Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

כדורי תא אפיתל ואנדותל של חלבי כמודל הפריה תפקודי פוטנציאלי לחקר סרטן השד

Published: July 12, 2021 doi: 10.3791/62940
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 1, 1, 1,3
1Department of Reproductive Endocrinology, Wagistrasse 14, University of Zurich and University Hospital Zurich, 2Department of Dermatology, Wagistrasse 18, University of Zurich and University Hospital Zurich, 3Department of Pharmacology and Chemical Biology, University of Pittsburgh

Summary

הצלבה בין תאי אפיתל חלביים לתאי אנדותל תורמת חשובה להתקדמות סרטן השד, לצמיחת הגידול ולגרורות. במחקר זה, כדוריות נעשו מתאי סרטן השד יחד עם תאי אנדותל כלי דם ו/או לימפתיים ולהדגים את ישימותם כמערכת במבחנה לחקר סרטן השד.

Abstract

סרטן השד הוא הגורם המוביל לתמותה אצל נשים. הצמיחה של תאים סרטניים השד גרורות הבאות שלהם הוא גורם מפתח להתקדמות שלה. למרות המנגנונים המעורבים בקידום צמיחת סרטן השד נחקרו באינטנסיביות באמצעות מונוקולטרות של תאים סרטניים בשד כגון תאי MCF-7, תרומתם של סוגי תאים אחרים, כגון תאי אנדותל וסקולריים ולימפתיים המעורבים באופן אינטימי בגידול, לא נחקרה לעומק. אינטראקציה בין תאים ממלאת תפקיד מרכזי בצמיחת הגידול ובהתקדמותו. Neoangiogenesis, או התפתחות של כלי דם, חיוני לצמיחת הגידול, ואילו מערכת הלימפה משמשת פורטל לנדידת תאים סרטניים ולעלמות שלאחר מכן. מחקרים אחרונים מספקים ראיות כי תאי אנדותל כלי דם ולימפה יכול להשפיע באופן משמעותי על צמיחת תאים סרטניים. תצפיות אלה מרמזות על צורך בפיתוח מודלים במבחנה שישקפו באופן מציאותי יותר את תהליכי הצמיחה של סרטן השד ב- vivo. יתר על כן, הגבלות במחקר בבעלי חיים דורשות פיתוח של מודלים ex vivo כדי לברוח טוב יותר את המנגנונים המעורבים.

מאמר זה מתאר את ההתפתחות של כדורי סרטן השד המורכבים הן מתאי סרטן השד (תאי MCF-7 חיוביים לקולטן אסטרוגן) ותאי אנדותל וסקולריים ו/או לימפתיים. הפרוטוקול מתאר גישה מפורטת שלב אחר שלב ביצירת כדורי תאים כפולים באמצעות שתי גישות שונות, טיפה תלויה (תקן זהב וזול) וצלחות U-התחתונות 96-היטב (יקר). הוראות מעמיקות מסופקות כיצד להרים בעדינות את כדוריות שנוצרו כדי לפקח על הצמיחה על ידי גודל מיקרוסקופי והערכה של הכדאיות באמצעות כתמי תאים מתים וחיים. יתר על כן, נהלים לתיקון כדורי לחתך והכתמה עם נוגדנים ספציפיים לצמיחה כדי להבדיל דפוסי צמיחה בספירואידים הם מתווים. בנוסף, פרטים להכנת כדוריות עם תאים שהודבקו ושיטות לחילוץ RNA לניתוח מולקולרי מסופקים. לסיכום, מאמר זה מספק הוראות מעמיקות להכנת כדוריות מרובות תאים לחקר סרטן השד.

Introduction

לשימוש בבעלי חיים לניסויים יש מגבלות. מחקרים בבעלי חיים אינם יכולים לחקות במדויק את התקדמות המחלה בבני אדם, ולבעלי חיים ובני אדם אין תגובות זהות לפתוגנים. בנוסף, הגבלות בניסויים בבעלי חיים בשל חשש לסבל בעלי חיים ובעיות אתיות1,2 יותר ויותר להגביל תוכניות מחקר. In vitro מערכות פותחו באופן נרחב כדי לעקוף את השימוש בבעלי חיים; יתר על כן, השימוש בתאים אנושיים עשה in vitro מודלים רלוונטיים יותר לחקירה הפתופיזיולוגית והטיפולית. תרבויות תאים קונבנציונליות של monolayer (2D) נמצאות בשימוש נרחב מכיוון שהן מחקות רקמות אנושיות במידה מסוימת. עם זאת, מונוקולטרות 2D לא מצליחות לחקות איברים אנושיים, ומונוקולטרות 2D אינן מסוגלות לדמות את המיקרו-וירוס המורכב של האיברים המקוריים ולחקות את in vivo המצב3,4,5,6. בנוסף, בתרביות תאים חד שכבתיים, טיפולים תרופתיים יכולים בקלות להרוס / לפגוע בכל התאים. חשוב לציין, ניתן להתגבר על חלק ממגבלות אלה על-ידי מעבר לתרבויות תאים תלת-ממדיות רב שכבתיות (תלת-ממדיות)7,8. למעשה, מודלים של תרבית תלת-ממדית הוכחו כמשקף טוב יותר את המבנה התאי, הפריסה והתפקוד של תאים ברקמות ראשוניות. ניתן ליצור תרביות תלת-ממד אלה באמצעות מגוון קווי תאים, בדומה לאיבר פונקציונלי. ואכן, ישנם שני מודלים של תרבויות תלת-ממד. מודל אחד מייצר כדוריות של תאים מצטברים היוצרים אשכולות ומארגנים אותם מחדש לספירות (מודלים ללא פיגומים). השני מניב organoids, אשר יש מבנה מורכב יותר מורכב מורכב שילובים של תאים מרובים ספציפיים לאיבר, אשר נחשבים גרסה זעירה של איברים9,10. בשל כך, מערכות תרבות תלת-ממדית מייצגות טכנולוגיה חדשנית עם יישומים ביולוגיים וקליניים רבים. לפיכך, לספרואידים ולאורגנואידים יש יישומים רבים למידול מחלות ומחקרים הקשורים לרפואה רגנרטיבית, הקרנת תרופות ומחקרים טוקסיקולוגיים6,11,12,13,14,15. כדוריות מסרטנות, המופקות מטכנולוגיית תלת-ממד, משחזרים את המורפולוגיה והפנוטיפ של סוגי תאים רלוונטיים, מחקים את in vivo מיקרו-סביבה של גידולים, מודל תקשורת תאים ומסלולי איתות פעילים במהלך התפתחות הגידול16,17,18. בנוסף, כדי לשפר את ההבנה הביולוגית של הסרטן, ניתן להשתמש בספירואידים/אורגנוידים של גידולים כדי לזהות טיפול אנטי-סרטני פוטנציאלי ספציפי לחולה (מותאם אישית) ולהעריך את יעילותו, רעילותו והשפעותיו ארוכות הטווח19,20,21,22. כדוריות פתחו הזדמנויות בולטות לחקור פתופיזיולוגיה, מידול מחלות והקרנת תרופות בגלל יכולתם לשמר את ארכיטקטורת הרקמות התאיות והתלת-ממדיות, היכולת לחקות את in vivo המצב, והאינטראקציות בין התא לתאים. עם זאת, יש גם להיות מודעים למגבלות של מערכת זו, כגון היעדר רכיב כלי דם / מערכתית, מערכת החיסון או מערכת העצבים התפקודית, והמערכת מייצגת גישה רדוקציוניסטית בהשוואה למודלים של בעלי חיים. ואכן, בניגוד למודלים של בעלי חיים, מבנים תלת-ממדיים מספקים רק קירוב של הביולוגיה בתוך גוף האדם. הבנת המגבלות של שיטת 3D עשויה לסייע לחוקרים לעצב תהליכים מעודנים ותקפים יותר לייצור כדוריות המייצגות טוב יותר איבר בקנה מידה גדול יותר23,24,25.

סרטן הוא הגורם המוביל למוות ברחבי העולם, וסרטן השד הוא הסרטן הנפוץ ביותר בקרב נשים26,27,28. כדי לחקות את המיקרו-סביבה המורכבת של סרטן השד, יש לתרבות כדורי סרטן השד באמצעות תאים הממלאים תפקיד בולט בגידולי השד, כלומר, תאי אפיתל, תאי אנדותל, פיברובלסטים ו/או תאי מערכת החיסון. יתר על כן, עבור כדורי המייצג סרטן השד, הביטוי של קולטני הורמון נשי (קולטני אסטרוגן / פרוגסטרון), היכולת לשמר את המצב היסטולוגי של הגידול החולה, ואת היכולת לחקות תגובה לטיפול יש לשקול גם. מחקרים הראו כי מערכות תרבית משותפת 3D יש ארגון הסלולר דומה לזה של הרקמה העיקרית ב vivo, יש את היכולת להגיב בזמן אמת לגירויים, ויש להם קולטני אנדרוגן פונקציונלי29,30,31,32. לפיכך, גישה דומה יכולה להיות שימושית כדי לחקות גידול בשד במבחנה. מטרת הפרוטוקול הנוכחי היא ליצור שיטה חדשה ליצירת כדורי סרטן השד. שיטה זו משתמשת בתאי MCF-7 חיוביים לקולטן אסטרוגן (קו תאים אנושי מונצח של תאי אפיתל) ותאי אנדותל וסקולריים (HUVECs) או תאי אנדותל לימפתיים (HMVEC-DNeo) כדי ליצור מודל המחקה או משקף מקרוב את האינטראקציות בין תאים אלה בתוך גידול. למרות MCF-7 (אסטרוגן מגיב) ותאי אנדותל שימשו לפיתוח כדורי במחקר הנוכחי, תאים אחרים כגון פיברובלסטים המייצגים ~ 80% של מסת הגידול בשד, יכול גם להיות משולב בעתיד כדי לייצג טוב יותר לחקות גידול השד.

ישנן מספר שיטות ליצירת כדוריות, כגון: 1) שיטת הטיפה התלויה המעסיקה כוח משיכה33,34; 2) שיטת הריחוף המגנטי המשתמשת בננו-חלקיקים מגנטיים החשופים למגנט חיצוני35, ו -3) שיטת המיקרו-לוחית הכדורית המבוצעת על ידי זריעת תאים על לוחות התקשרות נמוכים36,37. על בסיס השיטות הקיימות, המשתמשות רק בסוג תא אחד, הפרוטוקול הנוכחי עבר אופטימיזציה באמצעות תאי אפיתל ואנדותל כדי לחקות טוב יותר את תנאי הצמיחה של גידולים בסרטן השד ב vivo38,39,40,41. שיטה זו ניתן להשיג בקלות במעבדה בעלות נמוכה עם דרישות ציוד מינימליות. בהתבסס על הצורך / מטרות של המעבדה, גישות שונות שימשו ליצירת כדוריות ולקבל חומר תאי רלוונטי מן כדוריות אלה. בהקשר זה, עבור DNA, RNA, או ניתוח חלבון, כדורי התלת-ממד מיוצרים על ידי תאים אנדותל ואפיתל פולחניים עם שיטת טיפה תלויה. עם זאת, עבור מחקרים פונקציונליים, למשל, כדי לפקח על צמיחת התא לאחר הפרעה קצרה (siRNA) transfection ו/או טיפול הורמונלי, כדורי נוצרים באמצעות לוחות U-bottom.

מטרת הפרוטוקול הטכני הזה היא לספק תיאור מפורט שלב אחר שלב עבור 1) יצירת כדורי סרטן השד רב-תאיים, 2) הכנת דגימות להכתמה היסתולוגית, ו -3) אוסף תאים להפקת RNA, DNA וחלבונים. הן שיטת טיפת התלייה הזולה והן הצלחות היקרות יותר של U-bottom משמשות ליצירת כדוריות. כאן, פרוטוקול להכנת (תיקון) כדורי עבור חתך ולאחר מכן חיסונים עם סמנים כדי להעריך את התפשטות התא, אפופטוזיס, והפצה של אפיתל ותאי אנדותל בתוך כדורי מסופק. בנוסף, פרוטוקול זה מציג ניתוח מלא שלב אחר שלב של נתונים היסתולוגיים באמצעות תוכנת ImageJ. פרשנות הנתונים הביולוגיים משתנה בהתאם לסוג הניסוי והנוגדנים בהם נעשה שימוש. חלוקת כדוריות קבועות והכתמת החלקים לאחר מכן בוצעו על ידי מעבדה פתולוגית שגרתית (סופיסטולב: info@sophistolab.ch)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. תרבות התא

הערה: לנהל טיפול בתאים בתנאים סטריליים.

  1. תת-תרבות תאי האנדותל של וריד הטבור האנושי (HUVECs)
    1. יש מעיל 75 ס"מ2 צלוחיות קולגן (5 מיקרוגרם/ס"מ2)(זנב חולדה) למשך הלילה (ON) בטמפרטורת החדר (RT) או 2-3 שעות ב-37 מעלות צלזיוס, לשטוף במים ולאפשר לבקבוק להתייבש.
    2. לגדל HUVECs במדיום צמיחה (EBM-2, אנדותל בסיסי בינוני-2) בתוספת גלוטמין (1x = 2 mM), פתרון אנטיביוטי אנטי-מיקרוטי (AA; 100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין, 100 מיקרוגרם/מ"ל פניצילין ו-0.025 מיקרוגרם/מ"ל של אמפוטריצין B), LSGS (2% v/v FCS, 1 מיקרוגרם/מ"ל של הידרוקורטיזון, 10 ננוגרם/מ"ל של גורם גדילה אפידרמלי אנושי, 3 ננוגרם/מ"ל של גורם גדילה בסיסי אנושי של פיברובלסט, 10 מיקרוגרם/מ"ל של הפרין) ו-10% FCS (סרום עגל עוברי) בתנאי תרבית רקמות סטנדרטיים (37 °C (37 °C(5%, 5% CO2). לשנות את המדיום כל 2 ימים עד התאים להגיע 70%-80% מפגש.
    3. לשטוף את התרבויות תת-מפגש עם 5 מ"ל של HBSS (ללא Ca2+ ו Mg2 +) ולהוסיף 3 מ"ל של טריפסין (0.25% מדולל HBSS (ללא Ca2+ ו Mg2 +)).
      הערה: ניתן להחליף HBSS גם ב- PBS.
    4. לדגור על התאים ב 37 °C במשך 2 דקות (מיקרוסקופית לבדוק אם התאים מנותקים מעוגלים) ולהפסיק את תגובת ניתוק על ידי הוספת 6 מ"ל של 10% FCS בינוני (DMEM-F12 או EBM-2, 10% FCS).
    5. צנטריפוגה השעיית התא ב 250 x g במשך 5 דקות ב RT ולהשליך את supernatant.
    6. להשעות את התאים בצמיחה בינוני זרע 75 ס"מ2 צלוחיות או מנות תרבות.
  2. קרן הסרטן של מישיגן-7 (MCF-7, תאי אדנוקרצינומה שד אנושיים) תת-תרבות
    1. לגדל קווי תאים סרטניים השד האנושי ב 75 ס"מ2 צלוחיות במדיום צמיחה (DMEM / F12 בינוני בתוספת גלוטמין מסחרי (1x), פתרון אנטיביוטי-אנטימיקוטי (AA; 100 מיקרוגרם / מ"ל של סטרפטומיצין, 100 מיקרוגרם / מ"ל של פניצילין ו 0.025 מיקרוגרם / mL של אמפוטריצין B), ו 10% FCS בתנאי תרבית רקמות סטנדרטיים (37 °C, 5% CO2). לשנות את המדיום כל 2-3 ימים.
    2. לשטוף את תרביות התא תת-השפעה (70%-80% מפגש) עם 5 מ"ל של HBSS (ללא Ca2+ ו- Mg2+) ולהוסיף 3 מ"ל של טריפסין (0.5% מדולל ב- HBSS (ללא Ca2+ ו- Mg2+) ב- 37 °C למשך 5 דקות (אימות מיקרוסקופי שהתאים מנותקים).
      הערה: ניתן להחליף HBSS גם ב- PBS.
    3. הוסף 8 מ"ל של 10% FCS בינוני כדי לעצור את תגובת הניתוק, צנטריפוגה ב 250 x g במשך 5 דקות ב RT ולהשליך את supernatant.
    4. משעים את הכדור במדיום הצמיחה וצלחת ב 75 ס"מ2 צלוחיות או מנות תרבות.

2. היווצרות כדורית

  1. צלחת 5 x 105 תאים / מ"ל (HUVECs ו- MCF-7) בצלחת עגולה 3.5 ס"מ ותרבות עבור 48 שעות.
  2. לטפל או לבצע טרנסג'נדרים של התאים בציפוי למשך 24 שעות או לפי הצורך.
  3. שלב אופציונלי המבוצע בצלחת 96 טוב U-bottom: לשטוף את התאים עם 1 מ"ל של HBSS (Ca2+ ו Mg2+) ולהכתים HUVECs באמצעות צבע כחול (0.5 מיקרוגרם / מ"ל) ו MCF-7 תאים באמצעות צבע ירוק (0.5 μM) מדולל במדיום הצמיחה המתאים ומניחים לתוך 37 °C ו 5% CO2 אינקובטור במשך 30-40 דקות.
  4. לשטוף את התאים עם 1 מ"ל של HBSS (ללא Ca2+ ו Mg2+), להוסיף 1 מ"ל של ריאגנט ניתוק אנזימטי (0.25% טריפסין עבור HUVEC ו 0.5% טריפסין עבור MCF-7) לכל צלחת עגולה באמצעות פיפטה P1000, ולאחר מכן דגירה במשך 2-5 דקות עד התאים מנותקים.
  5. לאסוף כל סוג תא בנפרד בצינור פוליסטירן עגול 5 מ"ל ולהוסיף 1 מ"ל של 10% FCS בינוני באמצעות פיפטה P1000 כדי לעצור את התגובה אנזימטית. צנטריפוגות התליות התא ב 250 x g במשך 5 דקות.
  6. בזהירות לשאוף supernatant ולהשעות את התאים ב 1 מ"ל של מדיום ללא סטרואידים (EBM-2, גלוטמין , אנטישמי-אנטימיקוטי, 0.4% FCS sf (פחם-מופשט)).
    הערה: מדיום ללא סטרואידים ניתן להחליף עם מדיום צמיחה נורמלי.
  7. השתמש 100 μL של כל השעיה תא מדולל עם 10 מ"ל של דילול II (ראה טבלה של חומרים) כדי לקבוע את מספר התא הכולל ולחשב את כמות מדיום הטיפול (EBM-2, גלוטמין, אנטי-אנטימיקוטי, 0.4% FCS sf, רכב / טיפול) הדרושים כדי לקבל השעיית תא של 5 x 103 תאים / מ"ל או 3.4 x 105 תאים / מ"ל לכל סוג תא.
    1. ספירת תאים
      1. הפעל את המחשב ורוקן על-ידי לחיצה על לחצני הפונקציה וההתחלה (הגדרת S3), עם פתרון Diluent II במתקפת מונה תאים.
      2. השתמש בהגדרת S4 ולחץ על התחל כדי למדוד את הריק עם פתרון DIluent II טרי.
      3. שנה את מבחן הניצוצות עם 100 μL של השעיית תא ב 10 מ"ל של פתרון דילול II ולמדוד את הדגימות: להגדיר S4 ולחץ על התחל.
      4. שים לב למספר התאים לכל mL בצג הדיגיטלי.
        הערה: ספירת תאים יכולה להתבצע גם באמצעות מערכות ידניות או אוטומטיות אחרות: קווי רשת Hemocytometer, טכנולוגיית ספירת תאים מפוזרת אור, עקיפה חשמלית, מערכות מבוססות הדמיה באמצעות כתמי תאים, למשל, כחול טריפן.
    2. 96 לוחות תחתית U 96-היטב
      1. הכן 5 מ"ל של כל מתלה תא (5 x 103 תאים /mL) ולערבב אותם כדי לקבל נפח סופי של 10 מ"ל ביחס של 1:1.
      2. השתמש פיפטה חוזרת ידנית כדי pipette החוצה 100 μL של השעיית התא לתוך כל באר של 96 טוב U-התחתון הלוחות.
      3. מניחים את הצלחת לתוך אינקובטור בתנאי תרבית רקמות סטנדרטיים ולבדוק היווצרות כדוריות לאחר 48 שעות.
      4. שלב אופציונלי: צלם תמונות של כדוריות (40x) באמצעות מיקרוסקופ סטריאו פלואורסצנטי.
        הערה: שיטה זו מייצרת 96 כדוריות (כדורי אחד / טוב) לאחר 48 שעות (אזור 1-2 פיקסל2), והיא משמשת בדרך כלל למחקרי צמיחה.
    3. טיפה תלויה
      1. ערבבו את מתליות התא (3.4 x 105 תאים/מ"ל) ביחס של 1:1 כדי לקבל נפח סופי של 2 מ"ל.
      2. השתמש פיפטה P20 לזרוע את תערובת התא בצורה של 15 טיפות μL על המכסה ההפוך של צלחת פטרי 10 ס"מ.
      3. הפוך את המכסה עם טיפות ולהוסיף 5 מ"ל של בינוני בסיס (EBM-2) בתחתית המנה כדי למנוע אידוי של טיפות.
        הערה: שיטה זו יוצרת כדורי/טיפה אחת לאחר 48 שעות. ודא שההורדות נפרדות במידה מספקת זו מזו, כך שהן לא יתמזגו בעת החלפת המכסה. יש להשתמש ביותר ממנת פטרי אחת 10 ס"מ במידת הצורך.

3. מחקר צמיחה כדורי

  1. צלחת 100 μL של HUVECs ותערובת תאים MCF-7 (5 x 102 תאים / טוב) ב 96-טוב U-התחתון לוחות ומניחים אותם באינקובטור.
  2. 48 שעות לאחר ה ציפוי, לבדוק היווצרות כדוריות עם מיקרוסקופ הפוך (שדה בהיר). צלם תמונות (לפחות שש תמונות לטיפול, פי 40) בשעה 96 שעות של תרבות.
  3. פתח את התמונות באמצעות תוכנת עיבוד תמונה ועיבוד התמונה ל- 300 פיקסלים/אינץ' ושמור את התמונה כקובץ tiff.
  4. הורד את תוכנת ImageJ ופתח אותה. לחץ על האפשרות קובץ ולעבור אל פתח.
  5. המר את אזורי העניין לאזורים שחורים רוויים באופן אחיד כדי שתהיה לו תמונה בינארית (שחור ולבן). עבור כך, בחרו באפשרות 'תמונה', בחרו 'הקלד | 8 סיביות' . עכשיו, התמונה היא שחור ולבן.
  6. השתמש בכלי הבחירה החופשית כדי לצייר את הגבול של כדורי.
  7. לחישוב אזור העניין ולהפרדת הפיקסלים של האובייקט או הקידמה מפיקסלים ברקע, השתמשו בפונקציית הסף: בחרו באפשרות 'תמונה', בחרו 'התאם' ולחצו על 'סף'.
  8. כעת ייפתח חלון מוקפץ של סף. הסרגל העליון מציין את ערך הסף המינימלי: הגדר את הערך באפס. השורה התחתונה מציינת את ערך הסף המרבי: הזז את הסרגל עד שתחום העניין יהפוך לאדום לחלוטין.
    הערה: אם הצבע אינו אדום, בחר אדום מחלון הסף.
  9. עבור אל ניתוח | קבעו מדידות ובחרו 'אזור והיקף'.
  10. למדידת אזור העניין, בחרו באפשרות 'נתח' והשתמשו בכלי 'ניתוח חלקיקים'. בחלון ניתוח חלקיקים, הגדר את הגודל למדידת (0.00003-Infinity או 3-Infinity, בהתאם לגודל כדוריות), בחר סיכום וצג תוצאות. לאחר מכן, לחץ על אישור.
  11. התוצאות יופיעו בתרשים. העתק את המידות לגיליון אלקטרוני כדי לנתח את הנתונים.
    הערה: האזור מחושב כמספר הפיקסלים הכולל; השתמש באזור הסכום לחישוב.

4. מחקר אימונוהיסטוכימיה של ספרואיד

  1. הכנת דוגמה
    1. צלחת תערובת התא של HUVECs ו- MCF-7 (5 x 103 תאים / טוב) ב 96 טוב U-התחתון לוחות בינוני צמיחה HUVEC עבור 96 שעות.
    2. לאסוף כ 50 כדורי לתוך צינור 1.5 מ"ל עם קצה לחתוך של פיפטה P200 μL; לאפשר להם להתיישב לתחתית הצינור על ידי כוח המשיכה, ולאחר מכן להשליך את supernatant.
    3. תקן את כדורי עם 500 μL של 4% PFA עבור 1 שעה, RT.
    4. מרתיחים 2% תמיסת נובל אגר ב-PBS באמצעות פלטה חמה עם מערבל מגנטי למשך 3-5 דקות כדי להמיס את אבקת האגורוז לחלוטין ומצננים לסביבות 60 מעלות צלזיוס.
    5. הסר את PFA עם פיפטה P1000, לשטוף את כדורי עם 500 μL של PBS, ולאפשר להם משקעים. זרוק את סופר-טבעי.
    6. בזהירות pipette 600 μL של פתרון agarose לתוך צינור 1.5 מ"ל עם כדוריות ומניחים את הצינור מיד בצנטריפוגה עם רוטור אופקי ב 177 x g במשך 2 דקות.
    7. הוסף מחרוזת קצרה באמצע פתרון agarose כדי להסיר בקלות את התקע מן הצינור.
    8. לחזק תקע אגרוז על קרח או ב 4 °C (5 °F). הוסף 500 μL של PBS לתוך צינור 1.5 מ"ל כדי למנוע ייבוש מתוך הכדור.
      הערה: הדגימות מוכנות להתייבשות הבאה, הטמעת פרפין, חלוקה, העברה על שקופיות המיקרוסקופ והכתמת IHC (המבוצעת על ידי סופיסטולב).
  2. רכישת ועיבוד תמונה
    1. השג תמונות של מקטעים כדוריים באמצעות סטריאומיקרוסקופ.
    2. שמור שלוש תמונות עבור כל דגימה כקבצים .jpg.
    3. פתח את תוכנת ImageJ. פתח את התמונה JPEG, לחץ על קובץ ולאחר מכן על פתח.
    4. בחרו 'פירוק צבע וצבע' באפשרות 'תמונה'.
    5. בחרו וקטורים של H DAB בחלון 'פירוק צבעים 1.7', ושלוש התמונות מופיעות.
      הערה: שלוש התמונות הן: צבע 1 מייצג רק את כתמי המטוקסילין (כחול/סגול), וצבע 2 מייצג רק את כתמי ה- DAB (חום). צבע 3 אינו נחוץ לניתוח התמונה עם שני כתמים.
    6. בחר את החלון צבע 1 והגדר את הסף: עבור אל תמונה | כוונן ולחץ על סף. חלון הסף מופיע.
    7. השאר את ערך הסף המינימלי מוגדר באפס והתאם את ערך הסף המרבי כדי להסיר את אות הרקע מבלי להשפיע על האות האמיתי. לחץ על החל.
      1. מדידת שטח
        1. לחץ על נתח, בחר הגדר מדידה. בחר אזור, ערך אפור ממוצע וערך אפור מינימום ומקס ולחץ על אישור כדי לאשר.
        2. מדוד את גודל הגרעין באמצעות האפשרות נתח ולאחר מכן בחר מדוד.
          הערה: החלון תוצאות מעניק את שם התמונה (תווית), את גודל התמונה (אזור), את עוצמת הפיקסלים הממוצעת של תמונת IHC (ממוצע) ואת ערכי האפור המינימלי והמקסימלי (מינימום, מקסימום). השתמש בערך Mean לחישוב.
        3. חזור על שלבים 4.2.6-4.7.1.2 עבור החלון צבע 2 (וצבע 3 אם יש מכתים כפול).
      2. כימות תאים
        1. לחץ על תהליך, בחר באפשרות בינארי ובחר קו פרשת מים כדי להפריד תאים.
        2. עבור אל ניתוח ולחץ על ניתוח חלקיקים. בחלון המוקפץ 'ניתוח חלקיקים', הגדר את גודל התאים כך שלא יכלול חלקיקים לא מוגדרים. לאחר מכן, באפשרות הצג, לחץ על התיבה הנפתחת ובחר קווי מתאר. לאחר מכן, לחץ על אישור.
        3. חזור על שלבים 4.2.6-4.2.7 ועל שלבי כימות תאים (סעיף 4.2.7.2) עבור החלון צבע 2 (וצבע 3 אם יש כתמים כפולים).
          הערה: כעת יופיעו שלושה חלונות: 1) תוצאות סיכום (מספר התאים שנספרו, שטח כולל, גודל ממוצע, % מהשטח והממוצע), 2) תוצאות (בהתאמה לתאים הנספרים) ו- 3) חלון ציור (תמונה מתוארת של התאים הנספרים).

5. כתמים חיים/מתים בספרואידים

  1. הכן 4 mM פתרונות מלאי של Calcein AM ב DMSO (כתמים תאים חיים ירוקים) ו 2 mM של הומודימר אתידיום ב- DMSO (כתמים תאים מתים אדומים) בצינורות 1.5 מ"ל.
  2. חשב את כמות הפתרון הדרוש כדי להוסיף 10 μL / באר של תערובת של Calcein AM ואתידיום הומודימר מדולל 1:50 ב EBM-2.
  3. מוסיפים את תערובת הכתמים לספרואידים ומניחים את הצלחת באינקובטור בתנאי תרבית רקמות סטנדרטיים במשך 30-60 דקות.
  4. לרכוש תמונות (40x) באמצעות מיקרוסקופ סטריאו פלואורסצנטי.

6. בידוד חלבון ורנ"א של כדורי

  1. הכן מתלים תא ב 3.4 x 105 תאים / מ"ל לכל סוג תא, לערבב אותם ביחס של 1:1, ולזרוע את תערובת התא באמצעות פיפטה P20 בצורה של 15 טיפות μL על המכסה של צלחת פטרי 10 ס"מ. הפוך את המכסה והנח אותו באינקובטור בתנאי תרבית רקמות סטנדרטיים עבור 96 שעות.
  2. השתמש 5-6 מ"ל של PBS כדי לאסוף כדוריות בצינור פוליסטירן עגול 15 מ"ל באמצעות 5 מ"ל פיפטות פוליסטירן סטרילי.
    הערה: ניתן גם להשתמש בצינורות חרוטים 15 מ"ל.
  3. צנטריפוגות השעיית כדוריות ב 250 x g במשך 5 דקות, ולאחר מכן בזהירות לשאוף supernatant.
  4. הוסף 500 μL של טריפסין (100%) ופיפטה למעלה ולמטה באמצעות פיפטה P1000 עבור 30 s כדי לפרק כדוריות, השגת השעיית תא.
  5. לנטרל טריפסין עם 10% בינוני FCS, צנטריפוגות הצינורות ב 250 x g במשך 5 דקות, ולשאף את supernatant.
  6. על פי פרוטוקול היצרן (ערכה ספציפית לבידוד RNA ללא DNA), השתמש 300 μL של מאגר תמה RNA כדי לייס את גלולה התא.
    הערה: מאגר תמוות ניתן גם להוסיף ישירות כדורי שלם (אין צעד טריפסין נדרש) כדי לחלץ RNA. הוסף 300 μL של חיץ תמיסת כדורית כדורית, למקם צינורות בקרח, ו triturate 10 פעמים באמצעות פיפטה P200. לאחר מכן, לבודד RNA כאמור. ייתכן שיהיה צורך בדיסוציאציה של כדורית אם התאוששות הרנ"א נמוכה עקב הפרעות מטריצה.
  7. לחלופין, יש להשתמש ב-70 מיקרו-אל של מאגר ליסיס לבידוד חלבונים. הומוגניזציה עבור 2-4 s על ידי sonication ולקבוע את ריכוז החלבון על פי פרוטוקול היצרן באמצעות ערכת BCA Assay.
    הערה: לבידוד חלבונים, כדורי כדוריות ניתן לתיז ישירות במאגר תמיסת ואחריו sonication. השתמש 25 מיקרוגרם של חלבון הכולל כדי לבצע כתם מערבי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מודל כדורי באמצעות תרבויות אפיתל ואנדותל נדרש לחקות מקרוב בתנאי vivo של גידולי השד לניסויים במבחנה. התוכנית באיור 1 מתארת את הפרוטוקול ליצירת כדוריות עם תאי אפיתל לסרטן השד ותאי אנדותל וסקולריים או לימפתיים(איור 1). כל סוג תא נזרע בנפרד בצלחת עגולה 3.5 ס"מ ומטופל עם ממריצי צמיחה / מעכבים או transfected עם אוליגונוקלאוטידים באמצעות Lipofectamine. המונו-שכבתיים המשפיעים של תאי האפיתל או האנדותל נקצרים לאחר טריפסיניזציה, נשטפים ומעורבים ביחס של 1:1. התאים מצופים לאחר מכן בלוחות תחתית 96-well(איור 1A)או על המכסה ההפוך של צלחת תרבות עגולה בקוטר 10 ס"מ כדי להקל על תרבות טיפה תלויה(איור 1B). זמן קצר לאחר זריעה, התאים מופיעים כמו גיליונות שטוחים, צפופים של תאים בתחתית כל באר או טיפה, ולאחר מכן, הם מצטברים עם הזמן (24-48 שעות), ובכך יוצרים כדורי שלם ב 48 שעות. על מנת למנוע כל נזק לצבירה של התאים שנוצרו באופן רופף, אין להפריע ללוחות לפחות 24 שעות.

בלוחות ה-U-bottom, זריעה של תאי MCF-7, אך לא תאי אנדותל או תאי לימפה, הביאה להיווצרות כדורית לאחר 48 שעות(איור 2A,B,בהתאמה). יתר על כן, זריעה של MCF-7 בתוספת תאי אנדותל או תאי לימפה ביחס של 1:1 הביאה גם להיווצרות כדורית(איור 2C,D,בהתאמה). כדי לאמת כדוריות כמודל לחקר גידול, שינויים תלויי זמן בגודל כדורי בתגובה לפתרון מגרה צמיחה נמדדו/כימתו בהשוואה לבקרות שלא טופלו (איור 2). פוטו-מיקרוגרוגרפים באיור 2E מציגים צמיחה רציפה תלוית זמן (24-120 שעות) של ספירואיד MCF-7 מייצג. גרף הקו באיור 2F מתאר את השינוי באזור כדורי MCF-7 לאורך זמן כאשר מטפלים בהם עם או בלי ממריץ צמיחה. גודל הכדוריד גדל מ ~ 100 מיקרומטר ל ~ 200 מיקרומטר במשך 5 ימים; יתר על כן, קצב צמיחה מוגבר נצפה בספירואידים שטופלו עם ממריץ הצמיחה (איור 2F). מכיוון שטיפול ארוך טווח (168 שעות) הביא לירידה בכדאיות MCF-7, פוטנציאל בשל תנאים היפוקסיים במרכז הכדורואידים (איור 3),צמיחת מבנה תלת-ממדי נחקרה עד 96 שעות. כדוריות שנוצרו עם תאי MCF-7 ו- HUVECs מציגות מספר נמוך יותר של תאים מתים ב 168 שעות בהשוואה לספרואידים שנוצרו עם MCF-7 בלבד.

בניסויים הראשוניים, רק גידול קטן בגודל של כדוריות נצפתה לאחר 4 ימים של תרבות. ההשערה הייתה כי ייתכן שהסיבה לכך היא המספר הגבוה של תאים שנזרעו כדי ליצור כדוריות. בלוחות התרבות התחתונים של U, הצמיחה של כדורי היה יכול להיות מוגבל על ידי הצורה קעורה של הבאר. מאז הצמיחה הייתה תלויה במספר הראשוני של תאים זרע, מספרי תאים שונים שימשו כדי ליצור כדוריות כדי לבדוק ולקבוע תנאים זה יהיה אופטימלי כדי לפקח על צמיחת כדורית. כפי שניתן לראות באיור 4, הממצאים מצביעים על כך שעבור מחקרי צמיחה כדוריים, זריעת 500 תאים/באר ליצירת כדוריות הייתה אמינה ווניתנת לשחזור לניטור צמיחת כדוריות במשך 4-6 ימים בתגובה לגורמים אפנון צמיחה. כדוריות המתאימות ביותר לתצפיות היסתולוגיות או חיסוניות-היסתולוגיות הושגו ביום 4, לאחר זריעת 5 x 103 תאים /well. אותו ריכוז ראשוני שימש לחלבון תאים או עקירות RNA. הגדלת ריכוז התאים ההתחלתי ביותר מ-7.5 x 103 תאים/טוב לא שיפרה את היווצרות הכדוריד, והתאים לא צברו כראוי והניחו מבנים לא סדירים(איור 4).

על מנת להעריך את הרכב התא, התפשטות, ומצב אפופטוזיס, חלקים היסתולוגיים של כדוריות שנוצרו עם תאים סרטניים השד בתוספת תאי אנדותל נבדקו באמצעות H&E ו Ki67 (דילול 1:300) ו Cleaved Caspase-3 (דילול 1:500) נוגדנים. תהליך הכנת המדגם הסופי דורש טיפול / תשומת לב ודיוק. איור 5A מתאר את זרימת העבודה עבור האיסוף והשילוב של כדוריות באגרוז לחתך. פוטומיקרוגרוגרפיות באיור 5B-C ממחישות את ההבדל בהיווצרות כדורית MCF-7 בנוכחות (איור 5B) והיעדרות ( איור5C) של ליפופקטמין (0.17% ריכוז סופי), חומר טרנספטיישן נפוץ. תמונות מיקרוסקופיות בהירות של מקטעים היסתולוגיים מציגות מבנה מעגלי וקומפקטי של תערובת הומוגנית של שני סוגי תאים(איור 5D-G). המבנה של כדוריות ואת הצורה של התאים שלהם לא הראו חריגות בעקבות transfection עם אוליגונוקלאוטידים שליטה בנוכחות ליפופקטמין (איור 5D). יתר על כן, תאים המבטאים את הסמן הרב, Ki67, הופצו באופן הומוגני בפרואידים; עם זאת, טבעת של תאים מתרבים נצפתה גם על פני השטח של כדוריות(איור 5E). כתמי Caspase-3 מבקעים הראו תאים אפופטוטיים לאחר 4 ימים של תרבות(איור 5F). מקטעים היסתולוגיים שימושיים כדי להעריך את ההתפלגות של אפיתל ותאי אנדותל בספירואידים באמצעות סמנים ספציפיים. באמצעות CD31 כסמן ספציפי עבור תאי אנדותל, ניתן לקבוע את ההתפלגות שלהם בתוך המבנה 3D. מאז כל התאים מוכתמים המטוקסילין (כתמים כחולים של הגרעין של התא), החישוב של ביטוי CD31 יכול לספק את האזור של כדורי המכיל תאי אנדותל לאחר טיפול או transfection (פרוטוקול סעיף 4.2.7.1.). יתר על כן, על ידי ביצוע ביצוע מבחן כתמים כפול, ניתן לקבל מידע נוסף, למשל, כפי שמוצג באיור 5G, CD31 כתמים תאי אנדותל (אדום) ו Ki67 כתמים תאים מתרבים (חום). בעקבות סעיף הפרוטוקול 4.2.7.2, איור 5G גילה כי 55% הם תאי אפיתל, 45% הם תאי אנדותל, ו -25% מהתאים מתרבים.

המבנה של כדורי ניתן ללמוד גם באמצעות ניתוח אימונופלואורסצנטיות בעקבות תיוג של תאים עם צבעים חיים. תרביות דו-מושביות של תאי HUVEC ו-MCF-7 הוכתמו בנפרד בצבעים כחולים (HUVEC) וירוקים (MCF-7). לאחר מכן, התאים המוכתמים נאספו ועורבו ביחס של 1:1 וזרעו בארות להיווצרות כדורית. תמונות של תאים פלואורסצנטיים מוכתמים צולמו מיד לאחר זריעה (איור 6A) ולאחר 3 ימים של תרבות (איור 6B). במטרה להעריך את אחוז התאים החיים והמתים, כדוריות בנות 4 ימים הוכתמו בקלצין-AM (ירוק) ובהומודימר אתידיום (אדום)(איור 6C). לא ניתן היה להקפיא/לשמר ספירואידים שנוצרו עם MCF-7 ו- HUVECs בהצלחה באמצעות הפרוטוקולים הסטנדרטיים להקפאת תאים (אמצעי צמיחה בתוספת 10% DMSO ו- 10% FCS) להקפאת תאים. בפרואידים קפואים ומופשרים ניכרו קרעים של אגרגטים בתאים ואובדן מוגבר של הכדאיות התאית. התמונה הייצוגית באיור 6D מציגה כדורית שהופשרה זה עתה מוכתמת בתאים מתים וחיים. זה מראה כי כדורי רגישים מאוד לתנאי ההקפאה.

לאחר 5 ימים של תרבות בתנאי ניסוי, תמוגה של כ -100 כדוריות היה נחוץ כדי לאסוף מספיק חלבון (~ 3 מיקרוגרם / מ"ל) או RNA (~ 60 ננומטר / μL) לניתוח. איור 7 מייצג זרימת עבודה מאוסף כדוריות (שנוצר בשיטת טיפות תלויות) ועד תמוגה לתאים להפקת חלבונים לביצוע בידוד רנ"א מערבי לבדיקות או ניתוח עתידיים של Microarray על-ידי RT-PCR. בידוד של RNA / DNA מאוכלוסיית תאים הטרוגניים בספירואיד לניתוח microarray יכול להביא קצת מידע שימושי. עם זאת, כדי לזהות מנגנונים מרכזיים ספציפיים לתא או אינטראקציות תא-תאים, ניתן להפריד את התאים כדוריים לאחר דיסוציאציה אנזימטית (טריפסין או אקאטאז), באמצעות ניתוח FACS ו- RNA מתאים ספציפיים המשמשים לניתוח מיקרו-array. יתר על כן, קווי תאים עמידים לאנטיביוטיקה (למשל, באמצעות EGFP ו/או קווי תאי התנגדות puromycin) יכול לשמש כדורי כדי לטפל בתפקיד של סוג תא מסוים של אינטראקציה תא תא. בנוסף, ניתן להשתמש בכלי השתקת גנים כדי להנדס את התאים כדי לטפל בבעיות ספציפיות של אינטראקציה בין תאים בתאים.

Figure 1
איור 1:זרימת עבודה של היווצרות כדוריות. MCF-7 ו HUVEC או תאי LEC בתרביות דו-פעמיות גדלים בנפרד ונאספים לאחר טיפולים שונים הרצויים. כדוריות נוצרות לאחר מכן על ידי ערבוב ישיר של תאים ב -A) 96 טוב U-bottom לוחות, אשר מקדמים היווצרות של מבנה 3D על ידי צבירת תא לתא, או באמצעות (B)תלוי תרבית טיפה התומכת היווצרות כדורי באמצעות כוח הכבידה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: היווצרות והתפתחות כדורית לאורך זמן. תמונות מתארות היווצרות של כדורי על ידי תאי MCF-7 (פאנל A), חוסר היווצרות כדורית על ידי תאים אנדותל או לימפה (HUVECs; (לוח ב')) מצופה באותה צפיפות, היווצרות כדורית על ידי תאי MCF-7 בתוספת HUVECs או LECs מעורבב ביחס 1:1(לוחות C, D). כמו כן מתואר הגידול בגודל של כדורי לאורך זמן (24 שעות, 48 שעות, 72 שעות, 96 שעות, ו 120 שעות). כדורי זה נוצר מתערובת של MCF-7 בתוספת HUVECs ביחס של 1:1 וזרע בצפיפות של 500 תאים / באר של צלחת U-תחתון 96 טוב(פאנל E),(סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר, 40x). גרף קו (לוח F) מציג את הצמיחה תלוית הזמן של שליטה (CTR) לעומת כדורי גדילה מגורה (טיפול). האזורים של ספרואיד נמדדו והושוו בין כדוריות לא מטופלות ומטופלות. התוצאות מייצגות ± SEM, *** p < 0.001 בהשוואה לפקד המתאים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: ספירואידים לתרבות ולתחימות ארוכת טווח. פוטומיקוגרפיה מציגה את יכולת ההשתאות של התאים בפרואידים שנוצרו עם תאי MCF-7 בלבד ב- 96 שעות(פאנל A)ו- 168 שעות (לוח C), ואילו לוחות B ו- D מתארים את כדאיות התאים בפרואידים המיוצרים עם MCF-7 בתוספת HUVECs (יחס של 1:1) ב- 96 שעות (לוח B) ו - 168 שעות (לוח D) (סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר). תאים היו מוכתמים בקלסין (תאים אדומים, מתים) ובהודימר אתידיום (תאים ירוקים, חיים). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: צפיפות זריעת תאים ופרופיל צמיחה תלוי זמן של MCF-7 בתוספת כדורי HUVEC. HUVECs ותאי MCF-7 מעורבבים ביחס של 1:1 נזרעו בצפיפות הולכת וגדלה (102-104 תאים /well), ואת הצמיחה של כדורי היה במעקב מעל 24-96 שעות. תמונות מיקרוסקופיות של שדות בהירים צולמו (סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר, פי 40) כדי להעריך את הצמיחה של כדורית לאורך זמן. תאים בצפיפות של 500 תאים / סיפק גודל אופטימלי לחקר צמיחת כדורית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: הטמעת כדורית לחתך והכתמים היסטולוגיים. פאנל א':קריקטורה המתארת את זרימת העבודה לאיסוף ושילוב של כדורי HUVECs/MCF-7 באגרוז. לאחר הטמעת פרפין של כדוריות בתקע אגרוז וחתך של בלוקים פרפין, הדגימות שימשו להכתמה היסתולוגית סטנדרטית. לוחות B ו- C מראים נציג MCF-7 בתוספת כדורי HUVEC שטופלו ללא ועם ליפופקטמין 2000, בהתאמה (סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר, 40x). לוחות D-G מציגים תמונות מייצגות של מקטעי כדוריה מוכתמים בסמנים ספציפיים. לוח D מציג כדוריות מוכתמות בהמטוקסילין-אאוזין להערכת מבנה כדורי (סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר). כתמים בלוח E מתאר תאים מתרבים מוכתמים באופן חיובי עם Ki67. פאנל F מציג תאים אפופטוטיים בספירואיד מוכתם באופן חיובי עם Cleaved Caspase-3 (סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר). פאנל G מתאר מקטעים כדוריים עם כתמים כפולים: CD31 (סמן תאי אנדותל) ו- Ki67 (סמן רב-תכליתי) (סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר). החלקה של כדוריות וכתמים בוצעו על ידי סופיסטולב (info@sophistolab.ch). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: תמונות פלואורסצנטיות של כדורי MCF-7/HUVEC המציגות התפלגות תאים ושמיה. לוחות A ו- B מתארים כדוריות מייצגות עם HUVECs מוכתמים בצבע כחול ותאי MCF-7 מוכתמים בצבע ירוק. לוקליזציה של HUVEC ו- MCF-7 בתוך הכדור משתנה מיד לאחר זריעה (A) ולאחר היווצרות ספרואיד (B) (סרגל קנה מידה = 250 מיקרומטר). לוחות C-D מראים כדוריות מוכתמות ב- Calcein / Ethidium Homodimer כדי לזהות תאים חיים (ירוקים) ומתים (אדום) במבנים תלת-ממדיים בתנאי תרבות רגילים (C) ולאחר הקפאה (D) (סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 7
איור 7: ייצוג סכמטי של איסוף כדורי לניתוח ביוכימי. קריקטורה המציגה את התוכנית לקצור כדוריות, להפריד או לשחרר תאים, ולהשעות אותם בתמיסת תמיס לניתוח חלבונים או מיצוי RNA. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בהשוואה לתרבויות תאים 2D, טכנולוגיית תרבית כדורית תלת-ממדית מהפכנית היא כלי טוב וחזק יותר לשחזור המיקרו-סביבה של איבר, אינטראקציות בין תאים ותגובות סמים במבחנה. זהו הפרוטוקול הראשון המתאר היווצרות של כדוריות מקווי תאים רב תאיים (אפיתל ואנדהל) לחקר סרטן השד. פרוטוקול זה מבטיח צמיחה תלת-ממדית כדורית של כדוריות למשך עד 5 ימים, וניתן לבדוק כדוריות לאחר הטבעה פרפין, חתך והכתמה היסתולוגית. מעניין, האלמנטים התאיים בתוך הספרואיד עדיין מבטאים קולטנים המקדמים את צמיחת התאים ומגיבים לגירויים מתרבים ואפופטוטיים. הפרוטוקול המתואר מייצר חומר ביולוגי מספיק לניתוח חלבון או RNA/ DNA. מערכת התרבות המשותפת הנ"ל, מושגת בקלות בתנאי מעבדה ובעלות נמוכה, יכולה להיות יתרון עבור יישומים עתידיים, במיוחד בטיפול בסרטן השד ובבדיקה ברגישות לתרופות. בנוסף, פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על סוגי תאים אפיתל ואנתל שונים.

קשה מאוד לחקות במבחנה רקמה מורכבת הקיימת ב- vivo. הסיבה לכך היא כי ברקמות vivo מורכב מרכיבים אינטראקציה רבים, כולל עצבים, כלי דם, mesenchyme, ותאי מערכת החיסון30,42. מטרת פרוטוקול זה היא להתגבר על חלק מהמגבלות הללו באמצעות מערכת תרבית משותפת תלת-ממדית עם שני סוגי תאים שונים כדי להתקרב למצב הגידול בפועל. כאן נוצרו כדוריות עם תאי גידול אפיתל בשילוב עם תאי אנדותל או תאים לימפתיים כדי לחקות את מצב in vivo ככל האפשר, כולל אינטראקציות תא-תאים, רגישות לגורמים אפופוטוטיים המשתחררים לחללים הבין-תאיים על ידי תאים גוססים, ותנאים היפוקסיים במרכז הספרואידים. פרוטוקול זה עבר אופטימיזציה לבדיקת תגובות תאיות לגורמי גדילה, גורמי איתות והורמונים, המפעילים במהירות מפלי איתות ותמלול גנים ממוקדים וממריצים ביטוי חלבון והובלה30,31. בספירואידים, אך לא ב- vivo, ניתן להעריך תגובות של תאים סרטניים לגירויים במהירות ובתדירות.

במחקר הנוכחי, תאים אנדותל בספירואידים לא נראה ליצור מבנים דמויי נימי. מאז תאים אנדותל הוכחו ליצור נימים כאשר מצופה בצפיפות נמוכה monolayers בצפיפות גבוהה, זה אפשרי כי הורדת יחס MCF-7 לתאי אנדותל עלול לגרום היווצרות נימי בתוך כדורי. לחלופין, תוספת של חלבוני מטריצה ספציפיים או מטריגל עשוי לקדם היווצרות נימים. היעדר מבנה דמוי נימי בספירואיד אינו מדלל את היתרון של תאי אנדותל MCF-7 פלוס לעומת תאי MCF-7 כשלעצמו, שכן הגורמים ששוחררו על ידי תאי MCF-7 יכולים לקדם התפשטות תאי אנדותל ולהיפך; אינטראקציות כאלה יישארו מבלי שיבחינו ב- MCF-7 רק כדוריות.

מספר מחקרים הראו כי 5 x 103 תאים / well היה הריכוז המתאים לתאי זרע כדי ליצור כדורי43,44,45,46,47; עם זאת, בלוחות 96-טוב U-bottom, מספר זה של תאים הגביל את הצמיחה המתואמת של כדוריות בתנאי ניסוי. לכן, בכל מחקר חדש, עבור כל סוג תא חדש, חשוב לעקוב אחר הצמיחה של מערכת 3D לאחר טיפול תרופתי, כדי לקבוע את ההשפעות של הטיפול על גודל כדורי.

המגבלה של הפרוטוקול הנוכחי היא כי התרבות של כדוריות שנוצרו בעבר לא ניתן להמשיך לאחר הקפאה והפשרה על ידי שיטת DMSO הקלאסית. למעשה, כאשר הפשירו, רוב התאים היו מתים. Vitrification עשוי להוכיח להיות חלופה לשמירה על התאים בחיים48.

תשומת לב זהירה לפרטים טכניים יש צורך למנוע שגיאות לייצר ולתחזק כדוריות מעוצבות היטב. אתגר אחד הוא הכנת המדגם לחיסון (סעיף 4.1). כדי להקל על ההעברה על ידי צנרת כדורי לתוך צינור 1.5 מ"ל, חשוב להשתמש קצה P200 לחתוך עם מספריים, כך שטח החור גדול יותר מאשר כדורי עצמם. אחרת, ההעברה עלולה להרוס את הכדורים. אתגר נוסף הוא כיצד לשאוף למדיום לאחר שהספרואידים התיישבו לתחתית מבחנה. בהקשר זה, עדיף להשתמש פיפטה P1000 במקום משאבת ואקום כדי למנוע את השאיפה של כדורי. צעד חשוב ועדין בהכנת כדוריות לחתך הוא להוסיף את האגרוז לפרנואידים המנוגדים. כדורי הכדור, פעם מושעה אגרוז, חייב להיות גלולה במהירות לתחתית צינור microfuge באמצעות צנטריפוגה אופקית בטמפרטורת החדר ולפני האגרוז פולימר.

בסך הכל, כדורי שני תאים עשוי MCF-7 ותאי אנדותל מספק חלופה מעשית לחקור אינטראקציות תא-תאים ומנגנונים המניעים את הצמיחה של תאים סרטניים או תאים אנדותל בתוך גידול. כדורי יכול לשמש מודל כדי להעריך את היעילות של סוכנים טיפוליים מיקוד גידול או סרטן צמיחה. חשוב לציין, מודל זה של שני תאים יכול להיות מאולתר עוד יותר כדי לכלול סוגי תאים אחרים רלוונטיים בגידול. בהקשר זה, פיברובלסטים המהווים 80% ממסת גידול השד עשויים להיכלל כדי ליצור MCF-7, תאי אנדותל, וספירואיד פיברובלסט. יתר על כן, השתקת גנים ותאים מהונדסים גנטית יכול לשמש כדי לטפל בתפקיד של אינטראקציה תא תא, קולטני הורמון (אסטרוגן / פרוגסטרון), גורמי גדילה, ומסלולי איתות על גידול / סרטן, כמו גם כדי לבדוק את היעילות של מולקולות אנטי סרטניים חדשים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

מחקר זה נתמך על ידי הקרן לחקר הסרטן / הליגה השוויצרית לסרטן מענק KFS-4125-02-2017 ל RKD והמכון הלאומי לבריאות מענק DK079307 ל- EKJ.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm × 20 mm tissue-culture treated culture dishes Corning CLS430167
149MULTI0C1
35 x 10 mm Tissue Culture Dish Falcon 353001
5 mL Serological Pipet, Polystyrene, Individually Packed, Sterile Falcon 357543
Adobe Photoshop Version: 13.0.1 (64-bit)
Antibiotic Antimycotic Solution (100×) Sigma-Aldrich A5955
Calcein-AM Sigma-Aldrich 17783
CD31 (cluster of differentiation 31) Cell Marque 131M-95 monoclonal mouse ab clone JC70
CellTracker Green CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate) Invitrogen C7025
CK8/18 (cytokeratins 8 and 18) DBS Mob189-05 monoclonal mouse ab, clone 5D3
CKX41 Inverted Microscope Olympus Life Science Olympus DP27 digital camera
Cleaved Caspase 3 Cell Signaling 9661L polyclonal rabbit ab
Collagen (rat tail) Roche 11 179 179 001
Coulter ISOTON II Diluent Beckman Coulter 844 80 11 Diluent II
Coulter Z1, Cell Counter Coulter Electronics, Luton, UK
Dehydrated Culture Media: Noble Agar BD Difco BD 214220
Dermal Microvascular Endothelial Neonatal, Pooled Donors (HMVEC-DNeo) Lonza CC-2516
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2650
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham Sigma-Aldrich D6434
EBM-2 Endothelial Cell Growth Basal Medium-2 Lonza 190860
Ethidium homodimer Sigma-Aldrich 46043
Fetal Calf Serum (FCS) Thermo Fisher Scientific SH30070
Fetal Calf Serum Charcoal Stripped (FCS sf) Thermo Fisher Scientific SH3006803
Fluorescence stereo microscopes Leica M205 FA Leica Microsystems
GlutaMAX Supplement (100x) Gibco 35050038
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red Gibco 14175053
Hoechst 33342 Life Technologies H3570
HUVEC – Human Umbilical Vein Endothelial Cells Lonza CC-2517
ImageJ National Institute of Health, USA Wayne Rasband
Version: 1.52a (64-bit)
Ki67 Cell Marque 275R-16 monoclonal rabbit ab, clone SP6
Leica fully motorized fluorescence stereo microscope Leica Microsystems M205 FA
Leica Histocore Multicut Rotary Microtome 149MULTI0C1
Low Serum Growth Supplement Kit (LSGS Kit) Gibco S003K
MCF-7 cells – human breast adenocarcinoma cell line Clinic for Gynecology, University Hospital Zurich Provived from Dr Andrè Fedier obtained from ATCC
Nunclon Sphera 96U-well plate Thermo Fisher Scientific 174925
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich P6148
Phosphate-buffered saline (PBS) 1x Gibco 10010015
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific 23225
Protein Lysis Buffer Cell Signaling, Danvers, USA 9803
Quick-RNA Miniprep Kit Zymo Research R1055
RNA Lysis Buffer Zymo Research R1060-1-100 Contents in Quick-RNA Miniprep Kit
Rotina 46R Centrifuge Hettich
Round-Bottom Polystyrene Tubes, 5 mL Falcon 352003
Sonicator Bandelin electronics, Berlin, DE
Tecan Infinite series M200 microplate reader Tecan, Salzburg, AU
Tissue Culture Flasks 75 TPP 90076
Trypsin-EDTA solution Sigma-Aldrich T3924

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sakamoto, K. The pathology of Mycobacterium tuberculosis infection. Veterinary Pathology. 49 (3), 423-439 (2012).
  2. Morrisey, E. E., Hogan, B. L. Preparing for the first breath: genetic and cellular mechanisms in lung development. Developmental Cell. 18 (1), 8-23 (2010).
  3. Goodman, T. T., Ng, C. P., Pun, S. H. 3-D tissue culture systems for the evaluation and optimization of nanoparticle-based drug carriers. Bioconjugate Chemistry. 19 (10), 1951-1959 (2008).
  4. Yang, L., et al. Tumor organoids: From inception to future in cancer research. Cancer Letters. 454, 120-133 (2019).
  5. Velasco-Velázquez, M. A., Popov, V. M., Lisanti, M. P., Pestell, R. G. The role of breast cancer stem cells in metastasis and therapeutic implications. The American Journal of Pathology. 179 (1), 2-11 (2011).
  6. Imamura, Y., et al. Comparison of 2D- and 3D-culture models as drug-testing platforms in breast cancer. Oncology Reports. 33 (4), 1837-1843 (2015).
  7. Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33 (2020).
  8. Russell, S., Wojtkowiak, J., Neilson, A., Gillies, R. J. Metabolic profiling of healthy and cancerous tissues in 2D and 3D. Scientific Reports. 7 (1), 15285 (2017).
  9. Sakalem, M. E., De Sibio, M. T., da Costa, F., de Oliveira, M. Historical evolution of spheroids and organoids, and possibilities of use in life sciences and medicine. Biotechnology Journal. 16 (5), (2021).
  10. Zanoni, M., et al. Modeling neoplastic disease with spheroids and organoids. Journal of Hematology & Oncology. 13 (1), 97 (2020).
  11. Corrò, C., Novellasdemunt, L., Li, V. S. W. A brief history of organoids. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 319 (1), 151-165 (2020).
  12. Ding, Y., et al. Three-dimensional tissue culture model of human breast cancer for the evaluation of multidrug resistance. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (9), 1959-1971 (2018).
  13. Little, M. H. Organoids: a special issue. Development. 144 (6), Cambridge, England. 935-937 (2017).
  14. Rimann, M., Graf-Hausner, U. Synthetic 3D multicellular systems for drug development. Current Opinion in Biotechnology. 23 (5), 803-809 (2012).
  15. Breslin, S., O'Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).
  16. Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).
  17. Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130 (4), 601-610 (2007).
  18. Weigelt, B., Ghajar, C. M., Bissell, M. J. The need for complex 3D culture models to unravel novel pathways and identify accurate biomarkers in breast cancer. Advanced Drug Delivery Reviews. 69-70, 42-51 (2014).
  19. Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnology Journal. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
  20. Fong, E. L., et al. Modeling Ewing sarcoma tumors in vitro with 3D scaffolds. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (16), 6500-6505 (2013).
  21. Hauptmann, S., et al. Integrin expression on colorectal tumor cells growing as monolayers, as multicellular tumor spheroids, or in nude mice. International Journal of Cancer. 61 (6), 819-825 (1995).
  22. Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), New York, N.Y. 920-926 (2018).
  23. Ashok, A., Choudhury, D., Fang, Y., Hunziker, W. Towards manufacturing of human organoids. Biotechnology Advances. 39, 107460 (2020).
  24. Lehmann, R., et al. Human organoids: a new dimension in cell biology. Molecular Biology of the Cell. 30 (10), 1129-1137 (2019).
  25. Verjans, E. T., Doijen, J., Luyten, W., Landuyt, B., Schoofs, L. Three-dimensional cell culture models for anticancer drug screening: Worth the effort. Journal of Cellular Physiology. 233 (4), 2993-3003 (2018).
  26. Bombonati, A., Sgroi, D. C. The molecular pathology of breast cancer progression. The Journal of Pathology. 223 (2), 307-317 (2011).
  27. DeSantis, C., Ma, J., Bryan, L., Jemal, A. Breast cancer statistics, 2013. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 64 (1), 52-62 (2014).
  28. Solanki, M., Visscher, D. Pathology of breast cancer in the last half century. Human Pathology. 95, 137-148 (2020).
  29. Djomehri, S. I., Burman, B., Gonzalez, M. E., Takayama, S., Kleer, C. G. A reproducible scaffold-free 3D organoid model to study neoplastic progression in breast cancer. Journal of Cell Communication and Signaling. 13 (1), 129-143 (2019).
  30. Xu, H., et al. Organoid technology and applications in cancer research. Journal of Hematology & Oncology. 11 (1), 116 (2018).
  31. Yu, J., Huang, W. The progress and clinical application of breast cancer organoids. International Journal of Stem Cells. 13 (3), 295-304 (2020).
  32. Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. The Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
  33. Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (51), e2720 (2011).
  34. Tung, Y. C., et al. High-throughput 3D spheroid culture and drug testing using a 384 hanging drop array. The Analyst. 136 (3), 473-478 (2011).
  35. Türker, E., Demirçak, N., Arslan-Yildiz, A. Scaffold-free three-dimensional cell culturing using magnetic levitation. Biomaterials Science. 6 (7), 1745-1753 (2018).
  36. Froehlich, K., et al. Generation of multicellular breast cancer tumor spheroids: comparison of different protocols. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 21 (3-4), 89-98 (2016).
  37. Vinci, M., et al. Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC Biology. 10, 29 (2012).
  38. Kaushik, G., Ponnusamy, M. P., Batra, S. K. Concise review: Current status of three-dimensional organoids as preclinical models. Stem Cells. 36 (9), Dayton, Ohio. 1329-1340 (2018).
  39. Marconi, A., Quadri, M., Saltari, A., Pincelli, C. Progress in melanoma modelling in vitro. Experimental Dermatology. 27 (5), 578-586 (2018).
  40. Saltari, A., et al. CD271 down-regulation promotes melanoma progression and invasion in three-dimensional models and in zebrafish. The Journal of Investigative Dermatology. 136 (10), 2049-2058 (2016).
  41. Yamauchi, M., et al. A novel in vitro survival assay of small intestinal stem cells after exposure to ionizing radiation. Journal of Radiation Research. 55 (2), 381-390 (2014).
  42. Jabs, J., et al. Screening drug effects in patient-derived cancer cells links organoid responses to genome alterations. Molecular Systems Biology. 13 (11), 955 (2017).
  43. Arruabarrena-Aristorena, A., et al. FOXA1 mutations reveal distinct chromatin profiles and influence therapeutic response in breast cancer. Cancer Cell. 38 (4), 534-550 (2020).
  44. Carey, S. P., Starchenko, A., McGregor, A. L., Reinhart-King, C. A. Leading malignant cells initiate collective epithelial cell invasion in a three-dimensional heterotypic tumor spheroid model. Clinical & Experimental Metastasis. 30 (5), 615-630 (2013).
  45. Park, S., et al. Differential functions of splicing factors in mammary transformation and breast cancer metastasis. Cell Reports. 29 (9), 2672-2688 (2019).
  46. Truong, D. D., et al. A human organotypic microfluidic tumor model permits investigation of the interplay between patient-derived fibroblasts and breast cancer cells. Cancer Research. 79 (12), 3139-3151 (2019).
  47. Zhang, J., et al. Energetic regulation of coordinated leader-follower dynamics during collective invasion of breast cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (16), 7867-7872 (2019).
  48. Jeong, Y. H., et al. Vitrification for cryopreservation of 2D and 3D stem cells culture using high concentration of cryoprotective agents. BMC Biotechnology. 20 (1), 45 (2020).

Tags

חקר הסרטן גיליון 173 סרטן השד גידול כדורי ניאו-וסקולריזציה כלי לימפה גידול גידול תאי אנדותל תאי אפיתל התפשטות תאים
כדורי תא אפיתל ואנדותל של חלבי כמודל <em>הפריה</em> תפקודי פוטנציאלי לחקר סרטן השד
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Azzarito, G., Szutkowska, M. E.,… More

Azzarito, G., Szutkowska, M. E., Saltari, A., Jackson, E. K., Leeners, B., Rosselli, M., Dubey, R. K. Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research. J. Vis. Exp. (173), e62940, doi:10.3791/62940 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter