible), mekanisk fleksible og optisk gjennomsiktige sensorer og biosensorer, som kan gi forskere i cellulær biologi, vevsteknikk og nevrovitenskap nye spesialiserte verktøy for å studere cellulære systemer in vitro.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å erklære.
Acknowledgments
Forfatterne erkjenner finansiering fra EUs forsknings- og innovasjonsprogram Horizon 2020 under tilskuddsavtale ARS01_00996 nr.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | Sigma Aldrich | 440159 | |
| 3D printer Makerbot Replicator 2x | Makerbot | https://www.makerbot.gr/. Estimated price: 2k-3k euros. | |
| ABS filament | |||
| Anisole | Sigma Aldrich | 296295 | |
| Bromograph model Hellas | Bungard | https://www.bungard.de/. Estimated price: 1k-2k euros. | |
| Gold | Local seller | ||
| Hydrofluoric acid | Sigma Aldrich | 695068 | |
| Iodine | Sigma Aldrich | 207772 | |
| Kapton tape | polyimide insulation tape | ||
| Laser cutter VLS2.30 | Universal Laser Systems | https://www.ulsinc.com/it. Estimated price: 20k euros. | |
| Multichannel Systems acquisition board | www.multichannelsystems.com | ||
| NaOH pellets | Sigma Aldrich | 567530 | |
| Parylene C dimer | SCS special coating systems coating | ||
| PDMS Silgard 184 | Sigma Aldrich | 761036 | |
| PDS 2010 LABCOATER 2 Parylene Deposition System | SCS special coating systems | https://scscoatings.com/. Estimated price: 50k euros | |
| PET film biaxially oriented (thickness 0.25 mm) | Goodfellow | ES301450 | |
| Petri dishes | |||
| Plasma cleaner Gambetti "Tucano" | Gambetti | https://www.gambetti.it/. Estimated price: 20k euros. | |
| Positive photoresist AZ1518 | MicroChemicals | ||
| Potassium iodide KI | Sigma Aldrich | 221945 | |
| Source Meter 2636 | Keithley | https://it.farnell.com/. Estimated price: 18k euros | |
| Spin coater unit | Ossila | https://www.ossila.com/. Estimated price: 2.5k euros. | |
| Stereoscopic microscope SMZ745T | Nikon | https://www.microscope.healthcare.nikon. com/. Estimated price: 2k-3k euros. |
|
| Thermal evaporator unit | |||
| TIPS pentacene (6,13-Bis(triisopropylsilylethynyl)-pentacene) | Sigma Aldrich | 716006 | |
| Titanium wire | Goodfellow | TI005129 | |
| Ultrasonic bath | Falc Instruments | https://www.falcinstruments.it/. Estimated price: 1k euro. |
References
- Hubel, D. H. Tungsten microelectrode for recording from single units. Science. 125 (3247), 549-550 (1957).
- Verzeano, M., Negishi, K., Angeles, L. Neuronal activity in cortical and thalamic networks. A study with multiple microelectrodes. Journal of General Physiology. 43 (6), 177-195 (1960).
- Thomas, C. A. Jr, Springer, P. A., Loeb, G. E., Berwald-Netter, Y., Okun, L. M. A miniature microelectrode array to monitor the bioelectric activity of cultured cells. Experimental Cell Research. 74 (1), 61-66 (1972).
- Grattarola, M., Martinoia, S. Modeling the neuron-microtransducer junction: from extracellular to patch recording. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 40 (1), 35-41 (1993).
- Wallace, K., Strickland, J. D., Valdivia, P., Mundy, W. R., Shafer, T. J. A multiplexed assay for determination of neurotoxicant effects on spontaneous network activity and viability from microelectrode arrays. NeuroToxicology. 49, 79-85 (2015).
- Bergveld, P. Development, operation, and application of the tool for electrophysiology. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 19 (5), 342-351 (1972).
- Bergveld, P., Wiersma, J., Meertens, H. Extracellular potential recordings by means of a field effect transistor without gate metal, called OSFET. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 23 (2), 136-144 (1976).
- Fromherz, P., Offenhausser, A., Vetter, T., Weis, J. A neuron-silicon junction: a Retzius cell of the leech on an insulated-gate field-effect transistor. Science. 252 (5010), 1290-1293 (1991).
- Martinoia, S., et al. Development of ISFET array-based microsystems for bioelectrochemical measurements of cell populations. Biosensors and Bioelectronics. 16 (9-12), 1043-1050 (2001).
- Heer, F., et al. CMOS microelectrode array for the monitoring of electrogenic cells. Biosensors and Bioelectronics. 20 (2), 358-366 (2004).
- Berdondini, L., et al. Active pixel sensor array for high spatio-temporal resolution electrophysiological recordings from single cell to large scale neuronal networks. Lab on a Chip. 9 (18), 2644-2651 (2009).
- Maccione, A., et al. Multiscale functional connectivity estimation on low-density neuronal cultures recorded by high-density CMOS micro electrode arrays. Journal of Neuroscience Methods. 207 (2), 161-171 (2012).
- Kibler, A. B., Jamieson, B. G., Durand, D. M. A high aspect ratio microelectrode array for mapping neural activity in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 204 (2), 296-305 (2012).
- Frega, M., Tedesco, M., Massobrio, P., Pesce, M., Martinoia, S. Network dynamics of 3D engineered neuronal cultures: a new experimental model for in-vitro electrophysiology. Scientific Reports. 4, 5489 (2014).
- Zuo, L., Yu, S., Briggs, C. A., Kantor, S., Pan, J. Y. Design and fabrication of a three-dimensional multi-electrode array for neuron electrophysiology. Journal of Biomechanical Engineering. 139 (12), (2017).
- Spanu, A., et al. A three-dimensional micro-electrode array for in-vitro neuronal interfacing. Journal of Neural Engineering. 17 (3), 036033 (2020).
- Spanu, A., Martines, L., Bonfiglio, A. Interfacing cells with organic transistors: a review of in vitro and in vivo applications. Lab on a Chip. 21 (5), 795-820 (2021).
- Spanu, A., et al. An organic transistor-based system for reference-less electrophysiological monitoring of excitable cells. Scientific Reports. 5, 8807 (2015).
- Viola, F. A., Spanu, A., Ricci, P. C., Bonfiglio, A., Cosseddu, P. Ultrathin, flexible and multimodal tactile sensors based on organic field-effect transistors. Scientific Reports. 8, 8073 (2018).
- Napoli, C., et al. Electronic detection of DNA hybridization by coupling organic field-effect transistor-based sensors and hairpin-shaped probes. Sensors. 18 (4), 990 (2018).
- Spanu, A., et al. A reference-less pH sensor based on an organic field effect transistor with tunable sensitivity. Organic Electronics. 48, 188-193 (2017).
- Lundgaard, I., et al. Direct neuronal glucose uptake heralds activity-dependent increases in cerebral metabolism. Nature Communications. 6, 6807 (2015).
- Zhang, Y. S., et al. Multisensor-integrated organs-on-chips platform for automated and continual in situ monitoring of organoid behaviors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), 2293-2302 (2017).
- Yu, H., et al. A novel design of multifunctional integrated cell-based biosensors for simultaneously detecting cell acidification and extracellular potential. Biosensors and Bioelectronics. 24 (5), 1462-1468 (2009).
- Maccione, A., et al. A novel algorithm for precise identification of spikes in extracellularly recorded neuronal signals. Journal of Neuroscience Methods. 177 (1), 241-249 (2009).
- Spanu, A., Tedesco, M. T., Martines, L., Martinoia, S., Bonfiglio, A. An organic neurophysiological tool for neuronal metabolic activity monitoring. APL Bioengineering. 2 (4), 046105 (2018).
- Díaz-García, C. M., et al. Neuronal stimulation triggers neuronal glycolysis and not lactate uptake. Cell Metabolism. 26 (2), 361-374 (2017).
- Xie, Y., Dengler, K., Zacharias, E., Wilffert, B., Tegtmeier, F. Effects of the sodium channel blocker tetrodotoxin (TTX) on cellular ion homeostasis in rat brain subjected to complete ischemia. Brain Research. 652 (2), 216-224 (1994).
- Caboni, A., Orgiu, E., Barbaro, M., Bonfiglio, A. Flexible organic thin-film transistors for pH monitoring. IEEE Sensors Journal. 9 (12), 1963-1970 (2009).
- Fraboni, B., Bonfiglio, A., Basiricò, L. Inkjet printing of transparent, flexible, organic transistors. Thin Solid Films. 520, 1291-1294 (2011).
