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Cancer Research

Sferoidi epiteliali ed endoteliali mammari come potenziale modello funzionale in vitro per la ricerca sul cancro al seno

Published: July 12, 2021 doi: 10.3791/62940
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 1, 1, 1,3
1Department of Reproductive Endocrinology, Wagistrasse 14, University of Zurich and University Hospital Zurich, 2Department of Dermatology, Wagistrasse 18, University of Zurich and University Hospital Zurich, 3Department of Pharmacology and Chemical Biology, University of Pittsburgh

Summary

La diafonia tra cellule epiteliali mammarie e cellule endoteliali contribuisce in modo importante alla progressione del cancro al seno, alla crescita del tumore e alle metastasi. In questo studio, gli sferoidi sono stati realizzati da cellule di cancro al seno insieme a cellule endoteliali vascolari e / o linfatiche e dimostrano la loro applicabilità come sistema in vitro per la ricerca sul cancro al seno.

Abstract

Il cancro al seno è la principale causa di mortalità nelle donne. La crescita delle cellule del cancro al seno e le loro successive metastasi è un fattore chiave per la sua progressione. Sebbene i meccanismi coinvolti nella promozione della crescita del cancro al seno siano stati intensamente studiati utilizzando monocolture di cellule di cancro al seno come le cellule MCF-7, il contributo di altri tipi di cellule, come le cellule endoteliali vascolari e linfatiche che sono intimamente coinvolte nella crescita del tumore, non è stato studiato in profondità. L'interazione cellula-cellula svolge un ruolo chiave nella crescita e nella progressione del tumore. La neoangiogenesi, o lo sviluppo dei vasi, è essenziale per la crescita del tumore, mentre il sistema linfatico funge da portale per la migrazione delle cellule tumorali e le successive metastasi. Studi recenti forniscono la prova che le cellule endoteliali vascolari e linfatiche possono influenzare significativamente la crescita delle cellule tumorali. Queste osservazioni implicano la necessità di sviluppare modelli in vitro che riflettano più realisticamente i processi di crescita del cancro al seno in vivo. Inoltre, le restrizioni nella ricerca sugli animali richiedono lo sviluppo di modelli ex vivo per chiarire meglio i meccanismi coinvolti.

Questo articolo descrive lo sviluppo di sferoidi del cancro al seno composti sia da cellule di cancro al seno (cellule MCF-7 positive al recettore degli estrogeni) che da cellule endoteliali vascolari e / o linfatiche. Il protocollo descrive un approccio dettagliato passo-passo nella creazione di sferoidi a doppia cella utilizzando due diversi approcci, hanging drop (gold standard ed economico) e piastre a U a 96 pozzetti (costose). Vengono fornite istruzioni approfondite su come raccogliere delicatamente gli sferoidi formati per monitorare la crescita mediante dimensionamento microscopico e valutazione della vitalità utilizzando la colorazione di cellule morte e vive. Inoltre, vengono delineate le procedure per fissare gli sferoidi per il sezionamento e la colorazione con anticorpi specifici della crescita per differenziare i modelli di crescita negli sferoidi. Inoltre, vengono forniti dettagli per la preparazione di sferoidi con cellule trasfettate e metodi per estrarre l'RNA per l'analisi molecolare. In conclusione, questo articolo fornisce istruzioni approfondite per la preparazione di sferoidi multicellulari per la ricerca sul cancro al seno.

Introduction

L'uso di animali per esperimenti ha dei limiti. Gli studi sugli animali non possono imitare accuratamente la progressione della malattia negli esseri umani e gli animali e gli esseri umani non hanno risposte identiche agli agenti patogeni. Inoltre, le restrizioni nella sperimentazione animale a causa delle preoccupazioni per la sofferenza degli animali e dei problemi etici1,2 vincolano sempre più i programmi di ricerca. In vitro sono stati ampiamente sviluppati sistemi per eludere l'uso degli animali; inoltre, l'uso di cellule umane ha reso in vitro modelli più rilevanti per l'indagine fisiopatologica e terapeutica. Le colture cellulari monostrato convenzionali (2D) sono ampiamente utilizzate perché imitano i tessuti umani in una certa misura. Tuttavia, le monocolture 2D non riescono a imitare gli organi umani e le monocolture 2D non sono in grado di simulare il complesso microambiente degli organi originali e imitare il in vivo situazione3,4,5,6. Inoltre, nelle colture cellulari monostrato, i trattamenti farmacologici potrebbero facilmente distruggere / danneggiare tutte le cellule. È importante sottolineare che alcune di queste limitazioni possono essere superate passando a colture cellulari tridimensionali multistrato (3D)7,8. In effetti, i modelli di coltura 3D hanno dimostrato di riflettere meglio la struttura cellulare, il layout e la funzione delle cellule nei tessuti primari. Queste colture 3D possono essere formate utilizzando una varietà di linee cellulari, simili a un organo funzionale. In effetti, ci sono due modelli di culture 3D. Un modello produce sferoidi di cellule aggregate che formano cluster e li riorganizzano in sfere (modelli senza impalcature). Il secondo produce organoidi, che hanno una struttura più complessa e consistono in combinazioni di più cellule specifiche dell'organo, che sono considerate come una versione in miniatura degli organi9,10. Per questo motivo, i sistemi di coltura 3D rappresentano una tecnologia innovativa con molte applicazioni biologiche e cliniche. Pertanto, gli sferoidi e gli organoidi hanno numerose applicazioni per la modellazione delle malattie e gli studi relativi alla medicina rigenerativa, allo screening dei farmaci e agli studi tossicologici.6,11,12,13,14,15. Gli sferoidi cancerogeni, derivati dalla tecnologia 3D, ricreano la morfologia e il fenotipo dei tipi cellulari rilevanti, imitano il in vivo microambiente tumorale e modelli di comunicazioni cellulari e vie di segnalazione che sono operative durante lo sviluppo del tumore16,17,18. Inoltre, per migliorare la comprensione della biologia del cancro, gli sferoidi / organoidi tumorali possono anche essere utilizzati per identificare una potenziale terapia antitumorale specifica per il paziente (personalizzata) e valutarne l'efficacia, la tossicità e gli effetti a lungo termine19,20,21,22. Gli sferoidi hanno aperto importanti opportunità per studiare la fisiopatologia, la modellazione delle malattie e lo screening dei farmaci a causa della loro capacità di preservare l'architettura dei tessuti cellulari e tridimensionali, la capacità di imitare il in vivo e le interazioni cellula-cellula. Tuttavia, si deve anche essere consapevoli dei limiti di questo sistema, come la mancanza di componente vascolare / sistemica, sistema immunitario funzionale o nervoso, e il sistema rappresenta un approccio riduzionista rispetto ai modelli animali. Infatti, a differenza dei modelli animali, le strutture 3D forniscono solo un'approssimazione della biologia all'interno di un corpo umano. Comprendere i limiti del metodo 3D può aiutare i ricercatori a progettare processi più raffinati e validi per la produzione di sferoidi che rappresentino meglio un organo su scala più ampia.23,24,25.

Il cancro è la principale causa di morte in tutto il mondo e il cancro al seno è il cancro più comune nelle donne26,27,28. Per imitare il complesso microambiente del cancro al seno, gli sferoidi del cancro al seno devono essere coltivati utilizzando cellule che svolgono un ruolo di primo piano nei tumori al seno, cioè cellule epiteliali, cellule endoteliali, fibroblasti e / o cellule immunitarie. Inoltre, per uno sferoide che rappresenta il cancro al seno, dovrebbero essere prese in considerazione anche l'espressione dei recettori ormonali femminili (recettori degli estrogeni / progesterone), la capacità di conservare lo stato istologico del tumore del paziente e la capacità di imitare la risposta alla terapia. Gli studi hanno dimostrato che i sistemi di co-coltura 3D hanno un'organizzazione cellulare simile a quella del tessuto primario in vivo,hanno la capacità di reagire in tempo reale agli stimoli, e hanno recettori androgeni funzionali29,30,31,32. Quindi, un approccio simile potrebbe essere utile per imitare un tumore al seno in vitro. Lo scopo dell'attuale protocollo è quello di stabilire un nuovo metodo per generare sferoidi del cancro al seno. Questo metodo utilizza cellule MCF-7 positive al recettore degli estrogeni (una linea cellulare umana immortalizzata di cellule epiteliali) e cellule endoteliali vascolari (HUVEC) o cellule endoteliali linfatiche (HMVEC-DNeo) per creare un modello che imita o riflette da vicino le interazioni tra queste cellule all'interno di un tumore. Sebbene MCF-7 (estrogeno-responsivo) e cellule endoteliali siano state utilizzate per sviluppare sferoidi nel presente studio, altre cellule come i fibroblasti che rappresentano circa l'80% della massa tumorale al seno, potrebbero anche essere combinate in futuro per rappresentare e imitare meglio il tumore al seno.

Esistono diversi metodi per formare sferoidi, come: 1) il metodo delle goccioline appese che impiega la gravità33,34; 2) il metodo di levitazione magnetica che utilizza nanoparticelle magnetiche esposte ad un magnete esterno35,e 3) il metodo delle micropiastre sferoidi che viene eseguito seminando cellule su piastre a basso attacco36,37. Sulla base dei metodi esistenti, che utilizzano un solo tipo di cellula, il presente protocollo è stato ottimizzato utilizzando cellule epiteliali ed endoteliali per imitare meglio le condizioni di crescita dei tumori del cancro al seno in vivo38,39,40,41. Questo metodo può essere facilmente ottenuto in laboratorio a basso costo e con requisiti minimi di attrezzatura. Sulla base delle necessità / obiettivi del laboratorio, sono stati utilizzati diversi approcci per formare sferoidi e ottenere materiale cellulare rilevante da questi sferoidi. In questo contesto, per l'analisi del DNA, dell'RNA o delle proteine, gli sferoidi 3D sono prodotti co-coltivando cellule endoteliali ed epiteliali con il metodo della goccia sospesa. Tuttavia, per gli studi funzionali, ad esempio, per monitorare la crescita cellulare dopo una breve trasfezione interferente (siRNA) e / o un trattamento ormonale, gli sferoidi vengono generati utilizzando piastre A-fondo.

Lo scopo di questo protocollo tecnico è quello di fornire una descrizione dettagliata passo-passo per 1) formare sferoidi di tipo multicellulare del cancro al seno, 2) preparare campioni per la colorazione istologica e 3) raccogliere cellule per l'estrazione di RNA, DNA e proteine. Sia il metodo economico della goccia sospesa che le piastre più costose con fondo a U vengono utilizzate per formare sferoidi. Qui, viene fornito un protocollo per la preparazione (fissaggio) di sferoidi per il sezionamento e la successiva immunocolorazione con marcatori per valutare la proliferazione cellulare, l'apoptosi e la distribuzione delle cellule epiteliali ed endoteliali all'interno di uno sferoide. Inoltre, questo protocollo mostra un'analisi completa passo-passo dei dati istologici utilizzando il software ImageJ. L'interpretazione dei dati biologici varia a seconda del tipo di esperimento e degli anticorpi utilizzati. Il sezionamento degli sferoidi fissi e la successiva colorazione delle sezioni è stato eseguito da un laboratorio di patologia di routine (Sophistolab: info@sophistolab.ch)

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Protocol

1. Coltura cellulare

NOTA: Condurre la manipolazione delle cellule in condizioni sterili.

  1. Sottocoltura delle cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC)
    1. Rivestire 75 cm2 palloni con collagene (5 μg/cm2) (coda di ratto) durante la notte (ON) a temperatura ambiente (RT) o 2-3 ore a 37 °C, risciacquare con acqua e lasciare asciugare il matraccio.
    2. Crescere HUVEC in terreno di crescita (EBM-2, Endothelial Basal Medium-2) integrato con glutammina (1x = 2 mM), soluzione antibiotico-antimicotica (AA; 100 μg/mL di streptomicina, 100 μg/mL di penicillina e 0,025 μg/mL di amfotericina B), LSGS (2% v/v FCS, 1 μg/mL di idrocortisone, 10 ng/mL di fattore di crescita epidermico umano, 3 ng/mL di fattore di crescita dei fibroblasti di base umano, 10 μg/mL di eparina) e 10% FCS (Fetal Calf Serum) in condizioni standard di coltura tissutale (37 °C, 5% CO2). Cambiare il mezzo ogni 2 giorni fino a quando le cellule raggiungono il 70% -80% di confluenza.
    3. Lavare le colture subconfluenti con 5 mL di HBSS (senza Ca2+ e Mg2+) e aggiungere 3 mL di tripsina (0,25% diluito in HBSS (senza Ca2+ e Mg2+)).
      NOTA: HBSS può anche essere sostituito con PBS.
    4. Incubare le cellule a 37 °C per 2 minuti (controllare al microscopio se le cellule sono staccate e arrotondate per eccesso) e fermare la reazione di distacco aggiungendo 6 ml di mezzo FCS al 10% (DMEM-F12 o EBM-2, 10% FCS).
    5. Centrifugare la sospensione cellulare a 250 x g per 5 minuti a RT ed eliminare il surnatante.
    6. Sospendere le cellule nel terreno di crescita e seminare in 75 cm2 fiaschi o piatti di coltura.
  2. Michigan Cancer Foundation-7 (MCF-7, cellule di adenocarcinoma mammario umano) sottocultura
    1. Coltivare linee cellulari di carcinoma mammario umano in flaconi da 75 cm2 in mezzo di crescita (mezzo DMEM/F12 integrato con una glutammina commerciale (1x), soluzione antibiotico-antimicotica (AA; 100 μg/mL di streptomicina, 100 μg/mL di penicillina e 0,025 μg/mL di amfotericina B) e 10% FCS in condizioni standard di coltura tissutale (37 °C, 5% CO2). Cambia il mezzo ogni 2-3 giorni.
    2. Lavare le colture cellulari subconfluenti (confluenza 70%-80%) con 5 mL di HBSS (senza Ca2+ e Mg2+) e aggiungere 3 mL di tripsina (0,5% diluita in HBSS (senza Ca2+ e Mg2+) a 37 °C per 5 min (verificare microscopicamente che le cellule siano staccate).
      NOTA: HBSS può anche essere sostituito con PBS.
    3. Aggiungere 8 mL di mezzo FCS al 10% per fermare la reazione di distacco, centrifugare a 250 x g per 5 minuti a RT ed eliminare il surnatante.
    4. Sospendere il pellet in terreno di crescita e piastra in 75 cm2 fiaschi o piatti di coltura.

2. Formazione sferoide

  1. Piastra 5 x 105 celle/mL (HUVEC e MCF-7) in un piatto rotondo di 3,5 cm e coltura per 48 ore.
  2. Trattare o trasfettare le cellule placcate per 24 ore o come desiderato.
  3. Fase opzionale eseguita in piastra con fondo a U a 96 pozzetti: lavare le celle con 1 mL di HBSS (Ca2+ e Mg2+)e colorare gli HUVEC utilizzando un colorante blu (0,5 μg/mL) e le cellule MCF-7 utilizzando un colorante verde (0,5 μM) diluito nel rispettivo mezzo di crescita e posizionare in un incubatore a CO2 a 37 °C e 5% per 30-40 min.
  4. Lavare le cellule con 1 mL di HBSS (senza Ca2+ e Mg2+), aggiungere 1 mL di reagente di distacco enzimatico (0,25% tripsina per HUVEC e 0,5% tripsina per MCF-7) a ciascun piatto rotondo usando una pipetta P1000, quindi incubare per 2-5 minuti fino a quando le cellule non si sono staccate.
  5. Raccogliere ogni tipo di cella separatamente in un tubo di polistirene a fondo tondo da 5 mL e aggiungere 1 mL di mezzo FCS al 10% utilizzando una pipetta P1000 per fermare la reazione enzimatica. Centrifugare le sospensioni cellulari a 250 x g per 5 min.
  6. Aspirare accuratamente il surnatante e sospendere le cellule in 1 mL di mezzo privo di steroidi (EBM-2, glutammina, antibiotico-antimicotico, 0,4% FCS sf (charcoal-stripped)).
    NOTA: il mezzo privo di steroidi può essere sostituito con il normale mezzo di crescita.
  7. Utilizzare 100 μL di ciascuna sospensione cellulare diluita con 10 mL di Diluente II (vedi Tabella dei Materiali)per determinare il numero totale di cellule e calcolare la quantità di mezzo di trattamento (EBM-2, glutammina, antibiotico-antimicotico, 0,4% FCS sf, veicolo/Trattamento) necessaria per ottenere una sospensione cellulare di 5 x10 3 cellule/mL o 3,4 x 105 cellule/mL per tipo di cellula.
    1. Conteggio delle celle
      1. Accendere la macchina e lavare premendo i pulsanti Funzione e Start (configurazione S3), con la soluzione Diluent II in un flaconcino del contatore cellulare.
      2. Utilizzare set up S4 e premere Start per misurare lo spazio vuoto con la nuova soluzione Diluent II.
      3. Cambiare il flaconcino di scintillazione con 100 μL di sospensione cellulare in 10 mL di soluzione di Diluent II e misurare i campioni: impostare S4 e premere Start.
      4. Prendere nota del numero di celle per mL sul display digitale.
        NOTA: il conteggio delle cellule può essere eseguito anche utilizzando altri sistemi manuali o automatici: griglie dell'emocitometro, tecnologia di conteggio delle celle a dispersione luminosa, impedenza elettrica, sistemi basati sull'imaging che utilizzano la colorazione cellulare, ad esempio il tripano blu.
    2. Piastre con fondo a U a 96 pozzetti
      1. Preparare 5 mL di ogni sospensione cellulare (5 x10 3 celle/mL) e mescolarli per ottenere un volume finale di 10 mL nel rapporto di 1:1.
      2. Utilizzare una pipetta a ripetizione manuale per pipettare 100 μL della sospensione cellulare in ciascun pozzetto delle piastre con fondo a U a 96 pozzetti.
      3. Posizionare la piastra in un incubatore in condizioni standard di coltura tissutale e verificare la formazione di sferoidi dopo 48 ore.
      4. Passaggio opzionale: scatta foto degli sferoidi (40x) usando uno stereomicroscopio a fluorescenza.
        NOTA: Questo metodo genera 96 sferoidi (uno sferoide / pozzetto) dopo 48 ore (area 1-2 pixel2), e di solito viene utilizzato per studi di crescita.
    3. Goccia sospesa
      1. Mescolare le sospensioni cellulari (3,4 x 105 celle/ml) in un rapporto 1:1 per ottenere un volume finale di 2 ml.
      2. Utilizzare una pipetta P20 per seminare la miscela cellulare sotto forma di gocce da 15 μL sul coperchio invertito di una capsula di Petri da 10 cm.
      3. Capovolgere il coperchio con le gocce e aggiungere 5 ml di base media (EBM-2) sul fondo del piatto per evitare l'evaporazione delle gocce.
        NOTA: questo metodo genera uno sferoide/drop dopo 48 h. Assicurarsi che le gocce siano sufficientemente distanti l'una dall'altra, in modo che non si uniscano durante la commutazione del coperchio. Utilizzare più di una capsula di Petri da 10 cm, se necessario.

3. Studio sulla crescita sferoide

  1. Piastra 100 μL di HUVEC e miscela di cellule MCF-7 (5 x 102 celle / pozzetto) in piastre a U a 96 pozzetti e metterle nell'incubatore.
  2. 48 ore dopo la placcatura, verificare la formazione di sferoidi con un microscopio invertito (campo luminoso). Scatta foto (almeno sei foto per trattamento, 40x) a 96 ore di coltura.
  3. Apri le immagini utilizzando un software di elaborazione delle immagini ed elabora l'immagine a 300 pixel / pollice e salva l'immagine come file tiff.
  4. Scarica il software ImageJ e aprilo. Fai clic sull'opzione File e vai su Apri.
  5. Converti le aree di interesse in aree nere sature in modo uniforme per avere un'immagine binaria (bianco e nero). Per questo, seleziona l'opzione Immagine, scegli Tipo | 8 bit. Ora, l'immagine è in bianco e nero.
  6. Utilizzate lo strumento di selezione a mano libera per disegnare il bordo degli sferoidi.
  7. Per calcolare l'area di interesse e separare l'oggetto o i pixel in primo piano dai pixel di sfondo, utilizzare la funzione soglia: selezionare l'opzione Immagine, scegliere Regola e fare clic su Soglia.
  8. Ora si aprirà una finestra pop-up Soglia. La barra superiore indica il valore minimo di soglia: impostare il valore su zero. La barra inferiore indica il valore massimo di soglia: sposta la barra fino a quando l'area di interesse diventa completamente rossa.
    NOTA: se il colore non è rosso, selezionare Rosso dalla finestra Soglia.
  9. Vai ad Analizza | Impostate Misure (Measurements) e selezionate Area e Perimetro (Area) e Perimetro (Perimeter).
  10. Per misurare l'area di interesse, selezionare l'opzione Analizza e utilizzare lo strumento Analizza particelle. Nella finestra Analizza particelle, impostare la dimensione su misura (0,00003-Infinity o 3-Infinity, a seconda delle dimensioni degli sferoidi), selezionare Riepiloga e Visualizza risultati. Quindi, fare clic su OK.
  11. I risultati verranno visualizzati in un grafico. Copia le misurazioni in un foglio di calcolo per analizzare i dati.
    NOTA: l'area viene calcolata come numero di pixel totali; utilizzare l'area totale per il calcolo.

4. Studio di immunoistochimica sferoide

  1. Preparazione del campione
    1. Placcare la miscela cellulare di HUVEC e MCF-7 (5 x 103 celle / pozzetto) in piastre A fondo U a 96 pozzetti nel mezzo di crescita HUVEC per 96 ore.
    2. Raccogliere circa 50 sferoidi in un tubo da 1,5 ml con una punta tagliata di una pipetta P200 μL; permettere loro di depositarsi sul fondo del tubo per gravità, quindi scartare il surnatante.
    3. Fissare gli sferoidi con 500 μL di PFA al 4% per 1 ora, RT.
    4. Far bollire la soluzione di Nobel Agar al 2% in PBS utilizzando una piastra calda con un agitatore magnetico per 3-5 minuti per sciogliere completamente la polvere di agarosio e raffreddare a circa 60 °C.
    5. Rimuovere il PFA con una pipetta P1000, lavare gli sferoidi con 500 μL di PBS e lasciarli sedimentare. Scartare il surnatante.
    6. Pipettare con cura 600 μL di soluzione di agarosio nel tubo da 1,5 mL con sferoidi e posizionare immediatamente il tubo in una centrifuga con rotore orizzontale a 177 x g per 2 minuti.
    7. Aggiungere una corda corta nel mezzo della soluzione di agarosio per rimuovere facilmente la spina dal tubo.
    8. Solidificare il tappo di agarosio su ghiaccio o a 4 °C. Aggiungere 500 μL di PBS nel tubo da 1,5 mL per evitare l'essiccazione del pellet.
      NOTA: I campioni sono pronti per la successiva disidratazione, l'incorporamento di paraffina, il sezionamento, il trasferimento sui vetrini del microscopio e la colorazione IHC (eseguita da Sophistolab).
  2. Acquisizione ed elaborazione di immagini
    1. Acquisire immagini di sezioni sferoidi utilizzando uno stereomicroscopio.
    2. Salvare tre immagini per ogni esempio come file .jpg.
    3. Aprire il software ImageJ. Apri l'immagine JPEG, clicca su File e poi su Apri.
    4. Selezionate Deconvoluzione colore e colore nell'opzione Immagine.
    5. Selezionate I vettori H DAB nella finestra Color Deconvolution 1.7 e vengono visualizzate le tre immagini.
      NOTA: Le tre immagini sono: il colore 1 rappresenta solo la colorazione ematossilina (blu/viola) e il colore 2 rappresenta solo la colorazione DAB (marrone). Il colore 3 non è necessario per l'analisi dell'immagine con due macchie.
    6. Seleziona la finestra Colore 1 e imposta la Soglia: vai a Immagine | Regolare e fare clic su Soglia. Viene visualizzata la finestra Soglia.
    7. Lasciare il valore di soglia minima impostato su zero e regolare il valore di soglia massima per rimuovere il segnale di fondo senza influenzare il segnale reale. Fare clic su Applica.
      1. Misurazione dell'area
        1. Fare clic su Analizza, scegliere Imposta misurazione. Selezionare Area, Valore grigio medioe Valore grigio Minimo e Massimo e fare clic su OK per confermare.
        2. Misurare la dimensione del nucleo utilizzando l'opzione Analizza e quindi selezionare Misura.
          NOTA: la finestra Risultati fornisce il nome dell'immagine (Etichetta), le dimensioni dell'immagine (Area), l'intensità media in pixel dell'immagine IHC (Media) e i valori di grigio minimo e massimo (Min, Max). Utilizzare il valore medio per il calcolo.
        3. Ripetere i passaggi 4.2.6-4.7.1.2 per la finestra Colore 2 (e Colore 3 se è presente una doppia colorazione).
      2. Quantificazione cellulare
        1. Fare clic su Processo, scegliere l'opzione Binario e selezionare Spartiacque per separare le celle.
        2. Vai su Analizza e fai clic su Analizza particelle. Nella finestra popup Analizza particelle, impostare la dimensione delle celle per escludere particelle non specifiche. Quindi, nell'opzione Mostra, fai clic sulla casella a discesa e seleziona Contorni. Quindi, fare clic su OK.
        3. Ripetere i passaggi 4.2.6-4.2.7 e le fasi di quantificazione cellulare (sezione 4.2.7.2) per la finestra Colore 2 (e Colore 3 se è presente una doppia colorazione).
          NOTA: ora verranno visualizzate tre finestre: 1) Risultati di riepilogo (numero di celle contate, area totale, dimensione media, % di area e media), 2) Risultati (rispettivi alle celle contate) e 3) Finestra di disegno (immagine illustrata delle celle contate).

5. Colorazione viva / morta negli sferoidi

  1. Preparare 4 mM di soluzioni stock di Calcein AM in DMSO (macchie di cellule vive verdi) e 2 mM di omodimero di Ethidium in DMSO (macchie di cellule morte rosse) in tubi da 1,5 mL.
  2. Calcolare la quantità di soluzione necessaria per aggiungere 10 μL/pozzetto di una miscela di Calcein AM e Ethidium homodimer diluito 1:50 in EBM-2.
  3. Aggiungere la miscela colorante agli sferoidi e posizionare la piastra nell'incubatore in condizioni standard di coltura tissutale per 30-60 minuti.
  4. Acquisire immagini (40x) utilizzando lo stereomicroscopio a fluorescenza.

6. Isolamento proteico e RNA dello sferoide

  1. Preparare le sospensioni cellulari a 3,4 x 105 cellule / mL per tipo di cellula, mescolarle in un rapporto di 1: 1 e seminare la miscela cellulare usando una pipetta P20 sotto forma di gocce da 15 μL sul coperchio di una capsula di Petri da 10 cm. Capovolgere il coperchio e posizionarlo nell'incubatore in condizioni di coltura tissutale standard per 96 ore.
  2. Utilizzare 5-6 mL di PBS per raccogliere gli sferoidi in un tubo di polistirene a fondo tondo da 15 mL utilizzando pipette sterili in polistirene da 5 mL.
    NOTA: È anche possibile utilizzare tubi conici da 15 ml.
  3. Centrifugare la sospensione degli sferoidi a 250 x g per 5 minuti, quindi aspirare accuratamente il surnatante.
  4. Aggiungere 500 μL di tripsina (100%) e pipettare su e giù usando una pipetta P1000 per 30 s per disaggregare gli sferoidi, ottenendo una sospensione cellulare.
  5. Neutralizzare la tripsina con il 10% di mezzo FCS, centrifugare i tubi a 250 x g per 5 minuti e aspirare il surnatante.
  6. Secondo il protocollo del produttore (kit specifico per l'isolamento dell'RNA privo di DNA), utilizzare 300 μL di tampone di lisi dell'RNA per lisare il pellet cellulare.
    NOTA: il tampone di lisi può anche essere aggiunto direttamente agli sferoidi intatti (non è richiesto alcun passaggio di tripsina) per estrarre l'RNA. Aggiungere 300 μL del tampone di lisi agli sferoidi pellettati, posizionare i tubi nel ghiaccio e triturare 10 volte usando una pipetta P200. Successivamente, isolare l'RNA come sopra. La dissociazione sferoide può essere necessaria se il recupero dell'RNA è basso a causa dell'interferenza della matrice.
  7. In alternativa, utilizzare 70 μL del tampone di lisi per l'isolamento proteico. Omogeneizzare per 2-4 s mediante sonicazione e determinare la concentrazione proteica secondo il protocollo del produttore utilizzando un kit di analisi BCA.
    NOTA: per l'isolamento proteico, gli sferoidi pellettati possono essere lisati direttamente nel tampone di lisi seguito da sonicazione. Utilizzare 25 μg di proteine totali per eseguire western blot.

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Representative Results

Il modello di sferoidi che utilizza co-colture epiteliali ed endoteliali è necessario per imitare da vicino le condizioni in vivo dei tumori al seno per esperimenti in vitro. Lo schema in Figura 1 illustra il protocollo per formare sferoidi con cellule epiteliali del cancro al seno e cellule endoteliali vascolari o linfatiche (Figura 1). Ogni tipo di cellula viene seminato separatamente in un piatto rotondo di 3,5 cm e trattato con stimolatori/inibitori della crescita o trasfettato con oligonucleotidi utilizzando Lipofectamine. I monostrati confluenti delle cellule epiteliali o endoteliali vengono raccolti dopo tripsinizzazione, lavati e miscelati in un rapporto 1: 1. Le celle vengono successivamente placcate in piastre con fondo a U a 96 pozzetti (Figura 1A) o sul coperchio rovesciato di un piatto di coltura rotondo di 10 cm di diametro per facilitare la coltura a goccia sospesa (Figura 1B). Subito dopo la semina, le cellule appaiono come fogli piatti e densi di cellule sul fondo di ogni pozzetto o goccia e, successivamente, si aggregano con il tempo (24-48 h), formando così sferoidi intatti a 48 h. Al fine di prevenire eventuali danni agli aggregati cellulari liberamente formati, le piastre non devono essere disturbate per almeno 24 ore.

Nelle placche A-fondo, la semina delle cellule MCF-7, ma non delle cellule endoteliali o delle cellule linfatiche, ha provocato la formazione di sferoidi dopo 48 ore(Figura 2A,B,rispettivamente). Inoltre, la semina di MCF-7 più cellule endoteliali o cellule linfatiche con un rapporto 1:1 ha anche provocato la formazione di sferoidi(Figura 2C,D,rispettivamente). Per convalidare gli sferoidi come modello per studiare la crescita tumorale, sono stati misurati/quantificati i cambiamenti dipendenti dal tempo nelle dimensioni degli sferoidi in risposta alla soluzione stimolante la crescita e confrontati con i controlli non trattati (Figura 2). Le fotomicrografie nella Figura 2E mostrano una crescita sequenziale dipendente dal tempo (24-120 h) di uno sferoide MCF-7 rappresentativo. Il grafico a linee nella Figura 2F mostra il cambiamento nell'area degli sferoidi MCF-7 nel tempo quando trattati con o senza uno stimolatore della crescita. La dimensione dello sferoide è aumentata da ~ 100 μm a ~ 200 μm in 5 giorni; inoltre, è stato osservato un aumento del tasso di crescita negli sferoidi trattati con lo stimolatore della crescita (Figura 2F). Poiché il trattamento a lungo termine (168 h) ha portato a una ridotta vitalità di MCF-7, potenzialmente a causa di condizioni ipossiche al centro degli sferoidi (Figura 3), la crescita della struttura 3D è stata studiata fino a 96 h. Gli sferoidi formati con cellule MCF-7 e HUVEC mostrano un numero inferiore di cellule morte a 168 h rispetto agli sferoidi formati con MCF-7 da solo.

Negli esperimenti iniziali, solo una piccola crescita delle dimensioni degli sferoidi è stata osservata dopo 4 giorni di coltura. È stato ipotizzato che ciò potrebbe essere dovuto all'elevato numero di cellule seminate per formare sferoidi. Nelle placche di coltura A U-bottom, la crescita degli sferoidi potrebbe essere stata limitata dalla forma concava del pozzo. Poiché la crescita dipendeva dal numero iniziale di cellule seminate, sono stati utilizzati diversi numeri di cellule per formare sferoidi per testare e stabilire condizioni ottimali per monitorare la crescita degli sferoidi. Come mostrato nella Figura 4,i risultati suggeriscono che per gli studi di crescita sferoide, la semina di 500 cellule / pozzo per formare sferoidi era affidabile e riproducibile per il monitoraggio della crescita degli sferoidi per 4-6 giorni in risposta ai fattori modulatori della crescita. Gli sferoidi più adatti per le osservazioni istologiche o immuno-istologiche sono stati ottenuti il giorno 4, dopo la semina di 5 x 103 cellule/pozzetto. Questa stessa concentrazione iniziale è stata utilizzata per le estrazioni di proteine cellulari o RNA. Aumentare la concentrazione cellulare iniziale di oltre 7,5 x 103 cellule/pozzetto non ha migliorato la formazione di sferoidi e le cellule non si sono aggregate correttamente e hanno assunto strutture irregolari (Figura 4).

Al fine di valutare la composizione cellulare, la proliferazione e lo stato di apoptosi, sezioni istologiche di sferoidi formate con cellule di cancro al seno più cellule endoteliali sono state esaminate utilizzando anticorpi H&E e Ki67 (diluizione 1:300) e Cleaved Caspase-3 (diluizione 1:500). Il processo per la preparazione del campione finale richiede cura/attenzione e precisione. La Figura 5A illustra il flusso di lavoro per la raccolta e l'incorporazione di sferoidi nell'agarosio per il sezionamento. Le fotomicrografie in Figura 5B-C dimostrano la differenza nella formazione di sferoidi MCF-7 nella presenza ( Figura 5B ) e nell'assenza ( Figura5C) di Lipofectamine (concentrazione finale dello 0,17%), un agente trasfezionale comunemente usato. Immagini microscopiche a campo luminoso di sezioni istologiche mostrano una struttura circolare e compatta di una miscela omogenea di due tipi di cellule (Figura 5D-G). La struttura degli sferoidi e la forma delle loro cellule non hanno mostrato anomalie a seguito della trasfezione con oligonucleotidi di controllo in presenza di Lipofectamine (Figura 5D). Inoltre, le cellule che esprimono il marcatore proliferativo, Ki67, sono state distribuite omogeneamente negli sferoidi; tuttavia, un anello di cellule proliferative è stato osservato anche sulla superficie degli sferoidi (Figura 5E). La colorazione caspasi-3 scissa ha mostrato cellule apoptotiche dopo 4 giorni di coltura (Figura 5F). Le sezioni istologiche sono utili per valutare la distribuzione delle cellule epiteliali ed endoteliali negli sferoidi utilizzando marcatori specifici. Utilizzando CD31 come marcatore specifico per le cellule endoteliali, è possibile determinare la loro distribuzione all'interno della struttura 3D. Poiché tutte le cellule sono colorate con ematossilina (colorazione blu del nucleo della cellula), il calcolo dell'espressione di CD31 potrebbe fornire l'area degli sferoidi contenenti cellule endoteliali dopo il trattamento o la trasfezione (paragrafo del protocollo 4.2.7.1.). Inoltre, eseguendo un doppio test di colorazione, è possibile avere ancora più informazioni, ad esempio, come mostrato in Figura 5G,CD31 colora le cellule endoteliali (rosso) e Ki67 colora le cellule proliferative (marrone). Seguendo la sezione 4.2.7.2 del protocollo, la Figura 5G ha rivelato che il 55% sono cellule epiteliali, il 45% sono cellule endoteliali e il 25% delle cellule sta proliferando.

La struttura degli sferoidi può anche essere studiata utilizzando l'analisi di immunofluorescenza dopo l'etichettatura delle cellule con coloranti vivi. Le colture 2D confluenti di cellule HUVEC e MCF-7 sono state colorate separatamente con coloranti blu (HUVEC) e verdi (MCF-7). Successivamente, le cellule colorate sono state raccolte e mescolate in un rapporto 1: 1 e seminate in pozzi per la formazione di sferoidi. Le immagini delle cellule fluorescenti colorate sono state scattate immediatamente dopo la semina (Figura 6A) e dopo 3 giorni di coltura (Figura 6B). Con l'obiettivo di valutare la percentuale di cellule vive e morte, gli sferoidi di 4 giorni sono stati colorati con calceina-AM (verde) e con omodimero di etidio (rosso) (Figura 6C). Gli sferoidi formati con MCF-7 e HUVEC non potevano essere congelati / conservati con successo utilizzando i protocolli standard per il congelamento delle cellule (terreno di crescita integrato con il 10% di DMSO e il 10% di FCS) per il congelamento delle cellule. Negli sferoidi congelati e scongelati, la rottura degli aggregati cellulari e l'aumento della perdita di vitalità cellulare erano evidenti. L'immagine rappresentativa nella Figura 6D mostra uno sferoide appena scongelato colorato per cellule morte e vive. Mostra che gli sferoidi sono molto sensibili alle condizioni di congelamento.

Dopo 5 giorni di coltura in condizioni sperimentali, è stata necessaria la lisi di circa 100 sferoidi per raccogliere abbastanza proteine (~ 3 μg / mL) o RNA (~ 60 ng / μL) per l'analisi. La Figura 7 rappresenta un flusso di lavoro dalla raccolta di sferoidi (generati con il metodo delle gocce sospese) alla lisi cellulare per l'estrazione di proteine per eseguire il western blotting o l'isolamento dell'RNA per futuri saggi o analisi Microarray mediante RT-PCR. L'isolamento di RNA/DNA da una popolazione cellulare eterogenea in uno sferoide per l'analisi di microarray può portare alcune informazioni utili. Tuttavia, per identificare i meccanismi chiave cellula-specifica o le interazioni cellula-cellula, le cellule sferoidi possono essere separate dopo la dissociazione enzimatica (tripsina o accutasi), utilizzando l'analisi FACS e l'RNA da cellule specifiche utilizzate per l'analisi dei microarray. Inoltre, le linee cellulari resistenti agli antibiotici (ad esempio, utilizzando linee cellulari di resistenza all'EGFP e/o alla puromicina) potrebbero essere utilizzate negli sferoidi per affrontare il ruolo di uno specifico tipo di interazione cellula-cellula. Inoltre, gli strumenti di silenziamento genico possono essere utilizzati per ingegnerizzare le cellule per affrontare specifici problemi di interazione cellula-cellula.

Figure 1
Figura 1: Flusso di lavoro della formazione di sferoidi. Le cellule MCF-7 e HUVEC o LEC in colture 2D vengono coltivate separatamente e raccolte dopo vari trattamenti desiderati. Gli sferoidi sono successivamente generati dalla miscelazione diretta di cellule in (A) piastre a U a 96 pozzetti, che promuovono la formazione di strutture 3D mediante aggregazione cellula-cellula, o utilizzando (B) coltura a goccia sospesa che supporta la formazione di sferoidi tramite forza di gravità. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Formazione e sviluppo degli sferoidi nel tempo. Le immagini raffigurano la formazione di uno sferoide da parte delle cellule MCF-7 (Panel A), la mancanza di formazione di sferoidi da parte di cellule endoteliali o linfatiche (HUVEC; (Pannello B)) placcati alla stessa densità e formazione di sferoidi da parte di cellule MCF-7 più HUVEC o LEC miscelati in un rapporto 1:1 (Pannelli C,D). Viene anche raffigurata la crescita delle dimensioni di uno sferoide nel tempo (24 ore, 48 ore, 72 ore, 96 ore e 120 ore). Questo sferoide è stato formato da una miscela di MCF-7 più HUVEC in un rapporto 1: 1 e seminato ad una densità di 500 cellule / pozzetto di una piastra inferiore a U a 96 pozzetti(Pannello E), (barra della scala = 200 μm, 40x). Il grafico a linee (Pannello F) mostra la crescita dipendente dal tempo degli sferoidi di controllo (CTR) rispetto agli sferoidi stimolati dalla crescita (Trattamento). Le aree dello sferoide sono state misurate e confrontate tra sferoidi non trattati e trattati. I risultati rappresentano ± SEM, *** p < 0,001 rispetto al rispettivo controllo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Cultura e vitalità a lungo termine degli sferoidi. La fotomicrografia mostra la vitalità cellulare negli sferoidi formati con cellule MCF-7 da sole a 96 h(Pannello A)e 168 h(Pannello C),mentre i Pannelli B e D raffigurano la vitalità cellulare in sferoidi realizzati con MCF-7 più HUVEC (rapporto 1:1) a 96 h (Pannello B) e 168 h (Pannello D) (barra di scala = 100 μm). Le cellule sono state colorate con Calcein (rosso, cellule morte) e Ethidium homodimer (verde, cellule vive). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Densità di semina cellulare e profilo di crescita dipendente dal tempo di MCF-7 più sferoide HUVEC. HUVEC e cellule MCF-7 mescolate in un rapporto 1:1 sono state seminate a densità crescenti (102-104 cellule/pozzetto) e la crescita degli sferoidi è stata monitorata per 24-96 ore. Sono state scattate immagini microscopiche in campo luminoso (barra di scala = 200 μm, 40x) per valutare la crescita sferoide nel tempo. Cellule ad una densità di 500 cellule / ben fornite dimensioni ottimali per studiare la crescita sferoide. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Incorporamento di sferoidi per il sezionamento e la colorazione istologica. Pannello A: Cartone animato raffigurante il flusso di lavoro per la raccolta e l'incorporazione di HUVEC/Sferoidi MCF-7 nell'agarosio. Dopo l'incorporazione di paraffina degli sferoidi in un tappo di agarosio e il sezionamento di blocchi di paraffina, i campioni sono stati utilizzati per la colorazione istologica standard. I pannelli B e C mostrano rappresentanti MCF-7 più sferoidi HUVEC trattati rispettivamente senza e con Lipofectamine 2000 (barra di scala = 200 μm, 40x). I pannelli D-G mostrano immagini rappresentative di sezioni sferoidi macchiate con marcatori specifici. Il pannello D mostra sferoidi colorati con ematossilina-eosina per valutare la struttura sferoide (barra della scala = 100 μm). La colorazione nel pannello E raffigura cellule proliferanti macchiate positivamente con Ki67. Il pannello F mostra cellule apoptotiche in uno sferoide colorato positivamente con Caspasi-3 cleaved (barra della scala = 50 μm). Il pannello G raffigura sezioni sferoidi con doppia colorazione: CD31 (marcatore di cellule endoteliali) e Ki67 (marcatore proliferativo) (barra di scala = 100 μm). Il sezionamento degli sferoidi e la colorazione sono stati eseguiti da Sophistolab (info@sophistolab.ch). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Immagini di fluorescenza di sferoidi MCF-7/HUVEC che mostrano la distribuzione cellulare e la vitalità. I pannelli A e B raffigurano sferoidi rappresentativi con HUVEC colorati con un colorante blu e cellule MCF-7 colorate con un colorante verde. La localizzazione di HUVEC e MCF-7 all'interno dello sferoide varia immediatamente dopo la semina (A) e dopo la formazione di sferoidi (B) (barra di scala = 250 μm). I pannelli C-D mostrano sferoidi colorati con Calcein/Ethidium Homodimer per identificare cellule vive (verdi) e morte (rosse) nelle strutture 3D in condizioni di coltura normali(C)e dopo il congelamento(D)(barra di scala = 100 μm). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 7
Figura 7: Rappresentazione schematica della collezione di sferoidi per l'analisi biochimica. Cartone animato che mostra lo schema per raccogliere sferoidi, separare o rilasciare cellule e sospenderle in soluzione di lisi per l'analisi proteica o l'estrazione di RNA. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Rispetto alle colture cellulari 2D, la rivoluzionaria tecnologia di coltura sferoide 3D è uno strumento migliore e più potente per ricostruire il microambiente di un organo, le interazioni cellula-cellula e le risposte ai farmaci in vitro. Questo è il primo protocollo che descrive la formazione di sferoidi da linee cellulari multicellulari (epiteliali ed endoteliali) per la ricerca sul cancro al seno. Questo protocollo garantisce la crescita 3D sferoidale degli sferoidi per un massimo di 5 giorni e gli sferoidi possono essere esaminati dopo l'incorporamento, il sezionamento e la colorazione istologica della paraffina. È interessante notare che gli elementi cellulari all'interno dello sferoide esprimono ancora recettori che promuovono la crescita cellulare e rispondono agli stimoli proliferativi e apoptotici. Il protocollo descritto genera materiale biologico sufficiente per l'analisi di proteine o RNA / DNA. Il sistema di co-coltura di cui sopra, facilmente realizzabile in condizioni di laboratorio e a basso costo, potrebbe essere un vantaggio per le applicazioni future, in particolare nella terapia del cancro al seno e per i test di sensibilità ai farmaci. Inoltre, questo protocollo può essere applicato a diversi tipi di cellule epiteliali ed endoteliali.

È estremamente difficile imitare in vitro un tessuto complesso che esiste in vivo. Questo perché i tessuti in vivo sono costituiti da molti componenti interagenti, tra cui nervi, vasi sanguigni, mesenchima e cellule immunitarie30,42. Lo scopo di questo protocollo è quello di superare alcune di queste limitazioni utilizzando un sistema di co-coltura 3D con due diversi tipi di cellule per avvicinarsi allo stato tumorale effettivo. Qui, gli sferoidi sono stati formati con cellule tumorali epiteliali in combinazione con cellule endoteliali o cellule linfatiche per imitare il più possibile la situazione in vivo, comprese le interazioni cellula-cellula, la suscettibilità ai fattori apoptotici rilasciati negli spazi intercellulari dalle cellule morenti e le condizioni ipossiche al centro degli sferoidi. Questo protocollo è stato ottimizzato per testare le risposte cellulari a fattori di crescita, fattori di segnalazione e ormoni, che attivano rapidamente le cascate di segnalazione e la trascrizione del gene bersaglio e stimolano l'espressione e il trasporto proteico30,31. Negli sferoidi, ma non in vivo,le risposte delle cellule tumorali agli stimoli possono essere valutate rapidamente e frequentemente.

Nel presente studio, le cellule endoteliali negli sferoidi non sembrano formare strutture simili a capillari. Poiché le cellule endoteliali hanno dimostrato di formare capillari quando placcate a bassa densità e monostrati ad alta densità, è possibile che l'abbassamento del rapporto MCF-7 /cellule endoteliali possa causare la formazione di capillari all'interno degli sferoidi. In alternativa, l'aggiunta di specifiche proteine della matrice o matrigel può favorire la formazione capillare. La mancanza di una struttura capillare nello sferoide non diluisce il vantaggio delle cellule MCF-7 più endoteliali rispetto alle cellule MCF-7 di per sé, poiché i fattori rilasciati dalle cellule MCF-7 potrebbero promuovere la proliferazione delle cellule endoteliali e viceversa; tali interazioni rimarrebbero inosservate solo negli sferoidi MCF-7.

Diversi studi hanno dimostrato che 5 x 103 cellule/pozzetto era la concentrazione appropriata per seminare cellule per formare sferoidi43,44,45,46,47; tuttavia, nelle placche con fondo a U a 96 pozzetti, questo numero di cellule ha limitato la crescita coordinata degli sferoidi in condizioni sperimentali. Pertanto, in ogni nuovo studio, per ogni nuovo tipo di cellula, è importante monitorare la crescita del sistema 3D dopo il trattamento farmacologico, per determinare gli effetti del trattamento sulle dimensioni dello sferoide.

Il limite del protocollo attuale è che la coltura di sferoidi precedentemente formati non può essere continuata dopo il congelamento e lo scongelamento con il metodo DMSO classico. Infatti, quando si scongelava, la maggior parte delle cellule erano morte. La vitrificazione può rivelarsi un'alternativa al mantenimento in vita delle cellule48.

Un'attenta attenzione ai dettagli tecnici è necessaria per evitare errori e produrre e mantenere sferoidi ben formati. Una sfida è la preparazione del campione per l'immunocolorazione (paragrafo 4.1). Per facilitare il trasferimento mediante pipettaggio degli sferoidi nel tubo da 1,5 ml, è importante utilizzare una punta P200 tagliata con forbici in modo tale che l'area del foro sia più grande degli sferoidi stessi. Altrimenti, il trasferimento potrebbe distruggere le sfere. Un'altra sfida è come aspirare il mezzo dopo che gli sferoidi si sono depositati sul fondo di una provetta. A questo proposito, è meglio usare una pipetta P1000 invece di una pompa per vuoto per evitare l'aspirazione di sferoidi. Un passo importante e delicato nella preparazione degli sferoidi per il sezionamento è quello di aggiungere l'agarosio agli sferoidi pellettati. Gli sferoidi, una volta sospesi in agarosio, devono essere pellettizzati rapidamente sul fondo del tubo della microfuga utilizzando la centrifugazione orizzontale a temperatura ambiente e prima che l'agarosio polimerizzi.

Nel complesso, lo sferoide a due cellule costituito da MCF-7 e cellule endoteliali fornisce una valida alternativa per studiare le interazioni e i meccanismi cellula-cellula che guidano la crescita delle cellule tumorali o delle cellule endoteliali all'interno di un tumore. Gli sferoidi potrebbero servire come modello per valutare l'efficacia degli agenti terapeutici che prendono di mira la crescita del tumore o del cancro. È importante sottolineare che questo modello a due cellule potrebbe essere ulteriormente improvvisato per includere altri tipi di cellule rilevanti nella crescita del tumore. In questo contesto, i fibroblasti che costituiscono l'80% della massa tumorale mammaria possono essere inclusi per formare un MCF-7, cellule endoteliali e fibroblasti sferoidi. Inoltre, il silenziamento genico e le cellule geneticamente modificate potrebbero essere utilizzate per affrontare il ruolo dell'interazione cellula-cellula, i recettori ormonali (estrogeni / progesterone), i fattori di crescita e le vie di segnalazione sulla crescita tumorale / cancro, nonché per testare l'efficacia di nuove molecole anti-cancro.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Questa ricerca è stata sostenuta dalla Cancer Research Foundation / Swiss Cancer League grant KFS-4125-02-2017 a RKD e National Institute of Health grant DK079307 a EKJ.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm × 20 mm tissue-culture treated culture dishes Corning CLS430167
149MULTI0C1
35 x 10 mm Tissue Culture Dish Falcon 353001
5 mL Serological Pipet, Polystyrene, Individually Packed, Sterile Falcon 357543
Adobe Photoshop Version: 13.0.1 (64-bit)
Antibiotic Antimycotic Solution (100×) Sigma-Aldrich A5955
Calcein-AM Sigma-Aldrich 17783
CD31 (cluster of differentiation 31) Cell Marque 131M-95 monoclonal mouse ab clone JC70
CellTracker Green CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate) Invitrogen C7025
CK8/18 (cytokeratins 8 and 18) DBS Mob189-05 monoclonal mouse ab, clone 5D3
CKX41 Inverted Microscope Olympus Life Science Olympus DP27 digital camera
Cleaved Caspase 3 Cell Signaling 9661L polyclonal rabbit ab
Collagen (rat tail) Roche 11 179 179 001
Coulter ISOTON II Diluent Beckman Coulter 844 80 11 Diluent II
Coulter Z1, Cell Counter Coulter Electronics, Luton, UK
Dehydrated Culture Media: Noble Agar BD Difco BD 214220
Dermal Microvascular Endothelial Neonatal, Pooled Donors (HMVEC-DNeo) Lonza CC-2516
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2650
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham Sigma-Aldrich D6434
EBM-2 Endothelial Cell Growth Basal Medium-2 Lonza 190860
Ethidium homodimer Sigma-Aldrich 46043
Fetal Calf Serum (FCS) Thermo Fisher Scientific SH30070
Fetal Calf Serum Charcoal Stripped (FCS sf) Thermo Fisher Scientific SH3006803
Fluorescence stereo microscopes Leica M205 FA Leica Microsystems
GlutaMAX Supplement (100x) Gibco 35050038
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red Gibco 14175053
Hoechst 33342 Life Technologies H3570
HUVEC – Human Umbilical Vein Endothelial Cells Lonza CC-2517
ImageJ National Institute of Health, USA Wayne Rasband
Version: 1.52a (64-bit)
Ki67 Cell Marque 275R-16 monoclonal rabbit ab, clone SP6
Leica fully motorized fluorescence stereo microscope Leica Microsystems M205 FA
Leica Histocore Multicut Rotary Microtome 149MULTI0C1
Low Serum Growth Supplement Kit (LSGS Kit) Gibco S003K
MCF-7 cells – human breast adenocarcinoma cell line Clinic for Gynecology, University Hospital Zurich Provived from Dr Andrè Fedier obtained from ATCC
Nunclon Sphera 96U-well plate Thermo Fisher Scientific 174925
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich P6148
Phosphate-buffered saline (PBS) 1x Gibco 10010015
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific 23225
Protein Lysis Buffer Cell Signaling, Danvers, USA 9803
Quick-RNA Miniprep Kit Zymo Research R1055
RNA Lysis Buffer Zymo Research R1060-1-100 Contents in Quick-RNA Miniprep Kit
Rotina 46R Centrifuge Hettich
Round-Bottom Polystyrene Tubes, 5 mL Falcon 352003
Sonicator Bandelin electronics, Berlin, DE
Tecan Infinite series M200 microplate reader Tecan, Salzburg, AU
Tissue Culture Flasks 75 TPP 90076
Trypsin-EDTA solution Sigma-Aldrich T3924

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Sferoidi epiteliali ed endoteliali mammari come potenziale modello funzionale <em>in vitro</em> per la ricerca sul cancro al seno
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Azzarito, G., Szutkowska, M. E., Saltari, A., Jackson, E. K., Leeners, B., Rosselli, M., Dubey, R. K. Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research. J. Vis. Exp. (173), e62940, doi:10.3791/62940 (2021).

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