Настоящий протокол описывает интратибию остеосаркомы для генерации мышиных моделей, несущих ортотопическую остеосаркому и поражения легочными метастазами.
Остеосаркома является наиболее распространенным первичным раком кости у детей и подростков, причем легкие являются наиболее распространенным метастатическим участком. Пятилетняя выживаемость больных остеосаркомой с легочными метастазами составляет менее 30%. Поэтому использование мышиных моделей, имитирующих развитие остеосаркомы у людей, имеет большое значение для понимания фундаментального механизма канцерогенеза остеосаркомы и легочных метастазов для разработки новых терапевтических средств. Здесь сообщается о подробных процедурах для создания моделей первичной остеосаркомы и легочных метастазов мыши путем инъекции интратибии клеток остеосаркомы. В сочетании с биолюминесценцией или рентгеновской системой визуализации в реальном времени эти живые мышиные модели используются для мониторинга и количественной оценки роста и метастазирования остеосаркомы. Чтобы установить эту модель, базальную мембранную матрицу, содержащую клетки остеосаркомы, загружали в микрообъемный шприц и вводили в одну большеберцовую кость каждой атипичной мыши после анестезии. Мышей приносили в жертву, когда первичная остеосаркома достигла ограничения размера в одобренном IACUC протоколе. Ноги, несущие остеосаркому, и легкие с метастазирующими поражениями были разделены. Эти модели характеризуются коротким инкубационным периодом, быстрым ростом, тяжелыми поражениями, а также чувствительностью при мониторинге развития первичных и легочных метастатических поражений. Таким образом, это идеальные модели для изучения функций и механизмов специфических факторов канцерогенеза остеосаркомы и легочных метастазов, микроокружения опухоли и оценки терапевтической эффективности in vivo.
Остеосаркома является наиболее распространенным первичным раком кости у детей и подростков 1,2, который в основном проникает в окружающие ткани и даже метастазирует в легкие при постановке диагноза пациентам. Легочное метастазирование является основной проблемой для терапии остеосаркомы, а пятилетняя выживаемость пациентов с остеосаркомой с легочным метастазированием остается на уровне 20%-30%3,4,5. Тем не менее, пятилетняя выживаемость первичной остеосаркомы была увеличена примерно до 70% с 1970-х годов из-за введения химиотерапии6. Поэтому крайне необходимо понять фундаментальный механизм канцерогенеза остеосаркомы и легочных метастазов для разработки новых методов лечения. Применение мышиных моделей, которые лучше всего имитируют прогрессирование остеосаркомы у людей, имеет большое значение7.
Животные модели остеосаркомы генерируются спонтанной, индуцированной генной инженерией, трансплантацией и другими методами. Модель спонтанной остеосаркомы редко используется из-за длительного времени образования опухоли, непоследовательной частоты возникновения опухоли, низкой заболеваемости и плохой стабильности 8,9. Хотя модель индуцированной остеосаркомы более доступна для получения, чем спонтанная остеосаркома, применение модели индуцированной остеосаркомы ограничено, поскольку индуцирующий фактор будет влиять на микроокружение, патогенез и патологические характеристики остеосаркомы10. Трансгенные модели помогают понять патогенез раковых заболеваний, поскольку они могут лучше имитировать физиологическую и патологическую среду человека; однако трансгенные модели животных также имеют свои ограничения из-за сложности, долгосрочности и высокой стоимости трансгенной модификации. Более того, даже в наиболее широко распространенных трансгенных моделях животных, генерируемых модификацией генов p53 и Rb, только 13,6% саркомы произошло в четырех костях конечностей11,12.
Трансплантация является одним из наиболее часто используемых первичных и отдаленных методов производства модели метастатического рака в последние годы из-за ее простого маневра, стабильной скорости образования опухоли и лучшей однородности13. Трансплантация включает в себя гетеротопную трансплантацию и ортотопическую трансплантацию в соответствии с местами трансплантации. При гетеротопной трансплантации остеосаркомы клетки остеосаркомы вводят вне первичных участков остеосаркомы (кости) животных, обычно под кожу, подкожно14. Хотя гетеротопная трансплантация проста без необходимости выполнения операции у животных, участки, где вводятся клетки остеосаркомы, не представляют собой фактическую микросреду остеосаркомы человека. Ортотопическая трансплантация остеосаркомы – это когда клетки остеосаркомы вводятся в кости животных, такие как большеберцоваякость 15,16. По сравнению с гетеротопными трансплантатами ортотопические трансплантаты остеосаркомы характеризуются коротким инкубационным периодом, быстрым ростом и сильным эрозионным характером; поэтому они являются идеальными животными моделями для исследований, связанных с остеосаркомой17.
Наиболее часто используемыми животными являются мыши, собаки и рыбки данио18,19. Спонтанная модель остеосаркомы обычно используется у собак, потому что остеосаркома является одной из наиболее распространенных опухолей у собак. Однако применение этой модели ограничено из-за длительного времени образования опухоли, низкой скорости опухолевого генеза, плохой однородности и стабильности. Рыбки данио часто используются для построения трансгенных или нокаутирующих опухолевых моделей из-за их быстрого размножения20. Но гены рыбок данио отличаются от генов человека, поэтому их применение ограничено.
В этой работе описываются подробные процедуры, меры предосторожности и репрезентативные изображения для получения первичной остеосаркомы в большеберцовой кости с легочным метастазированием путем инъекции интратибии клеток остеосаркомы у атимических мышей. Этот метод был применен для создания первичной остеосаркомы у голени мыши для оценки терапевтической эффективности, которая показала высокую воспроизводимость21,22.
Ортотопическая инъекция клеток остеосаркомы является идеальной моделью для изучения функции и механизма специфических факторов канцерогенеза остеосаркомы и развития для оценки терапевтической эффективности. Чтобы избежать различий в росте опухоли, наиболее активные клетки остеос?…
The authors have nothing to disclose.
Это исследование было поддержано грантами (1) Национальной ключевой программы исследований и разработок Китая (2018YFC1704300 и 2020YFE0201600), (2) Национального фонда наук о природе (81973877 и 82174408).
Automatic cell counter | Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd | IC1000 | Counting cells |
Anesthesia machine | Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd | R500IP | The Equipment of Anesthesia mice |
BALB/c athymic mice | Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd. | / | animal |
Basement Membrane Matrix | Shanghai Uning Bioscience Technology Co., Ltd | 356234, BD, Matrigel | re-suspende cells |
Bioluminescence imaging system | Shanghai Baitai Technology Co., Ltd | Vieworks | tracking the tumor growth and pulmonary metastasis, if the injection cell is labeled by luciferase |
Centrifuge tube (15 mL) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 430790, Corning | Centrifuge the cells |
isoflurane | Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd | VETEASY | Anesthesia mice |
MEM media | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | LM-E1141 | Cell culture medium |
Micro-volume syringe | Shanghai high pigeon industry and trade Co., Ltd | 0-50 μL | Inject precise cells into the tibia |
Phosphate-buffered saline | Beyotime Biotechnology | ST447 | wash the human osteosarcoma cells |
1ml syringes | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd | 20200411 | drilling |
143B cell line | ATCC | CRL-8303 | osteosarcoma cell line |
Trypsin (0.25%) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 25200056, Gibco | trypsin treatment of cells |
Trypan blue | Beyotime Biotechnology | ST798 | Staining cells to assess activity |
vector (pLV-luciferase) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | VL3613 | Plasmid |
Lipofectamine 2000 | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 11668027,Thermo fisher | Plasmid transfection reagent |
X-ray imaging system | Brook (Beijing) Technology Co., Ltd | FX PRO | X-ray images were obtained to detect tumor growth |