Summary
Het protocol beschrijft de bereiding van celmembraanaffiniteitschromatografie (CMAC) kolommen met geïmmobiliseerde celmembraanfragmenten die functionele transmembraantropomyosinekinasereceptor B-eiwitten bevatten. Het gebruik van CMAC-kolommen bij de identificatie van gespecialiseerde plantenmetabolieten die interageren met deze receptoren en aanwezig zijn in complexe natuurlijke mengsels wordt ook uitgelegd.
Abstract
Chemicaliën gesynthetiseerd door planten, schimmels, bacteriën en ongewervelde zeedieren zijn een rijke bron van nieuwe medicijnhits en -leads. Geneesmiddelen zoals statines, penicilline, paclitaxel, rapamycine of artemisinine, vaak gebruikt in de medische praktijk, zijn voor het eerst geïdentificeerd en geïsoleerd uit natuurlijke producten. De identificatie en isolatie van biologisch actieve gespecialiseerde metabolieten uit natuurlijke bronnen is echter een uitdagend en tijdrovend proces. Traditioneel worden individuele metabolieten geïsoleerd en gezuiverd uit complexe mengsels, na de extractie van biomassa. Vervolgens worden de geïsoleerde moleculen getest in functionele assays om hun biologische activiteit te verifiëren. Hier presenteren we het gebruik van cellulaire membraanaffiniteitschromatografie (CMAC) -kolommen om biologisch actieve verbindingen rechtstreeks uit complexe mengsels te identificeren. CMAC-kolommen maken de identificatie mogelijk van verbindingen die interageren met geïmmobiliseerde functionele transmembraaneiwitten (TMP's) ingebed in hun inheemse fosfolipide dubbellaagse omgeving. Dit is een gerichte aanpak, die vereist dat men de TMP kent waarvan men de activiteit wil moduleren met het nieuw geïdentificeerde kandidaat-geneesmiddel met kleine moleculen. In dit protocol presenteren we een aanpak om CMAC-kolommen voor te bereiden met geïmmobiliseerde tropomyosinekinasereceptor B (TrkB), die naar voren is gekomen als een levensvatbaar doelwit voor het ontdekken van geneesmiddelen voor tal van aandoeningen van het zenuwstelsel. In dit artikel bieden we een gedetailleerd protocol om de CMAC-kolom samen te stellen met geïmmobiliseerde TrkB-receptoren met behulp van neuroblastoomcellijnen die TrkB-receptoren overexpressie geven. We presenteren verder de aanpak om de functionaliteit van de kolom en het gebruik ervan bij de identificatie van gespecialiseerde plantenmetabolieten die interageren met TrkB-receptoren te onderzoeken.
Introduction
Botanische mengsels zijn rijk aan farmacologisch actieve verbindingen1, die dienen als een goede bron voor de identificatie van nieuwe medicijnhits en leads 2,3,4,5. De ontdekking van nieuwe geneesmiddelen uit natuurlijke producten is een vruchtbare aanpak geweest en veel momenteel goedgekeurde geneesmiddelen zijn afkomstig van verbindingen die voor het eerst in de natuur zijn geïdentificeerd. De chemische diversiteit van natuurlijke verbindingen is moeilijk te evenaren door door de mens gemaakte bibliotheken van chemisch gesynthetiseerde moleculen. Veel natuurlijke verbindingen interageren met en moduleren menselijke eiwitdoelen en kunnen worden beschouwd als evolutionair geoptimaliseerde medicijnachtige moleculen6. Deze natuurlijke verbindingen zijn bijzonder geschikt voor de identificatie van geneesmiddellood voor gebruik bij neurologische aandoeningen6. Twee van de momenteel door de FDA goedgekeurde geneesmiddelen voor de behandeling van de ziekte van Alzheimer (AD) zijn afgeleid van natuurlijke alkaloïden, namelijk: galantamine en rivastigmine (een derivaat van fysostigmine)6. Levodopa, momenteel het meest voorgeschreven medicijn voor de ziekte van Parkinson, werd voor het eerst geïdentificeerd uit de brede boon (Vicia faba L.) 7. Pergolide en lisuride, dopaminerge receptoragonisten zijn de derivaten van natuurlijke moederkorenalkaloïden uit de parasitaire schimmel Claviceps purpurea8. Reserpine, een alkaloïde geïsoleerd uit Indiase slangenwortel (Rauvolfia serpentina (L.) Benth. ex Kurz) was een van de eerste antipsychotica9. Onlangs zijn ontregelde immuunrespons en systemische ontsteking in verband gebracht met de ontwikkeling van tal van neurologische aandoeningen, zoals depressieve stoornissen of neurodegeneratieve ziekten10. Een plantaardig dieet samen met andere leefstijlinterventies blijkt de cognitieve en functionele vaardigheden bij ouderen te verbeteren 11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 . Bepaalde elektrofiele moleculen die behoren tot triterpenen en polyfenolen blijken ontstekingsreacties te moduleren in zowel in vitro als in vivo modellen12. Natuurlijke verbindingen die α,β-onverzadigde carbonyl (bijv. Curcumine, cinnamaldehyde) of isothiocyanaatgroep (bijv. Sulforafaan) bevatten, interfereren bijvoorbeeld met Toll-like receptor-4 (TLR4) dimerisatie en remmen de stroomafwaartse synthese van pro-inflammatoire cytokines in een muriene interleukine-3-afhankelijke pro-B-cellijn12,22 . Epidemiologisch bewijs wijst er sterk op dat fytochemicaliën in de voeding, aanwezig in complexe voedselmatrices, ook een levensvatbare bron van nieuwe geneesmiddelen kunnen vormen6.
Een van de belangrijkste obstakels bij de identificatie van biologisch actieve moleculen die aanwezig zijn in plantenextracten, waaronder plantaardig voedsel, is de complexiteit van de onderzochte monsters. Traditioneel worden de individuele verbindingen geïsoleerd, gezuiverd en vervolgens getest op biologische activiteit. Deze aanpak leidt meestal tot de identificatie van de meest voorkomende en goed gekarakteriseerde verbindingen. Fenotypische geneesmiddelontdekkingsbenaderingen zonder een gedefinieerd moleculair doelwit zijn afhankelijk van de biogeleide fractionering van complexe mengsels23. In deze benadering wordt een extract gefractioneerd in minder complexe subfracties die vervolgens worden getest in fenotypische assays. De isolatie en zuivering van actieve verbindingen worden geleid door biologische activiteit die in de test wordt geverifieerd. De kennis van de identiteit van een bepaald geneesmiddeldoel kan de identificatie van farmacologisch actieve verbindingen in complexe mengsels aanzienlijk versnellen. Die benaderingen zijn meestal gebaseerd op de immobilisatie van het moleculaire doelwit, bijvoorbeeld een enzym, op een vast oppervlak, zoals magnetische kralen23. De geïmmobiliseerde doelen worden vervolgens gebruikt in de screeningsexperimenten die resulteren in de isolatie van verbindingen die interageren met het doelwit. Hoewel deze benadering op grote schaal is gebruikt bij de identificatie van verbindingen die gericht zijn op cytosolische eiwitten, is deze minder vaak toegepast bij de identificatie van chemicaliën die interageren met transmembraaneiwitten (TMP's)23. Een extra uitdaging bij de immobilisatie van TMP's komt voort uit het feit dat de activiteit van het eiwit afhankelijk is van de interactie met celmembraanfosfolipiden en andere moleculen in de dubbellaag zoals cholesterol 23,24. Het is belangrijk om deze subtiele interacties tussen eiwitten en hun inheemse fosfolipide dubbellaagse omgeving te behouden bij het immobiliseren van het transmembraandoel.
Bij cellulaire membraanaffiniteit chromatografie (CMAC) worden celmembraanfragmenten, en niet gezuiverde eiwitten, geïmmobiliseerd op de stationaire fasedeeltjes van het kunstmatige membraan (IAM) 23. IAM stationaire fasen worden bereid door fosfatidylcholine analogen covalent te binden aan silica. Onlangs zijn nieuwe klassen van IAM stationaire fasen ontwikkeld waarin vrije amine- en silanolgroepen end-capped (IAM. PC. DD2 deeltjes). Tijdens cmac-kolommenvoorbereiding worden celmembraanfragmenten geïmmobiliseerd op het oppervlak van IAM-deeltjes door adsorptie.
CMAC-kolommen zijn tot nu toe gebruikt om verschillende klassen TMP's te immobiliseren, waaronder ionkanalen (bijv. Nicotinereceptoren), GPCR's (bijv. Opioïde receptoren), eiwittransporters (bijv. P-glycoproteïne), enz.24. De geïmmobiliseerde eiwitdoelen zijn gebruikt bij de karakterisering van de farmacodynamiek (bijv. Dissociatieconstante, Kd) of bij het bepalen van bindingskinetiek (kaan en kuit) van liganden met kleine moleculen die interageren met het doelwit, evenals bij het proces van identificatie van potentiële nieuwe geneesmiddelkabels die aanwezig zijn in complexe matrices24 . Hier presenteren we de voorbereiding van CMAC-kolommen met de geïmmobiliseerde tropomyosinekinasereceptor B (TrkB), die naar voren is gekomen als een levensvatbaar doelwit voor medicijnontdekking voor tal van aandoeningen van het zenuwstelsel.
Eerdere studies toonden aan dat de activering van de van de hersenen afgeleide neurotrofe factor (BDNF) / TrkB-route geassocieerd is met de verbetering van bepaalde neurologische aandoeningen, zoals AD of depressievestoornis 25,26,27,28. Er werd gemeld dat BDNF-niveaus en de receptor TrkB-expressie afnemen in AD, en vergelijkbare reducties verminderen de hippocampusfunctie in diermodellen van AD29. Verlaagde niveaus van BDNF werden gemeld in serum en hersenen van AD-patiënten 30,31,32. Tau-overexpressie of hyperfosforylering bleken de BDNF-expressie in primaire neuronen en AD-diermodellen te downreguleren 33,34,35. Bovendien werd gemeld dat BDNF beschermende effecten had op β-amyloïde geïnduceerde neurotoxiciteit in vitro en in vivo36. Directe toediening van BDNF in de hersenen van ratten bleek het leren en geheugen te verhogen bij cognitief gehandicapte dieren37. BDNF /TrkB kwam naar voren als een geldig doelwit voor het verbeteren van neurologische en psychiatrische stoornissen, waaronder AD28,38. Het richten op de BDNF/TrkB-signaleringsroute voor de ontwikkeling van therapieën in AD zal ons begrip van de ziekte mogelijk verbeteren39. Helaas kan BDNF zelf niet als behandeling worden gebruikt vanwege de slechte farmacokinetische eigenschappen en nadelige bijwerkingen40. Kleine molecuulactivatoren van TrkB/BDNF-routes zijn onderzocht als potentiële TrkB-liganden 41,42,43. Van de geteste agonisten met kleine moleculen is aangetoond dat 7,8-dihydroxyflavone (7,8-DHF) de BDNF / TrkB-route 41,44,45,46 activeert. Een derivaat van 7,8-DHF (R13; 4-Oxo-2-phenyl-4H-chromene-7,8-diyl bis(methylcarbamaat)) wordt momenteel overwogen als een mogelijk medicijn voor AD47. Onlangs werd aangetoond dat verschillende antidepressiva werken door direct te binden aan TrkB en BDNF-signalering te bevorderen, waardoor het belang van het nastreven van TrkB als een geldig doelwit voor de behandeling van verschillende neurologische aandoeningen verder wordt benadrukt48.
Het protocol beschrijft het proces van het samenstellen van de functionele TrkB-kolom en de TrkB-NULL-negatieve besturingskolom. De kolommen worden gekarakteriseerd met behulp van een bekend natuurproduct kleinmoleculair ligand: 7,8-DHF. Daarnaast beschrijven we het proces van het screenen van complexe matrices, met behulp van plantenextract als voorbeeld, voor de identificatie van verbindingen die interageren met TrkB.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Celkweek van SH-SY5Y neuroblastoomcellen (TrkB en TrkB-NULL (ouderlijke) cellijnen)
OPMERKING: Cellijnen (SH-SY5Y Cell Line (TrkB, BR6) en SH-SY5Y Parental Cell Line (TrkB NULL))49,50 werden gekocht bij Kerafast. Gekweekte cellen worden gebruikt als bron van de transmembraanreceptoren die moeten worden geïmmobiliseerd voor de bereiding van CMAC-kolommen. In de volgende stappen wordt beschreven hoe u celmembraanfragmenten kunt verkrijgen en functionele CMAC-kolommen kunt samenstellen.
- Kweek de cellen in een celkweekmedium bereid door 450 ml RPMI-media, 50 ml FBS, 5 ml penicilline / streptomycine-oplossing en 0,3 mg / ml geneticine (G418) te mengen in een celkweekschaal van 150 mm bij 37 ° C in een vochtige atmosfeer met 5% CO2.
2. Celoogst
- Bevestig de celconfluentie (80%-90%) met behulp van een microscoop, bereikt na 3-4 dagen na celpassageing.
- Zuig celkweekmedium op van boven de cellen en was de cellen tweemaal met fosfaatgebuufferde zoutoplossing (PBS, 1x, pH 7,4). Verwijder PBS en voeg 2 ml laag geconcentreerd trypsine (0,25%) toe om cellen los te maken.
- Draai de plaat voorzichtig om alle cellen gelijkmatig te bedekken met trypsine-oplossing en incamineer de cellen gedurende ongeveer 2 minuten bij 37 °C in een vochtige atmosfeer met 5% CO2. Voeg 8 ml celkweekmedium toe aan losmakende cellen en breng losgemaakte cellen over naar een conische buis van 50 ml en plaats deze op ijs.
- Gebruik een hemocytometer om het aantal cellen (ongeveer 3 x 107 cellen) te schatten. Meng celsuspensie door op en neer te pipetteren om een gelijkmatige celdichtheid in het mengsel te verkrijgen. Plaats 10 μL celsuspensie onder de coverslip en tel de cellen onder een microscoop met behulp van een 40x objectief.
3. Celhomogenisatie
- Bereid voorraadoplossingen van de volgende proteaseremmers: benzamidine (200 mM), fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF, 10 mM) en in de handel verkrijgbare proteaseremmers cocktail (100x concentratie) met 4-(2-aminoethyl)benzeensulfonylfluoridehydrochloride (AEBSF), aprotinine, bestatine en leupeptine.
LET OP: PMSF mag alleen in de zuurkast worden gehanteerd.- Bereid benzamidine-stamoplossing (200 mM) door 120 mg benzamidine op te lossen in 5 ml ultrapuur gedeïoniseerd water. Bewaren bij 4 °C en binnen een dag gebruiken. Bereid de oplossing vers voor elk gebruik (aanbevolen).
- Bereid PMSF-stamoplossing (10 mM) door 0,017 g PMSF op te lossen in 10 ml ethanol. Bewaren bij - 20 °C.
- Bereid proteaseremmercocktail (100x) door het in de handel verkrijgbare proteaseremmermengsel op te lossen in 1 ml ultrapuur gedeïoniseerd water. Meng grondig en aliquot 200-300 μL van de cocktail en bewaar bij - 20 °C voor gebruik.
- Bereid ATP-stamoplossing (100 mM) door 55,114 mg ATP-dinatriumzouthydraat op te lossen in 1 ml gedeïoniseerd ultrapuur water. Meng grondig en aliquot 100 μL van het mengsel en bewaar bij - 20 °C voor gebruik.
- Bereid de buffer voor door 3,03 g tris(hydroxymethyl)aminomethaanhydrochloride (Tris-HCl, 50 mM), 2,9 g natriumchloride (NaCl, 100 mM), 0,22 g watervrij calciumchloride (CaCl2, 3 mM), 0,2 g magnesiumchloridehexahydraat (MgCl2, 2 mM) en 0,19 kaliumchloride (KCl, 5 mM) op te lossen in 500 ml ultrapuur gedeïoniseerd water.
- Bereid homogenisatiebuffer door 17,3 ml van de in stap 3.3 bereide buffer te mengen met 0,3 ml (3 mM) benzamidine-stamoplossing, 0,2 ml (0,1 mM) PMSF-stamoplossing, 0,2 ml cocktailmengsel met proteaseremmer, 20 μl (100 μM) ATP-voorraadoplossing, 2 ml (10%) glycerol en 0,029 g (5mM) EDTA (tabel 1). Stel de pH in op 7,4 met behulp van zoutzuuroplossing.
- Draai de in stap 2.3 geoogste cellen gedurende 5 minuten bij 400 x g bij 4 °C af. Verwijder het supernatant en was de resterende celkorrel met 10 ml ijskoude PBS (1x, pH 7,4). Draai de cellen opnieuw af bij 4 °C gedurende 5 minuten bij 400 x g.
- Gooi het supernatant weg en vervang het door 20 ml homogenisatiebuffer die in stap 3.4 is voorbereid. Plaats de conische buis op ijs.
- Breng de celsuspensie over in een 40 ml Dounce homogenisator weefselslijper en plaats deze op ijs. Homogeniseer de ophanging handmatig, op ijs, met behulp van 40 op-en-neer stamperslagen. Breng gehomogeniseerde celsuspensie over in een conische buis van 50 ml.
- Centrifugeer het homogenaat bij 4 °C gedurende 7 minuten bij 400 x g. Gooi de pellet weg en breng het supernatant over in een nieuwe conische buis en centrifugeer het gedurende 30 minuten bij 4 °C bij 47900 x g. Bewaar de celmembraankorrel en gooi het supernatant weg.
4. Oplosbaarheid van het celmembraan
- Bereid de oplosbuffer door 8,7 ml van de in stap 3.3 gemaakte bufferoplossing te mengen met 0,1 ml (0,1 mM) PMSF-stamoplossing, 0,15 ml (3 mM) benzamidine-stamoplossing, 0,1 ml proteaseremmercocktail, 10 μl (100 μM) ATP-voorraadoplossing, 1 ml (10%) glycerol en 0,2 g (2%) natrium cholaat (tabel 2).
- Breng de oplosbuffer over in de conische buis met celmembraanfragmenten verkregen in stap 3.8 en resuspend de pellet. Draai het resulterende mengsel gedurende 18 uur bij 150 tpm bij 4 °C.
OPMERKING: Op dit punt kan het experiment worden gepauzeerd voor nachtelijke oplosbaarheid van celmembraankorrels.
5. Immobilisatie van het celmembraan op IAM. PC. DD2 deeltjes
- Centrifugeer na 18 uur het oplosbaarheidsmengsel bij 4 °C gedurende 30 minuten bij 47900 x g.
- Bewaar het bovennatuurlijk en gooi de pellet weg. Voeg 100 mg IAM toe. PC. DD2-deeltjes, naar het supernatant, vortex en roteren het resulterende suspensiemengsel bij 150 tpm bij 4 °C gedurende 1 uur.
- Om de immobilisatie van celmembraanfragmenten op de IAM te vergemakkelijken. PC. DD2-deeltjes gaan verder met de dialysestap zoals hieronder beschreven.
- Bereid dialysebuffer voor in 4 l ultrapuur gedeïoniseerd water door toevoeging van 24 g tris-HCl (50 mM), 23,4 g NaCl (100 mM), 0,06 g CaCl2 (0,1 mM), 5,85 g EDTA (5 mM) en 0,07 g PMSF (0,1 mM; Tabel 3).
OPMERKING: PMSF is niet oplosbaar in water, los het daarom eerst op in een klein volume ethanol en voeg het vervolgens langzaam toe aan het bekerglas met de buffer. - Stel de pH in op 7,4 met zoutzuuroplossing. Plaats de buffer minimaal 1 uur bij 4 °C voordat u overgaat tot de dialysestap.
- Bereid de dialysebuis voor door 10 cm cellulosemembraandialysebuis te snijden (10 K MWCO, 35 mm) en breng de suspensie met IAM over. PC. DD2-deeltjes en celmembraanfragmenten in de dialysebuis. Gebruik dialysebuisclips om beide uiteinden van de dialysebuis te sluiten.
- Plaats de dialysebuis met daarin de IAM. PC. DD2 stationaire fase in de dialysebuffer en dialyseer bij 4 °C gedurende 24 uur onder zacht roeren.
- Plaats na 24 uur de dialyseslang in de vers voorbereide dialysebuffer en ga nog 24 uur verder met dialyse.
- Bereid dialysebuffer voor in 4 l ultrapuur gedeïoniseerd water door toevoeging van 24 g tris-HCl (50 mM), 23,4 g NaCl (100 mM), 0,06 g CaCl2 (0,1 mM), 5,85 g EDTA (5 mM) en 0,07 g PMSF (0,1 mM; Tabel 3).
6. CMAC kolom verpakking
- Bereid ammoniumacetaatbuffer (10 mM, pH 7,4) voor die zal worden gebruikt om de IAM te wassen. PC. DD2-deeltjes en in kolomkarakteriseringsexperimenten door het oplossen van 0,7708 g ammoniumacetaat in 1 L ultrapuur gedeïoniseerd water. Stel de pH in op 7,4 met zoutzuuroplossing.
- Verwijder na 48 uur dialyse de dialysebuis uit de dialysebuffer en breng de inhoud van de dialysebuis over in een conische buis van 15 ml.
- Centrifugeer het mengsel bij 4 °C gedurende 5 minuten bij 400 x g. Gooi het supernatant weg en was de resterende pellet driemaal met 10 ml ammoniumacetaatbuffer, waarbij u het mengsel na elke wasbeurt gedurende 5 minuten bij 4 °C bij 400 x g centrifugeert.
- Na de derde wasbeurt, resuspend de resterende pellet in 1 ml ammoniumacetaatbuffer. Meng het grondig en gebruik de resulterende slurry om de 5/20 glazen kolom te verpakken tot CMAC chromatografie kolom.
- Om de kolom te verpakken, plaatst u eerst een bodemfilter dat eerder is gedrenkt met ammoniumacetaatbuffer in de filterhouder. Plaats de filterhouder in de glazen kolom en schroef de kolomdop om de positie van de houder vast te zetten. Plaats de kolom verticaal in een vingerklem en zet hem vast in de labstandaard. Plaats een bekerglas onder de kolom.
- Breng met behulp van een eenkanaals pipettor een klein volume van de in stap 6.4 verkregen slurry over in de glazen kolom. Giet het materiaal langzaam en houd de pipetpunt tegen de glazen kolomwand. Laat het verpakkingsmateriaal bezinken voordat u nog een volume drijfmest giet.
- Om het verpakkingsproces te versnellen, verwijdert u de buffer van boven het stationaire bed met behulp van een micropipette tussen elke stap. Herhaal deze stappen totdat 1 ml van de drijfmest is verpakt.
- Plaats een bovenfilter en schroef de adaptereenheid zo dat er geen buffer boven de stationaire fase overblijft, zoals weergegeven in figuur 1. Bevestig de positie van de adaptereenheid met de adaptervergrendeling.
- Sluit de kolom aan op een HPLC-pomp (High Performance Liquid Chromatography), stel het debiet in op 0,2 ml/min en was de kolom 's nachts met ammoniumacetaatbuffer. De kolom is nu klaar voor de karakteriseringsstap. Bewaar de kolom bij 4 °C tot gebruik.
OPMERKING: Voor langere opslag (kolom niet langer dan een week gebruikt) voert u de kolom met 0,05% natriumazideoplossing uit in ammoniumacetaatbuffer en bewaart u deze bij 4 °C.
LET OP: Natriumazide is zeer giftig wanneer het oraal wordt ingenomen of door de huid wordt geabsorbeerd; het mag alleen onder de zuurkast worden gehanteerd. Zorg ervoor dat u een laboratoriumjas, veiligheidsbril en handschoenen (nitril bij voorkeur) draagt bij het werken met natriumazide.
7. CMAC-kolomkarakterisering
- Confocale microscopie en BDNF-binding
- Bereid IAM voor. Pcc. DD2 stationaire fasedeeltjes met geïmmobiliseerde celmembraanfragmenten die afzonderlijk zijn verkregen uit SH-SY5Y neuroblastoomcellen die TrkB- en SH-SY5Y TrkB-NULL-cellen overexpresseren door de instructies van stap 1 tot stap 6.4 te volgen.
- Voor monsters die voorafgaand aan antilichaamkleuring met BDNF worden geïncubeerd, bereidt u BDNF-stamoplossing door 10 μg BDNF op te lossen in 100 μL ultrapuur gedeïoniseerd water. Bewaar de oplossing bij -20 °C.
- Breng over in afzonderlijke microcentrifugebuizen van 1,5 ml, 100 μL aliquot IAM. PC. DD2-kolomverpakkingsmateriaal met geïmmobiliseerde SH-SY5Y Neuroblastoomcellen die TrkB en 100 μL aliquot IAM overexpressie geven. PC. Verpakkingsmateriaal van DD2-kolommen met geïmmobiliseerde SH-SY5Y TrkB-NULL-cellen gesuspendeerd in ammoniumacetaatbuffer.
- Voeg 390 μL ammoniumacetaatbuffer, 10 μL BDNF-stamoplossing en 0,5 μL ATP-stamoplossing (bereid in stap 3.2) toe aan elke buis en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met schommelen.
- Voor monsters die niet zullen worden geïncubeerd met BDNF voorafgaand aan antilichaamkleuring, draagt u 100 μL aliquot IAM over. PC. Verpakkingsmateriaal van de DD2-kolom met geïmmobiliseerde SH-SY5Y Neuroblastoomcellen die TrkB overexpressie geven, gesuspendeerd in ammoniumacetaat in microcentrifugebuizen van 1,5 ml.
- Voeg 400 μL ammoniumacetaatbuffer en 0,5 μL ATP-stamoplossing (bereid in stap 3.2) toe aan elke buis en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met schommelen.
- Draai de in de stappen 7.1.2 en 7.1.4 bereide monsters gedurende 1 min bij 10.000 x g bij 4 °C en gooi het supernatant weg.
- Was de resulterende pellets gedurende 10 minuten met 500 μL ammoniumacetaatbuffer en draai opnieuw bij 4 °C gedurende 1 min bij 10.000 x g en gooi het supernatant weg.
- Voeg aan elk van de pellets 220 μL ammoniumacetaatbuffer, 25 μL 10% normaal geitenserum en 5 μL primair anti-BDNF-antilichaam toe. Incubeer in een koude kamer (4 °C) een nacht met schommelen.
- Na voltooiing van de incubatiestap draait u het mengsel gedurende 1 minuut bij 10.000 x g bij 4 °C en gooit u het supernatant weg.
- Was de resulterende pellet 3 keer met ammoniumacetaatbuffer met 1% mild reinigingsmiddel (bijv. natrium cholaat) gedurende 10 minuten en draai de mengsels gedurende 1 min op 10.000 x g bij 4 °C en gooi het supernatant weg.
- Bereid secundaire antilichaamoplossing door 900 μL ammoniumacetaatbuffer, 100 μL 10% normaal geitenserum en 1 μL fluorofoor-geconjugeerd secundair antilichaam (1:1.000 verdunning) te mengen. Voeg 300 μL secundaire antilichaamoplossing toe aan elk van de in stap 7.1.9 verkregen pellets. en incubeer 's nachts bij 4 °C met schommelen.
- Spin het mengsel gedurende 1 min bij 4 °C op 10.000 x g en gooi het supernatant weg.
- Was de resulterende pellet 3 keer met ammoniumacetaatbuffer met 1% mild reinigingsmiddel (bijv. natrium cholaat) gedurende 10 minuten en draai het mengsel gedurende 1 min op 10.000 x g bij 4 °C en gooi het supernatant weg.
- Resuspend de resulterende pellets in 50 μL ammoniumacetaatbuffer. Plaats 20 μL van elk van de mengsels op een dia en dek af met een coverslip.
- Stel je de IAM voor. PC. DD2-deeltjes met de geïmmobiliseerde celmembraanfragmenten met behulp van een confocale laserscanmicroscoop met excitatie bij 488 nm en emissie bij 520 nm gegenereerd met behulp van een solid state lasersysteem. Gebruik een 20x objectief met een NA van 0,75 en WD van 0,35mm.
- Frontale affiniteitschromatografie met 7,8-DHF als markerligand
- Sluit een CMAC-kolom aan op een HPLC-systeem met een diode-array detector en/of massaspectrometer.
- Bereid 500 ml 1 mM-oplossing van 7,8-DHF in ammoniumacetaatbuffer met 5% methanol.
- Pomp de constante concentratie van het markerligand (1 mM) door de CMAC-kolom bij een debiet van 0,4 ml/min bij kamertemperatuur. Bewaak het elutieprofiel met behulp van een DIODE ARRAY DETECTION (DAD) (golflengte 254 nm) detector of massaspectrometer (gebruik single ion monitoring mode; m/z 253 in negatieve ionisatie modus).
- Na voltooiing van de run voert u 's nachts wassen uit door ammoniumacetaatbuffer door de kolom te laten lopen.
- Herhaal stap 7.2.2. - 7.2.4. met behulp van verschillende concentraties van het markerligand (750 nM, 500 nM, 300 nM), waarbij de kolommen na elke run een nacht worden gewassen. Gebruik frontale affiniteitschromatografie om ligand Kd te berekenen, zoals elders in detail besproken. 24,51
- Verplaatsingsstudies met Centella asiatica (L.) Urb. (gotu kola) extract
- Bereid 500 ml 500 nM-oplossing van 7,8-DHF in ammoniumacetaatbuffer met 5% methanol en 0,2% waterig gotu kola-extract (10 mg/ml).
- Pomp constante concentratie van het markerligand (500 nM) met het extract door de kolom bij 0,4 ml/min debiet bij kamertemperatuur. Bewaak het elutieprofiel met behulp van een DAD-detector (golflengte 254 nm) of een massaspectrometer (gebruik de bewakingsmodus met één ion; m/z 253 in negatieve ionisatiemodus).
- Na voltooiing van de run voert u 's nachts wassen uit door ammoniumacetaatbuffer door de kolom te laten lopen.
- Plot de elutieprofielen voor 500 nM 7,8-DHF en de profielen die worden verkregen na het uitvoeren van de oplossing met gotu kola-extract om te inspecteren op markerligandverplaatsing.
8. Ontbrekende piekchromatografiebenadering om potentiële TrkB-bindmiddelen van gotu kola-extract te identificeren
- Fractionering van gotu kola extract op CMAC kolommen
- Sluit de CMAC TrkB- en TrkB-NULL-kolommen afzonderlijk aan op een HPLC-systeem en injecteer 50 μL van het waterige gotu kola-extract (10 mg/ml) op elk van de kolommen. Pomp ammoniumacetaatbuffer (10 mM, pH 7,4) met 5% methanol door de kolom bij 0,4 ml/min debiet bij kamertemperatuur.
- Verzamel fracties afzonderlijk van CMAC TrkB en TrkB-NULL kolommen als volgt: 0-5 min, 5-10 min, 10-15 min, 15-20 min, 20-25 min, 25-30 min, 30-35 min, 35-40 min, 40-45 min, 45-50 min, 50-55 min, 55-60 min.
- Vries en lyofiliseer de verkregen fracties. Resuspend gelyofiliseerde fracties in 50 μL methanol voordat u overgaat tot ultra-performance vloeistofchromatografie en massaspectrometrie-analyse.
- Ultra-performance vloeistofchromatografie quadruole time-of-flight massaspectrometrie (UPLC-QTOF-MS) analyse van gotu kola CMAC fracties
- Analyseer alle in punt 8.1.3 verkregen fracties. met behulp van een massaspectrometer in combinatie met een UPLC-systeem (UPLC-MS E-analysemodus). Analyseer de fracties met behulp van een C18-kolom (2,1 x 50 mm, 1,7 μm) met een C18 VanGuard-voorkolom (2,1 mm x 5 mm, 1,7 μm).
- Eluteer de kolom met behulp van de volgende gradiëntoplossingen met een debiet van 0,3 ml/min met mobiele fase A (water met 0,1% mierenzuur) en B (acetonitril met 0,1% mierenzuur): 0,0 min 99% A 1% B, 1,5 min 84% A 16% B, 5,0 min 80% A 20% B, 7,0 min 75% A 25% B, 10,0 min 65% A 35% B, 20,0-24,0 min 1% A 99% B, 25,0-29,0 min 99% A 1% B.
- Stel het injectievolume voor elk monster in op 3 μL. Voer MSE uit in resolutiepositieve en negatieve ionenmodi, met botsingsenergie bij 4V voor lage energie en 20-35 V voor hoge energie.
- Gebruik de volgende ESI-broncondities in positieve ionisatiemodus: capillaire spanning 1,5 kV, bemonsteringskegel 40 V, bronverschuiving 80, brontemperatuur 100 °C, desolvatietemperatuur. 350 °C, kegelgasstroom 38,0 l/h, desolvatiegas 400 l/h.
- Gebruik de volgende ESI-broncondities in negatieve ionisatiemodus: capillaire spanning 1,45 kV, bemonsteringskegel 40 V, bronverschuiving 80, brontemperatuur 110 °C, desolvatietemperatuur. 300 °C, kegelgasstroom 50,0 l/h, desolvatiegasstroom 652 l/h.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Volgens het protocol werden twee CMAC-chromatografische kolommen samengesteld: één met de geïmmobiliseerde SH-SY5Y neuroblastoomcelmembraanfragmenten met overexpressie TrkB en één met SH-SY5Y TrkB-NULL celmembraanfragmenten. De correct geassembleerde CMAC-kolom is weergegeven in figuur 1 en de stappen die betrokken zijn bij immobilisatie van celmembraanfragmenten zijn weergegeven in figuur 2.
Sinds de immobilisatie van TrkB receptoren op IAM. PC. DD2 chromatografische stationaire fase was nog niet eerder geprobeerd, de succesvolle immobilisatie van de receptoren werd bevestigd door antilichaamkleuring en frontale affiniteitschromatografie met behulp van een markerligand: 7,8-DHF. Een schematische weergave van het antilichaamkleuringsexperiment is weergegeven in figuur 2. Celmembraanfragmenten verkregen uit neuroblastoom cellijn overexpressie TrkB receptoren en celmembraan fragmenten van ouderlijke cellijn zonder TrkB receptoren (TrkB-NULL)) werden geïmmobiliseerd op IAM. PC. DD2-deeltjes met behulp van het geoptimaliseerde protocol. Vervolgens werden de deeltjes met geïmmobiliseerde celmembraanfragmenten geïncubeerd met BDNF (fysiologisch ligand) en vervolgens met primaire en fluorescerend gelabelde secundaire antilichamen (figuur 2). Iam. PC. DD2-deeltjes met geïmmobiliseerde neuroblastoom TrkB-celmembraanfragmenten en in aanwezigheid van BDNF resulteerden in fluorescerend gelabelde deeltjes (figuur 3C). Er werd geen fluorescentie (behalve zwakke achtergrondfluorescentie) waargenomen wanneer TrkB-NULL-celmembraan ingekapselde IAM-deeltjes werden onderzocht (figuur 3A) of wanneer geen BDNF werd gebruikt in het geval van TrkB-celmembraan ingekapselde IAM-deeltjes (figuur 3B).
Om de binding van een klein markerligand (7,8-DHF) aan de geïmmobiliseerde TrkB-receptoren te karakteriseren, werd frontale affiniteitschromatografie uitgevoerd met verschillende concentraties van 7,8-DHF. Een typisch chromatogram van toenemende 7,8-DHF-concentraties op een functionele CMAC-kolom is weergegeven in figuur 4. De specifieke binding van 7,8-DHF aan de geïmmobiliseerde TrkB werd bevestigd door de concentratieafhankelijke afname van de retentietijd van het markerligand. Frontale affiniteitschromatografieresultaten verkregen op een niet-functionele CMAC-kolom zijn weergegeven in figuur 5. Het ontbreken van concentratieafhankelijke veranderingen in het vasthouden van het markerligand duidt op de mislukte poging in CMAC-voorbereiding.
Verbindingen die op de CMAC-kolom worden geïnjecteerd, interageren niet alleen specifiek, maar kunnen ook niet-specifiek interageren met IAM. PC. DD2-deeltjes, fosfolipide bilaag van de geïmmobiliseerde celmembraanfragmenten en andere eiwitten die aanwezig zijn in de dubbellaag. Om verbindingen uit te sluiten die niet-specifiek interageren met de CMAC-kolom tijdens het proces van screening van complexe extracten op TrkB-bindmiddelen, is het belangrijk om cmac-negatieve controlekolom voor te bereiden door celmembraanfragmenten van de ouderlijke cellijn te immobiliseren die het beoogde eiwit niet tot expressie brengen (in dit geval TrkB-NULL). Frontale affiniteitschromatografieresultaten verkregen op een negatieve CMAC TrkB-NULL kolom zijn weergegeven in figuur 6.
Functionele CMAC-kolommen kunnen voor verschillende doeleinden worden gebruikt, zoals karakterisering van het beoogde eiwit, het bestuderen van interacties van individuele verbindingen met de geïmmobiliseerde doelen (bijv. Het verkrijgen van dissociatieconstante, Kd) of het bepalen van bindingskitiek (kaan en kuit) enz.24. De kolommen kunnen ook worden gebruikt om complexe monsters, zoals plantenextracten, te screenen op de aanwezigheid van verbindingen die binden aan TrkB-receptoren, waardoor mogelijk moleculen worden bevat die fungeren als TrkB-agonisten of antagonisten. Om te controleren of een extract mogelijk verbindingen bevat die interageren met de geïmmobiliseerde receptoren, wordt een eenvoudig verplaatsingsexperiment uitgevoerd. Het resultaat van het competitie-experiment uitgevoerd met gotu kola-extract en 500 nM van 7,8-DHF op een functionele TrkB-kolom is weergegeven in figuur 7. De toevoeging van 0,2% waterig gotu kola-extract (10 mg/ml) resulteerde in een significante vermindering van 7,8-DHF-retentie, wat wijst op de aanwezigheid van concurrerende ligand(en) voor de agonistbindingsplaats. Het resultaat van het verplaatsingsexperiment dat is uitgevoerd op de CMAC-negatieve kolom TrkB-NULL is weergegeven in figuur 8. Het ontbreken van vermindering van 7,8-DHF-retentie op die kolom bevestigt verder het gebrek aan functionele TrkB-receptoren op de CMAC TrkB-NULL-kolom.
Om gespecialiseerde metabolieten te identificeren die specifiek interageren met de geïmmobiliseerde doelen, worden CMAC-kolommen gebruikt in een benadering die missing-peak chromatography52 wordt genoemd na het verplaatsingsexperiment. Bij deze benadering wordt een klein volume van het onderzochte extract parallel gechromatografeerd op de kolom met het onderzochte geïmmobiliseerde doelwit en de CMAC-negatieve controlekolom. Deze twee kolommen verschillen in de expressie van het doelwit, daarom zijn eventuele verschillen in de retentiepatronen van individuele moleculen te wijten aan de specifieke aard van interacties met de onderzochte doelen op de CMAC-kolom die deze TMP's bevat. Getimede fracties uit beide kolommen worden verzameld, geconcentreerd en vervolgens geanalyseerd op een C18-kolom. De verkregen chromatogrammen worden vergeleken en verbindingen die worden weergegeven door pieken die op dezelfde manier op beide kolommen worden vastgehouden, worden gelabeld als niet-specifiek interagerende moleculen. De aanwezigheid van een piek in latere fracties op de CMAC-kolom met de geïmmobiliseerde receptoren en het ontbreken van een piek die dezelfde verbinding vertegenwoordigt in vroege fracties van cmac-negatieve kolom vertegenwoordigt specifieke interactie van de verbinding met het geïmmobiliseerde doelwit. De verbindingen die in deze stap worden geïdentificeerd, kunnen worden gericht op isolatie en verdere tests, zonder dat biogeleide fractionering hoeft te worden uitgevoerd. De missing-peak chromatografiebenadering werd gebruikt om verbindingen te identificeren die specifiek interageren met TrkB-receptoren uit gotu kola-extract. Gotu kola-extract werd gefractioneerd op zowel TrkB- als TrkB-NULL-kolommen en verbindingen die in deze fracties aanwezig waren, werden geanalyseerd met behulp van UPLC-QTOF-MS. Onderzoek van de chromatogrammen van elk van de fracties leidde tot de identificatie van een verbinding die sterk werd vastgehouden op de TrkB-kolom (50-55 min fractie), terwijl vroeg werd geëlueerd op de TrkB-NULL-kolom (0-5 min fractie), wat wijst op specifieke interactie met de geïmmobiliseerde TrkB-receptoren (figuur 9). De verbinding eluting op ~ 17,48 min (figuur 9) is nu gericht op isolatie en testen in functionele assays.
Figuur 1. Correct geassembleerde CMAC-kolom. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. CMAC-voorbereidingsstappen en fluorescerende antilichaametikettering van de geïmmobiliseerde receptoren. Schematische weergave van de voorbereiding van een CMAC-kolom (1-4) en het antilichaametiketteringsexperiment (5-8). (1) Gehomogeniseerde celmembraanfragmenten die gericht transmembraaneiwit bevatten, TrkB. (2) Opgeloste celmembraanfragmenten in een micellaire structuur. (3) Celmembraanfragmenten geïmmobiliseerd op het oppervlak van de IAM-deeltjes. (4) IAM-deeltjes met geïmmobiliseerde celmembraanfragmenten verpakt in een glazen kolom. (5) Geïmmobiliseerde TrkB-receptor in de celmembraanfragmenten. (6) Binding van het natuurlijke ligand BDNF aan de functionele TrkB-receptor. (7) Binding van de primaire antilichamen aan BDNF-moleculen. (8) Binding van fluorofoor-gelabelde secundaire antilichamen aan de primaire antilichamen resulterend in groene fluorescentie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Immobilisatie van celmembraanfragmenten met TrkB-receptoren op IAM-deeltjes. Confocale microscopiebeelden tonen de immobilisatie van celmembraanfragmenten met functionele TrkB-receptoren op IAM-deeltjes. (A) Celmembraanfragmenten van SH-SY5Y TrkB-NULL-cellijn geïmmobiliseerd op IAM-deeltjes na incubatie met BDNF, primair antilichaam en fluorofoor-gelabeld secundair antilichaam. (B) Celmembraanfragmenten van SH-SY5Y Neuroblastoomcellijnen die TrkB tot expressie brengen, geïmmobiliseerd op IAM-deeltjes na incubatie met primair antilichaam en fluorofoor-gelabeld secundair antilichaam zonder BDNF. (C) Celmembraanfragmenten van SH-SY5Y neuroblastoomcellijnen die TrkB tot expressie brengen, geïmmobiliseerd op IAM-deeltjes na incubatie met BDNF, primair antilichaam en fluorofoor-gelabeld secundair antilichaam. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Frontale affiniteitschromogrammen van 7,8-DHF op de TrkB CMAC-kolom. Frontaal chromatogram van toenemende concentraties van 7,8-DHF op de TrkB CMAC-kolom, waarbij A - 1 mM, B - 750 nM, C - 500 nM en D - 300 nM. Ammoniumacetaatbuffer (10 mM, pH 7,4) met 5% methanol werd gebruikt als eluent bij een debiet van 0,4 ml/min. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5. Frontale affiniteitschromogrammen van 7,8-DHF op niet-functionele TrkB CMAC-kolom. Frontaal chromatogram van verschillende concentraties van 7,8-DHF op de niet-functionele TrkB CMAC-kolom, waarbij A -1 μM, B - 1 μM, C - 750 nM en D - 500 nM. Ammoniumacetaatbuffer (10 mM, pH 7,4) met 5% methanol werd gebruikt als eluent bij een debiet van 0,4 ml/min. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6. Frontale affiniteitschromatogrammen van 7,8-DHF op de TrkB-NULL CMAC-kolom. Frontaal chromatogram van toenemende concentraties van 7,8-DHF op de TrkB-NULL CMAC-kolom, waarbij A - 1 mM, B - 750 nM, C - 500 nM en D - 300 nM. Ammoniumacetaatbuffer (10 mM, pH 7,4) met 5 % methanol werd gebruikt als eluent bij een debiet van 0,4 ml/min. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 7. Frontale affiniteitschromatogrammen van 7,8-DHF met 0,2% gotu kola-extract op de TrkB CMAC-kolom. Representatief frontaal elutieprofiel van (A) 500 nM 7,8-DHF + 0,2% gotu kola extract (10 mg/ml) en (B) 500 nM 7,8-DHF op de CMAC TrkB kolom. Ammoniumacetaatbuffer (10 mM, pH 7,4) met 5% methanol werd gebruikt als eluent bij een debiet van 0,4 ml/min. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 8. Frontale affiniteitschromogrammen van 7,8-DHF met 0,2% gotu kola extract op de TrkB-NULL CMAC kolom. Representatief frontaal elutieprofiel van (A) 500 nM 7,8-DHF en (B) 500 nM 7,8-DHF + 0,2% gotu kola extract (10 mg/ml) op de TrkB-NULL CMAC kolom. Ammoniumacetaatbuffer (10 mM, pH 7,4) met 5% methanol werd gebruikt als eluent bij een debiet van 0,4 ml/min. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 9. UPLC-MS chromatogrammen van gotu kola extract fracties. UPLC-MS chromatogrammen van gotu kola extract fracties (A) geëlueerd tussen 0-5 min van TrkB-NULL CMAC kolom en (C) geëlueerd tussen 50-55 min van CMAC TrkB kolom. Een verbinding met een retentietijd van 17,48 min aanwezig in beide fracties, zoals bevestigd door overeenkomende massaspectra (B en D) werd geïdentificeerd als een potentieel TrkB-bindmiddel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Homogenisatiebuffer | ||||
| 1 | Tris(hydroxymethyl)aminomethaanhydrochloride (Tris-HCl) | 50 meter | ||
| 2 | Natriumchloride (NaCl) | 100m | ||
| 3 | Watervrij calciumchloride (CaCl2) | 3 meter | ||
| 4 | Magnesiumchloride hexahydraat (MgCl2) | 2 meter | ||
| 5 | Kaliumchloride (KCl) | 5 meter | ||
| 6 | Fenylmethaansulfonylfluoride (PMSF) | 0,1 mM | ||
| 7 | Benzamidine | 3 meter | ||
| 8 | Proteaseremmer cocktail (100X) | (1/100) | ||
| 9 | Glycerol | 10% | ||
| 10 | Adenosine 5'-trifosfaat (ATP) dinatriumzouthydraat | 100 μM | ||
| 11 | Ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) | 5mm | ||
Tabel 1. Homogenisatiebuffersamenstelling.
| Oplosbaarheidsbuffer | ||||
| 1 | Tris(hydroxymethyl)aminomethaanhydrochloride (Tris-HCl) | 50 meter | ||
| 2 | Natriumchloride (NaCl) | 100m | ||
| 3 | Watervrij calciumchloride (CaCl2) | 3 meter | ||
| 4 | Magnesiumchloride hexahydraat (MgCl2) | 2 meter | ||
| 5 | Kaliumchloride (KCl) | 5 meter | ||
| 6 | Fenylmethaansulfonylfluoride (PMSF) | 0,1 mM | ||
| 7 | Benzamidine | 3 meter | ||
| 8 | Proteaseremmer cocktail (100X) | (1/100) | ||
| 9 | Glycerol | 10% | ||
| 10 | Adenosine 5'-trifosfaat (ATP) dinatriumzouthydraat | 100 μM | ||
| 11 | Natrium cholaat | 2% | ||
Tabel 2. Samenstelling van de oplosbuffer.
| Dialyse buffer | ||||
| 1 | Tris(hydroxymethyl)aminomethaanhydrochloride (Tris-HCl) | 50 meter | ||
| 2 | Natriumchloride (NaCl) | 100m | ||
| 3 | Watervrij calciumchloride (CaCl2) | 0,1 mM | ||
| 4 | Ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) | 5 meter | ||
| 5 | Fenylmethaansulfonylfluoride (PMSF) | 0,1 mM | ||
Tabel 3. Dialysebuffersamenstelling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Identificatie van actieve verbindingen die aanwezig zijn in complexe mengsels van gespecialiseerde metabolieten is een zeer uitdagende taak23. Traditioneel worden individuele verbindingen geïsoleerd en wordt hun activiteit getest in verschillende testen. Deze aanpak is tijdrovend en kostbaar en leidt vaak tot isolatie en identificatie van de meest voorkomende en goed gekarakteriseerde verbindingen23. De momenteel gebruikte high-throughput screeningstests zijn sterk afhankelijk van het screenen van combinatorische chemiebibliotheken met reeds bekende doelwitten en zijn niet ontworpen om biologisch actieve verbindingen in complexe mengsels te identificeren en te isoleren53.
CMAC maakt de identificatie mogelijk van verbindingen die gericht zijn op TMP's 23,24,54. Bij deze techniek worden celmembraanfragmenten met TMP's geïmmobiliseerd op het oppervlak van IAM stationaire fasedeeltjes23,24. CMAC is een unieke aanpak die de immobilisatie van celmembraanfragmenten met gerichte eiwitten op de vaste ondersteuning mogelijk maakt die celmembraanfosfolipide dubbellaag24 imiteert. Dit maakt het mogelijk om de functionaliteit van geïmmobiliseerde eiwitdoelen te behouden en biedt dicht bij fysiologische omstandigheden tijdens het gebruik van CMAC om kleine moleculen te identificeren die interageren met TMP's. CMAC biedt het voordeel van mogelijkheden voor de ontdekking van nieuwe chemische steigers uit unieke bibliotheken met natuurlijke producten, die niet kunnen worden getest met behulp van een van de momenteel gebruikte testen23 . De voorgestelde aanpak maakt het mogelijk om verbindingen te identificeren die interageren met TMP's zonder de aard van deze interactie te ontrafelen. De wijze van interactie (allosterische of orthosterische interactie; remming of activering) moet worden geverifieerd met behulp van functionele celgebaseerde assays. CMAC met de geïmmobiliseerde eiwitdoelen kan ook worden gebruikt bij de karakterisering van de farmacodynamiek (bijv. dissociatieconstante, Kd) of bij het bepalen van de bindingskinetiek (kaan en kuit) van liganden met kleine moleculen die interageren met het doelwit, evenals bij het karakteriseren van de bindingsplaatsen op het geïmmobiliseerde eiwit24 . Hoewel CMAC alleen identificatie van verbindingen toestaat die binden aan TMP's, is het een innovatieve aanpak die de eerste stap in de pijplijn voor het ontdekken van geneesmiddelen aanzienlijk versnelt, omdat het geen synthesezuivering vereist, wat momenteel het belangrijkste knelpunt is in het ontdekkingsproces van geneesmiddelen van natuurlijke mengsels.
Hoewel het gepresenteerde protocol zich richt op de immobilisatie van één transmembraanreceptor (TrkB), kan CMAC-technologie worden gebruikt bij de voorbereiding van kolommen met andere doelen. Een van de cruciale aspecten van CMAC-voorbereiding is de keuze van cellijn of weefsel dat wordt gebruikt om celmembraanfragmenten te isoleren. Als kolommen worden gebruikt bij de screening van complexe mengsels op verbindingen die interageren met de geïmmobiliseerde receptoren, wordt geadviseerd om cellijnen te gebruiken die het beoogde eiwit overexpressie geven. Het gebruik van een dergelijke cellijn zal resulteren in een hoger aantal geïmmobiliseerde doelen en de kans vergroten op identificatie van verbindingen met een lagere affiniteit voor het doelwit of minder overvloedige moleculen. Als men zich richt op de karakterisering van het geïmmobiliseerde eiwit, wordt het gebruik van een inheemse cellijn aanbevolen, omdat posttranslationele modificaties die het eiwit ondergaat, evenals de fosfolipideomgeving aanzienlijk kunnen verschillen in de getransfecteerde cellijn.
Sommige aspecten van celmembraanisolatie en immobilisatie op IAM-deeltjes zijn van cruciaal belang en kunnen wijzigingen vereisen, afhankelijk van het receptortype of de bron van het eiwit. Om proteolytische splitsing van de geïmmobiliseerde eiwitten te voorkomen, is het essentieel om de juiste proteaseremmers te gebruiken in de homogenisatie- en oplosbuffers. Een literatuuronderzoek wordt aanbevolen om de vereiste proteaseremmers te identificeren. In het proces van protocoloptimalisatie hebben we vastgesteld dat de toevoeging van ATP en glycerol het aantal bindingsplaatsen (Bmax) op CMAC-kolommen verhoogt bij het immobiliseren van TrkB. Andere cofactoren kunnen nodig zijn bij het optimaliseren van de immobilisatie van andere soorten transmembraandoelen24. Momenteel onderzoeken we de toevoeging van cholesterol in het proces van TrkB-immobilisatie, omdat onlangs cholesterol de effecten van TrkB-liganden48 bleek te wijzigen. Eerder werd gemeld dat de toevoeging van cholesterol en/of andere lipiden nodig kan zijn voor het verkrijgen van functionele CMAC-kolommen24.
Verschillende soorten detectoren kunnen worden gebruikt om het kolomelek te bewaken, waaronder diode-arraydetector voor liganden met chromoforen, massaspectrometrie of radiostroomdetector voor radioactieve liganden.
Het bewaken van de stabiliteit van CMAC-kolommen is van cruciaal belang. CMAC-kolommen kunnen tot enkele maanden stabiel zijn, afhankelijk van het type geïmmobiliseerd eiwit, de gebruiksfrequentie en de opslagomstandigheden. Het wordt aanbevolen de kolom in 0,05% natriumazideoplossing in ammoniumacetaatbuffer bij 4 °C te bewaren als de kolom langer dan een week ongebruikt blijft. Het is belangrijk om de kolom na langere perioden grondig te wassen met ammoniumacetaatbuffer voordat u deze probeert te gebruiken. Het wordt geadviseerd om de functionaliteit van de kolom te controleren door wekelijks een geselecteerde concentratie van een markerligand te injecteren.
Ondanks tal van voordelen heeft CMAC-technologie verschillende beperkingen waarmee rekening moet worden gehouden bij het gebruik van de kolommen bij het ontdekken van geneesmiddelen. Ten eerste neemt het aantal geïmmobiliseerde transmembraandoelen met de tijd af en daarom wordt aanbevolen dat het totale aantal bindingsplaatsen wekelijks wordt gemonitord24. Een van de redenen voor deze daling is het gevolg van het immobilisatieproces dat gebaseerd is op adsorptie en geen covalente bindingen met zich meebrengt. Lipofiele verbindingen kunnen sterk worden vastgehouden op CMAC-kolommen vanwege de significante niet-specifieke binding aan het IAM-oppervlak en fosfolipide bilagen. Dit verhoogt de analysetijd aanzienlijk, waardoor de doorvoer afneemt. Het proces van CMAC-kolomvoorbereiding is cellijnspecifiek en vereist een grondig begrip van de aard van geïmmobiliseerde eiwitten, waardoor het minder geschikt is voor minder gekarakteriseerde doelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Lukasz Ciesla werkt samen met Regis Technologies, de leverancier van de IAM. PC. DD2 deeltjes.
Acknowledgments
Z.C.A. werd ondersteund door de Scientific and Technological Research Council of Turkey (TUBITAK) 2219 - International Postdoctoral Research Fellowship Program. Onderzoek gerapporteerd in deze publicatie werd ondersteund door het National Center for Complimentary and Integrative Medicine van de National Institutes of Health onder toekenningsnummer 1R41AT011716-01. Dit werk werd ook gedeeltelijk ondersteund door de American Society of Pharmacognosy Research Starter Grant, Regis Technologies-subsidie aan L.C. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 7-8 Dihydroxyflavone hydrate | Sigma-Aldrich | D5446-10 mg | ≥98% (HPLC) |
| Adenosine 5'-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A2383-1 g | |
| Ammonium acetate | VWR Chemicals BDH | BDH9204-500 g | |
| BDNF antibody | Invitrogen | PA5-15198-400 μL | Primary antibody; 2 mg/mL of concentration |
| Benzamidine hydrochloride hydrate | Sigma-Aldrich | B6506-25 g | |
| Brain derived neurotrophic factor (BDNF) human | Sigma-Aldrich | B3795-10 μg | Recombinant, expressed in E. coli, lyophilized powder, suitable for cell culture |
| Calcium chloride | VWR Analytical | BDH9224-1 kg | |
| Cholic acid sodium salt | Alfa Aesar | J62050-100 g | |
| Dounce homogenizer | VWR | 71000-516 | 40 mL, 285 mm (overall lenght), 32 x 140 mm (O.D. x H) |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 493511 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | VWR Analytical | BDH-9232-500 g | |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F2442-500 mL | sterile-filtered, suitable for cell culture |
| G418 disulfate salt solution | Sigma-Aldrich | G8168-100 mL | 50 mg/mL in H2O, 0.1 μm filtered, suitable for cell culture |
| Glycerol | VWR Life Science | E520-100 mL | |
| Immobilized artificial membrane (IAM.PC.DD2) | Regis Technologies, Inc. | 1-771050-500 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | VWR Analytical | BDH9244-500 mL | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 322425 | |
| Nikon C2 DUVb | Nikon | Confocal laser scanning microscope | |
| Normal goat serum (10%) | Life Technologies | 50197Z | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333-100 mL | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Thermo Scientific | 36978-5 g | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | VWR Life Science | K812-500 mL | 1x |
| Potassium chloride | VWR Chemicals BDH | 0395-1 kg | |
| Protease inhibitor cocktail | VWR Life Science Ambreso | M221-1 mL | Proteomics grade, containing 50 mM AEBSF, 30 µM aprotonin, 1 mM bestatin, 1 mM E-64 and 1 mM leupeptin |
| RPMI-1640 medium | Sigma-Aldrich | R8758-500 mL | with L-glutamine and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture |
| Secondary antibody goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen Alexa Flour Plus 488 | A32731 | |
| SH-SY5Y Neuroblastoma cell lines expressing Trk-B | Kerafast | ECP007 | |
| SH-SY5Y Trk-NULL cell line | Kerafast | ECP005 | |
| Snake skin dialysis tubing | Thermo Scientific | 88245 | 10K MWCO, 35 mm dry I.D. |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Sodium chloride | BDH VWR Analytical | BDH9286-2.5 kg | |
| Tricorn 5/20 column | GE Healthcare | 24-4064-08 | |
| Tris-HCl | VWR Life Science | 0497-1 kg | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T4049-500 mL | 0.25%, sterile-filtered, suitable for cell culture, 2.5 g porcine trypsin and 0.2 g EDTA |
References
- Thomford, N. E., et al. Natural Products for Drug Discovery in the 21st Century: Innovations for Novel Drug Discovery. International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1578 (2018).
- Atanasov, A. G., Zotchev, S. B., Dirsch, V. M. International Natural Product Sciences Taskforce, Supuran, C.T. Natural products in drug discovery: advances and opportunities. Nature Reviews. Drug Discovery. 20 (3), 200-216 (2021).
- Altmann, K. H. Drugs from the Oceans: Marine Natural Products as Leads for Drug Discovery. Chimia. 71 (10), 646-652 (2017).
- Bernardini, S., Tiezzi, A., Laghezza Masci, V., Ovidi, E. Natural products for human health: an historical overview of the drug discovery approaches. Natural Product Research. 32 (16), 1926-1950 (2018).
- DeCorte, B. L. Underexplored Opportunities for Natural Products in Drug Discovery. Journal of Medicinal Chemistry. 59 (20), 9295-9304 (2016).
- Lee, J., Jo, D. G., Park, D., Chung, H. Y., Mattson, M. P. Adaptive cellular stress pathways as therapeutic targets of dietary phytochemicals: focus on the nervous system. Pharmacological Reviews. 66 (3), 815-868 (2014).
- Hornykiewicz, O. L-DOPA: from a biologically inactive amino acid to a successful therapeutic agent. Amino Acids. 23 (1-3), 65-70 (2002).
- Hoyer, D. Targeting the 5-HT system: Potential side effects. Neuropharmacology. 179, 108233 (2020).
- Nur, S., Adams, C. E. Chlorpromazine versus reserpine for schizophrenia. The Cochrane Database of Systematic Reviews. 4, (2016).
- Chung, H. Y., et al. Redefining Chronic Inflammation in Aging and Age-Related Diseases: Proposal of the Senoinflammation Concept. Aging and Disease. 10 (2), 367-382 (2019).
- Fitzgerald, K. N., et al. Potential reversal of epigenetic age using a diet and lifestyle intervention: a pilot randomized clinical trial. Aging. 13 (7), 9419-9432 (2021).
- Zhao, L., Lee, J. Y., Hwang, D. H. Inhibition of pattern recognition receptor-mediated inflammation by bioactive phytochemicals. Nutrition Reviews. 69 (6), 310-320 (2011).
- Corbi, G., et al. Dietary Phytochemicals in Neuroimmunoaging: A New Therapeutic Possibility for Humans? Frontiers in Pharmacology. 7, 364 (2016).
- Davinelli, S., et al. Dietary phytochemicals and neuro-inflammaging: from mechanistic insights to translational challenges. Immunity & Ageing: I & A. 13, 16 (2016).
- Ostan, R., et al. Inflammaging and cancer: a challenge for the Mediterranean diet. Nutrients. 7 (4), 2589-2621 (2015).
- Martucci, M., et al. Mediterranean diet and inflammaging within the hormesis paradigm. Nutrition Reviews. 75 (6), 442-455 (2017).
- Szarcvel Szic, K., Declerck, K., Vidakovic, M., Vanden Berghe, W. From inflammaging to healthy aging by dietary lifestyle choices: is epigenetics the key to personalized nutrition. Clinical Epigenetics. 7 (1), 33 (2015).
- Dean, E., Gormsen Hansen, R. Prescribing optimal nutrition and physical activity as "first-line" interventions for best practice management of chronic low-grade inflammation associated with osteoarthritis: evidence synthesis. Arthritis. , 560634 (2012).
- Ruiz-Núñez, B., Pruimboom, L., Dijck-Brouwer, D. A., Muskiet, F. A. Lifestyle and nutritional imbalances associated with Western diseases: causes and consequences of chronic systemic low-grade inflammation in an evolutionary context. TheJournal of Nutritional Biochemistry. 24 (7), 1183-1201 (2013).
- Agarwal, P., et al. MIND Diet Associated with Reduced Incidence and Delayed Progression of Parkinsonism in Old Age. The Journal of Nutrition, Health & Aging. 22 (10), 1211-1215 (2018).
- Morris, M. C., et al. MIND diet associated with reduced incidence of Alzheimer's Disease. Alzheimer's & Dementia: The Journal of the Alzheimer's Association. 11 (9), 1007-1014 (2015).
- Franceschi, C., Garagnani, P., Parini, P., Giuliani, C., Santoro, A. Inflammaging: a new immune-metabolic viewpoint for age-related diseases. Nature Reviews. Endocrinology. 14 (10), 576-590 (2018).
- Ciesla, L., Moaddel, R. Comparison of analytical techniques for the identification of bioactive compounds from natural products. Natural Product Reports. 33 (10), 1131-1145 (2016).
- Moaddel, R., Wainer, I. W. The preparation and development of cellular membrane affinity chromatography columns. Nature Protocols. 4 (2), 197-205 (2009).
- Ferrer, I., et al. BDNF and full-length and truncated TrkB expression in Alzheimer disease. Implications in therapeutic strategies. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 58 (7), 729-739 (1999).
- Numakawa, T., Odaka, H., Adachi, N. Actions of Brain-Derived Neurotrophin Factor in the Neurogenesis and Neuronal Function, and Its Involvement in the Pathophysiology of Brain Diseases. International Journal of Molecular Sciences. 19 (11), 3650 (2018).
- Lima Giacobbo, B., et al. Brain-Derived Neurotrophic Factor in Brain Disorders: Focus on Neuroinflammation. Molecular Neurobiology. 56 (5), 3295-3312 (2019).
- Wang, Z. H., et al. Deficiency in BDNF/TrkB Neurotrophic Activity Stimulates δ-Secretase by Upregulating C/EBPβ in Alzheimer's Disease. Cell Reports. 28 (3), 655-669 (2019).
- Devi, L., Ohno, M. TrkB Reduction Exacerbates Alzheimer's Disease-like Signaling Aberrations and Memory Deficits without Affecting beta-Amyloidosis in 5XFAD Mice. Translational Psychiatry. 5 (5), 562 (2015).
- Jiao, S. S., et al. Brain-derived Neurotrophic Factor Protects against Tau-related Neurodegeneration of Alzheimer's Disease. Translational Psychiatry. 6 (10), 907 (2016).
- Ng, T., Ho, C., Tam, W., Kua, E., Ho, R. C. Decreased Serum Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) Levels in Patients with Alzheimer's Disease (AD): A Systematic Review and Meta-Analysis. International Journal of Molecular Sciences. 20 (2), 257 (2019).
- Amidfar, M., de Oliveira, J., Kucharska, E., Budni, J., Kim, Y. K. The Role of CREB and BDNF in Neurobiology and Treatment of Alzheimer's Disease. Life Sciences. 257, 118020 (2020).
- Atasoy, I. L., et al. Both Secreted and the Cellular Levels of BDNF Attenuated due to Tau Hyperphosphorylation in Primary Cultures of Cortical Neurons. Journal of Chemical Neuroanatomy. 80, 19-26 (2017).
- Rosa, E., et al. Tau Downregulates BDNF Expression in Animal and Cellular Models of Alzheimer's Disease. Neurobiology of Aging. 48, 135-142 (2016).
- Xiang, J., et al. Delta-secretase-cleaved Tau Antagonizes TrkB Neurotrophic Signalings, Mediating Alzheimer's Disease Pathologies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (18), 9094-9102 (2019).
- Giuffrida, M. L., Copani, A., Rizzarelli, E. A Promising Connection between BDNF and Alzheimer's Disease. Aging. 10 (8), 1791-1792 (2018).
- Ando, S., et al. Animal Model of Dementia Induced by Entorhinal Synaptic Damage and Partial Restoration of Cognitive Deficits by BDNF and Carnitine. Journal of Neuroscience Research. 70 (3), 519-527 (2002).
- Fischer, D. L., Sortwell, C. E. BDNF Provides Many Routes Toward STN DBS-Mediated Disease Modification. Movement Disorders. Official Journal of the Movement Disorder Society. 34 (1), 22-34 (2019).
- Zhang, F., Kang, Z., Li, W., Xiao, Z., Zhou, X. Roles of Brain-derived Neurotrophic Factor/Tropomyosin-related Kinase B (BDNF/TrkB) Signalling in Alzheimer's Disease. Journal of Clinical Neuroscience: Official Journal of the Neurological Society of Australasia. 19 (7), 946-949 (2012).
- Pilakka-Kanthikeel, S., Atluri, V. S., Sagar, V., Saxena, S. K., Nair, M. Targeted Brain Derived Neurotropic Factors (BDNF) Delivery across the Blood-Brain Barrier for Neuro-protection using Magnetic Nano Carriers: An In-vitro Study. PLoS One. 8 (4), 62241 (2013).
- Jang, S. W., et al. A Selective TrkB Agonist with Potent Neurotrophic Activities by 7,8-Dihydroxyflavone. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (6), 2687-2692 (2010).
- Todd, D., et al. A Monoclonal Antibody TrkB Receptor Agonist as a Potential Therapeutic for Huntington's Disease. Plos One. 9 (2), 87923 (2014).
- Liu, X., et al. Optimization of a Small Tropomyosin-Related Kinase B (TrkB) Agonist 7,8-Dihydroxyflavone Active in Mouse Models of Depression. Journal of Medicinal Chemistry. 55 (19), 8524-8537 (2012).
- Liu, X., et al. Biochemical and Biophysical Investigation of the Brain-derived Neurotrophic Factor Mimetic 7,8-Dihydroxyflavone in the Binding and Activation of the TrkB Receptor. The Journal of Biological Chemistry. 289 (40), 27571-27584 (2014).
- Chen, L., Gao, X., Zhao, S., Hu, W., Chen, J. The Small-Molecule TrkB Agonist 7,8-Dihydroxyflavone Decreases Hippocampal Newborn Neuron Death After Traumatic Brain Injury. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 74 (6), 557-567 (2015).
- Liu, X., et al. Optimization of a Small Tropomyosin-related Kinase B (TrkB) Agonist 7,8-Dihydroxyflavone Active in Mouse Models of Depression. Journal of Medicinal Chemistry. 55 (19), 8524-8537 (2012).
- Zhang, Z., et al. 7,8-Dihydroxyflavone Prevents Synaptic Loss and Memory Deficits in a Mouse Model of Alzheimer's Disease. Neuropsychopharmacology: Official Publication of the American College of Neuropsychopharmacology. 39 (3), 638-650 (2014).
- Casarotto, P. C., et al. Antidepressant Drugs Act by Directly Binding to TRKB Neurotrophin Receptors. Cell. 184 (5), 1299-1313 (2021).
- Iyer, R., et al. Entrectinib is a potent inhibitor of Trk-driven neuroblastomas in a xenograft mouse model. Cancer letters. 372 (2), 179-186 (2016).
- Iyer, R., et al. Nanoparticle delivery of an SN38 conjugate is more effective than irinotecan in a mouse model of neuroblastoma. Cancer letters. 360 (2), 205-212 (2015).
- Ng, E. S., Chan, N. W., Lewis, D. F., Hindsgaul, O., Schriemer, D. C.
- Maciuk, A., Moaddel, R., Haginaka, J., Wainer, I. W. Screening of Tobacco Smoke Condensate for Nicotinic Acetylcholine Receptor Ligands using Cellular Membrane Affinity Chromatography Columns and Missing Peak Chromatography. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 48 (2), 238-246 (2008).
- Harvey, A. L., Edrada-Ebel, R., Quinn, R. J. The Re-emergence of Natural Products for Drug Discovery in the Genomics Era. Nature Reviews. Drug Discovery. 14 (2), 111-129 (2015).
- Ciesla, L., et al. Development and Characterization of the α3β4α5 Nicotinic Receptor Cellular Membrane Affinity Chromatography Column and Its Application for on line Screening of Plant Extracts. Journal of Chromatography A. 1431, 138-144 (2016).
