Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

ماماري الظهارية والبطانية الخلايا كرويدات كنموذج وظيفي محتمل في المختبر لأبحاث سرطان الثدي

Published: July 12, 2021 doi: 10.3791/62940
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 1, 1, 1,3
1Department of Reproductive Endocrinology, Wagistrasse 14, University of Zurich and University Hospital Zurich, 2Department of Dermatology, Wagistrasse 18, University of Zurich and University Hospital Zurich, 3Department of Pharmacology and Chemical Biology, University of Pittsburgh

Summary

تساهم المحادثات المتقاطعة بين الخلايا الظهارية الثديية والخلايا البطانية بشكل كبير في تطور سرطان الثدي ونمو الورم والانبثاث. في هذه الدراسة، تم صنع كرويدات من خلايا سرطان الثدي جنبا إلى جنب مع الخلايا البطانية الوعائية و / أو اللمفاوية وإثبات قابليتها للتطبيق كنظام في المختبر لأبحاث سرطان الثدي.

Abstract

سرطان الثدي هو السبب الرئيسي للوفيات بين النساء. نمو خلايا سرطان الثدي ونقائلها اللاحقة هو عامل رئيسي لتطورها. على الرغم من أن الآليات المشاركة في تعزيز نمو سرطان الثدي قد درست بشكل مكثف باستخدام الثقافات الأحادية لخلايا سرطان الثدي مثل خلايا MCF-7 ، إلا أنه لم يتم التحقيق بعمق في مساهمة أنواع الخلايا الأخرى ، مثل الخلايا البطانية الوعائية واللمفاوية التي تشارك بشكل وثيق في نمو الورم. التفاعل بين الخلية والخلية يلعب دورا رئيسيا في نمو الورم وتطوره. تكوين النيوانجيوجينيسيس، أو تطور الأوعية، أمر ضروري لنمو الورم، في حين أن الجهاز اللمفاوي بمثابة بوابة لهجرة الخلايا السرطانية والانبثاث اللاحق. تقدم الدراسات الحديثة أدلة على أن الخلايا البطانية الوعائية واللمفاوية يمكن أن تؤثر بشكل كبير على نمو الخلايا السرطانية. هذه الملاحظات تعني الحاجة إلى تطوير نماذج في المختبر من شأنها أن تعكس بشكل أكثر واقعية عمليات نمو سرطان الثدي في الجسم الحي. وعلاوة على ذلك، تتطلب القيود المفروضة على البحوث الحيوانية تطوير نماذج الجسم الحي السابق لتوضيح أفضل للآليات المعنية.

توضح هذه المقالة تطور كرويات سرطان الثدي المكونة من كل من خلايا سرطان الثدي (خلايا MCF-7 الإيجابية لمستقبلات هرمون الاستروجين) والخلايا البطانية الوعائية و / أو اللمفاوية. يصف البروتوكول نهجا مفصلا خطوة بخطوة في إنشاء كرويات ثنائية الخلية باستخدام نهجين مختلفين ، إسقاط معلق (معيار الذهب ورخيصة) ولوحات U-bottom 96 جيدا (مكلفة). يتم توفير تعليمات متعمقة لكيفية التقاط بدقة كرويات شكلت لرصد النمو عن طريق التحجيم المجهري وتقييم الجدوى باستخدام تلطيخ الخلايا الميتة والحية. وعلاوة على ذلك، يتم تحديد إجراءات لإصلاح كرويدات للتقسم وتلطيخ مع الأجسام المضادة الخاصة بالنمو للتمييز بين أنماط النمو في كرويدات. بالإضافة إلى ذلك، يتم توفير تفاصيل لإعداد كرويدات مع الخلايا المصابة وأساليب لاستخراج الحمض النووي الريبي للتحليل الجزيئي. في الختام، توفر هذه المقالة تعليمات متعمقة لإعداد كرويات متعددة الخلايا لأبحاث سرطان الثدي.

Introduction

استخدام الحيوانات للتجارب له حدود. لا يمكن للدراسات الحيوانية أن تحاكي بدقة تطور المرض لدى البشر، وليس لدى الحيوانات والبشر استجابات متطابقة لمسببات الأمراض. بالإضافة إلى ذلك، القيود المفروضة على التجارب على الحيوانات بسبب المخاوف من معاناة الحيوانات والمشاكل الأخلاقية1,2 تقييد برامج البحث بشكل متزايد. In vitro وقد وضعت نظم على نطاق واسع للتحايل على استخدام الحيوانات؛ وعلاوة على ذلك، فإن استخدام الخلايا البشرية جعلت in vitro نماذج أكثر ملاءمة للتحقيق المرضي والعلاجي. تستخدم ثقافات الخلايا أحادية الطبقة التقليدية (2D) على نطاق واسع لأنها تحاكي الأنسجة البشرية إلى حد ما. ومع ذلك ، تفشل الثقافات الأحادية 2D في محاكاة الأعضاء البشرية ، ولا تستطيع الثقافات الأحادية 2D محاكاة البيئة الدقيقة المعقدة للأعضاء الأصلية وتقليد in vivo موقف3,4,5,6. بالإضافة إلى ذلك ، في ثقافات الخلايا أحادية الطبقة ، يمكن أن تدمر العلاجات الدوائية / تلحق الضرر بكل الخلايا بسهولة. الأهم من ذلك ، يمكن التغلب على بعض هذه القيود عن طريق التحول إلى متعدد الطبقات ثلاثي الأبعاد (3D) ثقافات الخلية7,8. في الواقع، أظهرت نماذج الثقافة ثلاثية الأبعاد أنها تعكس بشكل أفضل البنية الخلوية والتخطيط ووظيفة الخلايا في الأنسجة الأولية. يمكن تشكيل هذه الثقافات ثلاثية الأبعاد باستخدام مجموعة متنوعة من خطوط الخلايا ، على غرار الجهاز الوظيفي. في الواقع ، هناك نموذجان من الثقافات ثلاثية الأبعاد. نموذج واحد ينتج كرويدات من الخلايا المجمعة التي تشكل مجموعات وإعادة تنظيمها في المجالات (نماذج خالية من السقالات). والثاني ينتج organoids ، التي لديها بنية أكثر تعقيدا وتتألف من مجموعات من خلايا متعددة خاصة بالأعضاء ، والتي تعتبر نسخة مصغرة من الأعضاء9,10. ونتيجة لهذا، تمثل أنظمة الثقافة ثلاثية الأبعاد تقنية مبتكرة مع العديد من التطبيقات البيولوجية والسريرية. وهكذا ، فإن كرويدات و organoids لديها العديد من التطبيقات لنمذجة الأمراض والدراسات المتعلقة الطب التجديدي ، وفحص الأدوية ، والدراسات السمية6,11,12,13,14,15. كرويات مسرطنة، مستمدة من التكنولوجيا ثلاثية الأبعاد، إعادة مورفولوجيا والنمط الظاهري لأنواع الخلايا ذات الصلة، تحاكي in vivo البيئة الدقيقة الورم، ونموذج الاتصالات الخلية ومسارات الإشارات التي تعمل أثناء تطور الورم16,17,18. بالإضافة إلى ذلك ، لتحسين فهم بيولوجيا السرطان ، يمكن أيضا استخدام كرويدات / عضويات الورم لتحديد علاج محتمل مضاد للسرطان خاص بالمرضى (شخصي) وتقييم فعاليته وسمية وآثاره على المدى الطويل19,20,21,22. وقد فتحت Spheroids فرصا بارزة للتحقيق في علم وظائف الأعضاء المرضية ، والنمذجة المرض وفحص المخدرات بسبب قدرتها على الحفاظ على بنية الأنسجة الخلوية وثلاثية الأبعاد ، والقدرة على تقليد in vivo الوضع ، والتفاعلات الخلية الخلية. ومع ذلك ، يجب على المرء أيضا أن يكون على بينة من القيود المفروضة على هذا النظام ، مثل عدم وجود مكون الأوعية الدموية / الجهاز الجهازي ، والجهاز المناعي الوظيفي أو العصبي ، ويمثل النظام نهجا اختزاليا بالمقارنة مع النماذج الحيوانية. في الواقع ، على النقيض من النماذج الحيوانية ، لا توفر الهياكل ثلاثية الأبعاد سوى تقريب البيولوجيا داخل جسم الإنسان. قد يساعد فهم قيود الطريقة ثلاثية الأبعاد الباحثين على تصميم عمليات أكثر دقة وصالحة لإنتاج كرويدات تمثل جهازا بشكل أفضل على نطاق أوسع23,24,25.

السرطان هو السبب الرئيسي للوفاة في جميع أنحاء العالم، وسرطان الثدي هو السرطان الأكثر شيوعا لدى النساء26،27،28. لمحاكاة البيئة الدقيقة المعقدة لسرطان الثدي، يجب استزراع كرويات سرطان الثدي باستخدام الخلايا التي تلعب دورا بارزا في أورام الثدي، أي الخلايا الظهارية والخلايا البطانية والخلايا الليفية و/أو الخلايا المناعية. وعلاوة على ذلك، بالنسبة للكفرويد الذي يمثل سرطان الثدي، ينبغي أيضا النظر في التعبير عن مستقبلات الهرمونات الأنثوية (مستقبلات هرمون الاستروجين/البروجسترون)، والقدرة على الحفاظ على الحالة النسيجية للورم المريض، والقدرة على محاكاة الاستجابة للعلاج. وقد أظهرت الدراسات أن أنظمة 3D المشاركة في الثقافة لديها تنظيم الخلوية مماثلة لتلك التي من الأنسجة الأولية في الجسم الحي,لديها القدرة على التفاعل في الوقت الحقيقي للمحفزات, ولها مستقبلات الاندروجين وظيفية29,30,31,32. وبالتالي ، يمكن أن يكون نهجا مماثلا مفيدا لمحاكاة ورم الثدي في المختبر. الغرض من البروتوكول الحالي هو إنشاء طريقة جديدة لتوليد كرويدات سرطان الثدي. تستخدم هذه الطريقة خلايا MCF-7 الإيجابية لمستقبلات الإستروجين (خط خلايا بشرية خالدة من الخلايا الظهارية) والخلايا البطانية الوعائية (HUVECs) أو الخلايا البطانية اللمفاوية (HMVEC-DNeo) لإنشاء نموذج يحاكي أو يعكس عن كثب التفاعلات بين هذه الخلايا داخل الورم. على الرغم من أن MCF-7 (الإستروجين استجابة) والخلايا البطانية قد استخدمت لتطوير كرويدات في هذه الدراسة, خلايا أخرى مثل الخلايا الليفية التي تمثل ~ 80٪ من كتلة ورم الثدي, ويمكن أيضا أن تكون مجتمعة في المستقبل لتمثيل أفضل وتقليد ورم الثدي.

هناك عدة طرق لتشكيل كرويدات، مثل: 1) طريقة القطيرات المعلقة التي تستخدم الجاذبية33،34؛ 2) طريقة الارتفاع المغناطيسي الذي يستخدم الجسيمات النانوية المغناطيسية يتعرض لمغناطيس خارجي35، و 3) طريقة لوحة كروية الدقيقة التي يتم تنفيذها من قبل خلايا البذر على لوحات منخفضة المرفق36،37. على أساس الأساليب الموجودة، والتي تستخدم نوع خلية واحدة فقط، وقد تم الأمثل البروتوكول الحالي باستخدام الخلايا الظهارية والظهارية لمحاكاة أفضل لظروف نمو أورام سرطان الثدي في الجسم الحي38،39،40،41. ويمكن تحقيق هذه الطريقة بسهولة في المختبر بتكلفة منخفضة وبأقل قدر من الاحتياجات من المعدات. وبناء على حاجة/أهداف المختبر، استخدمت نهج مختلفة لتشكيل كرويدات والحصول على المواد الخلوية ذات الصلة من هذه الكرويات. في هذا السياق ، بالنسبة لتحليل الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي أو البروتين ، يتم إنتاج كرويدات ثلاثية الأبعاد عن طريق الخلايا البطانية والظهارية المشتركة مع طريقة الإسقاط المعلق. ومع ذلك ، للدراسات الوظيفية ، على سبيل المثال ، لمراقبة نمو الخلايا بعد التدخل القصير (siRNA) العدوى و / أو العلاج الهرموني ، يتم إنشاء كرويدات باستخدام لوحات U-bottom.

الغرض من هذا البروتوكول التقني هو تقديم وصف مفصل خطوة بخطوة ل1) تشكيل سرطان الثدي كرويدات متعددة الخلايا، 2) إعداد عينات لتلطيخ الخلايا النسيجية، و 3) جمع الخلايا لاستخراج الحمض النووي الريبي، الحمض النووي، والبروتينات. يتم استخدام كل من طريقة إسقاط شنقا غير مكلفة ولوحات U-أسفل أكثر تكلفة لتشكيل كرويدات. هنا، يتم توفير بروتوكول لإعداد (تحديد) كرويات للقسم والتلوي المناعي اللاحق مع علامات لتقييم انتشار الخلايا، وموت الخلايا المبرمج، وتوزيع الخلايا الظهارية والظهارية داخل كروية. بالإضافة إلى ذلك، يعرض هذا البروتوكول تحليلا كاملا خطوة بخطوة للبيانات النسيجية باستخدام برنامج ImageJ. يختلف تفسير البيانات البيولوجية حسب نوع التجربة والأجسام المضادة المستخدمة. تم إجراء تقسيم كرويات ثابتة وتلطيخ لاحق للأقسام من قبل مختبر علم الأمراض الروتيني (Sophistolab: info@sophistolab.ch)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ثقافة الخلية

ملاحظة: إجراء التعامل مع الخلايا في ظل ظروف معقمة.

  1. زراعة الخلايا البطانية الوريدية البشرية (HUVECs)
    1. معطف 75 سم2 قوارير مع الكولاجين (5 ميكروغرام / سم2)(ذيل الفئران) بين عشية وضحاها (ON) في درجة حرارة الغرفة (RT) أو 2-3 ساعة في 37 درجة مئوية، وشطف بالماء، والسماح للقارورة لتجف.
    2. تنمو HUVECs في المتوسط النمو (EBM-2, بطانة البازل المتوسطة-2) تستكمل مع الجلوتامين (1x = 2 mM), المضادات الحيوية المضادة للميكويك (AA; 100 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين, 100 ميكروغرام/مل من البنسلين و0.025 ميكروغرام/مل من الأمفوتريسين B)، LSGS (2٪ v/v FCS، 1 ميكروغرام/مل من الهيدروكورتيزون، 10 نانوغرام/مل من عامل نمو البشرة البشري، 3 نانوغرام/مل من عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية البشرية، 10 ميكروغرام/مل من الهيبارين) و10٪ FCS (مصل العجل الجنيني) في ظل ظروف زراعة الأنسجة القياسية (37 درجة مئوية، 5٪ CO2). تغيير المتوسطة كل يومين حتى تصل الخلايا التقاء 70٪-80٪.
    3. غسل الثقافات الفرعية التقاء مع 5 مل من HBSS (دون Ca2 + و Mg2 +) وإضافة 3 مل من التريبسين (0.25٪ مخففة في HBSS (بدون Ca2 + و Mg2 +)).
      ملاحظة: HBSS يمكن أيضا استبدال برنامج تلفزيوني.
    4. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة (فحص مجهري ما إذا كانت الخلايا منفصلة وتقريبها) ووقف رد فعل فصل بإضافة 6 مل من 10٪ FCS المتوسطة (DMEM-F12 أو EBM-2، 10٪ FCS).
    5. الطرد المركزي تعليق الخلية في 250 × ز لمدة 5 دقائق في RT والتخلص من supernatant.
    6. تعليق الخلايا في متوسط النمو والبذور في 75 سم2 قوارير أو أطباق الثقافة.
  2. ميشيغان مؤسسة السرطان-7 (MCF-7, خلايا الورم الغدي الثدي البشري) ثقافة فرعية
    1. تنمو خطوط خلايا سرطان الثدي البشري في 75 سم2 قوارير في المتوسط النمو (DMEM/F12 المتوسطة تكملها الجلوتامين التجارية (1x), مضاد للمضادات الحيوية المضادة للميكويك (AA; 100 ميكروغرام/مل من الستربتومايسين، و100 ميكروغرام/مل من البنسلين و0.025 ميكروغرام/مل من الأمفوتريسين B)، و10 في المائة FCS في ظل ظروف زراعة الأنسجة القياسية (37 درجة مئوية، 5 في المائة CO2). تغيير المتوسطة كل 2-3 أيام.
    2. غسل ثقافات الخلايا تحت السائل (70٪ -80٪ التقاء) مع 5 مل من HBSS (بدون Ca2 + و Mg2+) وإضافة 3 مل من التريبسين (0.5٪ مخففة في HBSS (بدون Ca2 + و Mg2 +) عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق (تحقق مجهريا من أن الخلايا منفصلة).
      ملاحظة: HBSS يمكن أيضا استبدال برنامج تلفزيوني.
    3. إضافة 8 مل من 10٪ FCS المتوسطة لوقف رد فعل فصل، والطرد المركزي في 250 × ز لمدة 5 دقائق في RT والتخلص من supernatant.
    4. تعليق بيليه في المتوسط النمو ولوحة في 75 سم2 قوارير أو أطباق الثقافة.

2. تشكيل كروي

  1. لوحة 5 × 105 خلايا / مل (HUVECs وMCF-7) في طبق مستدير 3.5 سم والثقافة لمدة 48 ساعة.
  2. علاج أو إعادة إصابة الخلايا المطلية لمدة 24 ساعة أو حسب الرغبة.
  3. خطوة اختيارية أجريت في 96 جيدا U-أسفل لوحة: غسل الخلايا مع 1 مل من HBSS (Ca2 + و Mg2+) وصمة عار HUVECs باستخدام صبغة زرقاء (0.5 ميكروغرام / مL) وخلايا MCF-7 باستخدام صبغة خضراء (0.5 ميكرومتر) مخففة في متوسط النمو المعنية ومكان في حاضنة 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 30-40 دقيقة.
  4. غسل الخلايا مع 1 مل من HBSS (دون Ca2 + و Mg2 +)، إضافة 1 مل من كاشف مفرزة الأنزيمية (0.25٪ تريبسين لHUVEC و 0.5٪ تريبسين لMCF-7) إلى كل طبق جولة باستخدام ماصة P1000، ومن ثم احتضان لمدة 2-5 دقائق حتى يتم فصل الخلايا.
  5. جمع كل نوع الخلية بشكل منفصل في 5 مل جولة أسفل أنبوب البوليسترين وإضافة 1 مل من 10٪ FCS المتوسطة باستخدام ماصة P1000 لوقف رد الفعل الأنزيمي. الطرد المركزي تعليق الخلية في 250 × ز لمدة 5 دقائق.
  6. يستنشق بعناية supernatant وتعليق الخلايا في 1 مل من المتوسطة خالية من الستيرويد (EBM-2, الجلوتامين , مضاد حيوي مضاد للميكون, 0.4٪ FCS SF (الفحم جردت)).
    ملاحظة: يمكن استبدال المتوسطة الخالية من الستيرويد مع متوسط النمو العادي.
  7. استخدام 100 ميكرولتر من كل تعليق الخلية المخفف مع 10 مل من Diluent II (انظر جدول المواد)لتحديد إجمالي عدد الخلايا وحساب كمية المعالجة المتوسطة (EBM-2، الجلوتامين، مضاد المضادات الحيوية، 0.4٪ FCS SF، السيارة / العلاج) اللازمة للحصول على تعليق الخلية من 5 × 103 خلايا / مل أو 3.4 × 105 خلايا / مل لكل نوع الخلية.
    1. عدد الخلايا
      1. قم بتشغيل الجهاز وامسحه بالضغط على زري Function and Start (إعداد S3)، مع حل Diluent II في قارورة عداد الخلية.
      2. استخدم إعداد S4 واضغط على البدء لقياس الفراغ باستخدام حل Diluent II الطازج.
      3. تغيير قارورة التلألؤ مع 100 ميكرولتر من تعليق الخلية في 10 مل من محلول Diluent II وقياس العينات: إعداد S4 واضغط ابدأ.
      4. لاحظ عدد الخلايا لكل مل على الشاشة الرقمية.
        ملاحظة: يمكن أيضا إجراء عد الخلايا باستخدام أنظمة يدوية أو تلقائية أخرى: خطوط الشبكة لقياس الخلايا، وتكنولوجيا عد الخلايا المبعثرة للضوء، والمعاوقة الكهربائية، والنظم القائمة على التصوير باستخدام تلطيخ الخلايا، على سبيل المثال، ثلاثية اللون الأزرق.
    2. 96-جيدا لوحات U-أسفل
      1. إعداد 5 مل من كل تعليق الخلية (5 × 103 خلايا / مل) ومزجها للحصول على حجم النهائي من 10 مل في نسبة 1:1.
      2. استخدام ماصة تكرار دليل إلى ماصة من أصل 100 ميكرولتر من تعليق الخلية في كل بئر من لوحات يو القاع 96 جيدا.
      3. ضع اللوحة في حاضنة تحت ظروف زراعة الأنسجة القياسية وتحقق من تكوين كرويدات بعد 48 ساعة.
      4. الخطوة الاختيارية: التقاط صور للشفرات (40x) باستخدام مجهر ستيريو مضان.
        ملاحظة: هذه الطريقة يولد 96 كروية (كروية واحدة / جيدا) بعد 48 ساعة (منطقة 1-2 بكسل2)،وعادة ما تستخدم لدراسات النمو.
    3. إسقاط معلق
      1. امزج تعليق الخلية (3.4 × 105 خلايا/مل) بنسبة 1:1 للحصول على حجم نهائي قدره 2 مل.
      2. استخدام ماصة P20 لزرع خليط الخلية في شكل قطرات 15 ميكرولتر على غطاء مقلوب من طبق بيتري 10 سم.
      3. عكس الغطاء مع قطرات وإضافة 5 مل من المتوسطة الأساسية (EBM-2) في الجزء السفلي من الطبق لتجنب تبخر قطرات.
        ملاحظة: هذا الأسلوب بإنشاء واحد كروي/إسقاط بعد 48 ساعة. تأكد من أن القطرات منفصلة بما فيه الكفاية عن بعضها البعض ، بحيث لا تندمج أثناء تبديل الغطاء. استخدام أكثر من 10 سم طبق بيتري إذا لزم الأمر.

3. دراسة النمو الكروي

  1. لوحة 100 ميكرولتر من HUVECs ومزيج الخلية MCF-7 (5 × 102 خلايا / جيدا) في لوحات U-bottom 96 جيدا ووضعها في الحاضنة.
  2. 48 ساعة بعد الطلاء، تحقق من تشكيل كرويدات مع المجهر المقلوب (حقل مشرق). التقاط الصور (ما لا يقل عن ست صور لكل علاج، 40x) في 96 ساعة من الثقافة.
  3. افتح الصور باستخدام برنامج معالجة الصور وعالج الصورة إلى 300 بكسل/بوصة واحفظ الصورة كملف tiff.
  4. تحميل برنامج ImageJ وفتحه. انقر على الخيار ملف واذهب إلى فتح.
  5. تحويل المناطق ذات الأهمية إلى المناطق السوداء المشبعة بطريقة موحدة أن يكون صورة ثنائية (أبيض وأسود). لهذا، حدد الخيار صورة، اختر نوع | 8 بت. الآن، الصورة بالأبيض والأسود.
  6. استخدم أداة التحديد اليدوي لرسم حدود كرويدات.
  7. لحساب مساحة الاهتمام وفصل الكائن أو وحدات البكسل الأمامية عن وحدات بكسل الخلفية، استخدم وظيفة العتبة: حدد خيار الصورة، واختر ضبط وانقر على العتبة.
  8. الآن سيتم فتح عتبة النافذة المنبثقة. يشير الشريط العلوي إلى الحد الأدنى لقيمة العتبة: تعيين القيمة عند الصفر. يشير الشريط السفلي إلى الحد الأقصى لقيمة العتبة: حرك الشريط حتى تصبح منطقة الاهتمام حمراء تماما.
    ملاحظة: إذا كان اللون غير أحمر، حدد أحمر من إطار العتبة.
  9. انتقل إلى تحليل | تعيين القياسات وتحديد المنطقة والمحيط.
  10. لقياس مجال الاهتمام، حدد الخيار تحليل واستخدم أداة تحليل الجسيمات. في إطار تحليل الجسيمات، قم بتعيين الحجم لقياس (0.00003-Infinity أو 3-Infinity، اعتمادا على حجم كرويدات)، حدد تلخيص وعرض النتائج. ثم انقر فوق موافق.
  11. ستظهر النتائج في مخطط. نسخ القياسات في جدول بيانات لتحليل البيانات.
    ملاحظة: يتم حساب المنطقة كعدد إجمالي وحدات البكسل; استخدم المساحة الإجمالية للحساب.

4. دراسة الكيمياء المناعية الكروية

  1. إعداد العينة
    1. لوحة خليط الخلية من HUVECs وMCF-7 (5 × 103 خلايا / جيدا) في لوحات U-bottom 96 جيدا في متوسط نمو HUVEC لمدة 96 ساعة.
    2. جمع ما يقرب من 50 كروية في أنبوب 1.5 مل مع طرف قطع من ماصة P200 ميكرولتر; السماح لهم بالاستقرار في الجزء السفلي من الأنبوب عن طريق الجاذبية ، ومن ثم التخلص من supernatant.
    3. إصلاح كرويدات مع 500 ميكرولتر من 4٪ PFA لمدة 1 ساعة، RT.
    4. يغلي 2٪ نوبل أغار الحل في برنامج تلفزيوني باستخدام لوحة ساخنة مع stirrer المغناطيسي لمدة 3-5 دقائق لإذابة مسحوق الآغروز تماما وتبرد إلى حوالي 60 درجة مئوية.
    5. إزالة PFA مع ماصة P1000، وغسل كرويدات مع 500 ميكروغرام من برنامج تلفزيوني، والسماح لهم الرواسب. تجاهل الناتنات الفائق.
    6. ماصة بعناية 600 ميكرولتر من محلول الآغروز في أنبوب 1.5 مل مع كرويدات ووضع الأنبوب على الفور في جهاز طرد مركزي مع الدوار الأفقي في 177 × ز لمدة 2 دقيقة.
    7. إضافة سلسلة قصيرة في منتصف الحل agarose لإزالة بسهولة المكونات من الأنبوب.
    8. ترسيخ سد العجز agarose على الجليد أو في 4 °C. إضافة 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني في أنبوب 1.5 مل لتجنب الجفاف من بيليه.
      ملاحظة: العينات جاهزة للجفاف اللاحق، وتضمين البارافين، والقسم، ونقلها إلى شرائح المجهر، وتلطيخ IHC (التي يؤديها سوفيستولاب).
  2. الحصول على الصور ومعالجتها
    1. الحصول على صور من المقاطع كروية باستخدام مجسم.
    2. احفظ ثلاث صور لكل عينة كملفات .jpg.
    3. افتح برنامج ImageJ. افتح صورة JPEG، وانقر على ملف ثم افتح.
    4. حدد لون وألوان Deconvolution في الخيار صورة.
    5. حدد ناقلات H DAB في إطار 1.7 Deconvolution اللون، وتظهر الصور الثلاث.
      ملاحظة: الصور الثلاث هي: اللون 1 يمثل فقط تلطيخ Hematoxylin (أزرق / أرجواني)، واللون 2 يمثل فقط تلطيخ DAB (البني). لا يلزم اللون 3 لتحليل الصورة مع اثنين من تلطيخ.
    6. حدد إطار اللون 1 ثم قم بتعيين العتبة: انتقل إلى صورة | ضبط وانقر على عتبة. يظهر إطار العتبة.
    7. اترك الحد الأدنى لقيمة العتبة معينا عند الصفر واضبط القيمة القصوى العتبة لإزالة إشارة الخلفية دون التأثير على الإشارة الحقيقية. انقر على تطبيق.
      1. قياس المنطقة
        1. انقر على تحليل، اختر تعيين القياس. حدد المنطقة ومتوسط القيمة الرماديةو Min و Max قيمة رمادية وانقر فوق موافق للتأكيد.
        2. قم بقياس حجم النواة باستخدام الخيار تحليل، ثم حدد قياس.
          ملاحظة: تعطي نافذة النتائج اسم الصورة (التسمية) وحجم الصورة (المنطقة) ومتوسط كثافة البكسل لصورة IHC (متوسط) والقيم الرمادية الدنيا والقص قصوى (الحد الأدنى والحد الأقصى). استخدم القيمة المتوسطة للحساب.
        3. كرر الخطوات 4.2.6-4.7.1.2 للون 2 (واللون 3 إذا كان هناك تلطيخ مزدوج) النافذة.
      2. تحديد كمية الخلية
        1. انقر على عملية، واختيار الخيار ثنائي وحدد مستجمعات المياه لفصل الخلايا.
        2. انتقل إلى تحليل وانقر على تحليل الجسيمات. في النافذة المنبثقة تحليل الجسيمات، قم بتعيين حجم الخلايا لاستبعاد الجسيمات غير المحددة. بعد ذلك، في الخيار إظهار، انقر على المربع المنسدل وحدد الخطوط العريضة. ثم انقر فوق موافق.
        3. كرر الخطوات 4.2.6-4.2.7 وخطوات تحديد كمية الخلية (القسم 4.2.7.2) للون 2 (واللون 3 إذا كان هناك تلطيخ مزدوج) النافذة.
          ملاحظة: الآن ستظهر ثلاث نوافذ: 1) نتائج الملخص (عدد الخلايا التي تم عدها، المساحة الإجمالية، متوسط الحجم، النسبة المئوية للمنطقة والمتوسط)، 2) النتائج (لكل منها للخلايا التي يتم عدها)، و 3) نافذة الرسم (صورة مصورة للخلايا التي يتم عدها).

5. يعيش / الميت تلطيخ في كرويدات

  1. إعداد 4 MM حلول الأسهم من Calcein AM في DMSO (البقع الخلايا الحية الخضراء) و 2 mM من Ethidium homodimer في DMSO (البقع الخلايا الميتة الحمراء) في أنابيب 1.5 مل.
  2. حساب كمية الحل اللازمة لإضافة 10 ميكرولتر / بئر من خليط من كالسين AM وEthidium homodimer المخفف 1:50 في EBM-2.
  3. إضافة خليط تلطيخ إلى كرويدات ووضع لوحة في الحاضنة في ظل ظروف زراعة الأنسجة القياسية لمدة 30-60 دقيقة.
  4. الحصول على الصور (40x) باستخدام المجهر ستيريو مضان.

6. بروتين كرويد وعزلة الحمض النووي الريبي

  1. إعداد تعليق الخلية في 3.4 × 105 خلايا / مل لكل نوع الخلية، ومزجها بنسبة 1:1، والبذور خليط الخلية باستخدام ماصة P20 في شكل قطرات 15 ميكرولتر على غطاء طبق بيتري 10 سم. عكس الغطاء ووضعه في الحاضنة في ظل ظروف زراعة الأنسجة القياسية لمدة 96 ساعة.
  2. استخدام 5-6 مل من برنامج تلفزيوني لجمع كرويدات في أنبوب البوليسترين 15 مل ذهابا وإيابا باستخدام 5 مل المصاطب البوليسترين المعقمة.
    ملاحظة: من الممكن أيضا استخدام أنابيب مخروطية سعة 15 مل.
  3. الطرد المركزي تعليق كرويدات في 250 × ز لمدة 5 دقائق، ومن ثم يستنشق بعناية supernatant.
  4. إضافة 500 ميكرولتر من التريبسين (100٪) وماصة صعودا وهبوطا باستخدام ماصة P1000 لمدة 30 ثانية لتصنيف كرويدات، وتحقيق تعليق الخلية.
  5. تحييد التريبسين مع 10٪ FCS المتوسطة، والطرد المركزي الأنابيب في 250 × ز لمدة 5 دقائق، ونسيخ supernatant.
  6. وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة (مجموعة محددة لعزل الحمض النووي الريبي الخالية)، استخدم 300 ميكرولتر من العازلة تحلل الحمض النووي الريبي لتحلل بيليه الخلية.
    ملاحظة: يمكن أيضا إضافة المخزن المؤقت Lysis مباشرة إلى كرويدات سليمة (لا خطوة جربسين المطلوبة) لاستخراج الحمض النووي الريبي. إضافة 300 ميكرولتر من العازلة تحلل إلى كرويدات بيليه، ووضع أنابيب في الجليد، وتريتورات 10 مرات باستخدام ماصة P200. في وقت لاحق، عزل الجيش الملكي النيبالي على النحو الوارد أعلاه. قد تكون هناك حاجة إلى فصفير كروي إذا كان استرداد الحمض النووي الريبي منخفضا بسبب تداخل المصفوفة.
  7. بدلا من ذلك، استخدم 70 ميكرولتر من حاجز التحلل لعزل البروتين. تجانس لمدة 2-4 ق عن طريق سونيكيشن وتحديد تركيز البروتين وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة باستخدام مجموعة BCA Assay Kit.
    ملاحظة: لعزل البروتين، يمكن أن يتم تحلل كرويات الكريات مباشرة في عازلة التحلل تليها سونيكيشن. استخدام 25 ميكروغرام من البروتين الكلي لأداء لطخة الغربية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

نموذج كرويدات باستخدام الثقافات الظهارية والظهارية المشتركة مطلوب لمحاكاة عن كثب في ظروف الجسم الحي من أورام الثدي للتجارب في المختبر. يصور المخطط في الشكل 1 البروتوكول لتشكيل كرويات مع خلايا ظهارية سرطان الثدي والخلايا البطانية الوعائية أو اللمفاوية (الشكل 1). يتم زرع كل نوع من أنواع الخلايا بشكل منفصل في طبق مستدير 3.5 سم ويتم علاجه بمحفزات النمو / مثبطات أو المصابين بالقلة باستخدام ليبوكوثامين. يتم حصاد الطبقات الأحادية الملتخمة من الخلايا الظهارية أو البطانية بعد الجربس ، وغسلها ، وخلطها بنسبة 1:1. الخلايا مطلية في وقت لاحق في لوحات U-bottom 96 جيدا(الشكل 1A)أو على الغطاء المقلوب لطبق ثقافة مستدير قطره 10 سم لتسهيل ثقافة الإسقاط المعلق(الشكل 1B). بعد فترة وجيزة من البذر ، تظهر الخلايا كصفائح مسطحة وكثيفة من الخلايا في الجزء السفلي من كل بئر أو قطرة ، وبعد ذلك ، تتجمع مع مرور الوقت (24-48 ساعة) ، وبالتالي تشكل كرويدات سليمة عند 48 ساعة. من أجل منع أي ضرر للمجاميع الخلية شكلت فضفاضة، يجب أن لا تكون منزعجة لوحات لمدة 24 ساعة على الأقل.

في لوحات U-bottom، أدى بذر خلايا MCF-7، ولكن ليس الخلايا البطانية أو الخلايا اللمفاوية، إلى تكوين كروي بعد 48 ساعة(الشكل 2A، B، على التوالي). وعلاوة على ذلك، فإن بذر MCF-7 بالإضافة إلى الخلايا البطانية أو الخلايا اللمفاوية بنسبة 1:1 أدى أيضا إلى تشكيل كروي(الشكل 2C، D، على التوالي). للتحقق من صحة كرويات كنموذج لدراسة نمو الورم، تم قياس التغيرات المعتمدة على الوقت في حجم كروية استجابة للحل المحفز للنمو / كميا ومقارنتها مع الضوابط غير المعالجة(الشكل 2). تظهر الصور الضوئية في الشكل 2E نموا متسلسلا معتمدا على الوقت (24-120 ساعة) ل كرويد MCF-7 التمثيلي. يصور الرسم البياني الخطي في الشكل 2F التغير في مجال كرويات MCF-7 بمرور الوقت عند التعامل مع محفز النمو أو بدونه. زاد حجم كروية من ~ 100 ميكرومتر إلى ~ 200 ميكرومتر على مدى 5 أيام. وعلاوة على ذلك، لوحظ معدل نمو متزايد في كرويات تعامل مع محفز النمو(الشكل 2F). لأن العلاج طويل الأجل (168 ح) أدى إلى انخفاض MCF-7 البقاء، وربما يرجع ذلك إلى ظروف نقص الأكز في وسط كرويدات (الشكل 3)، تمت دراسة نمو هيكل 3D حتى 96 ساعة. تظهر الشفرات التي تشكلت مع خلايا MCF-7 وHUVECs عددا أقل من الخلايا الميتة عند 168 ساعة مقارنة بشفرات الكربون التي تشكلت مع MCF-7 وحدها.

في التجارب الأولية ، لوحظ نمو صغير فقط في حجم كرويدات بعد 4 أيام من الثقافة. افترض أن هذا قد يكون راجعا إلى العدد الكبير من الخلايا المصنفة لتشكيل كرويات. في لوحات الثقافة U-bottom ، كان من الممكن أن يكون نمو الكرويات محدودا بسبب شكل البئر المقعر. وبما أن النمو يعتمد على العدد الأولي للخلايا المصنفة، فقد استخدمت أرقام خلايا مختلفة لتشكيل كرويات لاختبار وتحديد الظروف التي من شأنها أن تكون مثالية لرصد نمو الكرويات. كما هو مبين في الشكل 4، تشير النتائج إلى أنه بالنسبة لدراسات النمو الكروي ، كان بذر 500 خلية / بئر لتشكيل كرويدات موثوقا به وقابلا للاستنساخ لرصد نمو الكرويات لمدة 4-6 أيام استجابة لعوامل تعديل النمو. تم الحصول على كرويدات التي كانت الأكثر ملاءمة للملاحظات النسيجية أو المناعية النسيجية في اليوم 4، بعد البذر من 5 × 103 خلايا / جيدا. تم استخدام نفس التركيز الأولي لاستخراج بروتين الخلية أو الحمض النووي الريبي. زيادة تركيز الخلية الأولية بأكثر من 7.5 × 103 خلايا / جيدا لم يحسن تشكيل كروي، والخلايا لم تتجمع بشكل صحيح ويفترض هياكل غير منتظمة(الشكل 4).

من أجل تقييم تكوين الخلايا وانتشارها وحالة موت الخلايا المبرمج ، تم فحص أقسام الهسهولوجية من كرويات شكلت مع خلايا سرطان الثدي بالإضافة إلى الخلايا البطانية باستخدام H &؛ E و Ki67 (التخفيف 1:300) والأجسام المضادة Cleaved Caspase-3 (تخفيف 1:500). تتطلب عملية إعداد العينة النهائية الرعاية / الاهتمام والدقة. يصور الشكل 5 ألف سير العمل لجمع ودمج كرويدات في الآغاروز من أجل تقسيمها. تظهر الفوتوميكروغرافيات في الشكل 5B-C الفرق في تشكيل كروية MCF-7 في وجود ( الشكل5B) والغياب(الشكل 5C)من ليبوفيكتامين (0.17٪ تركيز نهائي)، وهو عامل نقل شائع الاستخدام. تظهر الصور المجهرية ذات الحقول الساطعة للأقسام النسيجية بنية دائرية ومدمجة لخليط متجانس من نوعين من الخلايا(الشكل 5D-G). وأظهرت بنية كرويدات وشكل خلاياها أي شذوذ بعد الترانزفيك مع أوليغونوكليوتيدات التحكم في وجود ليبوفيكتامين (الشكل 5D). وعلاوة على ذلك، تم توزيع الخلايا التي تعبر عن علامة التكاثر، Ki67، بشكل متجانس في كرويدات. ومع ذلك ، لوحظ أيضا حلقة من الخلايا التكاثرية على سطح كرويدات(الشكل 5E). وأظهرت Cleaved Caspase-3 تلطيخ الخلايا المبرمج بعد 4 أيام من الثقافة (الشكل 5F). أقسام الهسطولوجيا مفيدة لتقييم توزيع الخلايا الظهارية والظهارية في كرويات باستخدام علامات محددة. باستخدام CD31 كعلامة محددة للخلايا البطانية، فمن الممكن تحديد توزيعها داخل بنية 3D. وبما أن جميع الخلايا ملطخة بالهيماتوكسيلين (البقع الأزرق لنواة الخلية)، فإن حساب تعبير CD31 يمكن أن يوفر مساحة كرويدات تحتوي على خلايا البطانية بعد العلاج أو العدوى (قسم البروتوكول 4.2.7.1). وعلاوة على ذلك، من خلال إجراء اختبار تلطيخ مزدوج، فمن الممكن أن يكون أكثر من ذلك المعلومات، على سبيل المثال، كما هو مبين في الشكل 5G،CD31 البقع الخلايا البطانية (الأحمر) وKi67 البقع الخلايا التكاثرية (البني). بعد قسم البروتوكول 4.2.7.2، كشف الشكل 5G أن 55٪ خلايا ظهارية، و 45٪ خلايا بطانة الرحم، و 25٪ من الخلايا تتكاثر.

ويمكن أيضا أن تدرس بنية كرويدات باستخدام تحليل immunofluorescence بعد وضع العلامات على الخلايا مع الأصباغ الحية. كانت الثقافات التقاء 2D من خلايا HUVEC و MCF-7 ملطخة بشكل منفصل مع الأزرق (HUVEC) والأخضر (MCF-7) الأصباغ. في وقت لاحق، تم جمع الخلايا الملطخة ومختلطة بنسبة 1:1 وبذرها في آبار لتشكيل كروي. صور الخلايا الفلورية الملطخة التقطت مباشرة بعد البذر (الشكل 6A) وبعد 3 أيام من الثقافة (الشكل 6B). بهدف تقييم النسبة المئوية للخلايا الحية والميتة، كانت كرويدات عمرها 4 أيام ملطخة بالكالسين-AM (أخضر) وبالهوموديمر الإيثيديوم (الأحمر)(الشكل 6C). لا يمكن تجميد/الحفاظ على الشفرات التي تشكلت مع MCF-7 و HUVECs بنجاح باستخدام البروتوكولات القياسية لتجميد الخلايا (متوسط النمو المكمل بنسبة 10٪ DMSO و 10٪ FCS) لتجميد الخلايا. في كرويدات المجمدة والمذابة، كان تمزق مجاميع الخلايا وزيادة فقدان صلاحية الخلية واضحين. تظهر الصورة التمثيلية في الشكل 6D كروية مذابة حديثا ملطخة بالخلايا الميتة والحيوية. يظهر أن كرويات حساسة جدا لظروف التجمد.

بعد 5 أيام من الثقافة في ظروف تجريبية ، كان من الضروري تحلل حوالي 100 كروية لجمع ما يكفي من البروتين (~ 3 ميكروغرام / مل) أو الحمض النووي الريبي (~ 60 نانوغرام / ميكرولتر) للتحليل. الشكل 7 يمثل سير العمل من جمع كرويدات (ولدت مع طريقة قطرات معلقة) إلى تحلل الخلية لاستخراج البروتين لأداء النشاف الغربية أو عزل الجيش الملكي النيبالي لالقايسات Microarray في المستقبل أو التحليل من قبل RT-PCR. عزل الحمض النووي الريبي / الحمض النووي من مجموعة خلايا غير متجانسة في كروية لتحليل microarray يمكن أن تجلب بعض المعلومات المفيدة. ومع ذلك، لتحديد الآليات الرئيسية الخاصة بالخلايا أو التفاعلات بين الخلية والخلية، يمكن فصل الخلايا الكروية بعد انفصال الأنزيمية (التريبسين أو accutase)، وذلك باستخدام تحليل FACS والجيش الملكي النيبالي من خلايا محددة تستخدم لتحليل microarray. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام خطوط الخلايا المقاومة للمضادات الحيوية (على سبيل المثال، باستخدام خطوط خلايا مقاومة EGFP و/أو puromycin) في كرويدات لمعالجة دور نوع معين من الخلايا للتفاعل بين الخلية والخلية. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام أدوات إسكات الجينات لهندسة الخلايا لمعالجة مشكلات معينة في التفاعل بين الخلية والخلية.

Figure 1
الشكل 1: سير عمل تشكيل كرويدات. وتزرع خلايا MCF-7 و HUVEC أو LEC في الثقافات 2D بشكل منفصل ويتم جمعها بعد العلاجات المختلفة المطلوبة. يتم إنشاء Spheroids في وقت لاحق عن طريق الاختلاط المباشر للخلايا في (A) 96-جيدا لوحات U-bottom، والتي تعزز تشكيل هيكل 3D عن طريق تجميع الخلية إلى الخلية، أو باستخدام (B) تعليق قطرة الثقافة التي تدعم تشكيل كرويدات عن طريق قوة الجاذبية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: تشكيل Spheroid والتنمية مع مرور الوقت. صور تصور تشكيل كروي بواسطة خلايا MCF-7 (لوحة A)، وعدم وجود تشكيل كروي بواسطة خلايا البطانية أو اللمفاوية (HUVECs؛ (الفريق ب)) مطلي في نفس الكثافة، وتشكيل كروي من قبل خلايا MCF-7 بالإضافة إلى HUVECs أو LECs مختلطة بنسبة 1:1(لوحات C، D). كما يصور نمو في حجم كروية مع مرور الوقت (24 ساعة، 48 ساعة، 72 ساعة، 96 ساعة، و 120 ساعة). تم تشكيل هذا كروي من خليط من MCF-7 بالإضافة إلى HUVECs في نسبة 1:1 وبذر في كثافة 500 خلية / بئر من لوحة U-bottom 96 جيدا (لوحة E)، (شريط مقياس = 200 ميكرومتر، 40x). الرسم البياني الخطي (لوحة F) يبين نمو التحكم (CTR) المعتمد على الوقت مقابل كرويات (العلاج) المحفزة للنمو. تم قياس مناطق كرويد ومقارنتها بين كرويات غير المعالجة والعلاجية. تمثل النتائج ± SEM، *** p < 0.001 مقارنة بالتحكم المعني. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3:Spheroids الثقافة على المدى الطويل وقابلية البقاء. يظهر التصوير الضوئي قابلية الخلية للحياة في كرويدات مكونة من خلايا MCF-7 وحدها عند 96 ساعة(اللوحة A)و168 ساعة(لوحة C)،في حين أن اللوحين B وD يصوران صلاحية الخلية في كرويدات مصنوعة من MCF-7 بالإضافة إلى HUVECs (نسبة 1:1) عند 96 ساعة(لوحة B)و 168 ساعة (لوحة D) (شريط مقياس = 100 ميكرومتر). كانت الخلايا ملطخة بالكالسين (الخلايا الحمراء الميتة) وEthidium homodimer (الخلايا الخضراء والحية). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: كثافة بذر الخلايا وملف النمو المعتمد على الوقت من MCF-7 بالإضافة إلى كرويد HUVEC. تم زرع خلايا HUVECs و MCF-7 المختلطة بنسبة 1:1 بكثافات متزايدة (102-104 خلايا / جيد) ، وتم رصد نمو الكرويات على مدار 24-96 ساعة. تم التقاط صور مجهرية ذات مجال مشرق (شريط مقياس = 200 ميكرومتر، 40x) لتقييم نمو كروية مع مرور الوقت. الخلايا في كثافة 500 خلية / قدمت بشكل جيد الحجم الأمثل لدراسة نمو كروية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: غرس كروي للأقسام والتلوين النسيجي. لوحة A:الرسوم المتحركة التي تصور سير العمل لجمع ودمج HUVECs / MCF-7 كرويدات في agarose. بعد تضمين البارافين من كرويدات في سد agarose وتقسم كتل البارافين، واستخدمت العينات لتلطيخ الهسطولوجي القياسية. لوحات B و C تظهر ممثل MCF-7 بالإضافة إلى كرويدات HUVEC تعامل دون ومع Lipofectamine 2000، على التوالي (شريط مقياس = 200 ميكرومتر، 40x). لوحات D-G تظهر الصور التمثيلية للأقسام كروية ملطخة علامات محددة. تظهر اللوحة D كرويدات ملطخة بالهيماتوكسيلين-إيوسين لتقييم بنية كروية (شريط المقياس = 100 ميكرومتر). تلطيخ في لوحة E يصور الخلايا المنتشرة ملطخة بشكل إيجابي مع Ki67. لوحة F يظهر الخلايا المبرمج في كروية ملطخة بشكل إيجابي مع كليفي كاسباس-3 (شريط مقياس = 50 ميكرومتر). لوحة G يصور المقاطع الكروية مع تلطيخ مزدوج: CD31 (علامة الخلايا البطانية) وKi67 (علامة التكاثر) (شريط مقياس = 100 ميكرومتر). تم إجراء تقسيم كرويدات وتلطيخ من قبل سوفيستولاب (info@sophistolab.ch). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6:صور مضانة من كرويدات MCF-7/HUVEC التي تظهر توزيع الخلايا وقابليتها للحياة. وتصور اللوحان A وB كرويدات تمثيلية مع مركبات HUVECs ملطخة بصبغة زرقاء وخلايا MCF-7 ملطخة بصبغة خضراء. ترجمة HUVEC و MCF-7 داخل كروية يختلف مباشرة بعد البذر (أ) وبعد تشكيل كروي (ب) (شريط مقياس = 250 ميكرومتر). لوحات C-D تظهر كرويدات ملطخة Calcein / Ethidium Homodimer لتحديد الخلايا الحية (الخضراء) والميتة (الأحمر) في الهياكل 3D في حالة الثقافة العادية(C)وبعد تجميد (D) (شريط مقياس = 100 ميكرومتر). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 7
الشكل 7: التمثيل التخطيطي لجمع كروية للتحليل الكيميائي الحيوي. الرسوم المتحركة التي تبين مخطط لحصاد كرويدات، منفصلة أو الإفراج عن الخلايا، وتعليقها في محلول تحلل لتحليل البروتين أو استخراج الحمض النووي الريبي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

بالمقارنة مع ثقافات الخلايا 2D ، فإن تقنية ثقافة كروية ثلاثية الأبعاد الثورية هي أداة أفضل وأكثر قوة لإعادة بناء البيئة الدقيقة للجهاز ، وتفاعلات خلايا الخلية ، واستجابات الدواء في المختبر. هذا هو البروتوكول الأول الذي يصف تشكيل كرويات من خطوط الخلايا المتعددة الخلايا (الظهارية والظهارية) لأبحاث سرطان الثدي. يضمن هذا البروتوكول نمو كروي ثلاثي الأبعاد للشفرات لمدة تصل إلى 5 أيام ، ويمكن فحص كرويات بعد تضمين البارافين ، والقسم ، وتلطيخ الهسهسة. ومن المثير للاهتمام أن العناصر الخلوية داخل كروية لا تزال تعبر عن المستقبلات التي تعزز نمو الخلايا وتستجيب للمحفزات التكاثرية والمبوبتوتيكية. يولد البروتوكول الموصوف ما يكفي من المواد البيولوجية لتحليل البروتين أو الحمض النووي الريبي/الحمض النووي. ويمكن أن يكون نظام الثقافة المشتركة المذكور أعلاه، الذي يمكن تحقيقه بسهولة في الظروف المختبرية وبتكلفة منخفضة، ميزة للتطبيقات المستقبلية، ولا سيما في علاج سرطان الثدي واختبار الحساسية للأدوية. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تطبيق هذا البروتوكول على أنواع مختلفة من الخلايا الظهارية والظهارية.

من الصعب للغاية تقليد نسيج معقد موجود في الجسم الحي في المختبر. وذلك لأن في الأنسجة الحية تتكون من العديد من المكونات المتفاعلة, بما في ذلك الأعصاب, الأوعية الدموية, mesenchyme, والخلاياالمناعية 30,42. الهدف من هذا البروتوكول هو التغلب على بعض هذه القيود باستخدام نظام الثقافة المشتركة ثلاثية الأبعاد مع نوعين مختلفين من الخلايا للاقتراب من حالة الورم الفعلية. هنا، تم تشكيل كرويدات مع خلايا الورم الظهارية في تركيبة مع الخلايا البطانية أو الخلايا اللمفاوية لمحاكاة الوضع في الجسم الحي قدر الإمكان، بما في ذلك التفاعلات بين الخلية والخلية، والتعرض للعوامل المبرمج التي تطلق في المساحات بين الخلايا عن طريق الخلايا المحتضرة، وظروف نقص الأكسوجة في وسط كرويات. وقد تم تحسين هذا البروتوكول لاختبار الاستجابات الخلوية لعوامل النمو، وعوامل الإشارات، والهرمونات، والتي تنشط بسرعة الشلالات الإشارات واستهداف النسخ الجيني وتحفيز التعبير البروتيني والنقل30،31. في كرويات، ولكن ليس في الجسم الحي،يمكن تقييم استجابات الخلايا السرطانية للمحفزات بسرعة وتواتر.

في هذه الدراسة ، لا يبدو أن الخلايا البطانية في كرويات تشكل هياكل تشبه الشعيرات الدموية. منذ الخلايا البطانية وقد ثبت لتشكيل الشعيرات الدموية عندما مطلي في كثافة منخفضة وأحادية في كثافة عالية، فمن الممكن أن خفض نسبة الخلايا البطانية MCF-7 قد يؤدي إلى تشكيل الشعيرات الدموية داخل كرويدات. بدلا من ذلك، إضافة بروتينات مصفوفة محددة أو matrigel قد تعزز تشكيل الشعرية. عدم وجود هيكل يشبه الشعيرات الدموية في كروية لا يخفف من ميزة MCF-7 بالإضافة إلى الخلايا البطانية مقابل خلايا MCF-7 في حد ذاتها، كما يمكن للعوامل الصادرة عن خلايا MCF-7 تعزيز انتشار الخلايا البطانية والعكس بالعكس؛ مثل هذه التفاعلات ستبقى غير مكتشفة في كرويدات MCF-7 فقط.

وقد أظهرت العديد من الدراسات أن 5 × 103 خلايا / جيدا كان التركيز المناسب لخلايا البذور لتشكيل كرويدات43،44،45،46،47؛ ومع ذلك ، في 96 جيدا يو أسفل لوحات ، وهذا العدد من الخلايا محدودة النمو المنسق للشفرات في الظروف التجريبية. لذلك ، في كل دراسة جديدة ، لكل نوع جديد من الخلايا ، من المهم مراقبة نمو النظام ثلاثي الأبعاد بعد العلاج من المخدرات ، لتحديد آثار العلاج على حجم كروية.

الحد من البروتوكول الحالي هو أن ثقافة كرويدات شكلت سابقا لا يمكن أن تستمر بعد تجميد وذوبان من قبل الأسلوب DMSO الكلاسيكية. في الواقع، عندما إذابة، كانت معظم الخلايا ميتة. قد يثبت التزجيج أنه بديل للحفاظ على الخلايا على قيد الحياة48.

الاهتمام الدقيق بالتفاصيل التقنية ضروري لتجنب الأخطاء وإنتاج والحفاظ على كرويدات جيدة التشكيل. ويتمثل أحد التحديات في إعداد العينة لاحتواء المناعة (القسم 4-1). لتسهيل النقل عن طريق الأنابيب كرويدات في أنبوب 1.5 مل، من المهم استخدام قطع طرف P200 مع مقص بحيث مساحة الثقب أكبر من كرويدات أنفسهم. وإلا فإن النقل يمكن أن يدمر المجالات. وثمة تحد آخر هو كيفية تستنشق المتوسطة بعد أن استقرت كرويدات إلى الجزء السفلي من أنبوب الاختبار. في هذا الصدد، فمن الأفضل استخدام ماصة P1000 بدلا من مضخة فراغ لتجنب طموح كرويدات. خطوة هامة وحساسة في إعداد كرويدات للقسم هو إضافة agarose إلى كرويات بيليه. يجب أن يتم تثبيت الكرويات ، بمجرد تعليقها في agarose ، بسرعة إلى أسفل أنبوب الميكروفون باستخدام الطرد المركزي الأفقي في درجة حرارة الغرفة وقبل بلمرة agarose.

بشكل عام، يوفر كروي الخلايا الاثنان المصنوع من MCF-7 والخلايا البطانية بديلا قابلا للتطبيق للتحقيق في التفاعلات والآليات بين الخلايا التي تدفع نمو الخلايا السرطانية أو الخلايا البطانية داخل الورم. يمكن أن تكون الكرويات بمثابة نموذج لتقييم فعالية العوامل العلاجية التي تستهدف نمو الورم أو السرطان. الأهم من ذلك، يمكن أن يكون هذا النموذج من خليتين مرتجلة أخرى لتشمل أنواع الخلايا الأخرى ذات الصلة في نمو الورم. في هذا السياق، يمكن تضمين الخلايا الليفية التي تشكل 80٪ من كتلة ورم الثدي لتشكيل MCF-7، والخلايا البطانية، والفيرويد في الخلايا الليفية. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام إسكات الجينات والخلايا المعدلة وراثيا لمعالجة دور التفاعل بين الخلية والخلية، ومستقبلات الهرمونات (الإستروجين / البروجسترون)، وعوامل النمو، ومسارات الإشارة على نمو الورم / السرطان، فضلا عن اختبار فعالية جزيئات جديدة مضادة للسرطان.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgments

تم دعم هذا البحث من قبل مؤسسة أبحاث السرطان / منحة الرابطة السويسرية للسرطان KFS-4125-02-2017 إلى RKD ومنحة المعهد الوطني للصحة DK079307 إلى EKJ.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm × 20 mm tissue-culture treated culture dishes Corning CLS430167
149MULTI0C1
35 x 10 mm Tissue Culture Dish Falcon 353001
5 mL Serological Pipet, Polystyrene, Individually Packed, Sterile Falcon 357543
Adobe Photoshop Version: 13.0.1 (64-bit)
Antibiotic Antimycotic Solution (100×) Sigma-Aldrich A5955
Calcein-AM Sigma-Aldrich 17783
CD31 (cluster of differentiation 31) Cell Marque 131M-95 monoclonal mouse ab clone JC70
CellTracker Green CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate) Invitrogen C7025
CK8/18 (cytokeratins 8 and 18) DBS Mob189-05 monoclonal mouse ab, clone 5D3
CKX41 Inverted Microscope Olympus Life Science Olympus DP27 digital camera
Cleaved Caspase 3 Cell Signaling 9661L polyclonal rabbit ab
Collagen (rat tail) Roche 11 179 179 001
Coulter ISOTON II Diluent Beckman Coulter 844 80 11 Diluent II
Coulter Z1, Cell Counter Coulter Electronics, Luton, UK
Dehydrated Culture Media: Noble Agar BD Difco BD 214220
Dermal Microvascular Endothelial Neonatal, Pooled Donors (HMVEC-DNeo) Lonza CC-2516
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2650
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham Sigma-Aldrich D6434
EBM-2 Endothelial Cell Growth Basal Medium-2 Lonza 190860
Ethidium homodimer Sigma-Aldrich 46043
Fetal Calf Serum (FCS) Thermo Fisher Scientific SH30070
Fetal Calf Serum Charcoal Stripped (FCS sf) Thermo Fisher Scientific SH3006803
Fluorescence stereo microscopes Leica M205 FA Leica Microsystems
GlutaMAX Supplement (100x) Gibco 35050038
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red Gibco 14175053
Hoechst 33342 Life Technologies H3570
HUVEC – Human Umbilical Vein Endothelial Cells Lonza CC-2517
ImageJ National Institute of Health, USA Wayne Rasband
Version: 1.52a (64-bit)
Ki67 Cell Marque 275R-16 monoclonal rabbit ab, clone SP6
Leica fully motorized fluorescence stereo microscope Leica Microsystems M205 FA
Leica Histocore Multicut Rotary Microtome 149MULTI0C1
Low Serum Growth Supplement Kit (LSGS Kit) Gibco S003K
MCF-7 cells – human breast adenocarcinoma cell line Clinic for Gynecology, University Hospital Zurich Provived from Dr Andrè Fedier obtained from ATCC
Nunclon Sphera 96U-well plate Thermo Fisher Scientific 174925
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich P6148
Phosphate-buffered saline (PBS) 1x Gibco 10010015
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific 23225
Protein Lysis Buffer Cell Signaling, Danvers, USA 9803
Quick-RNA Miniprep Kit Zymo Research R1055
RNA Lysis Buffer Zymo Research R1060-1-100 Contents in Quick-RNA Miniprep Kit
Rotina 46R Centrifuge Hettich
Round-Bottom Polystyrene Tubes, 5 mL Falcon 352003
Sonicator Bandelin electronics, Berlin, DE
Tecan Infinite series M200 microplate reader Tecan, Salzburg, AU
Tissue Culture Flasks 75 TPP 90076
Trypsin-EDTA solution Sigma-Aldrich T3924

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sakamoto, K. The pathology of Mycobacterium tuberculosis infection. Veterinary Pathology. 49 (3), 423-439 (2012).
  2. Morrisey, E. E., Hogan, B. L. Preparing for the first breath: genetic and cellular mechanisms in lung development. Developmental Cell. 18 (1), 8-23 (2010).
  3. Goodman, T. T., Ng, C. P., Pun, S. H. 3-D tissue culture systems for the evaluation and optimization of nanoparticle-based drug carriers. Bioconjugate Chemistry. 19 (10), 1951-1959 (2008).
  4. Yang, L., et al. Tumor organoids: From inception to future in cancer research. Cancer Letters. 454, 120-133 (2019).
  5. Velasco-Velázquez, M. A., Popov, V. M., Lisanti, M. P., Pestell, R. G. The role of breast cancer stem cells in metastasis and therapeutic implications. The American Journal of Pathology. 179 (1), 2-11 (2011).
  6. Imamura, Y., et al. Comparison of 2D- and 3D-culture models as drug-testing platforms in breast cancer. Oncology Reports. 33 (4), 1837-1843 (2015).
  7. Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33 (2020).
  8. Russell, S., Wojtkowiak, J., Neilson, A., Gillies, R. J. Metabolic profiling of healthy and cancerous tissues in 2D and 3D. Scientific Reports. 7 (1), 15285 (2017).
  9. Sakalem, M. E., De Sibio, M. T., da Costa, F., de Oliveira, M. Historical evolution of spheroids and organoids, and possibilities of use in life sciences and medicine. Biotechnology Journal. 16 (5), (2021).
  10. Zanoni, M., et al. Modeling neoplastic disease with spheroids and organoids. Journal of Hematology & Oncology. 13 (1), 97 (2020).
  11. Corrò, C., Novellasdemunt, L., Li, V. S. W. A brief history of organoids. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 319 (1), 151-165 (2020).
  12. Ding, Y., et al. Three-dimensional tissue culture model of human breast cancer for the evaluation of multidrug resistance. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (9), 1959-1971 (2018).
  13. Little, M. H. Organoids: a special issue. Development. 144 (6), Cambridge, England. 935-937 (2017).
  14. Rimann, M., Graf-Hausner, U. Synthetic 3D multicellular systems for drug development. Current Opinion in Biotechnology. 23 (5), 803-809 (2012).
  15. Breslin, S., O'Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).
  16. Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).
  17. Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130 (4), 601-610 (2007).
  18. Weigelt, B., Ghajar, C. M., Bissell, M. J. The need for complex 3D culture models to unravel novel pathways and identify accurate biomarkers in breast cancer. Advanced Drug Delivery Reviews. 69-70, 42-51 (2014).
  19. Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnology Journal. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
  20. Fong, E. L., et al. Modeling Ewing sarcoma tumors in vitro with 3D scaffolds. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (16), 6500-6505 (2013).
  21. Hauptmann, S., et al. Integrin expression on colorectal tumor cells growing as monolayers, as multicellular tumor spheroids, or in nude mice. International Journal of Cancer. 61 (6), 819-825 (1995).
  22. Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), New York, N.Y. 920-926 (2018).
  23. Ashok, A., Choudhury, D., Fang, Y., Hunziker, W. Towards manufacturing of human organoids. Biotechnology Advances. 39, 107460 (2020).
  24. Lehmann, R., et al. Human organoids: a new dimension in cell biology. Molecular Biology of the Cell. 30 (10), 1129-1137 (2019).
  25. Verjans, E. T., Doijen, J., Luyten, W., Landuyt, B., Schoofs, L. Three-dimensional cell culture models for anticancer drug screening: Worth the effort. Journal of Cellular Physiology. 233 (4), 2993-3003 (2018).
  26. Bombonati, A., Sgroi, D. C. The molecular pathology of breast cancer progression. The Journal of Pathology. 223 (2), 307-317 (2011).
  27. DeSantis, C., Ma, J., Bryan, L., Jemal, A. Breast cancer statistics, 2013. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 64 (1), 52-62 (2014).
  28. Solanki, M., Visscher, D. Pathology of breast cancer in the last half century. Human Pathology. 95, 137-148 (2020).
  29. Djomehri, S. I., Burman, B., Gonzalez, M. E., Takayama, S., Kleer, C. G. A reproducible scaffold-free 3D organoid model to study neoplastic progression in breast cancer. Journal of Cell Communication and Signaling. 13 (1), 129-143 (2019).
  30. Xu, H., et al. Organoid technology and applications in cancer research. Journal of Hematology & Oncology. 11 (1), 116 (2018).
  31. Yu, J., Huang, W. The progress and clinical application of breast cancer organoids. International Journal of Stem Cells. 13 (3), 295-304 (2020).
  32. Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. The Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
  33. Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (51), e2720 (2011).
  34. Tung, Y. C., et al. High-throughput 3D spheroid culture and drug testing using a 384 hanging drop array. The Analyst. 136 (3), 473-478 (2011).
  35. Türker, E., Demirçak, N., Arslan-Yildiz, A. Scaffold-free three-dimensional cell culturing using magnetic levitation. Biomaterials Science. 6 (7), 1745-1753 (2018).
  36. Froehlich, K., et al. Generation of multicellular breast cancer tumor spheroids: comparison of different protocols. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 21 (3-4), 89-98 (2016).
  37. Vinci, M., et al. Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC Biology. 10, 29 (2012).
  38. Kaushik, G., Ponnusamy, M. P., Batra, S. K. Concise review: Current status of three-dimensional organoids as preclinical models. Stem Cells. 36 (9), Dayton, Ohio. 1329-1340 (2018).
  39. Marconi, A., Quadri, M., Saltari, A., Pincelli, C. Progress in melanoma modelling in vitro. Experimental Dermatology. 27 (5), 578-586 (2018).
  40. Saltari, A., et al. CD271 down-regulation promotes melanoma progression and invasion in three-dimensional models and in zebrafish. The Journal of Investigative Dermatology. 136 (10), 2049-2058 (2016).
  41. Yamauchi, M., et al. A novel in vitro survival assay of small intestinal stem cells after exposure to ionizing radiation. Journal of Radiation Research. 55 (2), 381-390 (2014).
  42. Jabs, J., et al. Screening drug effects in patient-derived cancer cells links organoid responses to genome alterations. Molecular Systems Biology. 13 (11), 955 (2017).
  43. Arruabarrena-Aristorena, A., et al. FOXA1 mutations reveal distinct chromatin profiles and influence therapeutic response in breast cancer. Cancer Cell. 38 (4), 534-550 (2020).
  44. Carey, S. P., Starchenko, A., McGregor, A. L., Reinhart-King, C. A. Leading malignant cells initiate collective epithelial cell invasion in a three-dimensional heterotypic tumor spheroid model. Clinical & Experimental Metastasis. 30 (5), 615-630 (2013).
  45. Park, S., et al. Differential functions of splicing factors in mammary transformation and breast cancer metastasis. Cell Reports. 29 (9), 2672-2688 (2019).
  46. Truong, D. D., et al. A human organotypic microfluidic tumor model permits investigation of the interplay between patient-derived fibroblasts and breast cancer cells. Cancer Research. 79 (12), 3139-3151 (2019).
  47. Zhang, J., et al. Energetic regulation of coordinated leader-follower dynamics during collective invasion of breast cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (16), 7867-7872 (2019).
  48. Jeong, Y. H., et al. Vitrification for cryopreservation of 2D and 3D stem cells culture using high concentration of cryoprotective agents. BMC Biotechnology. 20 (1), 45 (2020).

Tags

أبحاث السرطان، العدد 173، سرطان الثدي، الورم، كرويات، الأوعية الدموية الجديدة، الأوعية اللمفاوية، نمو الورم، الخلايا البطانية، الخلايا الظهارية، انتشار الخلايا
ماماري الظهارية والبطانية الخلايا كرويدات كنموذج وظيفي محتمل <em>في المختبر</em> لأبحاث سرطان الثدي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Azzarito, G., Szutkowska, M. E.,… More

Azzarito, G., Szutkowska, M. E., Saltari, A., Jackson, E. K., Leeners, B., Rosselli, M., Dubey, R. K. Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research. J. Vis. Exp. (173), e62940, doi:10.3791/62940 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter