Summary
本方案描述了胫骨肉瘤细胞注射生成具有原位骨肉瘤和肺转移病变的小鼠模型。
Abstract
骨肉瘤是儿童和青少年中最常见的原发性骨癌，肺是最常见的转移部位。骨肉瘤伴肺转移患者的五年生存率低于30%。因此，利用小鼠模型模拟人类骨肉瘤的发展，对于了解骨肉瘤癌发生和肺转移的基本机制，开发新的治疗方法具有重要意义。在这里，报告了 通过胫骨肉瘤细胞的胫内注射产生原发性骨肉瘤和肺转移小鼠模型的详细程序。结合生物发光或X射线实时成像系统，这些活小鼠模型用于监测和量化骨肉瘤的生长和转移。为了建立该模型，将含有骨肉瘤细胞的基底膜基质装入微量注射器中，并在麻醉后注射到每只无胸腺小鼠的一个胫骨中。当原发性骨肉瘤达到IACUC批准的方案中的大小限制时，处死小鼠。将有骨肉瘤的腿部与有转移病变的肺部分开。这些模型的特征是潜伏期短、生长迅速、病变严重以及监测原发性和肺转移性病变发展的敏感性。因此，这些是探索骨肉瘤癌发生和肺转移中特定因素的功能和机制，肿瘤微环境，评估 体内治疗效果的理想模型。
Introduction
骨肉瘤是儿童和青少年中最常见的原发性骨癌1，2，其主要浸润于周围组织，甚至在诊断患者时转移至肺部。肺转移是骨肉瘤治疗的主要挑战，骨肉瘤肺转移患者的五年生存率仍低至20%-30%3，4，5。然而，自 20 世纪 70 年代以来，由于引入了化疗 6，原发性骨肉瘤的五年生存率已提高到约 70%。因此，迫切需要了解骨肉瘤癌癌和肺转移的基本机制，以开发新的疗法。最能模拟人类骨肉瘤进展的小鼠模型的应用具有重要意义7.
骨肉瘤动物模型是通过自发的，诱导的基因工程，移植和其他技术产生的。自发性骨肉瘤模型由于肿瘤形成时间长、肿瘤发生率不一致、发病率低、稳定性差等原因，很少使用8，9。虽然诱导骨肉瘤模型比自发性骨肉瘤更容易获得，但诱导骨肉瘤模型的应用是有限的，因为诱导因子会影响骨肉瘤10的微环境、发病机制和病理特征。转基因模型有助于了解癌症的发病机制，因为它们可以更好地模拟人体生理和病理环境;然而，转基因动物模型也由于转基因修饰的难度大，长期且成本高而存在局限性。而且，即使在最广泛接受的由p53和Rb基因修饰产生的转基因动物模型中，也只有13.6%的肉瘤发生在四肢骨11，12中。
移植是近年来最常用的原发性和远处转移性癌症模型生成方法之一，因为它具有操作简单，肿瘤形成速率稳定，均匀性较好13。移植包括异位移植和根据移植部位的原位移植。在骨肉瘤异位移植中，骨肉瘤细胞被注射到动物的原发性骨肉瘤部位（骨）之外，通常在皮下，皮下14。虽然异位移植很简单，不需要在动物身上进行手术，但注射骨肉瘤细胞的部位并不代表实际的人类骨肉瘤微环境。骨肉瘤原位移植是将骨肉瘤细胞注射到动物的骨骼中，如胫骨15，16。与异位移植物相比，原位骨肉瘤移植物的特点是潜伏期短，生长快，侵蚀性强;因此，它们是骨肉瘤相关研究的理想动物模型17。
最常用的动物是老鼠，狗和斑马鱼18，19。骨肉瘤的自发模型通常用于犬类，因为骨肉瘤是犬科动物中最常见的肿瘤之一。但是，由于肿瘤形成时间长，肿瘤发生率低，均匀性差，稳定性差，该模型的应用受到限制。斑马鱼通常用于构建转基因或敲除肿瘤模型，因为它们的繁殖速度很快20。但斑马鱼基因与人类基因不同，因此其应用有限。
这项工作描述了 通过在 胸腺小鼠中通过胫骨内注射骨肉瘤细胞在胫骨中产生肺转移的原发性骨肉瘤的详细程序，注意事项和代表性图像。该方法应用于小鼠胫骨原发性骨肉瘤进行治疗效果评价，其重现率高达21，22。
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Protocol
所有动物实验均经上海中医药大学动物福利委员会批准。四周龄的雄性BALB / c无胸腺小鼠在手术前适应一周，以进行骨肉瘤细胞的原位注射。将小鼠饲养在单独通风的小鼠笼中，每个笼子有五只小鼠，在12小时的光照/黑暗循环中，随意获得SPF饲料和无菌水。
1. 细胞的制备
- 在骨肉瘤细胞（143B-荧光素酶）注射当天，用PBS（pH 7.4）洗涤在10cm细胞培养皿中培养的80%-90%融合细胞，并用1.5mL 0.25%胰蛋白酶消化3分钟。然后，加入6mL含10%血清MEM培养基以淬灭胰蛋白酶，并将细胞收集在15mL离心管中。
注意：143B-荧光素酶细胞系是从143B细胞系转染中获得的，具有pLV-荧光素酶载体23。 - 将20μL细胞悬浮液吸入细胞计数板的腔室中，并使用自动细胞计数器计算细胞浓度（参见 材料表）。
- 在室温下以800× g 离心细胞5分钟。
- 用移液管吸出上清液，并将细胞沉淀重悬于8.5mg / mL基底膜基质中（参见 材料表）至终浓度为2 x 107 细胞/ mL。
- 将细胞保持在冰上，将它们带到手术室。这些细胞将在2小时内使用。
注意：为了避免不准确的注射剂量（例如，由于注射器中的死腔），制备额外的细胞悬浮液（通常是所需体积的细胞悬浮液的两倍）。基底膜基质一直保持在冰上，因为它在室温24以上具有凝固特性。
2. 骨肉瘤细胞原位注射手术
注：手术工具如图 1所示。
- 在特定的无病原体条件下饲养小鼠。所有程序都是在装有无菌工具的无菌柜中完成的。
- 通过将小鼠暴露于2%异氟醚和98%氧气（氧气流速，2 L / min）来麻醉小鼠。
- 在眼睛上涂抹少量眼药膏，以防止麻醉时干燥。
注意：在通风良好的区域执行整个过程。在骨肉瘤细胞注射之前，确保每只小鼠通过脚趾捏合进行深度麻醉;如果鼠标仍然有响应，例如抽搐或抽搐，请等待很长时间，直到上述响应消失。 - 将每只鼠标保持在仰卧位。用拇指和食指握住小鼠的脚踝，用70%乙醇棉签消毒胫骨的注射部位。
注意：为了紧紧抓住鼠标脚踝，拇指和食指尖对于后续手术都非常重要。 - 向外旋转每只小鼠的踝关节以移动胫骨和腓骨，并将膝关节弯曲到合适的位置，直到通过皮肤清晰可见胫骨近端平台（胫骨顶部）（图2A）。
- 将针头连接到1 mL注射器上，并将针尖指向注射部位。确保注射器针头平行于胫骨的长轴。
- 经皮将针头穿过或靠近髌韧带插入皮肤/关节囊;th0en，旋转注射器（1/2至3/4圆）以通过胫骨平台向胫骨远端（髓质腔）钻一个孔，用微量注射器注射骨肉瘤细胞（图2B，C）。
注意：如果针尖准确，则在钻孔时可以感觉到胫骨同时旋转。确保针刺随着注射器的旋转向前移动，而不是直接向前推，直到大约一半的针头在胫骨中。
- 经皮将针头穿过或靠近髌韧带插入皮肤/关节囊;th0en，旋转注射器（1/2至3/4圆）以通过胫骨平台向胫骨远端（髓质腔）钻一个孔，用微量注射器注射骨肉瘤细胞（图2B，C）。
- 检查注射器针头是否突出地进入髓管，以确保钻孔成功。
注意：进行X射线检查（参见 材料表）以确认针的正确位置并收集图像。 - 将143B骨肉瘤细胞悬浮液（从步骤1.5开始）加载到微量注射器中，并用143B细胞加载的微量注射器替换胫骨中的1mL注射器（图2D）。将〜10μL（忽略针头中预先存在的溶液）143B细胞悬浮液缓慢注入每个无胸腺小鼠的胫骨（约2×105 个细胞），而不施加高压。
- 当取出微量注射器时，用棉签按压注射部位20-30秒。
- 将每只小鼠放回干净的笼子中并密切监测，直到小鼠从麻醉中完全恢复（约10分钟）。
- 使用X射线成像系统监测 体内 肿瘤生长。每周用卡尺测量癌症肿块的较长直径（a）和短直径（b），用于肿瘤体积（V）计算：V = 1/2 x a x b2。
注意：通过将小鼠暴露于2%异氟醚和98%氧气来麻醉小鼠。对小鼠进行麻醉以进行X射线成像。在萤骨内注射荧光素酶或标记的荧光蛋白骨肉瘤细胞能够追踪原发性和转移性骨肉瘤病变。
注意：由于膝关节和肺转移的肿瘤生长而患有骨肉瘤的小鼠的人道终点基于以下标准：（1）身体状况评分，（2）体重减轻阈值为20%，（3）肿瘤的平均最大直径为2cm，或（4）严重限制动物行为。
3.病理检查（收集原发性和肺转移性骨肉瘤标本进行分析）
- 注射骨肉瘤细胞六周后，暴露小鼠进行CO2 吸入后，通过宫颈脱位处死小鼠。
- 保持鼠标仰卧位，伸展后肢。
- 将携带骨肉瘤的整个腿部与腹股沟区域分开。
注意：确保所有支腿都与同一解剖部位分开。 - 通过去除皮肤，肌肉和脚部来制备患有骨肉瘤的腿部的组织学标本，然后将每只小鼠的标本用20mL福尔马林溶液（10%）固定在50mL管中24小时，然后在10%EDTA溶液中脱钙14天，偶尔更换缓冲液。
- 将标本嵌入石蜡中，并按照先前发表的工作25制备用于组织学检查的切片。
- 轻轻分离肺部并将其放入装有20 mL福尔马林溶液（10%）的50 mL管中。24小时后，将每只小鼠的肺转移到含有70%乙醇的15mL管中。将肺嵌入石蜡中用于苏木精和曙红（H&E）染色和免疫组化测定25。
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Representative Results
成功的原位（原发性）骨肉瘤和转移性肺模型取决于骨肉瘤细胞的准确原位注射。在这里， 通过 胫骨内骨肉瘤细胞注射成功开发了一种原位（原发性）骨肉瘤模型。 图3A 显示了具有代表性的小鼠携带原位（原发性）骨肉瘤， 图3B 显示了具有代表性的孤立性原位（原发性）骨肉瘤。用卡尺每周测量一次肿瘤体积，并按照步骤2.11中所述计算（图3C）。通过X射线和生物发光（当注射的细胞用荧光素酶标记时）活体成像系统跟踪 体内 原位（原发性）骨肉瘤的生长。 X射线图像是从143B骨肉瘤细胞注射后的第一周到第六周获得的（图3D）。此外，在将标记的143B细胞的荧光素酶注射到小鼠胫骨后，获得 体内 原位（原发性）骨肉瘤生长的图像（图3E）。
通过生物发光实时成像系统在体内成功跟踪由胫光素酶标记的骨肉瘤细胞在 体内 注射引起的肺转移（图4A）。分离的肺组织中的转移集落也在立体显微镜下可视化（图4B）。通过石蜡包埋的肺组织的H&E染色进一步证实了转移性病变（图4C）。
图 1：手术工具。 （A） 1 mL 秤注射器。（B）微量注射器。 请点击此处查看此图的大图。
图2：胫骨内注射手术的表示。 （A）无胸腺小鼠的胫骨内注射部位。（B）将无菌的1mL注射器与伴随针头经皮插入胫骨 ，通过 胫骨近端平台（胫骨顶部）向远端插入胫骨。（C） 钻孔过程的横向视图。注射器针头平行于长胫骨轴（实线）。（D）用骨肉瘤细胞加载的微容量注射器进行胫骨内注射。 请点击此处查看此图的大图。
图3：小鼠骨肉瘤生长的可视化。 （A）成功的小鼠原位骨肉瘤模型。（B）孤立性原位骨肉瘤。（C）用卡尺测量肿瘤体积，并使用以下公式计算：肿瘤体积=0.5×长直径×短直径×短直径。误差线代表标准偏差（n = 8）。（D）在不同时间（1-6周）从同一只小鼠获得X射线图像。（E）将第28天 获得的图像将标记的143B细胞的荧光素酶注射到小鼠胫骨中。红色箭头表示原位（原发性）骨肉瘤的发光强度。 请点击此处查看此图的大图。
图4：骨肉瘤的肺转移。 （A）将第28天 获得的荧光素酶标记的143B细胞注入小鼠胫骨后的图像。红色箭头表示肺转移的发光强度。（B）孤立的肺伴有骨肉瘤转移。红色箭头表示转移菌落（x20）。（C）H&E染色显示肺组织中的转移性病变（鳞条= 200μm）。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
原位注射骨肉瘤细胞是研究骨肉瘤癌发生中特定因素的功能和机制以及开发以评估治疗效果的理想模型。为避免肿瘤生长的差异，将大多数与相同数量汇合的80%-90%的活性骨肉瘤细胞小心地注射到每只小鼠的胫骨中，严格控制细胞胰蛋白酶消化时间而不影响细胞活力。由于细胞团块会影响细胞计数，导致将不准确的细胞数量注射到每只小鼠的胫骨中，因此需要用移液管适当地上下混合细胞悬浮液，以避免形成细胞团块。
必须考虑的另一个关键方面是骨肉瘤细胞的重悬溶液。将注射的细胞重悬于基底膜基质中，而不是在PBS或培养基中。此外，高浓度的基底膜基质难以移液并影响准确的体积;因此，基底膜基质需要适当浓度的基底膜26。为了在胫骨平台上钻一个洞以进行骨肉瘤细胞注射，针刺随着注射器的旋转向前移动，而不是直接向前推，直到大约一半的针头在胫骨中。更具体地说，免疫缺陷小鼠应用27个使用人骨肉瘤细胞建立原位骨肉瘤模型。同时，使用无菌手术工具在生物安全柜中进行注射程序。由于小鼠在麻醉和手术后可能会感到不安，因此必须在手术后的第一周密切监测小鼠。
用荧光蛋白或荧光素酶标记的骨肉瘤细胞的庭内注射能够使用光学成像28跟踪原发性和转移性病变。骨肉瘤绝不允许超过IACUC批准的方案中的大小限制;同时，溃疡可能发生在巨大的肿瘤肿块中，这可能导致免疫组织化学分析失败。虽然最近有报道称原发性骨肿瘤和骨转移是通过将实体瘤移植物植入骨骼中来实现的，并且动物发育出可重复的生长，以及最终的肺转移29;然而，作者直接将新鲜或冷冻保存的肿瘤片段植入胫骨近端，这表明开放手术的缺点是引起潜在的感染和肿瘤移植的失败。而且，植入肿瘤片段的体积在没有严格控制的情况下会导致产生的肿瘤体积有显著差异，这在后续应用时是困难的，例如 在体内评估治疗效果。在这里，报道了一种简单且可重复的技术 ，通过 根内注射骨肉瘤细胞建立胫内原发性骨肉瘤和后来的肺转移小鼠模型。这显示了最好地模仿人类骨肉瘤临床发育特征的优势;使用微量注射器直接注射到胫骨中的骨肉瘤细胞的准确数量允许相同的肿瘤形成率（100%）和肿瘤体积。该方法确保使用开放手术技术避免感染甚至死亡的可能性，并允许在注射的骨肉瘤细胞用生物发光标记后，使用生物发光实时成像系统活活监测和量化骨肉瘤的生长和转移。这可以防止注射的骨肉瘤细胞直接到达血流并在肺部定植以形成肺栓塞和/或假阳性肺转移，方法是将注射的骨肉瘤细胞以适当浓度的基底膜基质重悬，因为基底膜基质具有高于室温的凝血特性。将骨肉瘤细胞注射到小鼠胫骨后，立即凝固并限制基底膜基质内的骨肉瘤细胞。
另一文献报道了通过心内接种或胫骨内接种乳腺癌细胞30建立骨转移模型;然而，该文献中使用的细胞是乳腺癌细胞，其与骨肉瘤细胞具有不同的生物学和临床特征;此外，在骨骼中建立的心内和胫内接种的癌症模型都是由癌细胞直接定植或通过血流形成的，而不是由癌细胞从原发性癌症病变播散形成的转移病变。
当前协议有几个限制。该方案中使用的小鼠是遗传免疫系统缺陷的裸鼠，没有胸腺，阻止它们在免疫学上排斥人类细胞，并广泛用于临床前试验，不适用于免疫功能研究。此外，我们发现并非所有骨肉瘤细胞系在这些模型中都具有相同的相关性，并且143B，MNNG，MG-63和U-2 OS细胞的肿瘤发生能力高于Saos-2细胞。
综上所述，本正位骨肉瘤细胞注射产生的原发性和肺转移性骨肉瘤模型是研究肿瘤微环境、治疗骨肉瘤生长和/或转移疗效的便捷工具。此外，通过胫内注射专门针对基因的转基因骨肉瘤细胞，这些模型有助于探索骨肉瘤生长和肺转移中的关键癌基因和肿瘤抑制因子。
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Disclosures
作者声明，他们没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
本研究由（1）中国国家重点研发计划（2018YFC1704300和2020YFE0201600），（2）国家自然科学基金（81973877和82174408）资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Automatic cell counter | Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd | IC1000 | Counting cells |
| Anesthesia machine | Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd | R500IP | The Equipment of Anesthesia mice |
| BALB/c athymic mice | Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd. | / | animal |
| Basement Membrane Matrix | Shanghai Uning Bioscience Technology Co., Ltd | 356234, BD, Matrigel | re-suspende cells |
| Bioluminescence imaging system | Shanghai Baitai Technology Co., Ltd | Vieworks | tracking the tumor growth and pulmonary metastasis, if the injection cell is labeled by luciferase |
| Centrifuge tube (15 mL) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 430790, Corning | Centrifuge the cells |
| isoflurane | Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd | VETEASY | Anesthesia mice |
| MEM media | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | LM-E1141 | Cell culture medium |
| Micro-volume syringe | Shanghai high pigeon industry and trade Co., Ltd | 0-50 μL | Inject precise cells into the tibia |
| Phosphate-buffered saline | Beyotime Biotechnology | ST447 | wash the human osteosarcoma cells |
| 1ml syringes | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd | 20200411 | drilling |
| 143B cell line | ATCC | CRL-8303 | osteosarcoma cell line |
| Trypsin (0.25%) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 25200056, Gibco | trypsin treatment of cells |
| Trypan blue | Beyotime Biotechnology | ST798 | Staining cells to assess activity |
| vector (pLV-luciferase) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | VL3613 | Plasmid |
| Lipofectamine 2000 | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 11668027,Thermo fisher | Plasmid transfection reagent |
| X-ray imaging system | Brook (Beijing) Technology Co., Ltd | FX PRO | X-ray images were obtained to detect tumor growth |
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