Eferóides de células epiteliais e endoteliais como um modelo in vitro potencial funcional para pesquisa de câncer de mama

Giovanna Azzarito; Marta Ewa Szutkowska; Annalisa Saltari; Edwin K. Jackson; Brigitte Leeners; Marinella Rosselli; Raghvendra K. Dubey

doi:10.3791/62940

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Artigo de método

Eferóides de células epiteliais e endoteliais como um modelo in vitro potencial funcional para pesquisa de câncer de mama

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DOI:

10.3791/62940

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12 de julho de 2021

Giovanna Azzarito¹ , Marta Ewa Szutkowska¹ , Annalisa Saltari² , Edwin K. Jackson³ , Brigitte Leeners¹ , Marinella Rosselli¹ , Raghvendra K. Dubey¹^,³

¹Department of Reproductive Endocrinology, Wagistrasse 14, University of Zurich and University Hospital Zurich, ²Department of Dermatology, Wagistrasse 18, University of Zurich and University Hospital Zurich, ³Department of Pharmacology and Chemical Biology, University of Pittsburgh

Neste artigo

Resumo

O crosstalk entre células epiteliais mamárias e células endoteliais contribui importantemente para a progressão do câncer de mama, crescimento do tumor e metástase. Neste estudo, os esferoides foram feitos a partir de células cancerígenas de mama juntamente com células endoteliais vasculares e/ou linfáticas e demonstram sua aplicabilidade como um sistema in vitro para pesquisa de câncer de mama.

Resumo

O câncer de mama é a principal causa de mortalidade em mulheres. O crescimento das células cancerígenas de mama e sua metástase subsequente é um fator-chave para sua progressão. Embora os mecanismos envolvidos na promoção do crescimento do câncer de mama tenham sido intensamente estudados utilizando monoculturas de células cancerígenas de mama, como as células MCF-7, a contribuição de outros tipos celulares, como células endoteliais vasculares e linfáticas que estão intimamente envolvidas no crescimento do tumor, não tem sido investigada em profundidade. A interação célula-célula desempenha um papel fundamental no crescimento e progressão do tumor. A neoangiogênese, ou o desenvolvimento de vasos, é essencial para o crescimento do tumor, enquanto o sistema linfático serve como um portal para a migração de células cancerígenas e metástase subsequente. Estudos recentes fornecem evidências de que células endoteliais vasculares e linfáticas podem influenciar significativamente o crescimento de células cancerosas. Essas observações implicam a necessidade de desenvolver modelos in vitro que reflitam de forma mais realista os processos de crescimento do câncer de mama in vivo. Além disso, as restrições na pesquisa animal exigem o desenvolvimento de modelos ex vivo para elucidar melhor os mecanismos envolvidos.

Este artigo descreve o desenvolvimento de esferoides de câncer de mama compostos tanto de células cancerígenas de mama (células mcf-7 positivas do receptor de estrogênio) quanto de células endoteliais vasculares e/ou linfáticas. O protocolo descreve uma abordagem detalhada passo a passo na criação de esferoides de células duplas usando duas abordagens diferentes, queda suspensa (padrão ouro e barato) e placas de fundo U de 96 poços (caras). Instruções aprofundadas são fornecidas para como captar delicadamente os esferoides formados para monitorar o crescimento através do dimensionamento microscópico e avaliando a viabilidade usando manchas de células mortas e vivas. Além disso, são delineados procedimentos para fixação dos esferoides para secção e coloração com anticorpos específicos para o crescimento para diferenciar padrões de crescimento em esferoides. Além disso, são fornecidos detalhes para a preparação de esferoides com células transfectadas e métodos para extrair RNA para análise molecular. Em conclusão, este artigo fornece instruções aprofundadas para a preparação de esferoides multicelulares para a pesquisa do câncer de mama.

Introdução

O uso de animais para experimentos tem limitações. Estudos em animais não podem imitar com precisão a progressão da doença em humanos, e animais e humanos não têm respostas idênticas a patógenos. Além disso, restrições na experimentação animal devido a preocupações com o sofrimento animal e problemas éticos¹^,² cada vez mais restringe programas de pesquisa. In vitro sistemas têm sido amplamente desenvolvidos para contornar o uso de animais; além disso, o uso de células humanas fez in vitro modelos mais relevantes para a investigação fisiofisiológica e terapêutica. Culturas celulares monocamada....