Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Колонки клеточной мембранной аффинности хроматографии для идентификации специализированных растительных метаболитов, взаимодействующих с иммобилизованным рецептором тропомиозинкиназы B

Published: January 19, 2022 doi: 10.3791/63118
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1
1Department of Biological Sciences, The University of Alabama, 2Department of Pharmaceutical Botany, Faculty of Pharmacy, Hacettepe University

Summary

Протокол описывает получение колонок клеточной мембранно-аффинной хроматографии (CMAC) с иммобилизованными фрагментами клеточной мембраны, содержащими функциональные трансмембранные тропомиозинкиназные рецепторы В-белки. Также объясняется использование колонок CMAC для идентификации специализированных растительных метаболитов, взаимодействующих с этими рецепторами и присутствующих в сложных природных смесях.

Abstract

Химические вещества, синтезируемые растениями, грибами, бактериями и морскими беспозвоночными, были богатым источником новых лекарственных средств и свинец. Лекарства, такие как статины, пенициллин, паклитаксел, рапамицин или артемизинин, обычно используемые в медицинской практике, были впервые идентифицированы и выделены из натуральных продуктов. Однако идентификация и выделение биологически активных специализированных метаболитов из природных источников является сложным и трудоемким процессом. Традиционно отдельные метаболиты выделяют и очищают от сложных смесей после экстракции биомассы. Впоследствии выделенные молекулы тестируются в функциональных анализах для проверки их биологической активности. Здесь мы представляем использование колонок клеточной мембранной аффинной хроматографии (CMAC) для идентификации биологически активных соединений непосредственно из сложных смесей. Колонки CMAC позволяют идентифицировать соединения, взаимодействующие с иммобилизованными функциональными трансмембранными белками (TMP), встроенными в их нативную фосфолипидную двухслойную среду. Это целенаправленный подход, который требует знания TMP, активность которого предполагается модулировать с недавно идентифицированным кандидатом на низкомолекулярное лекарство. В этом протоколе мы представляем подход к подготовке колонок CMAC с иммобилизованным тропомиозинкиназным рецептором B (TrkB), который стал жизнеспособной мишенью для открытия лекарств для многочисленных расстройств нервной системы. В этой статье мы предоставляем подробный протокол для сборки колонки CMAC с иммобилизованными рецепторами TrkB с использованием клеточных линий нейробластомы, чрезмерно экспрессирующих рецепторы TrkB. Далее представлен подход к исследованию функциональности колонки и ее использование при идентификации специализированных растительных метаболитов, взаимодействующих с рецепторами TrkB.

Introduction

Ботанические смеси богаты фармакологически активными соединениями1, служащими хорошим источником для идентификации новых лекарственных хитов и свинец 2,3,4,5. Открытие новых лекарств из натуральных продуктов было плодотворным подходом, и многие одобренные в настоящее время лекарства произошли из соединений, впервые идентифицированных в природе. Химическое разнообразие природных соединений трудно сопоставить с искусственными библиотеками химически синтезированных молекул. Многие природные соединения взаимодействуют и модулируют мишени человеческого белка и могут считаться эволюционно оптимизированными лекарственными молекулами6. Эти природные соединения особенно хорошо подходят для идентификации лекарственного свинца для использования при неврологических расстройствах6. Два из одобренных в настоящее время FDA препаратов для лечения болезни Альцгеймера (БА) получены из природных алкалоидов, а именно: галантамин и ривастигмин (производное физостигмина)6. L-DOPA, в настоящее время наиболее часто назначаемый препарат при болезни Паркинсона, был впервые идентифицирован из широкой фасоли (Vicia faba L.) 7. Перголид и лизурид, агонисты дофаминергических рецепторов являются производными природных алкалоидов спорыньи из паразитического гриба Claviceps purpurea8. Резерпин, алкалоид, выделенный из индийского змеиного корня (Rauvolfia serpentina (L.) Benth. ex Kurz), был одним из первых антипсихотических препаратов9. В последнее время дисрегулируемый иммунный ответ и системное воспаление были связаны с развитием многочисленных неврологических заболеваний, таких как большое депрессивное расстройство или нейродегенеративные заболевания10. Было обнаружено, что растительная диета вместе с другими вмешательствами в образ жизни улучшает когнитивные и функциональные способности у пожилых людей 11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 . Было обнаружено, что некоторые электрофильные молекулы, принадлежащие тритерпенам и полифенолам, модулируют воспалительные реакции как в моделях in vitro, так и in vivo 12. Например, природные соединения, содержащие α β-ненасыщенного карбона (например, куркумин, циннамальдегид) или изотиоцианатную группу (например, сульфорафан), препятствуют димеризации Toll-подобного рецептора-4 (TLR4), ингибируя последующий синтез провоспалительных цитокинов в мышиной интерлейкин-3-зависимой про-В клеточной линии12,22 . Эпидемиологические данные убедительно указывают на то, что диетические фитохимические вещества, присутствующие в сложных пищевых матрицах, также могут представлять собой жизнеспособный источник новых лекарственных проводов6.

Одним из основных препятствий в идентификации биологически активных молекул, присутствующих в растительных экстрактах, включая растительную пищу, является сложность исследуемых образцов. Традиционно отдельные соединения выделяют, очищают и впоследствии проверяют на биологическую активность. Такой подход обычно приводит к выявлению наиболее распространенных и хорошо охарактеризованных соединений. Подходы к открытию фенотипических лекарств без определенной молекулярной мишени основаны на био-управляемом фракционировании сложных смесей23. При таком подходе экстракт фракционируется на менее сложные субфракции, которые впоследствии тестируются в фенотипических анализах. Выделение и очистка активных соединений определяются биологической активностью, проверенной в анализе. Знание идентичности указанной лекарственной мишени может значительно ускорить идентификацию фармакологически активных соединений, присутствующих в сложных смесях. Эти подходы обычно основаны на иммобилизации молекулярной мишени, например, фермента, на твердой поверхности, такой как магнитные шарики23. Иммобилизованные мишени впоследствии используются в скрининговых экспериментах, что приводит к выделению соединений, взаимодействующих с мишенью. Хотя этот подход широко использовался при идентификации соединений, нацеленных на цитозольные белки, он реже применялся при идентификации химических веществ, взаимодействующих с трансмембранными белками (TMP)23. Дополнительная проблема в иммобилизации TMP связана с тем, что активность белка зависит от его взаимодействия с фосфолипидами клеточной мембраны и другими молекулами в бислое, такими как холестерин23,24. Важно сохранить эти тонкие взаимодействия между белками и их нативной фосфолипидной двухслойной средой при попытке обездвижить трансмембранную мишень.

При сродстве клеточной мембраны (CMAC) фрагменты клеточной мембраны, а не очищенные белки, иммобилизуются на искусственной мембране (IAM) частиц стационарной фазы23. Стационарные фазы IAM получают путем ковалентного связывания аналогов фосфатидилхолина с кремнеземом. В последнее время были разработаны новые классы стационарных фаз IAM, в которых свободные аминные и силаноловые группы являются концевыми (IAM. ПК. Частицы DD2). При подготовке колонок CMAC фрагменты клеточной мембраны иммобилизуются на поверхность частиц IAM путем адсорбции.

Колонки CMAC до настоящего времени использовались для иммобилизации различных классов TMP, включая ионные каналы (например, никотиновые рецепторы), GPCR (например, опиоидные рецепторы), переносчики белка (например, p-гликопротеин) и т.д.24. Иммобилизованные белковые мишени были использованы для характеристики фармакодинамики (например, константа диссоциации, Kd) или определения кинетики связывания (kon и koff) лигандов малых молекул, взаимодействующих с мишенью, а также в процессе идентификации потенциальных новых лекарственных проводов, присутствующих в комплексных матрицах24 . Здесь мы представляем подготовку колонок CMAC с иммобилизованным тропомиозинкиназным рецептором B (TrkB), который стал жизнеспособной мишенью для открытия лекарств для многочисленных расстройств нервной системы.

Предыдущие исследования показали, что активация нейротрофического фактора мозга (BDNF) / пути TrkB связана с улучшением некоторых неврологических заболеваний, таких как AD или большое депрессивное расстройство 25,26,27,28. Сообщалось, что уровни BDNF и экспрессия TrkB рецептора TrkB снижаются при AD, и аналогичные снижения ухудшают функцию гиппокампа на животных моделях AD29. Снижение уровня BDNF было зарегистрировано в сыворотке крови и головном мозге пациентов с БА 30,31,32. Было обнаружено, что сверхэкспрессия тау или гиперфосфорилирование снижают экспрессию BDNF в первичных нейронах и животных моделях AD 33,34,35. Кроме того, сообщалось, что BDNF оказывает защитное воздействие на нейротоксичность in vitro и in vivo36, индуцированную β-амилоидом. Было показано, что прямое введение BDNF в мозг крысы улучшает обучение и память у животных с когнитивными нарушениями37. BDNF / TrkB стал действительной мишенью для улучшения неврологических и психических расстройств, включаяAD 28,38. Нацеливание на сигнальный путь BDNF / TrkB для разработки методов лечения при БА потенциально улучшит наше понимание заболевания39. К сожалению, сам BDNF не может быть использован в качестве лечения из-за его плохих фармакокинетических свойств и неблагоприятных побочных эффектов40. Низкомолекулярные активаторы путей TrkB/BDNF были исследованы в качестве потенциальных лигандов TrkB 41,42,43. Среди протестированных агонистов малых молекул было показано, что 7,8-дигидроксифлавон (7,8-DHF) активирует путь BDNF / TrkB 41,44,45,46. Производное 7,8-DHF (R13; 4-Oxo-2-фенил-4H-хромен-7,8-диил-бис(метилкарбамат)) в настоящее время рассматривается в качестве возможного лекарственного средства для AD47. Недавно было показано, что несколько антидепрессантов работают через прямое связывание с TrkB и содействие передаче сигналов BDNF, что еще больше подчеркивает важность использования TrkB в качестве действительной цели для лечения различных неврологических расстройств48.

Протокол описывает процесс сборки функциональной колонки TrkB и отрицательной управляющей колонки TrkB-NULL. Колонки характеризуются использованием известного натурального продукта мелкомолекулярного лиганда: 7,8-DHF. Дополнительно описан процесс скрининга сложных матриц, используя в качестве примера растительный экстракт, для идентификации соединений, взаимодействующих с TrkB.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Клеточная культура клеток нейробластомы SH-SY5Y (клеточные линии TrkB и TrkB-NULL (родительские))

ПРИМЕЧАНИЕ: Сотовые линии (SH-SY5Y Cell Line (TrkB, BR6) и SH-SY5Y Родительская клеточная линия (TrkB NULL))49,50 были приобретены у Kerafast. Культивируемые клетки используются в качестве источника трансмембранных рецепторов, подлежащих иммобилизации для подготовки колонок CMAC. Следующие шаги описывают, как получить фрагменты клеточной мембраны и собрать функциональные колонны CMAC.

  1. Выращивайте клетки в клеточной культуральной среде, приготовленной путем смешивания 450 мл среды RPMI, 50 мл FBS, 5 мл раствора пенициллина / стрептомицина и 0,3 мг / мл генетикина (G418) в чашке для культивирования клеток 150 мм при 37 ° C во влажной атмосфере с 5% CO2.

2. Сбор клеток

  1. Подтвердить слияние клеток (80%-90%) с помощью микроскопа, достигнутое через 3-4 дня после прохождения клеток.
  2. Аспирировать клеточную культуральную среду сверху клеток и дважды промыть клетки фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS, 1x, pH 7,4). Удалите PBS и добавьте 2 мл низкоконцентрированного трипсина (0,25%) для отделения клеток.
  3. Осторожно закрутите пластину, чтобы равномерно покрыть все клетки раствором трипсина и инкубируйте клетки в течение примерно 2 мин при 37 °C во влажной атмосфере с 5% CO2. Добавьте 8 мл клеточной культуральной среды к отсоединяющимся клеткам и перенесите отсоединенные клетки в коническую трубку объемом 50 мл и поместите ее на лед.
  4. Используйте гемоцитометр для оценки количества клеток (примерно 3 х 107 клеток). Смешайте клеточную суспензию путем пипетки вверх и вниз, чтобы получить ровную плотность клеток в смеси. Поместите 10 мкл клеточной суспензии под крышку и подсчитайте клетки под микроскопом с помощью объектива 40x.

3. Гомогенизация клеток

  1. Готовят исходные растворы следующих ингибиторов протеазы: бензамидин (200 мМ), фенилметилсульфонилфторид (PMSF, 10 мМ) и коммерчески доступный коктейль ингибиторов протеазы (100-кратная концентрация), содержащий 4-(2-аминоэтил)бензолсульфонилфторид гидрохлорид (AEBSF), апротинин, бестатин и леупептин.
    ВНИМАНИЕ: PMSF следует обрабатывать только внутри вытяжного шкафа.
    1. Готовят исходный раствор бензамидина (200 мМ), растворяя 120 мг бензамидина в 5 мл сверхчистой деионизированной воды. Хранить при температуре 4 °C и использовать в течение дня. Свежеприготовьте раствор перед каждым использованием (рекомендуется).
    2. Готовят готовый раствор PMSF (10 мМ), растворив 0,017 г PMSF в 10 мл этанола. Хранить при - 20 °C.
    3. Приготовьте коктейль ингибитора протеазы (100x), растворив коммерчески доступную смесь ингибиторов протеазы в 1 мл сверхчистой деионизированной воды. Тщательно перемешать и аликвотировать 200-300 мкл коктейля и хранить при - 20 °C перед употреблением.
  2. Приготовьте раствор АТФ (100 мМ), растворив 55,114 мг гидрата динатриевой соли АТФ в 1 мл деионизированной сверхчистой воды. Тщательно перемешайте и аликвот 100 мкл смеси и храните при - 20 °C перед использованием.
  3. Готовят буфер путем растворения 3,03 г трис(гидроксиметил)аминометана гидрохлорида (Tris-HCl, 50 мМ), 2,9 г хлорида натрия (NaCl, 100 мМ), 0,22 г хлорида кальция безводного (CaCl2, 3 мМ), 0,2 г гексагидрата хлорида магния (MgCl2, 2 мМ) и 0,19 хлористого калия (KCl, 5 мМ) в 500 мл сверхчистой деионизированной воды.
  4. Готовят буфер гомогенизации путем смешивания 17,3 мл буфера, приготовленного на стадии 3,3, с 0,3 мл (3 мМ) раствора бензамидина, 0,2 мл (0,1 мМ) раствора PMSF, 0,2 мл коктейльной смеси ингибитора протеазы, 20 мкл (100 мкм) раствора АТФ, 2 мл (10%) глицерина и 0,029 г (5 мМ) ЭДТА (таблица 1). Отрегулируйте рН до 7,4 с помощью раствора соляной кислоты.
  5. Открутите клетки, собранные на стадии 2.3 при 4 °C в течение 5 мин при 400 х г. Удалите супернатант и промыть оставшуюся ячейку гранулы 10 мл ледяного PBS (1x, pH 7,4). Снова раскрутите клетки при 4 °C в течение 5 мин при 400 х г.
  6. Выбросьте супернатант и замените его 20 мл буфера гомогенизации, приготовленного на этапе 3.4. Поместите коническую трубку на лед.
  7. Переложите клеточную суспензию в 40 мл гомогенизатора ткани Dounce и поместите ее на лед. Гомогенизируйте суспензию вручную, на льду, используя 40 ударов пестика вверх и вниз. Перенесите гомогенизированную клеточную суспензию в коническую трубку объемом 50 мл.
  8. Центрифугировать гомогенат при 4 °C в течение 7 мин при 400 х г. Выбросьте гранулу и переложите супернатант в новую коническую трубку и центрифугируйте его при 4 °C в течение 30 мин при 47900 х г. Сохраните гранулу клеточной мембраны и выбросьте супернатант.

4. Солюбилизация клеточных мембран

  1. Готовят солюбилизационный буфер путем смешивания 8,7 мл буферного раствора, изготовленного на стадии 3,3, с 0,1 мл (0,1 мМ) раствора PMSF, 0,15 мл (3 мМ) раствора бензамидина, 0,1 мл коктейля ингибитора протеазы, 10 мкл (100 мкм) раствора АТФ, 1 мл (10%) глицерина и 0,2 г (2%) холата натрия (таблица 2).
  2. Переложите буфер солюбилизации в коническую трубку с фрагментами клеточной мембраны, полученными на стадии 3.8, и повторно суспендируйте гранулу. Вращайте полученную смесь со скоростью 150 об/мин при 4 °C в течение 18 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе эксперимент может быть приостановлен для ночной солюбилизации гранул клеточной мембраны.

5. Иммобилизация клеточных мембран на IAM. ПК. Частицы DD2

  1. Через 18 ч центрифугируют солюбилизационную смесь при 4 °C в течение 30 мин при 47900 х г.
  2. Сохраните супернатант и выбросьте гранулу. Добавьте 100 мг IAM. ПК. Частицы DD2 к надосадочному веществу вихряют и вращают полученную суспензионную смесь со скоростью 150 об/мин при 4 °C в течение 1 ч.
  3. Для облегчения иммобилизации фрагментов клеточных мембран на ИАМ. ПК. Частицы DD2 переходят на стадию диализа, как описано ниже.
    1. Готовят диализный буфер в 4 л сверхчистой деионизированной воды, добавляя 24 г трис-HCl (50 мМ), 23,4 г NaCl (100 мМ), 0,06 г CaCl2 (0,1 мМ), 5,85 г ЭДТА (5 мМ) и 0,07 г ПМСФ (0,1 мМ; Таблица 3).
      ПРИМЕЧАНИЕ: PMSF не растворяется в воде, поэтому растворяют его сначала в небольшом объеме этанола, а затем медленно добавляют в стакан с буфером.
    2. Отрегулируйте рН до 7,4 раствором соляной кислоты. Поместите буфер при температуре 4 °C не менее чем на 1 ч, прежде чем приступить к этапу диализа.
    3. Подготовьте диализную трубку, разрезав 10 см диализной трубки целлюлозной мембраны (10 K MWCO, 35 мм) и перенесите суспензию, содержащую IAM. ПК. Частицы DD2 и фрагменты клеточной мембраны попадают в диализную трубку. Используйте зажимы для диализных трубок, чтобы закрыть оба конца диализной трубки.
    4. Поместите диализную трубку, содержащую IAM. ПК. DD2 стационарная фаза в диализном буфере и диализ при 4 °C в течение 24 ч при осторожном перемешивании.
    5. Через 24 ч поместите диализную трубку в свежеприготовленный диализный буфер и продолжайте диализ еще 24 ч.

6. Упаковка колонн CMAC

  1. Подготовьте буфер ацетата аммония (10 мМ, рН 7,4), который будет использоваться для промывки IAM. ПК. Частицы DD2 и эксперименты по характеристике колонн путем растворения 0,7708 г ацетата аммония в 1 л сверхчистой деионизированной воды. Отрегулируйте рН до 7,4 раствором соляной кислоты.
  2. После 48 ч диализа удалите диализную трубку из диализного буфера и перенесите содержимое диализной трубки в коническую трубку объемом 15 мл.
  3. Центрифугировать смесь при 4 °С в течение 5 мин при 400 х г. Откажитесь от супернатанта и промывайте оставшуюся гранулу три раза 10 мл буфера ацетата аммония, центрифугируя смесь при 4 °C в течение 5 мин при 400 х г, после каждой промывки.
  4. После третьей промывки повторно суспендируют оставшуюся гранулу в 1 мл буфера ацетата аммония. Тщательно перемешайте его и используйте полученную суспензию, чтобы упаковать стеклянную колонку 5/20, чтобы получить колонку хроматографии CMAC.
  5. Чтобы упаковать колонну, сначала поместите нижний фильтр, предварительно пропитанный буфером ацетата аммония, в фильтродержатель. Установите фильтродержатель в стеклянную колонну и прикрутите колпачок колонны, чтобы закрепить положение держателя. Поместите колонну вертикально в зажим для пальцев и закрепите ее на лабораторной подставке. Поместите стакан под колонку.
  6. С помощью одноканального пипетчера перенесите небольшой объем суспензии, полученной на стадии 6.4, в стеклянную колонну. Налейте материал медленно, прижимая кончик пипетки к стеклянной стенке колонны. Дайте упаковочному материалу осесть, прежде чем заливать еще один объем навозной жижи.
  7. Чтобы ускорить процесс упаковки, снимите буфер над стационарным слоем с помощью микропипетки между каждым шагом. Повторяйте эти шаги до тех пор, пока не будет упакован 1 мл навозной жижи.
  8. Поместите верхний фильтр и прикрутите адаптер так, чтобы над неподвижной фазой не оставалось буфера, как показано на рисунке 1. Закрепите положение адаптера с помощью замка адаптера.
  9. Подключите колонку к высокопроизводительному насосу жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), установите расход на 0,2 мл/мин и промывайте колонну на ночь буфером ацетата аммония. Теперь столбец готов к этапу определения характеристик. Храните колонку при температуре 4 °C до использования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для более длительного хранения (колонка не используется дольше недели) проводят колонку с 0,05% раствором азида натрия в буфере ацетата аммония и хранят при 4 °C.
    ВНИМАНИЕ: Азид натрия очень токсичен при пероральном приеме внутрь или всасывается через кожу; его следует обрабатывать только под вытяжным кожухом. Обязательно наденьте лабораторный халат, защитные очки и перчатки (предпочтительно нитрил) при работе с азидом натрия.

7. Характеристика столбцов CMAC

  1. Конфокальная микроскопия и связывание BDNF
    1. Подготовьте IAM. ПКЦ. Частицы стационарной фазы DD2 с иммобилизованными фрагментами клеточной мембраны, полученные отдельно от клеток нейробластомы SH-SY5Y, чрезмерно экспрессирующих клетки TrkB и SH-SY5Y TrkB-NULL, следуя инструкциям от шага 1 до шага 6.4.
    2. Для образцов, которые будут инкубированы с BDNF до окрашивания антителами, приготовьте раствор BDNF путем растворения 10 мкг BDNF в 100 мкл сверхчистой деионизированной воды. Хранить раствор при температуре -20 °C.
      1. Перенос в отдельные 1,5 мл микроцентрифужных пробирок, 100 мкл аликвоты ИАМ. ПК. Упаковочный материал колонны DD2 с иммобилизованными клетками нейробластомы SH-SY5Y, сверхэкспрессирующими TrkB и 100 мкл аликвоты IAM. ПК. Упаковочный материал колонны DD2 с иммобилизованными ячейками SH-SY5Y TrkB-NULL, взвешенными в буфере ацетата аммония.
      2. Добавьте 390 мкл буфера ацетата аммония, 10 мкл раствора BDNF и 0,5 мкл исходного раствора АТФ (приготовленного на стадии 3,2) в каждую трубку и инкубируйте в течение 1 ч при комнатной температуре с раскачиванием.
    3. Для образцов, которые не будут инкубированы с BDNF до окрашивания антителами, перенесите 100 мкл аликвоты IAM. ПК. Упаковочный материал колонны DD2 с иммобилизованными клетками нейробластомы SH-SY5Y, сверхэкспрессирующими TrkB, суспендированным в ацетате аммония в микроцентрифужные трубки объемом 1,5 мл.
    4. Добавьте в каждую пробирку 400 мкл буфера ацетата аммония и 0,5 мкл раствора АТФ (приготовленного на стадии 3,2) и инкубируйте в течение 1 ч при комнатной температуре с раскачиванием.
    5. Открутите образцы, приготовленные на этапах 7.1.2 и 7.1.4, при 4°С в течение 1 мин при 10 000 х г и выбросьте супернатант.
    6. Полученные гранулы промыть 500 мкл буфера ацетата аммония в течение 10 мин и снова вращать при 4 °C в течение 1 мин при 10 000 х г и выбросить надосадочное вещество.
    7. К каждой из гранул добавляют 220 мкл буфера ацетата аммония, 25 мкл 10% нормальной козьей сыворотки и 5 мкл первичного анти-BDNF антитела. Инкубировать в холодном помещении (4 °C) на ночь с раскачиванием.
    8. По завершении стадии инкубации открутите смесь в течение 1 мин при 10 000 х г при 4 °С и выбросьте супернатант.
    9. Вымойте полученную гранулу 3 раза буфером ацетата аммония, содержащим 1% мягкого моющего средства (например, холата натрия) в течение 10 мин и раскрутите смеси в течение 1 мин при 10 000 х г при 4 °C и выбросьте супернатант.
    10. Готовят раствор вторичных антител путем смешивания 900 мкл буфера ацетата аммония, 100 мкл 10% нормальной козьей сыворотки и 1 мкл флуорофор-конъюгированного вторичного антитела (разведение 1:1000). Добавляют 300 мкл раствора вторичных антител к каждой из гранул, полученных на стадии 7.1.9. и инкубировать в течение ночи при температуре 4 °C с раскачиванием.
    11. Раскрутите смесь при 10 000 х г в течение 1 мин при 4 °C и выбросьте супернатант.
    12. Полученную гранулу промыть 3 раза буфером ацетата аммония, содержащим 1% мягкого моющего средства (например, холата натрия) в течение 10 мин и открутить смесь в течение 1 мин при 10 000 х г при 4 °C и отказаться от надосадочного вещества.
    13. Повторно суспендировать полученные гранулы в 50 мкл буфера ацетата аммония. Поместите 20 мкл каждой из смесей на слайд и накройте крышкой.
    14. Создайте изображение IAM. ПК. Частицы DD2 с иммобилизованными фрагментами клеточной мембраны с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа с возбуждением при 488 нм и излучением при 520 нм генерируются с помощью твердотельной лазерной системы. Используйте объектив 20x с NA 0,75 и WD 0,35 мм.
  2. Фронтальная аффинная хроматография с использованием 7,8-DHF в качестве маркерного лиганда
    1. Подключите колонку CMAC к системе ВЭЖХ с помощью детектора диодной решетки и/или масс-спектрометра.
    2. Готовят 500 мл 1 мМ раствора 7,8-ДГФ в буфере ацетата аммония, содержащем 5% метанол.
    3. Перекачиваем постоянную концентрацию маркерного лиганда (1 мМ) через колонну CMAC со скоростью потока 0,4 мл/мин при комнатной температуре. Мониторинг профиля элюирования с помощью детектора диодной решетки (DAD) (длина волны 254 нм) или масс-спектрометра (используйте режим мониторинга одиночных ионов; м/з 253 в режиме отрицательной ионизации).
    4. После завершения пробега выполните ночную промывку, запустив буфер ацетата аммония через колонну.
    5. Повторите шаги 7.2.2. - 7.2.4. используя различные концентрации маркерного лиганда (750 нМ, 500 нМ, 300 нМ), промывая колонны в течение ночи после каждого пробега. Используйте фронтальную аффинную хроматографию для расчета лиганда Kd, как подробно рассмотрено, в другом месте. 24,51 грн.
  3. Исследования смещения с Centella asiatica (L.) Urb. (готу кола) экстракт
    1. Готовят 500 мл 500 нМ раствора 7,8-ДГФ в буфере ацетата аммония, содержащем 5% метанол и 0,2% водный экстракт готу кола (10 мг/мл).
    2. Насос постоянной концентрации маркерного лиганда (500 нМ) с экстрактом через колонну при скорости потока 0,4 мл/мин при комнатной температуре. Мониторинг профиля элюирования с помощью детектора DAD (длина волны 254 нм) или масс-спектрометра (используйте режим мониторинга одиночных ионов; m/z 253 в режиме отрицательной ионизации).
    3. После завершения пробега выполните ночную промывку, запустив буфер ацетата аммония через колонну.
    4. Нанесите профили элюирования на 500 нМ 7,8-ДГФ и полученные после запуска раствора с экстрактом готу кола для проверки на смещение маркерного лиганда.

8. Отсутствующий подход пиковой хроматографии для выявления потенциальных связующих веществ TrkB из экстракта готу кола

  1. Фракционирование экстракта готу кола на колонках CMAC
    1. Подключите отдельно колонки CMAC TrkB и TrkB-NULL к системе ВЭЖХ и введите 50 мкл водного экстракта готу кола (10 мг/мл) на каждую из колонн. Насос ацетатного буфера аммония (10 мМ, рН 7,4), содержащего 5% метанола, через колонну со скоростью потока 0,4 мл/мин при комнатной температуре.
    2. Фракции собирают отдельно от колонок CMAC TrkB и TrkB-NULL следующим образом: 0-5 мин, 5-10 мин, 10-15 мин, 15-20 мин, 20-25 мин, 25-30 мин, 30-35 мин, 35-40 мин, 40-45 мин, 45-50 мин, 50-55 мин, 55-60 мин.
    3. Заморозить и лиофилизировать полученные фракции. Повторное суспендирование лиофилизированных фракций в 50 мкл метанола перед переходом к ультраэффективной жидкостной хроматографии и масс-спектрометрическому анализу.
  2. Сверхпроизводительный анализ жидкостной хроматографии квадрупольной масс-спектрометрии времени пролета (UPLC-QTOF-MS) фракций готу кольского CMAC
    1. Проанализируйте все фракции, полученные в пункте 8.1.3. использование масс-спектрометра в сочетании с системой UPLC (режим анализа UPLC-MSE ). Анализируйте фракции с помощью колонки C18 (2,1 x 50 мм, 1,7 мкм) с предварительной колонкой C18 VanGuard (2,1 мм x 5 мм, 1,7 мкм).
    2. Элюируют колонку с помощью следующих градиентных растворов со скоростью потока 0,3 мл/мин с подвижной фазой А (вода с 0,1% муравьиной кислоты) и В (ацетонитрил с 0,1% муравьиной кислоты): 0,0 мин 99% А 1% В, 1,5 мин 84% А 16% В, 5,0 мин 80% А 20% В, 7,0 мин 75% А 25% В, 10,0 мин 65% А 35% В, 20,0-24,0 мин 1% А 99% В, 25,0-29,0 мин 99% А 1% В.
    3. Установите объем впрыска для каждого образца на 3 мкл. Выполняйте MSE в разрешении положительного и отрицательного ионных режимов, с энергией столкновения при 4 В для низкой энергии и 20-35 В для высокой энергии.
    4. Используйте следующие условия источника ESI в режиме положительной ионизации: капиллярное напряжение 1,5 кВ, конус отбора проб 40 В, смещение источника 80, температура источника 100 °C, температура дезинсоляции 350 °C, расход конусного газа 38,0 л/ч, газоразделения 400 л/ч.
    5. Используйте следующие условия источника ESI в режиме отрицательной ионизации: капиллярное напряжение 1,45 кВ, конус отбора проб 40 В, смещение источника 80, температура источника 110 °C, температура дезинсоляции 300 °C, расход конусного газа 50,0 л/ч, расход газа для дезинсоляции 652 л/ч.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

В соответствии с протоколом были собраны две хроматографические колонки CMAC: одна с иммобилизованными фрагментами клеточной мембраны нейробластомы SH-SY5Y с гиперэкспрессированным TrkB и одна с фрагментами клеточной мембраны SH-SY5Y TrkB-NULL. Правильно собранная колонна CMAC представлена на рисунке 1, а этапы, участвующие в иммобилизации фрагмента клеточной мембраны, представлены на рисунке 2.

С момента иммобилизации рецепторов TrkB на IAM. ПК. Хроматографическая стационарная фаза DD2 ранее не предпринималась, успешная иммобилизация рецепторов была подтверждена окрашиванием антителами и фронтальной аффинной хроматографией с использованием маркерного лиганда: 7,8-DHF. Схематическое изображение эксперимента по окрашиванию антител представлено на фиг.2. Фрагменты клеточной мембраны, полученные из клеточной линии нейробластомы, чрезмерно экспрессирующей рецепторы TrkB, и фрагменты клеточной мембраны из родительской клеточной линии без рецепторов TrkB (TrkB-NULL)) были иммобилизованы на IAM. ПК. Частицы DD2 с использованием оптимизированного протокола. Впоследствии частицы с иммобилизованными фрагментами клеточной мембраны инкубировали с BDNF (физиологический лиганд), а затем с первичными и флуоресцентно мечеными вторичными антителами (рисунок 2). ИАМ. ПК. Частицы DD2 с иммобилизованными фрагментами клеточной мембраны TrkB нейробластомы и в присутствии BDNF приводили к флуоресцентно меченым частицам (рисунок 3C). Флуоресценция (за исключением слабой фоновой флуоресценции) не наблюдалась при исследовании инкапсулированных частиц IAM клеточной мембраны TrkB-NULL (рисунок 3A) или когда BDNF не использовался в случае инкапсулированных частиц IAM клеточной мембраны TrkB (рисунок 3B).

Для характеристики связывания малого маркерного лиганда (7,8-DHF) с иммобилизованными TrkB рецепторами лобного сродства выполнена хроматография с различными концентрациями 7,8-DHF. Типичная хроматограмма увеличения концентраций 7,8-ДГФ на функциональной колонке CMAC представлена на рисунке 4. Специфическое связывание 7,8-ДГФ с иммобилизованным TrkB было подтверждено концентрационно-зависимым снижением времени удержания маркерного лиганда. Результаты фронтальной аффинной хроматографии, полученные на нефункциональной колонке CMAC, представлены на рисунке 5. Отсутствие концентрационно-зависимых изменений в удержании маркерного лиганда свидетельствует о неудачной попытке подготовки КМАК.

Соединения, вводимые в колонку CMAC, взаимодействуют не только специфически, но и могут неспецифически взаимодействовать с IAM. ПК. Частицы DD2, фосфолипидный бислой иммобилизованных фрагментов клеточной мембраны и другие белки, присутствующие в бислое. Для исключения соединений, неспецифически взаимодействующих с колонкой CMAC в процессе скрининга сложных экстрактов на связующие TrkB, важно подготовить CMAC отрицательную контрольную колонку путем иммобилизации фрагментов клеточной мембраны родительской клеточной линии, не экспрессирующих целевой белок (в данном случае TrkB-NULL). Результаты фронтальной аффинной хроматографии, полученные на отрицательной колонке CMAC TrkB-NULL, представлены на рисунке 6.

Функциональные колонки CMAC могут быть использованы для различных целей, таких как характеристика целевого белка, изучение взаимодействия отдельных соединений с иммобилизованными мишенями (например, получение константы диссоциации, Kd) или определение кинетики связывания (kon и koff) и т.д.24. Колонки также могут быть использованы для скрининга сложных образцов, таких как растительные экстракты, на наличие соединений, связывающихся с рецепторами TrkB, поэтому потенциально содержат молекулы, которые действуют как агонисты или антагонисты TrkB. Чтобы проверить, содержит ли экстракт потенциально соединения, взаимодействующие с иммобилизованными рецепторами, проводится простой эксперимент по вытеснению. Результат конкурсного эксперимента, выполненного с экстрактом готу кола и 500 нМ 7,8-ДГФ на функциональной колонке TrkB, представлен на рисунке 7. Добавление 0,2% водного экстракта готу кола (10 мг/мл) приводило к значительному снижению удержания 7,8-ДГФ, что указывает на наличие конкурирующих лигандов для сайта связывания агонистов. Результат эксперимента по смещению, проведенного на отрицательном столбце CMAC TrkB-NULL, представлен на рисунке 8. Отсутствие снижения удержания 7,8-DHF на этом столбце еще раз подтверждает отсутствие функциональных рецепторов TrkB на колонке CMAC TrkB-NULL.

Для идентификации специализированных метаболитов, специфически взаимодействующих с иммобилизованными мишенями, колонки CMAC используются в подходе, называемом отсутствующей пиковой хроматографией52 после эксперимента по вытеснению. При таком подходе небольшой объем исследуемого экстракта хроматографируется параллельно на колонке, содержащей исследуемую иммобилизованную мишень и отрицательную контрольную колонку CMAC. Эти две колонки различаются по выражению мишени, поэтому любые различия в паттернах удержания отдельных молекул обусловлены специфическим характером взаимодействий с исследуемыми мишенями на колонке CMAC, содержащей эти TMP. Синхронизированные фракции из обеих колонок собираются, концентрируются и впоследствии анализируются на колонке C18. Полученные хроматограммы сравнивают, а соединения, представленные пиками, аналогичным образом удерживаемыми на обеих колонках, маркируют как неспецифически взаимодействующие молекулы. Наличие пика в более поздних фракциях на колонке CMAC с иммобилизованными рецепторами и отсутствие пика, представляющего то же соединение в ранних фракциях отрицательного столбика CMAC, представляет собой специфическое взаимодействие соединения с иммобилизованной мишенью. Соединения, идентифицированные на этом этапе, могут быть нацелены на выделение и дальнейшее тестирование без необходимости выполнения фракционирования с биоуправляемым методом. Подход хроматографии с отсутствующим пиком был использован для идентификации соединений, специфически взаимодействующих с рецепторами TrkB из экстракта готу кола. Экстракт Готу кола фракционировали как на колонках TrkB, так и на TrkB-NULL, и соединения, присутствующие в этих фракциях, анализировали с использованием UPLC-QTOF-MS. Исследование хроматограмм каждой из фракций привело к выявлению соединения, сильно удерживаемого на колонке TrkB (фракция 50-55 мин), при раннем элюировании на колонке TrkB-NULL (фракция 0-5 мин), что указывает на специфическое взаимодействие с иммобилизованными рецепторами TrkB (рисунок 9). Элюирование соединения при ~ 17,48 мин (рисунок 9) теперь предназначено для выделения и тестирования в функциональных анализах.

Figure 1
Рисунок 1. Правильно собранная колонна CMAC. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2. Этапы приготовления CMAC и флуоресцентная маркировка антител иммобилизованных рецепторов. Схематическое изображение приготовления колонки CMAC (1-4) и эксперимента по маркировке антител (5-8). (1) Гомогенизированные фрагменты клеточной мембраны, содержащие целевой трансмембранный белок, TrkB. (2) Солюбилизированные фрагменты клеточной мембраны в мицеллярной структуре. (3) Фрагменты клеточной мембраны, обездвиженные на поверхности частиц IAM. (4) Частицы IAM с иммобилизованными фрагментами клеточной мембраны, упакованные в стеклянную колонку. (5) Иммобилизованный рецептор TrkB в фрагментах клеточной мембраны. (6) Связывание природного лиганда BDNF с функциональным рецептором TrkB. (7) Связывание первичных антител с молекулами BDNF. (8) Связывание флуорофорных меченых вторичных антител с первичными антителами, приводящее к зеленой флуоресценции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3. Иммобилизация фрагментов клеточных мембран с рецепторами TrkB на частицы IAM. Изображения конфокальной микроскопии, показывающие иммобилизацию фрагментов клеточных мембран функциональными рецепторами TrkB на частицах IAM. (A) Фрагменты клеточной мембраны из клеточной линии SH-SY5Y TrkB-NULL, иммобилизованные на частицах IAM после инкубации с BDNF, первичным антителом и флуорофорным меченым вторичным антителом. (B) Фрагменты клеточной мембраны из клеточных линий нейробластомы SH-SY5Y, экспрессирующих TrkB, иммобилизованные на частицах IAM после инкубации с первичным антителом и флуорофор-меченым вторичным антителом без BDNF. (C) Фрагменты клеточной мембраны из клеточных линий нейробластомы SH-SY5Y, экспрессирующих TrkB, иммобилизованные на частицах IAM после инкубации с BDNF, первичным антителом и флуорофорным меченым вторичным антителом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4. Фронтальные аффинные хроматограммы 7,8-ДГФ на колонке TrkB CMAC. Фронтальная хроматограмма повышения концентраций 7,8-ДГФ на колонке TrkB CMAC, где A - 1 мМ, B - 750 нМ, C - 500 нМ, d - 300 нМ. Буфер ацетата аммония (10 мМ, рН 7,4) с 5% метанолом использовался в качестве элюента при скорости потока 0,4 мл/мин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5. Фронтальные аффинные хроматограммы 7,8-ДГФ на нефункциональной колонке TrkB CMAC. Фронтальная хроматограмма различных концентраций 7,8-ДГФ на нефункциональной колонке TrkB CMAC, где A -1 мкМ, B - 1 мкМ, C - 750 нМ и D - 500 нМ. Буфер ацетата аммония (10 мМ, рН 7,4) с 5% метанолом использовался в качестве элюента при скорости потока 0,4 мл/мин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 6
Рисунок 6. Фронтальные аффинные хроматограммы 7,8-DHF на колонке TrkB-NULL CMAC. Фронтальная хроматограмма повышения концентраций 7,8-ДГФ на колонке TrkB-NULL CMAC, где A - 1 мМ, B - 750 нМ, C - 500 нМ и D - 300 нМ. Буфер ацетата аммония (10 мМ, рН 7,4) с 5% метанолом использовался в качестве элюента со скоростью потока 0,4 мл/мин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 7
Рисунок 7. Фронтальные аффинные хроматограммы 7,8-ДГФ с 0,2% экстрактом готу кола на колонке TrkB CMAC. Репрезентативный профиль лобного элюирования (А) 500 нМ 7,8-ДГФ + 0,2% экстракта готу кола (10 мг/мл) и (В) 500 нМ 7,8-ДГФ на колонке CMAC TrkB. Буфер ацетата аммония (10 мМ, рН 7,4) с 5% метанолом использовался в качестве элюента при скорости потока 0,4 мл/мин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 8
Рисунок 8. Фронтальные аффинные хроматограммы 7,8-ДГФ с 0,2% экстрактом готу кола на колонке TrkB-NULL CMAC. Репрезентативный профиль лобного элюирования (A) 500 нМ 7,8-DHF и (B) 500 нМ 7,8-DHF + 0,2% экстракта готу кола (10 мг/мл) на колонке TrkB-NULL CMAC. Буфер ацетата аммония (10 мМ, рН 7,4) с 5% метанолом использовался в качестве элюента при скорости потока 0,4 мл/мин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 9
Рисунок 9. UPLC-MS хроматограммы фракций экстракта готу колы. UPLC-MS хроматограммы фракций экстракта готу кола (A), элюированных между 0-5 мин из колонки TrkB-NULL CMAC и (C) элюированных между 50-55 мин из колонки CMAC TrkB. Соединение со временем удержания 17,48 мин, присутствующим в обеих фракциях, что подтверждается соответствующими масс-спектрами (B и D), было идентифицировано как потенциальное связующее TrkB. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Буфер гомогенизации
1 Трис(гидроксиметил)аминометан гидрохлорид (Tris-HCl) 50 мМ
2 Хлорид натрия (NaCl) 100 мМ
3 Кальция хлорид безводный (CaCl2) 3 мМ
4 Гексагидрат хлорида магния (MgCl2) 2 мМ
5 Калия хлорид (KCl) 5 мМ
6 Фенилметансульфонилфторид (PMSF) 0.1 мМ
7 Бензамидин 3 мМ
8 Коктейль ингибитора протеазы (100X) (1/100)
9 Глицерин 10%
10 Аденозин 5'-трифосфат (АТФ) динатрий солевой гидрат 100 мкМ
11 Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) 5мМ

Таблица 1. Гомогенизационный буферный состав.

Буфер солюбилизации
1 Трис(гидроксиметил)аминометан гидрохлорид (Tris-HCl) 50 мМ
2 Хлорид натрия (NaCl) 100 мМ
3 Кальция хлорид безводный (CaCl2) 3 мМ
4 Гексагидрат хлорида магния (MgCl2) 2 мМ
5 Калия хлорид (KCl) 5 мМ
6 Фенилметансульфонилфторид (PMSF) 0.1 мМ
7 Бензамидин 3 мМ
8 Коктейль ингибитора протеазы (100X) (1/100)
9 Глицерин 10%
10 Аденозин 5'-трифосфат (АТФ) динатрий солевой гидрат 100 мкМ
11 Холат натрия 2%

Таблица 2. Солюбилизирующий буферный состав.

Диализный буфер
1 Трис(гидроксиметил)аминометан гидрохлорид (Tris-HCl) 50 мМ
2 Хлорид натрия (NaCl) 100 мМ
3 Кальция хлорид безводный (CaCl2) 0.1 мМ
4 Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) 5 мМ
5 Фенилметансульфонилфторид (PMSF) 0.1 мМ

Таблица 3. Диализный буферный состав.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Идентификация активных соединений, присутствующих в сложных смесях специализированных метаболитов, является очень сложной задачей23. Традиционно выделяют отдельные соединения, а их активность тестируют в разных анализах. Такой подход является трудоемким и дорогостоящим и часто приводит к выделению и идентификации наиболее распространенных и хорошо охарактеризованных соединений23. Используемые в настоящее время высокопроизводительные скрининговые анализы в значительной степени опираются на библиотеки комбинаторной химии с уже известными мишенями и не предназначены для идентификации и выделения биологически активных соединений, присутствующих в сложных смесях53.

CMAC позволяет идентифицировать соединения, нацеленные на TMP 23,24,54. При этом при этом фрагменты клеточной мембраны с ТМП иммобилизуются на поверхности ИАМ частиц стационарной фазы23,24. CMAC является уникальным подходом, который позволяет иммобилизовать фрагменты клеточной мембраны с целевыми белками на твердой опоре, имитирующей клеточную мембрану фосфолипидного бислоя24. Это позволяет сохранить функциональность иммобилизованных белковых мишеней и обеспечивает приближенные к физиологическим условиям при использовании CMAC для идентификации малых молекул, взаимодействующих с TMP. CMAC предлагает преимущество возможностей для открытия новых химических каркасов из уникальных библиотек природных продуктов, которые не могут быть проверены с использованием любого другого из используемых в настоящее время анализов23 . Предложенный подход позволяет идентифицировать соединения, взаимодействующие с ТМП, не разгадывая природу этого взаимодействия. Способ взаимодействия (аллостерическое или ортостерическое взаимодействие; ингибирование или активация) должен быть проверен с использованием функциональных клеточных анализов. CMAC с иммобилизованными белковыми мишенями также может быть использован для характеристики фармакодинамики (например, константа диссоциации, Kd) или определения кинетики связывания (kon и koff) лигандов малых молекул, взаимодействующих с мишенью, а также в процессе характеристики сайтов связывания на иммобилизованном белке24 . Хотя CMAC позволяет идентифицировать только соединения, связывающиеся с TMP, это инновационный подход, который значительно ускоряет первый шаг в конвейере открытия лекарств, поскольку он не требует очистки соединений, которая в настоящее время является основным узким местом в процессе открытия лекарств из природных смесей.

Хотя представленный протокол фокусируется на иммобилизации одного трансмембранного рецептора (TrkB), технология CMAC может быть использована при подготовке колонок с другими мишенями. Одним из важнейших аспектов подготовки CMAC является выбор клеточной линии или ткани, которая используется для выделения фрагментов клеточной мембраны. Если колонки используются при скрининге сложных смесей на соединения, взаимодействующие с иммобилизованными рецепторами, рекомендуется использовать клеточные линии, гиперэкспрессирующие целевой белок. Использование такой клеточной линии приведет к большему количеству иммобилизованных мишеней и увеличит вероятность идентификации соединений с более низким сродством к мишени или менее обильным молекулам. Если сосредоточиться на характеристике иммобилизованного белка, рекомендуется использовать нативную клеточную линию, поскольку посттрансляционные модификации, которым подвергается белок, а также фосфолипидная среда могут значительно отличаться в трансфектированной клеточной линии.

Некоторые аспекты изоляции клеточной мембраны и иммобилизации на частицах IAM являются критическими и могут потребовать модификаций в зависимости от типа рецептора или источника белка. Чтобы предотвратить протеолитическое расщепление иммобилизованных белков, важно использовать надлежащие ингибиторы протеазы в буферах гомогенизации и солюбилизации. Для выявления необходимых ингибиторов протеазы рекомендуется поиск литературы. В процессе оптимизации протокола мы определили, что добавление АТФ и глицерина увеличивает количество сайтов связывания (Bmax) на колонках CMAC при иммобилизации TrkB. Другие кофакторы могут быть необходимы при оптимизации иммобилизации других типов трансмембранных мишеней24. В настоящее время мы исследуем добавление холестерина в процессе иммобилизации TrkB, так как недавно было обнаружено, что холестерин модифицирует эффекты лигандов TrkB48. Ранее сообщалось, что добавление холестерина и/или других липидов может потребоваться для получения функциональных колонок24 CMAC.

Различные типы детекторов могут быть использованы для мониторинга элюата колонны, включая детектор диодной решетки для лигандов с хромофорами, масс-спектрометрию или детектор радиопотока для радиоактивных лигандов.

Мониторинг устойчивости колонн CMAC имеет решающее значение. Колонки CMAC могут быть стабильными в течение нескольких месяцев, в зависимости от типа иммобилизованного белка, частоты использования и условий хранения. Рекомендуется хранить колонку в 0,05% растворе азида натрия в буфере ацетата аммония при 4 °C, если колонка остается неиспользованной более недели. Важно тщательно промыть колонну буфером ацетата аммония через более длительные периоды времени, прежде чем пытаться его использовать. Рекомендуется следить за функциональностью колонки путем введения выбранной концентрации маркерного лиганда еженедельно.

Несмотря на многочисленные преимущества, технология CMAC имеет несколько ограничений, которые необходимо учитывать при использовании столбцов в поисках лекарств. Во-первых, количество иммобилизованных трансмембранных мишеней со временем уменьшается, в связи с чем рекомендуется еженедельно контролировать общее количество сайтов связывания24. Одной из причин такого снижения является следствие процесса иммобилизации, который основан на адсорбции и не предполагает введения ковалентных связей. Липофильные соединения могут сильно задерживаться на колонках CMAC из-за значительного неспецифического связывания с поверхностью IAM и фосфолипидными бислоями. Это значительно увеличивает время анализа, уменьшая пропускную способность. Процесс подготовки колонки CMAC является специфичным для клеточной линии и требует глубокого понимания природы иммобилизованных белков, что делает его менее подходящим для менее характерных мишеней.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Лукаш Цисла сотрудничает с Regis Technologies, поставщиком IAM. ПК. Частицы DD2.

Acknowledgments

Z.C.A. была поддержана Советом по научным и технологическим исследованиям Турции (TUBITAK) 2219 - Международная программа постдокторских исследований. Исследование, о котором сообщается в этой публикации, было поддержано Национальным центром комплементарной и интегративной медицины Национальных институтов здравоохранения под номером 1R41AT011716-01. Эта работа также была частично поддержана грантом Американского общества фармакогнозии, грантом Regis Technologies для Лос-Анджелеса. Содержание является исключительной ответственностью авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения Национальных институтов здравоохранения.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
7-8 Dihydroxyflavone hydrate Sigma-Aldrich D5446-10 mg ≥98% (HPLC)
Adenosine 5'-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate Sigma-Aldrich A2383-1 g
Ammonium acetate VWR Chemicals BDH BDH9204-500 g
BDNF antibody Invitrogen PA5-15198-400 μL Primary antibody; 2 mg/mL of concentration
Benzamidine hydrochloride hydrate Sigma-Aldrich B6506-25 g
Brain derived neurotrophic factor (BDNF) human Sigma-Aldrich B3795-10 μg Recombinant, expressed in E. coli, lyophilized powder, suitable for cell culture
Calcium chloride VWR Analytical BDH9224-1 kg
Cholic acid sodium salt Alfa Aesar J62050-100 g
Dounce homogenizer VWR 71000-516 40 mL, 285 mm (overall lenght), 32 x 140 mm (O.D. x H)
Ethanol Sigma-Aldrich 493511
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) VWR Analytical BDH-9232-500 g
Fetal bovine serum Sigma-Aldrich F2442-500 mL sterile-filtered, suitable for cell culture
G418 disulfate salt solution Sigma-Aldrich G8168-100 mL 50 mg/mL in H2O, 0.1 μm filtered, suitable for cell culture
Glycerol VWR Life Science E520-100 mL
Immobilized artificial membrane (IAM.PC.DD2) Regis Technologies, Inc. 1-771050-500
Magnesium chloride hexahydrate VWR Analytical BDH9244-500 mL
Methanol Sigma-Aldrich 322425
Nikon C2 DUVb Nikon Confocal laser scanning microscope
Normal goat serum (10%) Life Technologies 50197Z
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich P4333-100 mL
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) Thermo Scientific 36978-5 g
Phosphate buffered saline (PBS) VWR Life Science K812-500 mL 1x
Potassium chloride VWR Chemicals BDH 0395-1 kg
Protease inhibitor cocktail VWR Life Science Ambreso M221-1 mL Proteomics grade, containing 50 mM AEBSF, 30 µM aprotonin, 1 mM bestatin, 1 mM E-64 and 1 mM leupeptin
RPMI-1640 medium Sigma-Aldrich R8758-500 mL with L-glutamine and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture
Secondary antibody goat anti-rabbit IgG (H+L) Invitrogen Alexa Flour Plus 488 A32731
SH-SY5Y Neuroblastoma cell lines expressing Trk-B Kerafast ECP007
SH-SY5Y Trk-NULL cell line Kerafast ECP005
Snake skin dialysis tubing Thermo Scientific 88245 10K MWCO, 35 mm dry I.D.
Sodium azide Sigma-Aldrich S2002
Sodium chloride BDH VWR Analytical BDH9286-2.5 kg
Tricorn 5/20 column GE Healthcare 24-4064-08
Tris-HCl VWR Life Science 0497-1 kg
Trypsin-EDTA solution Sigma-Aldrich T4049-500 mL 0.25%, sterile-filtered, suitable for cell culture, 2.5 g porcine trypsin and 0.2 g EDTA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thomford, N. E., et al. Natural Products for Drug Discovery in the 21st Century: Innovations for Novel Drug Discovery. International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1578 (2018).
  2. Atanasov, A. G., Zotchev, S. B., Dirsch, V. M. International Natural Product Sciences Taskforce, Supuran, C.T. Natural products in drug discovery: advances and opportunities. Nature Reviews. Drug Discovery. 20 (3), 200-216 (2021).
  3. Altmann, K. H. Drugs from the Oceans: Marine Natural Products as Leads for Drug Discovery. Chimia. 71 (10), 646-652 (2017).
  4. Bernardini, S., Tiezzi, A., Laghezza Masci, V., Ovidi, E. Natural products for human health: an historical overview of the drug discovery approaches. Natural Product Research. 32 (16), 1926-1950 (2018).
  5. DeCorte, B. L. Underexplored Opportunities for Natural Products in Drug Discovery. Journal of Medicinal Chemistry. 59 (20), 9295-9304 (2016).
  6. Lee, J., Jo, D. G., Park, D., Chung, H. Y., Mattson, M. P. Adaptive cellular stress pathways as therapeutic targets of dietary phytochemicals: focus on the nervous system. Pharmacological Reviews. 66 (3), 815-868 (2014).
  7. Hornykiewicz, O. L-DOPA: from a biologically inactive amino acid to a successful therapeutic agent. Amino Acids. 23 (1-3), 65-70 (2002).
  8. Hoyer, D. Targeting the 5-HT system: Potential side effects. Neuropharmacology. 179, 108233 (2020).
  9. Nur, S., Adams, C. E. Chlorpromazine versus reserpine for schizophrenia. The Cochrane Database of Systematic Reviews. 4, (2016).
  10. Chung, H. Y., et al. Redefining Chronic Inflammation in Aging and Age-Related Diseases: Proposal of the Senoinflammation Concept. Aging and Disease. 10 (2), 367-382 (2019).
  11. Fitzgerald, K. N., et al. Potential reversal of epigenetic age using a diet and lifestyle intervention: a pilot randomized clinical trial. Aging. 13 (7), 9419-9432 (2021).
  12. Zhao, L., Lee, J. Y., Hwang, D. H. Inhibition of pattern recognition receptor-mediated inflammation by bioactive phytochemicals. Nutrition Reviews. 69 (6), 310-320 (2011).
  13. Corbi, G., et al. Dietary Phytochemicals in Neuroimmunoaging: A New Therapeutic Possibility for Humans? Frontiers in Pharmacology. 7, 364 (2016).
  14. Davinelli, S., et al. Dietary phytochemicals and neuro-inflammaging: from mechanistic insights to translational challenges. Immunity & Ageing: I & A. 13, 16 (2016).
  15. Ostan, R., et al. Inflammaging and cancer: a challenge for the Mediterranean diet. Nutrients. 7 (4), 2589-2621 (2015).
  16. Martucci, M., et al. Mediterranean diet and inflammaging within the hormesis paradigm. Nutrition Reviews. 75 (6), 442-455 (2017).
  17. Szarcvel Szic, K., Declerck, K., Vidakovic, M., Vanden Berghe, W. From inflammaging to healthy aging by dietary lifestyle choices: is epigenetics the key to personalized nutrition. Clinical Epigenetics. 7 (1), 33 (2015).
  18. Dean, E., Gormsen Hansen, R. Prescribing optimal nutrition and physical activity as "first-line" interventions for best practice management of chronic low-grade inflammation associated with osteoarthritis: evidence synthesis. Arthritis. , 560634 (2012).
  19. Ruiz-Núñez, B., Pruimboom, L., Dijck-Brouwer, D. A., Muskiet, F. A. Lifestyle and nutritional imbalances associated with Western diseases: causes and consequences of chronic systemic low-grade inflammation in an evolutionary context. TheJournal of Nutritional Biochemistry. 24 (7), 1183-1201 (2013).
  20. Agarwal, P., et al. MIND Diet Associated with Reduced Incidence and Delayed Progression of Parkinsonism in Old Age. The Journal of Nutrition, Health & Aging. 22 (10), 1211-1215 (2018).
  21. Morris, M. C., et al. MIND diet associated with reduced incidence of Alzheimer's Disease. Alzheimer's & Dementia: The Journal of the Alzheimer's Association. 11 (9), 1007-1014 (2015).
  22. Franceschi, C., Garagnani, P., Parini, P., Giuliani, C., Santoro, A. Inflammaging: a new immune-metabolic viewpoint for age-related diseases. Nature Reviews. Endocrinology. 14 (10), 576-590 (2018).
  23. Ciesla, L., Moaddel, R. Comparison of analytical techniques for the identification of bioactive compounds from natural products. Natural Product Reports. 33 (10), 1131-1145 (2016).
  24. Moaddel, R., Wainer, I. W. The preparation and development of cellular membrane affinity chromatography columns. Nature Protocols. 4 (2), 197-205 (2009).
  25. Ferrer, I., et al. BDNF and full-length and truncated TrkB expression in Alzheimer disease. Implications in therapeutic strategies. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 58 (7), 729-739 (1999).
  26. Numakawa, T., Odaka, H., Adachi, N. Actions of Brain-Derived Neurotrophin Factor in the Neurogenesis and Neuronal Function, and Its Involvement in the Pathophysiology of Brain Diseases. International Journal of Molecular Sciences. 19 (11), 3650 (2018).
  27. Lima Giacobbo, B., et al. Brain-Derived Neurotrophic Factor in Brain Disorders: Focus on Neuroinflammation. Molecular Neurobiology. 56 (5), 3295-3312 (2019).
  28. Wang, Z. H., et al. Deficiency in BDNF/TrkB Neurotrophic Activity Stimulates δ-Secretase by Upregulating C/EBPβ in Alzheimer's Disease. Cell Reports. 28 (3), 655-669 (2019).
  29. Devi, L., Ohno, M. TrkB Reduction Exacerbates Alzheimer's Disease-like Signaling Aberrations and Memory Deficits without Affecting beta-Amyloidosis in 5XFAD Mice. Translational Psychiatry. 5 (5), 562 (2015).
  30. Jiao, S. S., et al. Brain-derived Neurotrophic Factor Protects against Tau-related Neurodegeneration of Alzheimer's Disease. Translational Psychiatry. 6 (10), 907 (2016).
  31. Ng, T., Ho, C., Tam, W., Kua, E., Ho, R. C. Decreased Serum Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) Levels in Patients with Alzheimer's Disease (AD): A Systematic Review and Meta-Analysis. International Journal of Molecular Sciences. 20 (2), 257 (2019).
  32. Amidfar, M., de Oliveira, J., Kucharska, E., Budni, J., Kim, Y. K. The Role of CREB and BDNF in Neurobiology and Treatment of Alzheimer's Disease. Life Sciences. 257, 118020 (2020).
  33. Atasoy, I. L., et al. Both Secreted and the Cellular Levels of BDNF Attenuated due to Tau Hyperphosphorylation in Primary Cultures of Cortical Neurons. Journal of Chemical Neuroanatomy. 80, 19-26 (2017).
  34. Rosa, E., et al. Tau Downregulates BDNF Expression in Animal and Cellular Models of Alzheimer's Disease. Neurobiology of Aging. 48, 135-142 (2016).
  35. Xiang, J., et al. Delta-secretase-cleaved Tau Antagonizes TrkB Neurotrophic Signalings, Mediating Alzheimer's Disease Pathologies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (18), 9094-9102 (2019).
  36. Giuffrida, M. L., Copani, A., Rizzarelli, E. A Promising Connection between BDNF and Alzheimer's Disease. Aging. 10 (8), 1791-1792 (2018).
  37. Ando, S., et al. Animal Model of Dementia Induced by Entorhinal Synaptic Damage and Partial Restoration of Cognitive Deficits by BDNF and Carnitine. Journal of Neuroscience Research. 70 (3), 519-527 (2002).
  38. Fischer, D. L., Sortwell, C. E. BDNF Provides Many Routes Toward STN DBS-Mediated Disease Modification. Movement Disorders. Official Journal of the Movement Disorder Society. 34 (1), 22-34 (2019).
  39. Zhang, F., Kang, Z., Li, W., Xiao, Z., Zhou, X. Roles of Brain-derived Neurotrophic Factor/Tropomyosin-related Kinase B (BDNF/TrkB) Signalling in Alzheimer's Disease. Journal of Clinical Neuroscience: Official Journal of the Neurological Society of Australasia. 19 (7), 946-949 (2012).
  40. Pilakka-Kanthikeel, S., Atluri, V. S., Sagar, V., Saxena, S. K., Nair, M. Targeted Brain Derived Neurotropic Factors (BDNF) Delivery across the Blood-Brain Barrier for Neuro-protection using Magnetic Nano Carriers: An In-vitro Study. PLoS One. 8 (4), 62241 (2013).
  41. Jang, S. W., et al. A Selective TrkB Agonist with Potent Neurotrophic Activities by 7,8-Dihydroxyflavone. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (6), 2687-2692 (2010).
  42. Todd, D., et al. A Monoclonal Antibody TrkB Receptor Agonist as a Potential Therapeutic for Huntington's Disease. Plos One. 9 (2), 87923 (2014).
  43. Liu, X., et al. Optimization of a Small Tropomyosin-Related Kinase B (TrkB) Agonist 7,8-Dihydroxyflavone Active in Mouse Models of Depression. Journal of Medicinal Chemistry. 55 (19), 8524-8537 (2012).
  44. Liu, X., et al. Biochemical and Biophysical Investigation of the Brain-derived Neurotrophic Factor Mimetic 7,8-Dihydroxyflavone in the Binding and Activation of the TrkB Receptor. The Journal of Biological Chemistry. 289 (40), 27571-27584 (2014).
  45. Chen, L., Gao, X., Zhao, S., Hu, W., Chen, J. The Small-Molecule TrkB Agonist 7,8-Dihydroxyflavone Decreases Hippocampal Newborn Neuron Death After Traumatic Brain Injury. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 74 (6), 557-567 (2015).
  46. Liu, X., et al. Optimization of a Small Tropomyosin-related Kinase B (TrkB) Agonist 7,8-Dihydroxyflavone Active in Mouse Models of Depression. Journal of Medicinal Chemistry. 55 (19), 8524-8537 (2012).
  47. Zhang, Z., et al. 7,8-Dihydroxyflavone Prevents Synaptic Loss and Memory Deficits in a Mouse Model of Alzheimer's Disease. Neuropsychopharmacology: Official Publication of the American College of Neuropsychopharmacology. 39 (3), 638-650 (2014).
  48. Casarotto, P. C., et al. Antidepressant Drugs Act by Directly Binding to TRKB Neurotrophin Receptors. Cell. 184 (5), 1299-1313 (2021).
  49. Iyer, R., et al. Entrectinib is a potent inhibitor of Trk-driven neuroblastomas in a xenograft mouse model. Cancer letters. 372 (2), 179-186 (2016).
  50. Iyer, R., et al. Nanoparticle delivery of an SN38 conjugate is more effective than irinotecan in a mouse model of neuroblastoma. Cancer letters. 360 (2), 205-212 (2015).
  51. Ng, E. S., Chan, N. W., Lewis, D. F., Hindsgaul, O., Schriemer, D. C. Frontal Affinity Chromatography-Mass spectrometry. Nature Protocols. 2 (8), 1907-1917 (2007).
  52. Maciuk, A., Moaddel, R., Haginaka, J., Wainer, I. W. Screening of Tobacco Smoke Condensate for Nicotinic Acetylcholine Receptor Ligands using Cellular Membrane Affinity Chromatography Columns and Missing Peak Chromatography. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 48 (2), 238-246 (2008).
  53. Harvey, A. L., Edrada-Ebel, R., Quinn, R. J. The Re-emergence of Natural Products for Drug Discovery in the Genomics Era. Nature Reviews. Drug Discovery. 14 (2), 111-129 (2015).
  54. Ciesla, L., et al. Development and Characterization of the α3β4α5 Nicotinic Receptor Cellular Membrane Affinity Chromatography Column and Its Application for on line Screening of Plant Extracts. Journal of Chromatography A. 1431, 138-144 (2016).

Tags

Биохимия выпуск 179
Колонки клеточной мембранной аффинности хроматографии для идентификации специализированных растительных метаболитов, взаимодействующих с иммобилизованным рецептором тропомиозинкиназы B
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Arituluk, Z. C., Adhikari, B.,… More

Arituluk, Z. C., Adhikari, B., Maitra, U., Goodman, C., Ciesla, L. M. Cellular Membrane Affinity Chromatography Columns to Identify Specialized Plant Metabolites Interacting with Immobilized Tropomyosin Kinase Receptor B. J. Vis. Exp. (179), e63118, doi:10.3791/63118 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter