Summary
Crosstalk zwischen Brustepithelzellen und Endothelzellen trägt wesentlich zum Fortschreiten von Brustkrebs, Tumorwachstum und Metastasierung bei. In dieser Studie wurden Sphäroide aus Brustkrebszellen zusammen mit vaskulären und/oder lymphatischen Endothelzellen hergestellt und demonstrieren ihre Anwendbarkeit als In-vitro-System für die Brustkrebsforschung.
Abstract
Brustkrebs ist die häufigste Todesursache bei Frauen. Das Wachstum von Brustkrebszellen und deren anschließende Metastasierung ist ein Schlüsselfaktor für ihr Fortschreiten. Obwohl die Mechanismen, die an der Förderung des Brustkrebswachstums beteiligt sind, intensiv mit Monokulturen von Brustkrebszellen wie MCF-7-Zellen untersucht wurden, wurde der Beitrag anderer Zelltypen, wie vaskulärer und lymphatischer Endothelzellen, die eng am Tumorwachstum beteiligt sind, nicht eingehend untersucht. Die Zell-Zell-Interaktion spielt eine Schlüsselrolle für das Wachstum und die Progression von Tumoren. Die Neoangiogenese oder die Entwicklung von Gefäßen ist für das Tumorwachstum unerlässlich, während das Lymphsystem als Portal für die Migration von Krebszellen und die anschließende Metastasierung dient. Neuere Studien belegen, dass vaskuläre und lymphatische Endothelzellen das Wachstum von Krebszellen signifikant beeinflussen können. Diese Beobachtungen implizieren die Notwendigkeit, In-vitro-Modelle zu entwickeln, die Brustkrebswachstumsprozesse in vivorealistischer widerspiegeln würden. Darüber hinaus erfordern Einschränkungen in der Tierforschung die Entwicklung von Ex-vivo-Modellen, um die beteiligten Mechanismen besser aufzuklären.
Dieser Artikel beschreibt die Entwicklung von Brustkrebs-Sphäroiden, die sowohl aus Brustkrebszellen (Östrogenrezeptor-positive MCF-7-Zellen) als auch aus vaskulären und/oder lymphatischen Endothelzellen bestehen. Das Protokoll beschreibt einen detaillierten Schritt-für-Schritt-Ansatz bei der Herstellung von Dual-Cell-Sphäroiden mit zwei verschiedenen Ansätzen, hängendem Drop (Goldstandard und billig) und 96-Well-U-Bodenplatten (teuer). Es werden detaillierte Anweisungen bereitgestellt, wie die gebildeten Sphäroide vorsichtig aufgenommen werden können, um das Wachstum durch mikroskopische Größenbestimmung zu überwachen und die Lebensfähigkeit durch Färbung toter und lebender Zellen zu beurteilen. Darüber hinaus werden Verfahren zur Fixierung der Sphäroide zum Schneiden und Färben mit wachstumsspezifischen Antikörpern zur Differenzierung von Wachstumsmustern in Sphäroiden beschrieben. Zusätzlich werden Details zur Herstellung von Sphäroiden mit transfizierten Zellen und Methoden zur Extraktion von RNA für die molekulare Analyse bereitgestellt. Zusammenfassend enthält dieser Artikel detaillierte Anweisungen zur Vorbereitung von mehrzelligen Sphäroiden für die Brustkrebsforschung.
Introduction
Die Verwendung von Tieren für Experimente hat Grenzen. Tierstudien können das Fortschreiten der Krankheit beim Menschen nicht genau nachahmen, und Tiere und Menschen haben keine identischen Reaktionen auf Krankheitserreger. Darüber hinaus Einschränkungen bei Tierversuchen aufgrund von Bedenken hinsichtlich Tierleid und ethischer Probleme1,2 forschungsprogramme zunehmend einschränken. In vitro Systeme zur Umgehung der Verwendung von Tieren wurden in großem Umfang entwickelt; Darüber hinaus hat die Verwendung menschlicher Zellen dazu geführt, dass in vitro Modelle, die für die pathophysiologische und therapeutische Untersuchung relevanter sind. Herkömmliche Monolayer (2D) Zellkulturen sind weit verbreitet, weil sie menschliches Gewebe bis zu einem gewissen Grad nachahmen. 2D-Monokulturen können jedoch keine menschlichen Organe nachahmen, und 2D-Monokulturen sind nicht in der Lage, die komplexe Mikroumgebung der ursprünglichen Organe zu simulieren und die in vivo Situation3,4,5,6. Darüber hinaus könnten in monoschichtigen Zellkulturen medikamentöse Behandlungen leicht alle Zellen zerstören / schädigen. Wichtig ist, dass einige dieser Einschränkungen durch die Umstellung auf mehrschichtige dreidimensionale (3D) Zellkulturen überwunden werden können.7,8. Tatsächlich wurde gezeigt, dass 3D-Kulturmodelle die zelluläre Struktur, das Layout und die Funktion von Zellen in Primärgeweben besser widerspiegeln. Diese 3D-Kulturen können aus einer Vielzahl von Zelllinien gebildet werden, ähnlich einem funktionellen Organ. Tatsächlich gibt es zwei Modelle von 3D-Kulturen. Ein Modell erzeugt Sphäroide von aggregierten Zellen, die Cluster bilden und sie in Kugeln (gerüstfreie Modelle) umorganisieren. Die zweite ergibt Organoide, die eine komplexere Struktur haben und aus Kombinationen mehrerer organspezifischer Zellen bestehen, die als Miniaturversion von Organen betrachtet werden.9,10. Aus diesem Grund stellen 3D-Kultursysteme eine innovative Technologie mit vielen biologischen und klinischen Anwendungen dar. So haben Sphäroide und Organoide zahlreiche Anwendungen für die Krankheitsmodellierung und Studien im Zusammenhang mit regenerativer Medizin, Arzneimittelscreening und toxikologischen Studien.6,11,12,13,14,15. Karzinogene Sphäroide, abgeleitet von der 3D-Technologie, bilden die Morphologie und den Phänotyp relevanter Zelltypen nach und ahmen die in vivo Tumormikroumgebung und Modellzellkommunikation und Signalwege, die während der Tumorentwicklung funktionsfähig sind16,17,18. Um das Verständnis der Krebsbiologie zu verbessern, können Tumorsphäroide / Organoide auch verwendet werden, um eine potenzielle patientenspezifische Krebstherapie (personalisiert) zu identifizieren und ihre Wirksamkeit, Toxizität und Langzeitwirkungen zu bewerten.19,20,21,22. Sphäroide haben prominente Möglichkeiten eröffnet, Pathophysiologie, Krankheitsmodellierung und Drogenscreening zu untersuchen, da sie in der Lage sind, die zelluläre und dreidimensionale Gewebearchitektur zu erhalten, die Fähigkeit, die in vivo -Situation und die Zell-Zell-Interaktionen. Man muss sich jedoch auch der Einschränkungen dieses Systems bewusst sein, wie dem Fehlen einer vaskulären / systemischen Komponente, eines funktionellen Immun- oder Nervensystems, und das System stellt im Vergleich zu Tiermodellen einen reduktionistischen Ansatz dar. Tatsächlich bieten 3D-Strukturen im Gegensatz zu Tiermodellen nur eine Annäherung an die Biologie innerhalb eines menschlichen Körpers. Das Verständnis der Grenzen der 3D-Methode kann Forschern helfen, verfeinerte und validere Prozesse zur Herstellung von Sphäroiden zu entwickeln, die ein Organ in einem größeren Maßstab besser darstellen23,24,25.
Krebs ist die häufigste Todesursache weltweit, und Brustkrebs ist die häufigste Krebsart bei Frauen26,27,28. Um die komplexe Mikroumgebung von Brustkrebs nachzuahmen, sollten Brustkrebs-Sphäroide mit Zellen kultiviert werden, die eine herausragende Rolle bei Brusttumoren spielen, d. H. Epithelzellen, Endothelzellen, Fibroblasten und / oder Immunzellen. Darüber hinaus sollten bei einem Sphäroid, das Brustkrebs darstellt, auch die Expression weiblicher Hormonrezeptoren (Östrogen-/Progesteronrezeptoren), die Fähigkeit, den histologischen Status des Patiententumors zu erhalten, und die Fähigkeit, das Ansprechen auf die Therapie nachzuahmen, in Betracht gezogen werden. Studien haben gezeigt, dass 3D-Kokultursysteme eine zelluläre Organisation ähnlich der des Primärgewebes in vivohaben, die Fähigkeit haben, in Echtzeit auf Reize zu reagieren, und funktionelle Androgenrezeptoren haben29,30,31,32. Daher könnte ein ähnlicher Ansatz nützlich sein, um einen Brusttumor in vitro nachzuahmen. Der Zweck des aktuellen Protokolls ist es, eine neue Methode zur Erzeugung von Brustkrebs-Sphäroiden zu etablieren. Diese Methode verwendet Östrogenrezeptor-positive MCF-7-Zellen (eine immortalisierte menschliche Zelllinie von Epithelzellen) und vaskuläre Endothelzellen (HUVECs) oder lymphatische Endothelzellen (HMVEC-DNeo), um ein Modell zu erstellen, das die Wechselwirkungen zwischen diesen Zellen innerhalb eines Tumors nachahmt oder genau widerspiegelt. Obwohl MCF-7 (Östrogen-responsive) und Endothelzellen verwendet wurden, um Sphäroide in der vorliegenden Studie zu entwickeln, könnten andere Zellen wie Fibroblasten, die ~ 80% der Brusttumormasse ausmachen, in Zukunft ebenfalls kombiniert werden, um den Brusttumor besser darzustellen und nachzuahmen.
Es gibt mehrere Methoden, um Sphäroide zu bilden, wie zum Beispiel: 1) die hängende Tröpfchenmethode, die die Schwerkraftverwendet 33,34; 2) die Magnetschwebemethode, bei der magnetische Nanopartikel verwendet werden, die einem externen Magneten35ausgesetzt sind, und 3) die sphäroide Mikrotiterplattenmethode, die durchgeführt wird, indem Zellen auf Platten mit geringer Befestigung36,37gesetzt werden. Auf der Grundlage der bestehenden Methoden, die nur einen Zelltyp verwenden, wurde das vorliegende Protokoll unter Verwendung von Epithel- und Endothelzellen optimiert, um die Wachstumsbedingungen von Brustkrebstumoren in vivobesser nachzuahmen38,39,40,41. Diese Methode kann leicht im Labor zu geringen Kosten und mit minimalem Gerätebedarf erreicht werden. Basierend auf dem Bedarf / den Zielen des Labors wurden verschiedene Ansätze verwendet, um Sphäroide zu bilden und relevantes zelluläres Material aus diesen Sphäroiden zu gewinnen. In diesem Zusammenhang werden die 3D-Sphäroide für die DNA-, RNA- oder Proteinanalyse durch Co-Kultivierung von Endothel- und Epithelzellen mit der Hanging-Drop-Methode hergestellt. Für funktionelle Studien, zum Beispiel zur Überwachung des Zellwachstums nach kurzer interferierender (siRNA) Transfektion und/oder Hormonbehandlung, werden die Sphäroide jedoch über U-Bodenplatten erzeugt.
Der Zweck dieses technischen Protokolls besteht darin, eine detaillierte Schritt-für-Schritt-Beschreibung für 1) die Bildung von mehrzelligen Sphäroiden von Brustkrebs, 2) die Vorbereitung von Proben für die histologische Färbung und 3) die Sammlung von Zellen für die Extraktion von RNA, DNA und Proteinen bereitzustellen. Sowohl die kostengünstige Hängetropfenmethode als auch die teureren U-Bodenplatten werden zur Bildung von Sphäroiden verwendet. Hier wird ein Protokoll zur Vorbereitung (Fixierung) von Sphäroiden für die Schnittung und anschließende Immunfärbung mit Markern zur Beurteilung der Zellproliferation, Apoptose und Verteilung von Epithel- und Endothelzellen innerhalb eines Sphäroids bereitgestellt. Darüber hinaus zeigt dieses Protokoll eine vollständige Schritt-für-Schritt-Analyse histologischer Daten mit der ImageJ-Software. Die Interpretation biologischer Daten variiert je nach Art des Experiments und den verwendeten Antikörpern. Die Schnittung der fixierten Sphäroide und die anschließende Färbung der Schnitte wurde von einem routinemäßigen Pathologielabor durchgeführt (Sophistolab: info@sophistolab.ch).
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Protocol
1. Zellkultur
HINWEIS: Führen Sie die Zellhandhabung unter sterilen Bedingungen durch.
- Subkultur menschlicher Nabelschnurvenendothelzellen (HUVECs)
- 75 cm2 Kolben mit Kollagen (5 μg/cm2) (Rattenschwanz) über Nacht (ON) bei Raumtemperatur (RT) oder 2-3 h bei 37 °C beschichten, mit Wasser abspülen und den Kolben trocknen lassen.
- HUVECs in Wachstumsmedium (EBM-2, Endothelial Basal Medium-2) anbauen, ergänzt mit Glutamin (1x = 2 mM), antibiotisch-antimykotischer Lösung (AA; 100 μg/ml Streptomycin, 100 μg/ml Penicillin und 0,025 μg/ml Amphotericin B), LSGS (2% v/v FCS, 1 μg/ml Hydrocortison, 10 ng/ml humaner epidermaler Wachstumsfaktor, 3 ng/ml humaner Basisfibroblasten-Wachstumsfaktor, 10 μg/ml Heparin) und 10% FCS (Fetal Calf Serum) unter Standard-Gewebekulturbedingungen (37 °C, 5%CO2). Wechseln Sie das Medium alle 2 Tage, bis die Zellen 70% -80% Konfluenz erreichen.
- Waschen Sie die subkonfluenten Kulturen mit 5 ml HBSS (ohne Ca2+ undMg2+)und geben Sie 3 ml Trypsin (0,25% verdünnt in HBSS (ohne Ca2+ undMg2+)).
HINWEIS: HBSS kann auch durch PBS ersetzt werden. - Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C für 2 min (mikroskopisch prüfen, ob die Zellen abgetrennt und aufgerundet sind) und stoppen Sie die Ablösungsreaktion durch Zugabe von 6 ml 10% FCS-Medium (DMEM-F12 oder EBM-2, 10% FCS).
- Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 250 x g für 5 min bei RT und verwerfen Sie den Überstand.
- Suspendieren Sie die Zellen im Wachstumsmedium und samen Sie in 75 cm2 Kolben oder Kulturschalen.
- Michigan Cancer Foundation-7 (MCF-7, humane Brust-Adenokarzinom-Zellen) Subkultur
- Menschliche Brustkrebs-Zelllinien in 75 cm2 Kolben im Wachstumsmedium (DMEM/F12-Medium ergänzt mit einem handelsüblichen Glutamin (1x), antibiotisch-antimykotischer Lösung (AA; 100 μg/ml Streptomycin, 100 μg/ml Penicillin und 0,025 μg/ml Amphotericin B) und 10% FCS unter Standard-Gewebekulturbedingungen (37 °C, 5%CO2) züchten. Wechseln Sie das Medium alle 2-3 Tage.
- Waschen Sie die subkonfluenten Zellkulturen (70%-80% Konfluenz) mit 5 ml HBSS (ohne Ca2+ und Mg2+)und fügen Sie 3 ml Trypsin (0,5% verdünnt in HBSS (ohne Ca2+ undMg2+)bei 37 °C für 5 min hinzu (mikroskopisch überprüfen, ob die Zellen abgetrennt sind).
HINWEIS: HBSS kann auch durch PBS ersetzt werden. - Fügen Sie 8 ml 10% FCS-Medium hinzu, um die Ablösungsreaktion zu stoppen, zentrifugieren Sie bei 250 x g für 5 min bei RT und verwerfen Sie den Überstand.
- Suspendieren Sie das Pellet im Wachstumsmedium und den Teller in 75 cm2 Kolben oder Kulturschalen.
2. Sphäroidbildung
- Platte 5 x 105 Zellen/ml (HUVECs und MCF-7) in einer 3,5 cm runden Schale und Kultur für 48 h.
- Behandeln oder transfizieren Sie die plattierten Zellen für 24 Stunden oder nach Wunsch.
- Optionaler Schritt in 96-Well-U-Bodenplatte: Waschen Sie die Zellen mit 1 ml HBSS (Ca2 + und Mg2 +)und färben Sie HUVECs mit einem blauen Farbstoff (0,5 μg / ml) und MCF-7-Zellen mit einem grünen Farbstoff (0,5 μM), der im jeweiligen Wachstumsmedium verdünnt ist, und geben Sie ihn für 30-40 min in einen 37 ° C und 5% CO 2-Inkubator.
- Waschen Sie die Zellen mit 1 ml HBSS (ohne Ca2+ und Mg2+),geben Sie 1 ml enzymatisches Ablösungsreagenz (0,25% Trypsin für HUVEC und 0,5% Trypsin für MCF-7) zu jeder runden Schüssel mit einer P1000-Pipette und inkubieren Sie dann für 2-5 min, bis sich die Zellen gelöst haben.
- Sammeln Sie jeden Zelltyp separat in einem 5-ml-Rundboden-Polystyrolröhrchen und fügen Sie 1 ml 10% iges FCS-Medium mit einer P1000-Pipette hinzu, um die enzymatische Reaktion zu stoppen. Zentrifugieren Sie die Zellsuspensionen bei 250 x g für 5 min.
- Den Überstand vorsichtig absaugen und die Zellen in 1 ml steroidfreiem Medium suspendieren (EBM-2, Glutamin, Antibiotikum-Antimykotikum, 0,4% FCS sf (Holzkohle-strippen)).
HINWEIS: Steroidfreies Medium kann durch normales Wachstumsmedium ersetzt werden. - Verwenden Sie 100 μL jeder Zellsuspension, die mit 10 ml Verdünnungsmittel II verdünnt ist (siehe Tabelle der Materialien),um die Gesamtzellzahl zu bestimmen und die Menge des Behandlungsmediums (EBM-2, Glutamin, Antibiotikum-Antimykotikum, 0,4% FCS sf, Vehikel /Behandlung) zu berechnen, das benötigt wird, um eine Zellsuspension von 5 x 103 Zellen / ml oder 3,4 x10 5 Zellen / ml pro Zelltyp zu erhalten.
- Zellzahl
- Schalten Sie die Maschine ein und bündig, indem Sie die Tasten Funktion und Start drücken (Set-up S3), mit Verdünnungsmittel II-Lösung in einer Zellzählerfläschchen.
- Verwenden Sie Setup S4 und drücken Sie Start, um den Rohling mit frischer Verdünnungsmittel-II-Lösung zu messen.
- Wechseln Sie die Szintillationsfläschchen mit 100 μL Zellsuspension in 10 mL Verdünnungsmittel-II-Lösung und messen Sie die Proben: S4 einrichten und Startdrücken.
- Beachten Sie die Anzahl der Zellen pro ml auf der Digitalanzeige.
HINWEIS: Die Zellzählung kann auch mit anderen manuellen oder automatischen Systemen durchgeführt werden: Hämozytometer-Gitternetzlinien, Lichtstreu-Zellzähltechnologie, elektrische Impedanz, bildgebende Systeme mit Zellfärbung, z. B. Trypanblau.
- 96-Well U-Bodenplatten
- Von jeder Zellsuspension (5 x 10 3 Zellen/ml)werden 5 ml hergestellt und zu einem Endvolumen von 10 ml im Verhältnis 1:1 vermischt.
- Verwenden Sie eine manuelle Repetierpipette, um 100 μL der Zellsuspension in jede Vertiefung der 96-Well-U-Bodenplatten zu pipettieren.
- Legen Sie die Platte unter Standardbedingungen der Gewebekultur in einen Inkubator und überprüfen Sie nach 48 h die Bildung von Sphäroide.
- Optionaler Schritt: Fotografieren Sie die Sphäroide (40x) mit einem Fluoreszenz-Stereomikroskop.
HINWEIS: Diese Methode erzeugt 96 Sphäroide (ein Sphäroid / Well) nach 48 h (Fläche 1-2 Pixel2)und wird normalerweise für Wachstumsstudien verwendet.
- Hängender Tropfen
- Mischen Sie die Zellsuspensionen (3,4 x 105 Zellen/ml) im Verhältnis 1:1, um ein Endvolumen von 2 ml zu erhalten.
- Verwenden Sie eine P20-Pipette, um die Zellmischung in Form von 15 μL-Tropfen auf den umgekehrten Deckel einer 10 cm großen Petrischale zu säen.
- Drehen Sie den Deckel mit den Tropfen um und fügen Sie 5 ml Basismedium (EBM-2) am Boden der Schüssel hinzu, um eine Verdunstung der Tropfen zu vermeiden.
HINWEIS: Diese Methode erzeugt nach 48 h ein Sphäroid/Tropfen. Stellen Sie sicher, dass die Tropfen ausreichend voneinander entfernt sind, damit sie beim Umschalten des Deckels nicht verschmelzen. Verwenden Sie bei Bedarf mehr als eine 10 cm Petrischale.
- Zellzahl
3. Sphäroid-Wachstumsstudie
- Platte 100 μL HUVECs und MCF-7 Zellmischung (5 x 102 Zellen/Well) in 96-Well U-Bodenplatten und legen Sie sie in den Inkubator.
- 48 h nach der Beschichtung mit einem inversen Mikroskop (Hellfeld) auf Sphäroidbildung prüfen. Machen Sie Fotos (mindestens sechs Bilder pro Behandlung, 40x) bei 96 h Kultur.
- Öffnen Sie die Bilder mit einer Bildverarbeitungssoftware und verarbeiten Sie das Bild auf 300 Pixel / Zoll und speichern Sie das Bild als TIFF-Datei.
- Laden Sie die ImageJ-Software herunter und öffnen Sie sie. Klicken Sie auf die Option Datei und gehen Sie zu Öffnen.
- Konvertieren Sie die Bereiche von Interesse einheitlich in gesättigte schwarze Bereiche, um ein binäres Bild (Schwarz-Weiß) zu erhalten. Wählen Sie dazu die Option Bild, wählen Sie Typ | 8-Bit. Jetzt ist das Bild schwarz-weiß.
- Verwenden Sie das Freihandauswahl-Werkzeug, um den Rand der Sphäroide zu zeichnen.
- Um den Interessenbereich zu berechnen und das Objekt oder die Vordergrundpixel von den Hintergrundpixeln zu trennen, verwenden Sie die Schwellenwertfunktion: Wählen Sie die Option Bild, wählen Sie Anpassen und klicken Sie auf Schwellenwert.
- Jetzt öffnet sich ein Popup-Fenster Schwellenwert. Die obere Leiste zeigt den minimalen Schwellenwert an: Setzen Sie den Wert auf Null. Die untere Leiste zeigt den maximalen Schwellenwert an: Verschieben Sie den Balken, bis der Interessenbereich vollständig rot wird.
HINWEIS: Wenn die Farbe nicht rot ist, wählen Sie im Fenster Schwellenwert die Option Rot aus. - Gehe zu | analysieren Stellen Sie Messungen ein und wählen Sie Fläche und Umfang.
- Um den Interessenbereich zu messen, wählen Sie die Option Analysieren (Analyze) und verwenden Sie das Werkzeug Partikel analysieren (Analyze Particles). Legen Sie im Fenster Partikel analysieren die zu messende Größe fest (0,00003-Unendlich oder 3-Unendlich, abhängig von der Größe der Sphäroide), wählen Sie Ergebnisse zusammenfassen und anzeigenaus. Klicken Sie dann auf OK.
- Die Ergebnisse werden in einem Diagramm angezeigt. Kopieren Sie die Messungen in eine Tabelle, um die Daten zu analysieren.
HINWEIS: Die Fläche wird als Gesamtzahl der Pixel berechnet. Verwenden Sie die Gesamtfläche für die Berechnung.
4. Sphäroid-Immunhistochemie-Studie
- Probenvorbereitung
- Platten Sie die Zellmischung aus HUVECs und MCF-7 (5 x 103 Zellen/Well) in 96-Well U-Bodenplatten in HUVEC Wachstumsmedium für 96 h.
- Etwa 50 Sphäroide in einem 1,5 ml Röhrchen mit einer Schnittspitze einer P200 μL-Pipette sammeln; Lassen Sie sie sich durch Schwerkraft am Boden der Röhre absetzen und verwerfen Sie dann den Überstand.
- Fixieren Sie die Sphäroide mit 500 μL 4% PFA für 1 h, RT.
- 2% ige Nobel-Agar-Lösung in PBS mit einer Heizplatte mit einem Magnetrührer für 3-5 min kochen, um das Agarosepulver vollständig aufzulösen und auf etwa 60 °C abzukühlen.
- Entfernen Sie die PFA mit einer P1000-Pipette, waschen Sie die Sphäroide mit 500 μL PBS und lassen Sie sie sedimentieren. Verwerfen Sie den Überstand.
- 600 μL Agaroselösung vorsichtig mit Sphäoiden in das 1,5 ml Röhrchen pipettieren und sofort in eine Zentrifuge mit horizontalem Rotor bei 177 x g für 2 min legen.
- Fügen Sie eine kurze Schnur in der Mitte der Agaroselösung hinzu, um den Stopfen leicht aus dem Röhrchen zu entfernen.
- Agarosepfropfen auf Eis oder bei 4 °C verfestigen. Geben Sie 500 μL PBS in das 1,5-ml-Röhrchen, um ein Austrocknen des Pellets zu vermeiden.
HINWEIS: Die Proben sind bereit für die anschließende Dehydratisierung, Paraffineinbettung, Schnitt, Übertragung auf die Objektträger und IHC-Färbung (durchgeführt von Sophistolab).
- Bildaufnahme und -verarbeitung
- Erfassen Sie Bilder von Sphäroideschnitten mit einem Stereomikroskop.
- Speichern Sie drei Bilder für jedes Beispiel als .jpg Dateien.
- Öffnen Sie die ImageJ-Software. Öffnen Sie das JPEG-Bild, klicken Sie auf Datei und dann auf Öffnen.
- Wählen Sie in der Option Bild die Option Farbe und Farbdekonvolution aus.
- Wählen Sie im Fenster Color Deconvolution 1.7 die Option H DAB-Vektoren aus, und die drei Bilder werden angezeigt.
HINWEIS: Die drei Bilder sind: Farbe 1 repräsentiert nur die Hematoxylin-Färbung (blau / lila) und Farbe 2 stellt nur die DAB-Färbung (braun) dar. Farbe 3 wird für die Bildanalyse mit zwei Verfärbungen nicht benötigt. - Wählen Sie das Fenster Farbe 1 und legen Sie den Schwellenwert fest: Gehen Sie zu Bild | Anpassen und auf Schwellenwertklicken. Das Fenster Schwellenwert wird angezeigt.
- Lassen Sie den minimalen Schwellenwert auf Null gesetzt und passen Sie den maximalen Schwellenwert an, um das Hintergrundsignal zu entfernen, ohne das wahre Signal zu beeinflussen. Klicken Sie auf Übernehmen.
- Flächenmessung
- Klicken Sie auf Analysieren, wählen Sie Set Measurement. Wählen Sie Bereich, mittlerer Grauwertund Min. und Max. Grauwert und klicken Sie zur Bestätigung auf OK.
- Messen Sie die Größe des Kerns mit der Option Analysieren und wählen Sie dann Messenaus.
HINWEIS: Das Ergebnisfenster enthält den Namen des Bildes (Beschriftung), die Größe des Bildes (Fläche), die durchschnittliche Pixelintensität des IHC-Bildes (Mittelwert) sowie die minimalen und maximalen Grauwerte (Min, Max). Verwenden Sie den Mittelwert für die Berechnung. - Wiederholen Sie die Schritte 4.2.6-4.7.1.2 für das Fenster Farbe 2 (und Farbe 3 bei doppelter Färbung).
- Zellquantifizierung
- Klicken Sie auf Verarbeiten, wählen Sie die Option Binär und wählen Sie Wasserscheide, um die Zellen zu trennen.
- Gehen Sie zu Analysieren und klicken Sie auf Partikel analysieren. Legen Sie im Popup-Fenster Partikel analysieren die Größe der Zellen so fest, dass unspezifische Partikel ausgeschlossen werden. Klicken Sie anschließend auf der Option Anzeigen auf das Dropdown-Feld und wählen Sie Gliederungenaus. Klicken Sie dann auf OK.
- Wiederholen Sie die Schritte 4.2.6-4.2.7 und die Zellquantifizierungsschritte (Abschnitt 4.2.7.2) für das Fenster Farbe 2 (und Farbe 3 bei doppelter Färbung).
HINWEIS: Jetzt werden drei Fenster angezeigt: 1) Zusammenfassungsergebnisse (Anzahl der gezählten Zellen, Gesamtfläche, durchschnittliche Größe, Prozentsatz der Fläche und Mittelwert), 2) Ergebnisse (entsprechend den gezählten Zellen) und 3) Zeichnungsfenster (dargestelltes Bild der gezählten Zellen).
- Flächenmessung
5. Lebende/tote Färbung in Sphäroide
- Herstellung von 4 mM Stammlösungen von Calcein AM in DMSO (färbt lebende Zellen grün) und 2 mM Ethidium homodimer in DMSO (färbt tote Zellen rot) in 1,5 ml Röhrchen.
- Berechnen Sie die Lösungsmenge, die erforderlich ist, um 10 μL/Well einer Mischung aus Calcein AM und Ethidium-Homodimer, verdünnt 1:50 in EBM-2, hinzuzufügen.
- Geben Sie die Färbemischung zu den Sphäroide und legen Sie die Platte unter Standard-Gewebekulturbedingungen für 30-60 min in den Inkubator.
- Erfassen Sie Bilder (40x) mit dem Fluoreszenz-Stereomikroskop.
6. Sphäroid-Protein- und RNA-Isolierung
- Zellsuspensionen mit 3,4 x 105 Zellen/ml pro Zelltyp vorbereiten, im Verhältnis 1:1 mischen und die Zellmischung mit einer P20-Pipette in Form von 15 μL-Tropfen auf den Deckel einer 10 cm großen Petrischale aussäen. Kehren Sie das Lid um und legen Sie es unter Standard-Gewebekulturbedingungen für 96 h in den Inkubator.
- Verwenden Sie 5-6 ml PBS, um Sphäroide in einem 15 ml polystyrolförmigen Röhrchen mit rundem Boden unter Verwendung von 5 ml sterilen Polystyrolpipetten zu sammeln.
HINWEIS: Es ist auch möglich, konische 15-ml-Rohre zu verwenden. - Zentrifugieren Sie die Sphäroidsuspension bei 250 x g für 5 min und aspirieren Sie dann vorsichtig den Überstand.
- Fügen Sie 500 μL Trypsin (100%) hinzu und pipettieren Sie mit einer P1000-Pipette für 30 s, um Sphäroide zu disaggregieren, wodurch eine Zellsuspension erreicht wird.
- Neutralisieren Sie Trypsin mit 10% FCS-Medium, zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 250 x g für 5 min und aspirieren Sie den Überstand.
- Verwenden Sie gemäß dem Protokoll des Herstellers (spezifisches Kit für die DNA-freie RNA-Isolierung) 300 μL RNA-Lysepuffer, um das Zellpellet zu lysieren.
HINWEIS: Lysepuffer kann auch direkt zu den intakten Sphäroiden hinzugefügt werden (kein Trypsin-Schritt erforderlich), um RNA zu extrahieren. 300 μL des Lysepuffers zu den pelletierten Sphäroide geben, Röhrchen in Eis legen und 10 Mal mit einer P200-Pipette verdränken. Anschließend isolieren Sie RNA wie oben. Sphäroiddissoziation kann erforderlich sein, wenn die RNA-Rückgewinnung aufgrund von Matrixinterferenz gering ist. - Alternativ können Sie 70 μL des Lysepuffers zur Proteinisolierung verwenden. Homogenisieren Sie für 2-4 s durch Beschallung und bestimmen Sie die Proteinkonzentration gemäß dem Protokoll des Herstellers mit einem BCA Assay Kit.
HINWEIS: Zur Proteinisolierung können pelletierte Sphäroide direkt im Lysepuffer lysiert werden, gefolgt von der Beschallung. Verwenden Sie 25 μg Gesamtprotein, um Western Blot durchzuführen.
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Representative Results
Das Sphäroidmodell unter Verwendung von epithelialen und endothelialen Co-Kulturen ist erforderlich, um die In-vivo-Bedingungen von Brusttumoren für In-vitro-Experimente genau nachzuahmen. Das Schema in Abbildung 1 zeigt das Protokoll zur Bildung von Sphäroide mit Brustkrebsepithelzellen und vaskulären oder lymphatischen Endothelzellen (Abbildung 1). Jeder Zelltyp wird separat in einer 3,5 cm langen runden Schale ausgesät und mit Wachstumsstimulatoren/Inhibitoren behandelt oder mit Lipofektovariden mit Lipofektamin transfiziert. Die konfluenten Monoschichten von Epithel- oder Endothelzellen werden nach der Trypsinisierung geerntet, gewaschen und im Verhältnis 1: 1 gemischt. Anschließend werden die Zellen in 96-Well-U-Bodenplatten(Abbildung 1A)oder auf dem umgekehrten Deckel einer runden Kulturschale mit 10 cm Durchmesser plattiert, um die hängende Tropfenkultur zu erleichtern (Abbildung 1B). Bald nach der Aussaat erscheinen die Zellen als flache, dichte Zellschichten am Boden jedes Brunnens oder Tropfens, und anschließend aggregieren sie sich mit der Zeit (24-48 h) und bilden so bei 48 h intakte Sphäroide. Um eine Beschädigung der lose gebildeten Zellaggregate zu vermeiden, dürfen die Platten mindestens 24 h lang nicht gestört werden.
In U-Bodenplatten führte die Aussaat von MCF-7-Zellen, aber nicht von Endothelzellen oder Lymphzellen, nach 48 h zu einer Sphäroidbildung(Abbildung 2A,B). Darüber hinaus führte die Aussaat von MCF-7 plus Endothelzellen oder Lymphzellen im Verhältnis 1:1 auch zur Bildung von Sphärooiden(Abbildung 2C,D). Um Sphäroide als Modell zur Untersuchung des Tumorwachstums zu validieren, wurden zeitabhängige Veränderungen der Sphäroidgröße als Reaktion auf wachstumsstimulierende Lösung gemessen/quantifiziert und mit den unbehandelten Kontrollen verglichen (Abbildung 2). Mikroaufnahmen in Abbildung 2E zeigen das zeitabhängige (24-120 h) sequentielle Wachstum eines repräsentativen MCF-7-Sphäroids. Das Liniendiagramm in Abbildung 2F zeigt die Veränderung der Fläche der MCF-7-Sphäroide im Laufe der Zeit, wenn sie mit oder ohne Wachstumsstimulator behandelt werden. Die Sphäroidgröße stieg innerhalb von 5 Tagen von ~100 μm auf ~200 μm; Darüber hinaus wurde eine erhöhte Wachstumsrate bei Sphäroiden beobachtet, die mit dem Wachstumsstimulator behandelt wurden (Abbildung 2F). Da eine Langzeitbehandlung (168 h) zu einer verminderten MCF-7-Lebensfähigkeit führte, möglicherweise aufgrund hypoxischer Bedingungen im Zentrum der Sphäroide(Abbildung 3),wurde das 3D-Strukturwachstum bis 96 h untersucht. Sphäroide, die mit MCF-7-Zellen und HUVECs gebildet wurden, zeigen eine geringere Anzahl toter Zellen bei 168 h im Vergleich zu Sphäroiden, die mit MCF-7 allein gebildet wurden.
In den ersten Experimenten wurde nach 4 Tagen Kultur nur ein geringes Wachstum der Sphäroidgröße beobachtet. Es wurde angenommen, dass dies auf die hohe Anzahl von Zellen zurückzuführen sein könnte, die zur Bildung von Sphäroiden ausgesät wurden. In den U-Bodenkulturplatten könnte das Wachstum von Sphäroiden durch die konkave Form des Brunnens begrenzt worden sein. Da das Wachstum von der anfänglichen Anzahl der ausgesäten Zellen abhängig war, wurden verschiedene Zellzahlen verwendet, um Sphäroide zu bilden, um Bedingungen zu testen und zu schaffen, die optimal wären, um das Sphäroidwachstum zu überwachen. Wie in Abbildung 4gezeigt, deuten die Ergebnisse darauf hin, dass für Sphäroidwachstumsstudien die Aussaat von 500 Zellen / Well zur Bildung von Sphäroide zuverlässig und reproduzierbar war, um das Wachstum von Sphäroiden für 4-6 Tage als Reaktion auf wachstumsmodulatorische Faktoren zu überwachen. Sphäroide, die für histologische oder immunhistologische Beobachtungen am besten geeignet waren, wurden am Tag 4 nach der Aussaat von 5 x 103 Zellen/Well erhalten. Dieselbe Ausgangskonzentration wurde für Zellprotein- oder RNA-Extraktionen verwendet. Die Erhöhung der anfänglichen Zellkonzentration um mehr als 7,5 x 103 Zellen / Well verbesserte die Sphäroidbildung nicht, und die Zellen aggregierten nicht richtig und nahmen unregelmäßige Strukturen an (Abbildung 4).
Um die Zellzusammensetzung, die Proliferation und den Apoptosestatus zu bewerten, wurden histologische Abschnitte von Sphäroiden, die mit Brustkrebszellen sowie Endothelzellen gebildet wurden, mit H& E und Ki67 (Verdünnung 1:300) und gespaltenen Caspase-3 (Verdünnung 1:500) Antikörpern untersucht. Der Prozess für die endgültige Probenvorbereitung erfordert Sorgfalt/ Aufmerksamkeit und Präzision. Abbildung 5A zeigt den Arbeitsablauf für die Sammlung und Einarbeitung von Sphäroide in Agarose zum Schneiden. Mikroaufnahmen in Abbildung 5B-C zeigen den Unterschied in der MCF-7-Sphäroidbildung in Gegenwart (Abbildung 5B) und Abwesenheit (Abbildung 5C) von Lipofektamin (0,17% Endkonzentration), einem häufig verwendeten Transfektionsmittel. Hellfeldmikroskopische Aufnahmen histologischer Schnitte zeigen eine kreisförmige, kompakte Struktur einer homogenen Mischung aus zwei Zelltypen (Abbildung 5D-G). Die Struktur der Sphäroide und die Form ihrer Zellen zeigten keine Anomalien nach der Transfektion mit Kontroll-Oligonukleotiden in Gegenwart von Lipofektamin (Abbildung 5D). Darüber hinaus waren Zellen, die den proliferativen Marker Ki67 exprimierten, homogen in den Sphäroiden verteilt; es wurde jedoch auch ein Ring aus proliferativen Zellen auf der Oberfläche der Sphäroide beobachtet (Abbildung 5E). Die gespaltene Caspase-3-Färbung zeigte nach 4 Tagen Kultur apoptotische Zellen (Abbildung 5F). Histologische Schnitte sind nützlich, um die Verteilung von Epithel- und Endothelzellen in Sphäroide mit spezifischen Markern zu bewerten. Mit CD31 als spezifischem Marker für Endothelzellen ist es möglich, ihre Verteilung innerhalb der 3D-Struktur zu bestimmen. Da alle Zellen mit Hematoxylin (blaue Färbung des Zellkerns) angefärbt sind, könnte die Berechnung der CD31-Expression die Fläche der Sphäroide liefern, die Endothelzellen nach behandlung oder Transfektion enthalten (Protokollabschnitt 4.2.7.1.). Darüber hinaus ist es durch die Durchführung eines Dual-Staining-Assays möglich, noch mehr Informationen zu erhalten, zum Beispiel, wie in Abbildung 5Ggezeigt, färbungen CD31-Endothelzellen (rot) und Ki67-Färbungen proliferative Zellen (braun). Nach dem Protokollabschnitt 4.2.7.2 zeigte Abbildung 5G, dass 55% Epithelzellen, 45% Endothelzellen und 25% der Zellen sind.
Die Struktur von Sphäroide kann auch mittels Immunfluoreszenzanalyse nach der Markierung von Zellen mit lebenden Farbstoffen untersucht werden. Konfluente 2D-Kulturen von HUVEC- und MCF-7-Zellen wurden separat mit blauen (HUVEC) und grünen (MCF-7) Farbstoffen gefärbt. Anschließend wurden die gefärbten Zellen im Verhältnis 1:1 gesammelt und gemischt und in Vertiefungen zur Sphäroidbildung ausgesät. Bilder von gefärbten fluoreszierenden Zellen wurden unmittelbar nach der Aussaat (Abbildung 6A) und nach 3 Tagen Kultur (Abbildung 6B )aufgenommen. Mit dem Ziel, den Prozentsatz lebender und toter Zellen zu beurteilen, wurden 4 Tage alte Sphäroide mit Calcein-AM (grün) und mit Ethidiumhomdimer (rot) gefärbt (Abbildung 6C). Mit MCF-7 und HUVECs gebildete Sphäroide konnten mit den Standardprotokollen zum Einfrieren von Zellen (Wachstumsmedium ergänzt mit 10% DMSO und 10% FCS) zum Einfrieren von Zellen nicht erfolgreich eingefroren/konserviert werden. In gefrorenen und aufgetauten Sphäroide waren das Aufbrechen von Zellaggregaten und ein erhöhter Verlust der Zelllebensfähigkeit offensichtlich. Das repräsentative Bild in Abbildung 6D zeigt ein frisch aufgetautes Sphäroid, das für tote und lebende Zellen gefärbt ist. Es zeigt, dass Sphäroide sehr empfindlich auf die Gefrierbedingungen reagieren.
Nach 5 Tagen Kultur unter experimentellen Bedingungen war eine Lyse von etwa 100 Sphäroiden notwendig, um genügend Protein (~ 3 μg / ml) oder RNA (~ 60 ng / μL) für die Analyse zu sammeln. Abbildung 7 zeigt einen Workflow von der Sphäroidsammlung (generiert mit der Hanging Drops-Methode) bis zur Zelllyse zur Proteinextraktion, um Western Blotting oder RNA-Isolierung für zukünftige Microarray-Assays oder Analysen mittels RT-PCR durchzuführen. Die Isolierung von RNA/DNA aus einer heterogenen Zellpopulation in einem Sphäroid für die Microarray-Analyse kann einige nützliche Informationen liefern. Um jedoch wichtige zellspezifische Mechanismen oder Zell-Zell-Interaktionen zu identifizieren, können die Sphäroidzellen nach enzymatischer (Trypsin oder Accutase) Dissoziation getrennt werden, indem FACS-Analyse und RNA aus spezifischen Zellen verwendet werden, die für die Microarray-Analyse verwendet werden. Darüber hinaus könnten antibiotikaresistente Zelllinien (z. B. durch verwendung von EGFP- und/oder Puromycin-Resistenzzelllinien) in Sphäroide verwendet werden, um die Rolle eines bestimmten Zelltyps der Zell-Zell-Interaktion zu adressieren. Darüber hinaus können Gen-Silencing-Tools verwendet werden, um die Zellen so zu konstruieren, dass sie spezifische Probleme mit der Zell-Zell-Interaktion lösen.
Abbildung 1: Arbeitsablauf der Sphäroidbildung. MCF-7- und HUVEC- oder LEC-Zellen in 2D-Kulturen werden separat gezüchtet und nach verschiedenen gewünschten Behandlungen gesammelt. Sphäroide werden anschließend durch direktes Mischen von Zellen in(A)96-Well-U-Bodenplatten erzeugt, die die Bildung einer 3D-Struktur durch Zell-zu-Zell-Aggregation fördern, oder durch Verwendung von (B) hängender Tropfenkultur, die die Bildung von Sphäroiden durch Schwerkraft unterstützt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Sphäroidbildung und -entwicklung im Laufe der Zeit. Bilder zeigen die Bildung eines Sphäroids durch MCF-7-Zellen (Panel A), das Fehlen einer Sphäroidbildung durch Endothel- oder Lymphzellen (HUVECs; (Panel B) plattiert mit der gleichen Dichte und Sphäroidbildung durch MCF-7-Zellen plus HUVECs oder LECs gemischt im Verhältnis 1:1 (Panels C, D). Ebenfalls dargestellt ist das Größenwachstum eines Sphäroids im Laufe der Zeit (24 h, 48 h, 72 h, 96 h und 120 h). Dieses Sphäroid wurde aus einer Mischung von MCF-7 plus HUVECs im Verhältnis 1:1 gebildet und mit einer Dichte von 500 Zellen/Well einer 96-Well U-Bodenplatte (Panel E) ausgesät (Maßstabsleiste = 200 μm, 40x). Liniendiagramm (Panel F) zeigt das zeitabhängige Wachstum von Kontroll- (CTR) versus wachstumsstimulierten (Behandlung) Sphäroiden. Die Bereiche von Spheroid wurden gemessen und zwischen unbehandelten und behandelten Sphäroiden verglichen. Die Ergebnisse stellen ± REM, *** p < 0,001 im Vergleich zur jeweiligen Kontrolle dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Sphäroide Langzeitkultur und Lebensfähigkeit. Die Mikrofotografie zeigt die Zelllebensfähigkeit in Sphäroide, die mit MCF-7-Zellen allein bei 96 h (Panel A) und 168 h (Panel C) gebildet werden, während die Panels B und D die Zelllebensfähigkeit in Sphäroiden darstellen, die mit MCF-7 plus HUVECs (Verhältnis 1:1) bei 96 h (Panel B) und 168 h ( PanelD) (Maßstabsleiste = 100 μm) hergestellt wurden. Die Zellen wurden mit Calcein (rote, abgestorbene Zellen) und Ethidium homodimer (grüne, lebende Zellen) gefärbt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Zellaussaatdichte und zeitabhängiges Wachstumsprofil von MCF-7 plus HUVEC-Sphäroide. HUVECs und MCF-7-Zellen, die im Verhältnis 1: 1 gemischt wurden, wurden mit zunehmender Dichte (102-104 Zellen / Well) ausgesät, und das Wachstum von Sphäroiden wurde über 24-96 h überwacht. Mikroskopische Hellfeldbilder wurden aufgenommen (Maßstabsbalken = 200 μm, 40x), um das Sphäroidwachstum im Laufe der Zeit zu beurteilen. Zellen mit einer Dichte von 500 Zellen / Well lieferten eine optimale Größe, um das Sphäroidwachstum zu untersuchen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Sphäroideinbettung für Schnitte und histologische Färbung. Panel A: Cartoon, der den Arbeitsablauf für die Sammlung und Einarbeitung von HUVECs/MCF-7-Sphäroide in Agarose darstellt. Nach der Paraffineinbettung der Sphäroide in einen Agarosepfropfen und dem Schneiden von Paraffinblöcken wurden die Proben für die histologische Standardfärbung verwendet. Die Panels B und C zeigen repräsentative MCF-7 plus HUVEC-Sphäroide, die ohne bzw. mit Lipofektamin 2000 behandelt wurden (Maßstabsleiste = 200 μm, 40x). Die Panels D-G zeigen repräsentative Bilder von Sphäroidschnitten, die mit spezifischen Markern gefärbt sind. Panel D zeigt Sphäroide, die mit Hämatoxylin-Eosin gefärbt sind, um die Sphäroidstruktur zu beurteilen (Maßstabsleiste = 100 μm). Die Färbung in Panel E zeigt proliferierende Zellen, die positiv mit Ki67 gefärbt sind. Panel F zeigt apoptotische Zellen in einem Sphäroid, die mit gespaltener Caspase-3 positiv gefärbt sind (Maßstabsbalken = 50 μm). Panel G zeigt Sphäroidschnitte mit doppelter Färbung: CD31 (Endothelzellenmarker) und Ki67 (proliferativer Marker) (Skalenbalken = 100 μm). Die Schnittung von Sphäroide und die Färbung wurden mit Sophistolab (info@sophistolab.ch) durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Fluoreszenzbilder von MCF-7/HUVEC-Sphärooiden, die die Zellverteilung und Lebensfähigkeit zeigen. Die Panels A und B zeigen repräsentative Sphäroide mit HUVECs, die mit einem blauen Farbstoff gefärbt sind, und MCF-7-Zellen, die mit einem grünen Farbstoff gefärbt sind. Die Lokalisation von HUVEC und MCF-7 innerhalb des Sphäroids variiert unmittelbar nach der Aussaat (A) und nach der Sphäroidbildung (B) (Skalenbalken = 250 μm). Die Tafeln C-D zeigen Sphäroide, die mit Calcein/Ethidium Homodimer gefärbt wurden, um lebende (grün) und abgestorbene Zellen (rot) in den 3D-Strukturen im normalen Kulturzustand (C) und nach dem Einfrieren (D) (Maßstabsbalken = 100 μm) zu identifizieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7: Schematische Darstellung der Sphäroidsammlung für die biochemische Analyse. Cartoon, der das Schema zeigt, Sphäroide zu ernten, Zellen zu trennen oder freizusetzen und sie in Lyselösung für die Proteinanalyse oder RNA-Extraktion zu suspendieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Im Vergleich zu 2D-Zellkulturen ist die revolutionäre 3D-Sphäroidkulturtechnologie ein besseres und leistungsfähigeres Werkzeug, um die Mikroumgebung, Zell-Zell-Interaktionen und Arzneimittelreaktionen eines Organs in vitrozu rekonstruieren. Dies ist das erste Protokoll, das die Bildung von Sphäroiden aus mehrzelligen (epithelialen und endothelialen) Zelllinien für die Brustkrebsforschung beschreibt. Dieses Protokoll gewährleistet das sphäroide 3D-Wachstum von Sphäroiden für bis zu 5 Tage, und Sphäroide können nach Paraffineinbettung, Schnitt und histologischer Färbung untersucht werden. Interessanterweise exprimieren die zellulären Elemente innerhalb des Sphäroids immer noch Rezeptoren, die das Zellwachstum fördern und auf proliferative und apoptotische Reize reagieren. Das beschriebene Protokoll erzeugt ausreichend biologisches Material für die Protein- oder RNA/DNA-Analyse. Das oben genannte Co-Kultur-System, das unter Laborbedingungen und zu geringen Kosten leicht zu erreichen ist, könnte ein Vorteil für zukünftige Anwendungen sein, insbesondere in der Brustkrebstherapie und für Arzneimittelempfindlichkeitstests. Darüber hinaus kann dieses Protokoll auf verschiedene Epithel- und Endothelzelltypen angewendet werden.
Es ist äußerst schwierig, in vitro ein komplexes Gewebe nachzuahmen, das in vivoexistiert. Dies liegt daran, dass In-vivo-Gewebe aus vielen interagierenden Komponenten bestehen, einschließlich Nerven, Blutgefäßen, Mesenchym und Immunzellen30,42. Ziel dieses Protokolls ist es, einige dieser Einschränkungen zu überwinden, indem ein 3D-Kokultursystem mit zwei verschiedenen Zelltypen verwendet wird, um sich dem tatsächlichen Tumorzustand zu nähern. Hier wurden Sphäroide mit epithelialen Tumorzellen in Kombination mit Endothelzellen oder Lymphzellen gebildet, um die In-vivo-Situation so weit wie möglich nachzuahmen, einschließlich Zell-Zell-Interaktionen, Anfälligkeit für apoptotische Faktoren, die durch sterbende Zellen in die Interzellularräume freigesetzt werden, und hypoxischer Zustände im Zentrum der Sphäroide. Dieses Protokoll wurde für das Testen zellulärer Reaktionen auf Wachstumsfaktoren, Signalfaktoren und Hormone optimiert, die Signalkaskaden schnell aktivieren und auf die Gentranskription abzielen und die Proteinexpression und den Proteintransport stimulieren30,31. In Sphäroiden, aber nicht in vivo,können Reaktionen von Tumorzellen auf Reize schnell und häufig beurteilt werden.
In der vorliegenden Studie scheinen Endothelzellen in den Sphäroiden keine kapillarähnlichen Strukturen zu bilden. Da gezeigt wurde, dass Endothelzellen Kapillaren bilden, wenn sie mit niedriger Dichte und Monoschichten mit hoher Dichte plattiert werden, ist es möglich, dass die Senkung des MCF-7-zu-Endothelzellen-Verhältnisses zu einer Kapillarbildung innerhalb der Sphäroide führen kann. Alternativ kann die Zugabe von spezifischen Matrixproteinen oder Matrigel die Kapillarbildung fördern. Das Fehlen einer kapillarartigen Struktur im Sphäroid verwässert nicht den Vorteil von MCF-7 plus Endothelzellen gegenüber MCF-7-Zellen an sich, da die von MCF-7-Zellen freigesetzten Faktoren die Proliferation von Endothelzellen fördern könnten und umgekehrt; solche Wechselwirkungen würden in MCF-7 nur Sphäroiden unentdeckt bleiben.
Mehrere Studien haben gezeigt, dass 5 x 103 Zellen/Well die geeignete Konzentration für Samenzellen war, um Sphäroide43,44,45,46,47zu bilden ; In 96-Well-U-Bodenplatten begrenzte diese Anzahl von Zellen jedoch das koordinierte Wachstum von Sphäroiden unter experimentellen Bedingungen. Daher ist es in jeder neuen Studie für jeden neuen Zelltyp wichtig, das Wachstum des 3D-Systems nach der medikamentösen Behandlung zu überwachen, um die Auswirkungen der Behandlung auf die Sphäroidgröße zu bestimmen.
Die Einschränkung des aktuellen Protokolls besteht darin, dass die Kultur von zuvor gebildeten Sphäroiden nach dem Einfrieren und Auftauen mit der klassischen DMSO-Methode nicht fortgesetzt werden kann. Tatsächlich waren beim Auftauen die meisten Zellen tot. Die Vitrifikation könnte sich als Alternative erweisen, um die Zellen am Leben zu erhalten48.
Sorgfältige Aufmerksamkeit für technische Details ist notwendig, um Fehler zu vermeiden und wohlgeformte Sphäroide herzustellen und zu erhalten. Eine Herausforderung ist die Probenvorbereitung zur Immunfärbung (Abschnitt 4.1). Um den Transfer durch Pipettieren der Sphäroide in das 1,5 ml Rohr zu erleichtern, ist es wichtig, eine P200-Spitze zu verwenden, die mit einer Schere so geschnitten ist, dass die Fläche des Lochs größer ist als die Sphäroide selbst. Andernfalls könnte der Transfer die Kugeln zerstören. Eine weitere Herausforderung besteht darin, das Medium abzusaugen, nachdem sich die Sphäroide am Boden eines Reagenzglases niedergelassen haben. In dieser Hinsicht ist es besser, eine P1000-Pipette anstelle einer Vakuumpumpe zu verwenden, um die Aspiration von Sphäroide zu vermeiden. Ein wichtiger und heikler Schritt bei der Vorbereitung der Sphäroide für das Schneiden ist die Zugabe der Agarose zu den pelletierten Sphäroide. Die Sphäroide, sobald sie in Agarose suspendiert sind, müssen schnell auf den Boden des Mikrofugenröhrchens durch horizontale Zentrifugation bei Raumtemperatur und vor der Polymerisation der Agarose pelletiert werden.
Insgesamt bietet das zweizellige Sphäroid aus MCF-7 und Endothelzellen eine praktikable Alternative zur Untersuchung von Zell-Zell-Interaktionen und -Mechanismen, die das Wachstum von Krebszellen oder Endothelzellen innerhalb eines Tumors vorantreiben. Die Sphäroide könnten als Modell dienen, um die Wirksamkeit von Therapeutika zu bewerten, die auf das Tumor- oder Krebswachstum abzielen. Wichtig ist, dass dieses Zwei-Zell-Modell weiter improvisiert werden könnte, um andere Zelltypen einzubeziehen, die für das Tumorwachstum relevant sind. In diesem Zusammenhang können Fibroblasten, die 80% der Brusttumormasse ausmachen, eingeschlossen werden, um ein MCF-7, Endothelzellen und Fibroblasten-Sphäroid zu bilden. Darüber hinaus könnten Gen-Silencing und gentechnisch veränderte Zellen verwendet werden, um die Rolle der Zell-Zell-Interaktion, der Hormonrezeptoren (Östrogen / Progesteron), der Wachstumsfaktoren und der Signalwege für das Tumor- / Krebswachstum zu untersuchen sowie die Wirksamkeit neuer Krebsmoleküle zu testen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preiszugeben.
Acknowledgments
Diese Forschung wurde von der Cancer Research Foundation / Swiss Cancer League Grant KFS-4125-02-2017 an RKD und Dem National Institute of Health Grant DK079307 an EKJ unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm × 20 mm tissue-culture treated culture dishes | Corning | CLS430167 | |
| 149MULTI0C1 | |||
| 35 x 10 mm Tissue Culture Dish | Falcon | 353001 | |
| 5 mL Serological Pipet, Polystyrene, Individually Packed, Sterile | Falcon | 357543 | |
| Adobe Photoshop | Version: 13.0.1 (64-bit) | ||
| Antibiotic Antimycotic Solution (100×) | Sigma-Aldrich | A5955 | |
| Calcein-AM | Sigma-Aldrich | 17783 | |
| CD31 (cluster of differentiation 31) | Cell Marque | 131M-95 | monoclonal mouse ab clone JC70 |
| CellTracker Green CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate) | Invitrogen | C7025 | |
| CK8/18 (cytokeratins 8 and 18) | DBS | Mob189-05 | monoclonal mouse ab, clone 5D3 |
| CKX41 Inverted Microscope | Olympus Life Science | Olympus DP27 digital camera | |
| Cleaved Caspase 3 | Cell Signaling | 9661L | polyclonal rabbit ab |
| Collagen (rat tail) | Roche | 11 179 179 001 | |
| Coulter ISOTON II Diluent | Beckman Coulter | 844 80 11 | Diluent II |
| Coulter Z1, Cell Counter | Coulter Electronics, Luton, UK | ||
| Dehydrated Culture Media: Noble Agar | BD Difco | BD 214220 | |
| Dermal Microvascular Endothelial Neonatal, Pooled Donors (HMVEC-DNeo) | Lonza | CC-2516 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham | Sigma-Aldrich | D6434 | |
| EBM-2 Endothelial Cell Growth Basal Medium-2 | Lonza | 190860 | |
| Ethidium homodimer | Sigma-Aldrich | 46043 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Thermo Fisher Scientific | SH30070 | |
| Fetal Calf Serum Charcoal Stripped (FCS sf) | Thermo Fisher Scientific | SH3006803 | |
| Fluorescence stereo microscopes Leica M205 FA | Leica Microsystems | ||
| GlutaMAX Supplement (100x) | Gibco | 35050038 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | Gibco | 14175053 | |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | |
| HUVEC – Human Umbilical Vein Endothelial Cells | Lonza | CC-2517 | |
| ImageJ | National Institute of Health, USA | Wayne Rasband Version: 1.52a (64-bit) |
|
| Ki67 | Cell Marque | 275R-16 | monoclonal rabbit ab, clone SP6 |
| Leica fully motorized fluorescence stereo microscope | Leica Microsystems | M205 FA | |
| Leica Histocore Multicut Rotary Microtome | 149MULTI0C1 | ||
| Low Serum Growth Supplement Kit (LSGS Kit) | Gibco | S003K | |
| MCF-7 cells – human breast adenocarcinoma cell line | Clinic for Gynecology, University Hospital Zurich | Provived from Dr Andrè Fedier obtained from ATCC | |
| Nunclon Sphera 96U-well plate | Thermo Fisher Scientific | 174925 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) 1x | Gibco | 10010015 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Protein Lysis Buffer | Cell Signaling, Danvers, USA | 9803 | |
| Quick-RNA Miniprep Kit | Zymo Research | R1055 | |
| RNA Lysis Buffer | Zymo Research | R1060-1-100 | Contents in Quick-RNA Miniprep Kit |
| Rotina 46R Centrifuge | Hettich | ||
| Round-Bottom Polystyrene Tubes, 5 mL | Falcon | 352003 | |
| Sonicator | Bandelin electronics, Berlin, DE | ||
| Tecan Infinite series M200 microplate reader | Tecan, Salzburg, AU | ||
| Tissue Culture Flasks 75 | TPP | 90076 | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T3924 |
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