Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

עמודי כרומטוגרפיה של זיקה לממברנת התא לזיהוי מטבוליטים מיוחדים של צמחים המקיימים אינטראקציה עם קולטן Tropomyosin Kinase משותק B

Published: January 19, 2022 doi: 10.3791/63118
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1
1Department of Biological Sciences, The University of Alabama, 2Department of Pharmaceutical Botany, Faculty of Pharmacy, Hacettepe University

Summary

הפרוטוקול מתאר את ההכנה של עמודי כרומטוגרפיית זיקה של קרום התא (CMAC) עם שברי קרום תאים משותקים המכילים חלבוני קולטן B טרנס-ממברנה tropomyosin kinase פונקציונליים. כמו כן מוסבר השימוש בעמודות CMAC בזיהוי מטבוליטים צמחיים מיוחדים המקיימים אינטראקציה עם קולטנים אלה ונוכחים בתערובות טבעיות מורכבות.

Abstract

כימיקלים המסונתזים על ידי צמחים, פטריות, חיידקים וחסרי חוליות ימיים היו מקור עשיר לפגיעות ומובילות של תרופות חדשות. תרופות כגון סטטינים, פניצילין, פקליטקסל, רפמיצין או ארטמיסינין, המשמשים בדרך כלל בפרקטיקה הרפואית, זוהו לראשונה ובודדו ממוצרים טבעיים. עם זאת, זיהוי ובידוד של מטבוליטים מיוחדים פעילים ביולוגית ממקורות טבעיים הוא תהליך מאתגר וגוזל זמן. באופן מסורתי, מטבוליטים בודדים מבודדים ומטוהרים מתערובות מורכבות, בעקבות מיצוי הביומסה. לאחר מכן, המולקולות המבודדות נבדקות במבחנים פונקציונליים כדי לאמת את פעילותן הביולוגית. כאן אנו מציגים את השימוש בעמודות כרומטוגרפיית זיקה של קרום התא (CMAC) לזיהוי תרכובות פעילות ביולוגית ישירות מתערובות מורכבות. עמודות CMAC מאפשרות זיהוי של תרכובות המקיימות אינטראקציה עם חלבוני טרנס-ממברנה פונקציונליים משותקים (TMPs) המוטבעים בסביבה הדו-שכבתית הפוספוליפידית המקורית שלהם. זוהי גישה ממוקדת, הדורשת הכרת ה-TMP שאת פעילותו מתכוונים לווסת עם המועמד החדש שזוהה לתרופה עם המולקולה הקטנה שזוהתה. בפרוטוקול זה, אנו מציגים גישה להכנת עמודות CMAC עם קולטן tropomyosin קינאז משותק B (TrkB), אשר התגלה כמטרה בת קיימא לגילוי תרופות עבור הפרעות רבות במערכת העצבים. במאמר זה, אנו מספקים פרוטוקול מפורט להרכבת עמודת CMAC עם קולטני TrkB משותקים באמצעות קווי תאי נוירובלסטומה המבטאים יתר על המידה קולטני TrkB. כמו כן, אנו מציגים את הגישה לחקור את הפונקציונליות של העמודה ואת השימוש בה בזיהוי מטבוליטים צמחיים מיוחדים המקיימים אינטראקציה עם קולטני TrkB.

Introduction

תערובות בוטניות עשירות בתרכובות פעילות פרמקולוגית1, משמשות כמקור טוב לזיהוי להיטים של תרופות חדשות ומובילות 2,3,4,5. הגילוי של תרופות חדשות ממוצרים טבעיים היה גישה פורייה ותרופות רבות שאושרו כיום מקורן בתרכובות שזוהו לראשונה בטבע. המגוון הכימי של תרכובות טבעיות קשה להתאמה על ידי ספריות מעשה ידי אדם של מולקולות מסונתזות כימית. תרכובות טבעיות רבות מתקשרות עם מטרות חלבונים אנושיות ומווסתות אותן, ויכולות להיחשב למולקולות דמויות-תרופה שעברו אופטימיזציה אבולוציונית6. תרכובות טבעיות אלה מתאימות במיוחד לזיהוי עופרת סמים לשימוש בהפרעות נוירולוגיות6. שתיים מהתרופות המאושרות כיום על ידי ה-FDA לטיפול במחלת אלצהיימר (AD) מופקות מאלקלואידים טבעיים, כלומר: גלנטמין וריבסטיגמין (נגזרת של physostigmine)6. L-DOPA, כיום התרופה הנפוצה ביותר למחלת פרקינסון, זוהתה לראשונה מהשעועית הרחבה (Vicia faba L.) 7. פרגוליד וליזורייד, אגוניסטים של קולטן דופמינרגי הם הנגזרות של אלקלואידים ארגוט טבעיים מהפטריה הטפילית Claviceps purpurea8. רסרפין, אלקלואיד שבודד מנחש הודי (Rauvolfia serpentina (L.) Benth. ex Kurz) היה אחד התרופות האנטי-פסיכוטיות הראשונות9. לאחרונה, תגובה חיסונית לא מווסתת ודלקת מערכתית נקשרו להתפתחות של מחלות נוירולוגיות רבות, כגון הפרעת דיכאון מז'ורי או מחלות נוירודגנרטיביות10. תזונה מבוססת צמחים יחד עם התערבויות אחרות באורח החיים נמצאה כמשפרת את היכולות הקוגניטיביות והתפקודיות בקרב קשישים 11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 . מולקולות אלקטרופיליות מסוימות השייכות לטריטרפנים ולפוליפנולים נמצאו כמכשירות תגובות דלקתיות הן במודלים של in vitro והן במודלים in vivo 12. לדוגמה, תרכובות טבעיות המכילות α,β-קרבוניל בלתי רווי (לדוגמה, כורכומין, סינמאלדהיד), או קבוצת איזותיוציאנטים (למשל, סולפוראפן) מפריעות לדמריזציה של קולטן דמוי אגרה-4 (TLR4) המעכבת את הסינתזה במורד הזרם של ציטוקינים פרו-דלקתיים בקו תאי פרו-B תלויי מורין אינטרלוקין-3בקו 12,22 . עדויות אפידמיולוגיות מצביעות על כך שפיטוכימיקלים תזונתיים, הנמצאים במטריצות מזון מורכבות, עשויים גם הם להוות מקור בר קיימא של תרופות חדשות המובילות6.

אחד המכשולים העיקריים בזיהוי מולקולות פעילות ביולוגית הנמצאות בתמציות צמחים, כולל מזון צמחי, הוא המורכבות של הדגימות הנחקרות. באופן מסורתי, התרכובות הבודדות מבודדות, מטוהרות, ולאחר מכן נבדקות לפעילות ביולוגית. גישה זו מובילה בדרך כלל לזיהוי התרכובות הנפוצות והמאופיינות ביותר. גישות לגילוי תרופות פנוטיפיות ללא מטרה מולקולרית מוגדרת מסתמכות על פיצול מונחה ביולוגית של תערובות מורכבות23. בגישה זו, תמצית מחולקת לתת-שברים פחות מורכבים שנבדקים לאחר מכן במבחנים פנוטיפיים. הבידוד והטיהור של תרכובות פעילות מונחים על ידי פעילות ביולוגית המאומתת בבדיקה. הידע על זהותה של מטרה תרופתית מוגדרת עשוי להאיץ באופן משמעותי את זיהוי התרכובות הפעילות מבחינה פרמקולוגית הקיימות בתערובות מורכבות. גישות אלה מבוססות בדרך כלל על אימוביליזציה של המטרה המולקולרית, למשל, אנזים, על משטח מוצק, כמו חרוזים מגנטיים23. המטרות המשותקות משמשות לאחר מכן בניסויי הסינון וכתוצאה מכך בידוד של תרכובות המקיימות אינטראקציה עם המטרה. בעוד שגישה זו שימשה באופן נרחב בזיהוי תרכובות המכוונות לחלבונים ציטוזוליים, היא יושמה פחות נפוץ בזיהוי כימיקלים המקיימים אינטראקציה עם חלבוני טרנס-ממברנה (TMPs)23. אתגר נוסף בשתוק של TMPs נובע מהעובדה שפעילות החלבון תלויה באינטראקציה שלו עם פוספוליפידים של קרום התא ומולקולות אחרות בדו-שכבתיות כגון כולסטרול23,24. חשוב לשמר את האינטראקציות העדינות האלה בין חלבונים לבין הסביבה הדו-שכבתית הפוספוליפידית הטבעית שלהם כאשר הם מנסים לשתק את המטרה הטרנס-ממברנית.

בכרומטוגרפיה של קרום התא (CMAC) שברי קרום התא, ולא חלבונים מטוהרים, משותקים על חלקיקי הפאזה הנייחים של הממברנה המלאכותית (IAM)23. פאזות נייחות של IAM מוכנות על ידי חיבור קוולנטי של אנלוגים פוספטידילכולין על סיליקה. לאחרונה פותחו מחלקות חדשניות של שלבים נייחים של IAM שבהן קבוצות אמין וסילנול חופשיות מכוסות סופית (IAM). מחשב אישי. חלקיקי DD2). במהלך הכנת עמודי CMAC שברי קרום התא משותקים על פני השטח של חלקיקי IAM באמצעות ספיחה.

עמודי CMAC שימשו עד כה לשתוק סוגים שונים של TMPs, כולל תעלות יונים (למשל, קולטנים ניקוטיניים), GPCRs (למשל, קולטני אופיואידים), מובילי חלבונים (למשל, p-גליקופרוטאין) וכו'24. מטרות החלבון המשותקות שימשו באפיון פרמקודינמיקה (למשל, קבוע דיסוציאציה, Kd) או בקביעת קינטיקה קושרת (kon ו-koff) של ליגנדות של מולקולות קטנות המקיימות אינטראקציה עם המטרה וכן בתהליך זיהוי של מובילי תרופות חדשות פוטנציאליים הנמצאים במטריצות מורכבות24 . כאן אנו מציגים את ההכנה של עמודות CMAC עם קולטן tropomyosin קינאז משותק B (TrkB), אשר התגלה כמטרה בת קיימא לגילוי תרופות עבור הפרעות רבות במערכת העצבים.

מחקרים קודמים הראו כי הפעלת הגורם הנוירוטרופי שמקורו במוח (BDNF)/TrkB קשורה לשיפור של מחלות נוירולוגיות מסוימות, כגון AD או הפרעת דיכאון מז'ורי 25,26,27,28. דווח כי רמות ה-BDNF והביטוי של הקולטן שלו TrkB יורדים באלצהיימר, והפחתות דומות פוגעות בתפקוד ההיפוקמפוס במודלים של בעלי חיים של29 לספירה. ירידה ברמות של BDNF דווחה בסרום ובמוח של חולי אלצהיימר 30,31,32. ביטוי יתר של טאו או היפר-פוספורילציה נמצאו כמפחיתים את ההנמכה של ביטוי ה-BDNF בתאי עצב ראשוניים ובמודלים של חיות AD 33,34,35. בנוסף, דווח כי ל-BDNF יש השפעות מגינות על רעילות עצבית הנגרמת על ידי β-עמילואיד במבחנה וב-in vivo36. הודגם כי מתן BDNF ישיר למוח החולדה מגביר את הלמידה והזיכרון אצל בעלי חיים לקויים קוגניטיבית37. BDNF/TrkB התגלה כיעד תקף להפרעות נוירולוגיות ופסיכיאטריות, כולל28,38 לספירה. התמקדות במסלול האיתות BDNF/TrkB לפיתוח טיפולים ב-AD עשויה לשפר את הבנתנו את המחלה39. למרבה הצער, BDNF עצמו לא יכול לשמש כטיפול בגלל התכונות הפרמקוקינטיות הגרועות שלו ותופעות לוואי שליליות40. מפעילי מולקולות קטנות של מסלולי TrkB/BDNF נחקרו כליגנדות TrkB פוטנציאליות 41,42,43. בקרב אגוניסטים של מולקולות קטנות שנבדקו, הוכח כי 7,8-דיהידרוקסיפלבון (7,8-DHF) מפעיל את מסלול ה-BDNF/TrkB 41,44,45,46. נגזרת של 7,8-DHF (R13; 4-Oxo-2-phenyl-4H-chromene-7,8-diyl bis(methylcarbamate)) נמצאת כעת בבחינה כתרופה אפשרית עבור AD47. לאחרונה, הוכח כי מספר תרופות נוגדות דיכאון פועלות באמצעות קשירת קשר ישיר ל- TrkB וקידום איתות BDNF, מה שמדגיש עוד יותר את החשיבות של רדיפה אחר TrkB כמטרה תקפה לטיפול בהפרעות נוירולוגיות שונות48.

הפרוטוקול מתאר את התהליך של הרכבת עמודת TrkB פונקציונלית ועמודת בקרה שלילית TrkB-NULL. העמודות מאופיינות באמצעות מוצר טבעי ידוע ליגנד קטן-מולקולרי: 7,8-DHF. בנוסף, אנו מתארים את תהליך סינון המטריצות המורכבות, תוך שימוש בתמצית צמחים כדוגמה, לזיהוי תרכובות המקיימות אינטראקציה עם TrkB.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. תרבית תאים של תאי נוירובלסטומה SH-SY5Y (קווי תאים TrkB ו-TrkB-NULL (הורים) )

הערה: קווי תאים (SH-SY5Y Cell Line (TrkB, BR6) וקו תאי הורים SH-SY5Y (TrkB NULL))49,50 נרכשו מ-Kerafast. תאים בתרבית משמשים כמקור של קולטני transmembrane להיות משותקים להכנת עמודות CMAC. השלבים הבאים מתארים כיצד להשיג שברי קרום התא ולהרכיב עמודות CMAC פונקציונליות.

  1. לגדל את התאים בתווך תרבית תאים שהוכן על ידי ערבוב של 450 מ"ל של מדיית RPMI, 50 מ"ל של FBS, 5 מ"ל של תמיסת פניצילין/סטרפטומיצין, ו-0.3 מ"ג/מ"ל של גנטיקין (G418) בצלחת תרבית תאים של 150 מ"מ בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספרה לחה עם 5% CO2.

2. קצירת תאים

  1. אשר את מפגש התאים (80%-90%) באמצעות מיקרוסקופ, שהושג לאחר 3-4 ימים לאחר העברת התא.
  2. לשאוף לתרבית תאים מדיום מעל התאים ולשטוף את התאים פעמיים עם מלח בעל מאגר פוספט (PBS, 1x, pH 7.4). הסר PBS והוסף 2 מ"ל של טריפסין מרוכז נמוך (0.25%) כדי לנתק תאים.
  3. סובבו בעדינות את הצלחת כדי לכסות באופן שווה את כל התאים בתמיסת טריפסין ודגרו את התאים למשך כ-2 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספרה לחה עם 5% CO2. מוסיפים 8 מ"ל של מדיום תרבית תאים לתאים מתנתקים ומעבירים תאים מנותקים לצינור חרוטי של 50 מ"ל ומניחים אותו על קרח.
  4. השתמש בהמוציטומטר כדי להעריך את מספר התאים (בערך 3 x 107 תאים). ערבבו את תרחיף התאים על ידי צנרת למעלה ולמטה כדי לקבל צפיפות תאים אחידה בתערובת. מניחים 10 μL של תרחיף התא מתחת לכיסוי וסופרים את התאים תחת מיקרוסקופ באמצעות מטרה של פי 40.

3. הומוגניזציה של התא

  1. הכינו תמיסות של מעכבי הפרוטאזות הבאים: בנזמידין (200 מ"מ), פניל-מתיל-סולפוניל פלואוריד (PMSF, 10 מ"מ), וקוקטייל מעכבי פרוטאז הזמינים מסחרית (ריכוז של פי 100) המכיל 4-(2-אמינואתיל)בנזנסולפוניל פלואוריד הידרוכלוריד (AEBSF), אפרוטינין, בסטטין ולאופפטין.
    אזהרה: PMSF צריך להיות מטופל רק בתוך מכסה האדים.
    1. הכן תמיסת מלאי בנזמידין (200 מ"מ) על ידי המסת 120 מ"ג של בנזמידין ב-5 מ"ל של מים אולטרה-פוריים שעברו דה-יוניזציה. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ולהשתמש תוך יום. להכין תמיסה טרייה לפני כל שימוש (מומלץ).
    2. הכן פתרון מלאי PMSF (10 mM) על ידי המסת 0.017 גרם של PMSF ב -10 מ"ל של אתנול. יש לאחסן ב- - 20 מעלות צלזיוס.
    3. הכינו קוקטייל מעכבי פרוטאז (פי 100) על ידי המסת תערובת מעכבי פרוטאז הזמינה מסחרית ב-1 מ"ל של מים אולטרה-פוריים שעברו דה-יוניזציה. מערבבים היטב ומכניסים 200-300 μL של הקוקטייל ומאחסנים בטמפרטורה של - 20 מעלות צלזיוס לפני השימוש.
  2. הכן תמיסת ATP (100 mM) על ידי המסת 55.114 מ"ג של מלח ATP דיסודיום מלח הידרט ב 1 מ"ל של מים אולטרה-פורים שעברו דה-יוניזציה. יש לערבב היטב ולהעלות 100 μL של התערובת ולאחסן ב - 20 °C (76 °F) לפני השימוש.
  3. הכן חיץ על ידי המסת 3.03 גרם של טריס (הידרוקסימתיל) אמינומתאן הידרוכלוריד (Tris-HCl, 50 mM), 2.9 גרם נתרן כלורי (NaCl, 100 mM), 0.22 גרם של סידן כלורי נטול מים (CaCl2, 3 mM), 0.2 גרם של מגנזיום כלוריד הקסהידרט (MgCl2, 2 mM) ו-0.19 של אשלגן כלורי (KCl, 5 mM) ב-500 מ"ל של מים אולטרה-אפורים שעברו דה-יוניזציה.
  4. הכן מאגר הומוגניזציה על ידי ערבוב של 17.3 מ"ל מהמאגר שהוכן בשלב 3.3 עם 0.3 מ"ל (3 mM) של תמיסת מלאי בנזמידין, 0.2 מ"ל (0.1 מ"ל) של תמיסת מלאי PMSF, 0.2 מ"ל של תערובת קוקטיילים מעכבי פרוטאז, 20 μL (100 μM) של תמיסת מלאי ATP, 2 מ"ל (10%) של גליצרול, ו-0.029 גרם (5mM) של EDTA (טבלה 1). התאם את ה-pH ל-7.4 באמצעות תמיסת חומצה הידרוכלורית.
  5. סובבו את התאים שנקטפו בשלב 2.3 ב-4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ב-400 x גרם. הסר את ה-supernatant ושטף את גלולת התא הנותרת עם 10 מ"ל של PBS קר כקרח (1x, pH 7.4). סובבו את התאים שוב ב-4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ב-400 x גרם.
  6. השליכו את הסופרנאטנט והחליפו אותו ב-20 מ"ל של מאגר הומוגניזציה שהוכן בשלב 3.4. הניחו את הצינור החרוטי על הקרח.
  7. מעבירים את תרחיף התא לתוך מטחנת רקמת הומוגנייזר של Dounce בגודל 40 מ"ל ומניחים אותה על קרח. הומוגניזציה של המתלים באופן ידני, על קרח, באמצעות 40 משיכות הדברה למעלה ולמטה. העברת תרחיף תא הומוגני לתוך צינור חרוטי של 50 מ"ל.
  8. צנטריפוגה ההומוגנטית ב 4 ° C במשך 7 דקות ב 400 x g. השליכו את הכדור והעבירו את הסופרנאטנט לצינור חרוטי חדש וצנטריפוגה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ב-47900 x גרם. שמור את גלולת קרום התא והשלך את הסופרנאטנט.

4. סולוביליזציה של קרום התא

  1. הכינו את מאגר הסולוביליזציה על ידי ערבוב של 8.7 מ"ל מתמיסת החיץ המיוצרת בשלב 3.3 עם 0.1 מ"ל (0.1 מ"ל) של תמיסת מניות PMSF, 0.15 מ"ל (3 מ"ל) של תמיסת מלאי בנזמידין, 0.1 מ"ל של קוקטייל מעכבי פרוטאז, 10 μL (100 μM) של תמיסת מניות ATP, 1 מ"ל (10%) של גליצרול ו-0.2 גרם (2%) של נתרן כולאט (2%) של נתרן כולאט (טבלה 2).
  2. מעבירים את חיץ הסולוביליזציה לתוך הצינור החרוטי עם שברי קרום התא המתקבלים בשלב 3.8 ומחזרים את הכדור. סובב את התערובת המתקבלת ב-150 סל"ד ב-4 מעלות צלזיוס למשך 18 שעות.
    הערה: בשלב זה, ניתן להשהות את הניסוי לצורך סולוביליזציה של כדוריות קרום התא במהלך הלילה.

5. אימוביליזציה של קרום התא ב-IAM. מחשב אישי. חלקיקי DD2

  1. לאחר 18 שעות, צנטריפוגה את תערובת הסולוביליזציה ב 4 °C (64 °F) למשך 30 דקות ב 47900 x g.
  2. שמרו על הסופרנט והשליכו את הכדור. הוסיפו 100 מ"ג של IAM. מחשב אישי. חלקיקי DD2, לסופרנאטנט, מערבולת ומסובבים את תערובת ההשעיה המתקבלת ב-150 סל"ד ב-4 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת.
  3. כדי להקל על אימוביליזציה של שברי קרום התא ב- IAM. מחשב אישי. חלקיקי DD2 ממשיכים לשלב הדיאליזה כמתואר להלן.
    1. הכן חיץ דיאליזה ב-4 ליטר של מים אולטרה-פוריים שעברו דה-יוניזציה על-ידי הוספת 24 גרם של tris-HCl (50 mM), 23.4 גרם NaCl (100 mM), 0.06 גרם של CaCl2 (0.1 mM), 5.85 גרם של EDTA (5 mM) ו-0.07 גרם PMSF (0.1 mM; טבלה 3).
      הערה: PMSF אינו מסיס במים, ולכן ממיסים אותו תחילה בנפח קטן של אתנול ולאחר מכן מוסיפים לאט לתוך הכוס עם החיץ.
    2. התאם את ה- pH ל- 7.4 עם תמיסת חומצה הידרוכלורית. הניחו את המאגר על 4 מעלות צלזיוס למשך שעה לפחות לפני שתמשיכו לשלב הדיאליזה.
    3. הכינו צינור דיאליזה על ידי חיתוך 10 ס"מ של צינורות דיאליזה של קרום התאית (10 K MWCO, 35 מ"מ) והעבירו את המתלים המכילים IAM. מחשב אישי. חלקיקי DD2 ושברי קרום התא לתוך צינור הדיאליזה. השתמש בקטעי צינורות דיאליזה כדי לסגור את שני הקצוות של שפופרת הדיאליזה.
    4. מקם את צינור הדיאליזה המכיל את ה- IAM. מחשב אישי. פאזה נייחת DD2 במאגר הדיאליזה והדיאליזה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות תוך ערבוב עדין.
    5. לאחר 24 שעות, מניחים את צינורות הדיאליזה במאגר הדיאליזה שזה עתה הוכן וממשיכים את הדיאליזה עוד 24 שעות.

6. אריזת עמודות CMAC

  1. הכן חיץ אמוניום אצטט (10 mM, pH 7.4) שישמש לשטיפת ה- IAM. מחשב אישי. חלקיקי DD2 ובניסויי אפיון עמודים על ידי המסת 0.7708 גרם אמוניום אצטט ב-1 ליטר של מים אולטרה-פוריים שעברו דה-יוניזציה. התאם את ה- pH ל- 7.4 עם תמיסת חומצה הידרוכלורית.
  2. לאחר 48 שעות של דיאליזה, הסר את שפופרת הדיאליזה ממאגר הדיאליזה והעבר את תוכן צינור הדיאליזה לצינור חרוטי של 15 מ"ל.
  3. צנטריפוגה את התערובת ב 4 ° C במשך 5 דקות ב 400 x גרם. השליכו את הסופרנאטנט ושטפו את הכדור הנותר שלוש פעמים עם 10 מ"ל של חיץ אמוניום אצטט, תוך צנטריפוגה בתערובת בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ב-400 x גרם, לאחר כל שטיפה.
  4. לאחר הכביסה השלישית, יש להחיות את הכדור הנותר ב-1 מ"ל של חיץ אמוניום אצטט. ערבבו אותו ביסודיות והשתמשו בסלרי שנוצר כדי לארוז את עמוד הזכוכית 5/20 כדי להפיק עמוד כרומטוגרפיית CMAC.
  5. כדי לארוז את העמודה, תחילה מכניסים מסנן תחתון שהושרה בעבר עם חיץ אמוניום אצטט, למחזיק המסנן. התאם את מחזיק המסנן בעמוד הזכוכית והבריג את מכסה העמוד כדי להבטיח את מיקום המחזיק. מניחים את העמוד במאונך במהדק אצבעות ומהדקים אותו במעמד המעבדה. מקם מתחת לעמודה.
  6. באמצעות פיפטטור ערוץ יחיד מעבירים נפח קטן של הסלורי המתקבל בשלב 6.4 לתוך עמוד הזכוכית. יוצקים את החומר באיטיות, מחזיקים את קצה הפיפטה על קיר עמוד הזכוכית. אפשרו לחומר האריזה להתיישב לפני שאתם שופכים עוד נפח של סלרי.
  7. כדי להאיץ את תהליך האריזה, הסר את המאגר מעל המיטה הנייחת באמצעות מיקרופיפט בין כל שלב. חזור על שלבים אלה עד לאריזה של 1 מ"ל של הסלרי.
  8. הניחו מסנן עליון והברגו את יחידת המתאם כך שלא יישאר מאגר מעל הפאזה הנייחת, כפי שמוצג באיור 1. אבטח את המיקום של יחידת המתאם באמצעות נעילת המתאם.
  9. חברו את העמודה למשאבת כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC), הגדירו את קצב הזרימה ל-0.2 מ"ל/דקה ושטפו את העמודה למשך הלילה עם מאגר אמוניום אצטט. הטור מוכן כעת לשלב האפיון. אחסנו את העמודה בטמפרטורה של 4 °C (75 °F) עד לשימוש.
    הערה: לאחסון ארוך יותר (עמודה שאינה בשימוש במשך יותר משבוע) הפעל את העמודה עם תמיסת נתרן אזיד של 0.05% במאגר אמוניום אצטט ואחסן ב- 4 °C (76 °F).
    אזהרה: נתרן אזיד רעיל מאוד כאשר הוא נבלע בעל פה או נספג דרך העור; זה צריך להיות מטופל רק מתחת למכסה האדים. הקפידו ללבוש מעיל מעבדה, משקפי בטיחות וכפפות (ניטריל מועדף) כשאתם עובדים עם נתרן אזיד.

7. אפיון עמודת CMAC

  1. מיקרוסקופיה קונפוקלית וקשירת BDNF
    1. הכן IAM. PCC. חלקיקי פאזה נייחים DD2 עם שברי קרום תאים משותקים המתקבלים בנפרד מתאי נוירובלסטומה SH-SY5Y הבוטאים יתר על המידה תאי TrkB ו- SH-SY5Y TrkB-NULL על ידי ביצוע ההוראות משלב 1 לשלב 6.4.
    2. עבור דגימות שידוגרו עם BDNF לפני צביעת נוגדנים, הכינו תמיסת מלאי BDNF על ידי המסת 10 מיקרוגרם של BDNF ב-100 מיקרול' של מים אולטרה-פוריים שעברו דה-יוניזציה. אחסן את הפתרון בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
      1. העברה בצינורות מיקרוצנטריפוג נפרדים של 1.5 מ"ל, 100 μL aliquot של IAM. מחשב אישי. חומר אריזת עמודי DD2 עם תאי נוירובלסטומה SH-SY5Y משותקים המבטאים יתר על המידה TrkB ו-100 μL aliquot של IAM. מחשב אישי. חומר אריזת עמודי DD2 עם תאי SH-SY5Y TrkB-NULL משותקים התלויים במאגר אמוניום אצטט.
      2. הוסף 390 μL של חיץ אמוניום אצטט, 10 μL של תמיסת מלאי BDNF, ו 0.5 μL של תמיסת מלאי ATP (מוכן בשלב 3.2) לכל צינור ודגירה במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר עם נדנדה.
    3. עבור דגימות שלא יודגרו עם BDNF לפני צביעת נוגדנים, יש להעביר 100 μL aliquot של IAM. מחשב אישי. חומר אריזת עמודי DD2 עם תאי נוירובלסטומה SH-SY5Y משותקים המבטאים יתר על המידה TrkB התלויים באמוניום אצטט לצינורות מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל.
    4. הוסיפו 400 μL של חיץ אמוניום אצטט ו-0.5 μL של תמיסת ATP (שהוכנה בשלב 3.2) לכל צינור ודגרו במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר עם נדנדה.
    5. סובבו את הדגימות שהוכנו בשלבים 7.1.2 ו-7.1.4 ב-4 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת ב-10,000 x גרם והשליכו את הסופרנאטנט.
    6. שטפו את הכדורים שהתקבלו עם 500 μL של חיץ אמוניום אצטט למשך 10 דקות וסובבו שוב ב-4 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת ב-10,000 x גרם והשליכו את הסופרנאטנט.
    7. לכל אחד מהכדורים, הוסיפו 220 μL של חיץ אמוניום אצטט, 25 μL של 10% סרום עיזים רגיל, ו-5 μL של נוגדן אנטי-BDNF ראשוני. דגירה בחדר קר (4 מעלות צלזיוס) לילה עם נדנדה.
    8. עם השלמת שלב הדגירה סובבו את התערובת במשך דקה אחת ב-10,000 x גרם בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס והשליכו את הסופרנאטנט.
    9. שטפו את הכדור שנוצר 3 פעמים עם חיץ אמוניום אצטט המכיל 1% חומר ניקוי קל (למשל, נתרן כולאט) במשך 10 דקות וסובבו את התערובות במשך דקה אחת בטמפרטורה של 10,000 x גרם בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס והשליכו את הסופרנטנט.
    10. הכינו תמיסת נוגדנים משנית על ידי ערבוב של 900 μL של חיץ אמוניום אצטט, 100 μL של 10% סרום עזים תקין, ו-1 μL של נוגדן משני מצומד פלואורופור (1:1,000 דילול). הוסף 300 μL של תמיסת נוגדנים משנית לכל אחד מהכדורים שהתקבלו בשלב 7.1.9. ודגירה לילה ב 4 מעלות צלזיוס עם נדנדה.
    11. סובבו את התערובת ב-10,000 x גרם למשך דקה אחת בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס והשליכו את הסופרנטנט.
    12. שטפו את הכדור שנוצר 3 פעמים עם חיץ אמוניום אצטט המכיל 1% חומר ניקוי קל (למשל, נתרן כולאט) במשך 10 דקות וסובבו את התערובת למשך דקה אחת ב-10,000 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס והשליכו את הסופרנאטנט.
    13. בצעו החייאה של הכדורים המתקבלים ב-50 μL של חיץ אמוניום אצטט. מניחים 20 μL של כל אחת מהתערובות על שקופית ומכסים בכיסוי.
    14. דמיין את ה- IAM. מחשב אישי. חלקיקי DD2 עם שברי קרום התא המשותקים באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי עם עירור של 488 ננומטר ופליטה ב-520 ננומטר שנוצרה באמצעות מערכת לייזר במצב מוצק. השתמש במטרה של פי 20 עם NA של 0.75 ו-WD של 0.35 מ"מ.
  2. כרומטוגרפיית זיקה חזיתית המשתמשת ב-7,8-DHF כליגנד סמן
    1. חבר עמודת CMAC למערכת HPLC באמצעות גלאי מערך דיודה ו/או ספקטרומטר מסה.
    2. הכן 500 מ"ל של תמיסת 1 mM של 7,8-DHF במאגר אמוניום אצטט המכיל 5% מתנול.
    3. ריכוז קבוע של ליגנד הסמן (1 mM) דרך עמודת CMAC בקצב זרימה של 0.4 מ"ל/דקה בטמפרטורת החדר. עקוב אחר פרופיל האלוטיון באמצעות גלאי זיהוי מערך דיודה (DAD) (אורך גל 254 ננומטר) או ספקטרומטר מסה (השתמש במצב ניטור יונים יחיד; m/z 253 במצב יינון שלילי).
    4. לאחר השלמת הריצה לבצע שטיפת לילה על ידי הפעלת חיץ אמוניום אצטט דרך העמודה.
    5. חזור על שלבים 7.2.2. - 7.2.4. באמצעות ריכוזים שונים של ליגנד הסמן (750 ננומטר, 500 ננומטר, 300 ננומטר), שטיפת העמודים לילה לאחר כל ריצה. השתמש בכרומטוגרפיה של זיקה פרונטלית כדי לחשב ליגנד Kd, כפי שנסקר בפירוט, במקום אחר. 24,51
  3. מחקרי עקירה עם סנטלה אסיטיקה (L.) Urb. (גוטו קולה) תמצית
    1. הכינו 500 מ"ל של תמיסת 500 ננומטר של 7,8-DHF במאגר אמוניום אצטט המכיל 5% מתנול ו-0.2% תמצית גוטו קולה מימית (10 מ"ג/מ"ל).
    2. ריכוז קבוע של ליגנדת הסמן (500 ננומטר) כאשר התמצית עוברת דרך העמודה בקצב זרימה של 0.4 מ"ל/דקה בטמפרטורת החדר. עקוב אחר פרופיל האלוטיון באמצעות גלאי DAD (אורך גל 254 ננומטר) או ספקטרומטר מסה (השתמש במצב ניטור יונים יחיד; m/z 253 במצב יינון שלילי).
    3. לאחר השלמת הריצה לבצע שטיפת לילה על ידי הפעלת חיץ אמוניום אצטט דרך העמודה.
    4. התווה את פרופילי האלוהות עבור 500 ננומטר 7,8-DHF ואת זה שהתקבל לאחר הפעלת התמיסה עם תמצית גוטו קולה כדי לבדוק אם יש תזוזת ליגנד סמן.

8. חסרה גישת כרומטוגרפיית שיא לזיהוי קלסרים פוטנציאליים של TrkB מתמצית גוטו קולה

  1. פיצול תמצית גוטו קולה בעמודות CMAC
    1. חבר בנפרד את העמודות CMAC TrkB TrkB ו-TrkB-NULL למערכת HPLC והזריק 50 μL של תמצית גוטו קולה מימית (10 מ"ג/מ"ל) על כל אחד מהעמודים. חיץ אמוניום אצטט (10 mM, pH 7.4) המכיל 5% מתנול דרך העמודה בקצב זרימה של 0.4 מ"ל לדקה בטמפרטורת החדר.
    2. אסוף שברים בנפרד מעמודות CMAC TrkB ו- TrkB-NULL כדלקמן: 0-5 דקות, 5-10 דקות, 10-15 דקות, 15-20 דקות, 20-25 דקות, 25-30 דקות, 30-35 דקות, 35-40 דקות, 40-45 דקות, 45-50 דקות, 50-55 דקות, 55-60 דקות.
    3. להקפיא וליופיליזציה של השברים המתקבלים. בצעו החייאה של שברים ליופיליים ב-50 μL של מתנול לפני שהם ממשיכים לכרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים במיוחד ולניתוח ספקטרומטריית מסות.
  2. ניתוח כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים אולטרה-ביצועים של ספקטרומטריית מסה קוודרופולית (UPLC-QTOF-MS) של שברים CMAC של גוטו קולה
    1. נתח את כל השברים המתקבלים בנקודה 8.1.3. באמצעות ספקטרומטר מסה בשילוב עם מערכת UPLC (מצב ניתוח UPLC-MSE ). נתח את השברים באמצעות עמודת C18 (2.1 x 50 מ"מ, 1.7 מיקרומטר) עם עמודת קדם של C18 VanGuard (2.1 מ"מ x 5 מ"מ, 1.7 מיקרומטר).
    2. הרדו את העמודה באמצעות תמיסות השיפוע הבאות בקצב זרימה של 0.3 מ"ל לדקה עם פאזה ניידת A (מים עם 0.1% חומצה פורמית) ו-B (אצטוניטריל עם 0.1% חומצה פורמית): 0.0 דקות 99% A 1% B, 1.5 דקות 84% A 16% B, 5.0 דקות 80% A 20% B, 7.0 דקות 75% A 25% B, 10.0 דקות 65% A 35% B, 20.0-24.0 דקות 1% A 99% B, 25.0-29.0 דקות 99% A 1% B.
    3. הגדר את נפח ההזרקה עבור כל דגימה ל- 3 μL. בצע MSE במצבי יונים חיוביים ושליליים ברזולוציה, עם אנרגיית התנגשות ב- 4V עבור אנרגיה נמוכה ו- 20-35 V עבור אנרגיה גבוהה.
    4. השתמש בתנאי מקור ESI הבאים במצב יינון חיובי: מתח נימי 1.5 kV, חרוט דגימה 40 V, היסט מקור 80, טמפרטורת מקור 100 °C, טמפ ' השממה 350 °C, זרימת גז חרוט 38.0 L / h, גז השמדה 400 L / h.
    5. השתמש בתנאי מקור ESI הבאים במצב יינון שלילי: מתח נימי 1.45 kV, חרוט דגימה 40 V, היסט מקור 80, טמפרטורת מקור 110 °C, טמפ ' השממה. 300 °C, זרימת גז חרוט 50.0 L / h, זרימת גז השממה 652 L / h.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בעקבות הפרוטוקול, הורכבו שתי עמודות כרומטוגרפיות של CMAC: אחת עם שברי קרום תאי הנוירובלסטומה SH-SY5Y המשותקים עם TrkB עם ביטוי יתר של TrkB ואחד עם שברי קרום תאי SH-SY5Y TrkB-NULL. עמודת CMAC שהורכבה כהלכה מוצגת באיור 1 והשלבים המעורבים באימוביליזציה של שברים של קרום התא מוצגים באיור 2.

מאז השתקת קולטני TrkB ב- IAM. מחשב אישי. פאזה נייחת כרומטוגרפית DD2 לא נוסתה קודם לכן, השתקת הקולטנים המוצלחת אושרה על ידי צביעת נוגדנים וכרומטוגרפיית זיקה מצחית באמצעות ליגנד סמן: 7,8-DHF. ייצוג סכמטי של ניסוי צביעת הנוגדנים מוצג באיור 2. שברי קרום התא שהתקבלו מקו תאי נוירובלסטומה המבטאים יתר על המידה קולטני TrkB ושברי קרום התא מקו התא ההורי ללא קולטני TrkB (TrkB-NULL)) היו משותקים ב- IAM. מחשב אישי. חלקיקי DD2 המשתמשים בפרוטוקול הממוטב. לאחר מכן, החלקיקים עם שברי קרום התא המשותקים דוגרו עם BDNF (ליגנד פיזיולוגי) ולאחר מכן עם נוגדנים משניים ראשוניים ופלורסנטיים מסומנים (איור 2). אני. מחשב אישי. חלקיקי DD2 עם שברי קרום תאי TrkB נוירובלסטומה משותקים ובנוכחות BDNF גרמו לחלקיקים המסומנים באופן פלואורסצנטי (איור 3C). לא נצפתה פלואורסצנציה פלואורסצנטית (למעט פלואורסצנציה חלשה ברקע) כאשר חלקיקי IAM עטופים בממברנת תאי TrkB-NULL נחקרו (איור 3A) או כאשר לא נעשה שימוש ב-BDNF במקרה של חלקיקי IAM עטופים בממברנת תאי TrkB (איור 3B).

כדי לאפיין את הקשירה של ליגנד סמן קטן (7,8-DHF) לקולטני TrkB המשותקים כרומטוגרפיית הזיקה המצחית בוצעה עם ריכוזים שונים של 7,8-DHF. כרומטוגרמה טיפוסית של ריכוזים הולכים וגדלים של 7,8-DHF בעמודת CMAC פונקציונלית מוצגת באיור 4. קשירה ספציפית של 7,8-DHF ל-TrkB המשותק אושרה על ידי הירידות התלויות בריכוז בזמן השמירה של ליגנדת הסמן. תוצאות כרומטוגרפיית זיקה פרונטלית המתקבלות בעמודת CMAC לא פונקציונלית מוצגות באיור 5. היעדר שינויים תלויי ריכוז בשמירה על ליגנדת הסמן מצביע על הניסיון הכושל בהכנת CMAC.

תרכובות המוזרקות לעמודת CMAC מתקשרות לא רק באופן ספציפי, אלא גם יכולות לקיים אינטראקציה לא ספציפית עם IAM. מחשב אישי. חלקיקי DD2, דו-שכבתי פוספוליפידי של שברי קרום התא המשותקים, וחלבונים אחרים הנמצאים בדו-שכבתי. כדי לשלול תרכובות שאינן מתקשרות באופן ספציפי עם עמודת CMAC במהלך תהליך הסינון של תמציות מורכבות עבור קלסרים של TrkB חשוב להכין עמודת בקרה שלילית של CMAC על ידי שיתוק שברי קרום התא של קו התא ההורי שאינם מבטאים את החלבון הממוקד (במקרה זה TrkB-NULL). תוצאות כרומטוגרפיית זיקה פרונטלית המתקבלות בעמודת CMAC TrkB-NULL שלילית מוצגות באיור 6.

ניתן להשתמש בעמודות CMAC פונקציונליות למטרות שונות, כגון אפיון החלבון הממוקד, חקר אינטראקציות של תרכובות בודדות עם המטרות המשותקות (למשל, קבלת קבוע דיסוציאציה, Kd) או קביעת קינטיקה מקשרת (kon ו-koff) וכו'.24. העמודות יכולות לשמש גם לסינון דגימות מורכבות, כגון תמציות צמחים לנוכחות תרכובות הנקשרות לקולטני TrkB, ולכן הן עשויות להכיל מולקולות הפועלות כאגוניסטים או אנטגוניסטים של TrkB. כדי לוודא אם תמצית מכילה באופן פוטנציאלי תרכובות המקיימות אינטראקציה עם הקולטנים המשותקים, מתבצע ניסוי תזוזה פשוט. התוצאה של ניסוי התחרות שבוצע עם תמצית גוטו קולה ו-500 ננומטר של 7,8-DHF על עמודת TrkB פונקציונלית מוצגת באיור 7. התוספת של 0.2% תמצית גוטו קולה מימית (10 מ"ג/מ"ל) הביאה להפחתה משמעותית של שמירה של 7,8-DHF המעידה על נוכחות של ליגנד(ים) מתחרים באתר הקשירה האגוניסטי. התוצאה של ניסוי התזוזה שבוצע בעמודה השלילית CMAC TrkB-NULL מוצגת באיור 8. חוסר ההפחתה של שמירה של 7,8-DHF בעמודה זו מאשר עוד יותר את המחסור בקולטני TrkB פונקציונליים בעמודת CMAC TrkB-NULL.

כדי לזהות מטבוליטים מיוחדים המקיימים אינטראקציה ספציפית עם המטרות המשותקות, עמודות CMAC משמשות בגישה הנקראת כרומטוגרפיה חסרת שיא52 בעקבות ניסוי התזוזה. בגישה זו, נפח קטן של התמצית הנחקרת הוא כרומטוגרף במקביל על העמודה המכילה את המטרה המשותקת הנחקרת ואת עמודת הבקרה השלילית CMAC. שתי עמודות אלה נבדלות זו מזו בביטוי המטרה, ולכן כל ההבדלים בדפוסי השמירה של מולקולות בודדות נובעים מהאופי הספציפי של האינטראקציות עם המטרות הנחקרות בעמודת CMAC המכילה את ה- TMPs הללו. הכרומטוגרמות המתקבלות מושוות, ותרכובות המיוצגות על ידי פסגות שנשמרו באופן דומה בשתי העמודות מסומנות כמולקולות שאינן מתקשרות באופן ספציפי. נוכחות של שיא בשברים מאוחרים יותר בעמודת CMAC עם הקולטנים המשותקים והיעדר שיא המייצג את אותה תרכובת בשברים מוקדמים של עמודה שלילית CMAC מייצגת אינטראקציה ספציפית של התרכובת עם המטרה המשותקת. התרכובות שזוהו בשלב זה יכולות להיות ממוקדות לבידוד ולבדיקות נוספות, ללא צורך בביצוע פיצול מונחה ביולוגית. גישת הכרומטוגרפיה החסרה שימשה לזיהוי תרכובות המקיימות אינטראקציה ספציפית עם קולטני TrkB מתמצית גוטו קולה. תמצית גוטו קולה נשברה הן בעמודות TrkB והן בעמודות TrkB-NULL והתרכובות הקיימות בשברים אלה נותחו באמצעות UPLC-QTOF-MS. חקירת הכרומטוגרמות של כל אחד מהשברים הובילה לזיהוי של תרכובת שנשמרה בחוזקה בעמודת TrkB (שבר של 50-55 דקות), תוך התבלטות מוקדמת בעמודת TrkB-NULL (שבר של 0-5 דקות), מה שמצביע על אינטראקציה ספציפית עם קולטני ה-TrkB המשותקים (איור 9). התרכובת המתנשאת לגובה של כ-17.48 דקות (איור 9) מיועדת כעת לבידוד ולבדיקות במבחנים פונקציונליים.

Figure 1
איור 1. עמודת CMAC שהורכבה כהלכה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2. שלבי הכנת CMAC ותיוג נוגדנים פלואורסצנטיים של הקולטנים המשותקים. ייצוג סכמטי של הכנת עמודת CMAC (1-4) וניסוי תיוג הנוגדנים (5-8). (1) שברי קרום תאים הומוגניים המכילים חלבון טרנס-ממברנה ממוקד מטרה, TrkB. (2) שברי קרום תאים מבודדים במבנה מיצלרי. (3) שברי קרום התא משותקים על פני השטח של חלקיקי ה-IAM. (4) חלקיקי IAM עם שברי קרום תאים משותקים הארוזים בעמוד זכוכית. (5) קולטן TrkB משותק בשברי קרום התא. (6) קשירת הליגנד הטבעי BDNF לקולטן TrkB התפקודי. (7) קשירת הנוגדנים העיקריים למולקולות BDNF. (8) קשירת נוגדנים משניים המסומנים בפלואורופור לנוגדנים הראשוניים וכתוצאה מכך פלואורסצנציה ירוקה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3. אימוביליזציה של שברי קרום התא עם קולטני TrkB לחלקיקי IAM. תמונות מיקרוסקופיה קונפוקלית מראות את השתק של שברי קרום התא עם קולטני TrkB פונקציונליים על חלקיקי IAM. (A) שברי קרום התא מקו התאים SH-SY5Y TrkB-NULL משותקים על חלקיקי IAM לאחר הדגירה עם BDNF, נוגדן ראשוני ונוגדן משני המסומן בפלואורופור. (B) שברי קרום התא מקווי תאי נוירובלסטומה SH-SY5Y המבטאים TrkB משותקים על חלקיקי IAM לאחר הדגירה עם נוגדן ראשוני ונוגדן משני המסומן בפלואורופור ללא BDNF. (C) שברי קרום התא מקווי תאי נוירובלסטומה SH-SY5Y המבטאים TrkB משותקים על חלקיקי IAM לאחר הדגירה עם BDNF, נוגדן ראשוני ונוגדן משני המסומן בפלואורופור. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
תרשים 4. כרומטוגרמות זיקה קדמיות של 7,8-DHF בעמודת TrkB CMAC. כרומטוגרמה חזיתית של ריכוזים הולכים וגדלים של 7,8-DHF בעמודת TrkB CMAC, כאשר A - 1 mM, B - 750 ננומטר, C - 500 ננומטר, ו- D - 300 ננומטר. חיץ אמוניום אצטט (10 מ"מ, pH 7.4) עם 5% מתנול שימש כ-eluent בקצב זרימה של 0.4 מ"ל/ דקה.

Figure 5
איור 5. כרומטוגרמות זיקה פרונטליות של 7,8-DHF בעמודת TrkB CMAC לא מתפקדת. כרומטוגרמה חזיתית של ריכוזים שונים של 7,8-DHF בעמודת TrkB CMAC הלא פונקציונלית, כאשר A -1 μM, B - 1 μM, C - 750 ננומטר, ו- D - 500 ננומטר. חיץ אמוניום אצטט (10 מ"מ, pH 7.4) עם 5% מתנול שימש כ-eluent בקצב זרימה של 0.4 מ"ל/ דקה.

Figure 6
איור 6. כרומטוגרמות זיקה חזיתית של 7,8-DHF בעמודת TrkB-NULL CMAC. כרומטוגרמה פרונטלית של ריכוזים הולכים וגדלים של 7,8-DHF בעמודת TrkB-NULL CMAC, כאשר A - 1 mM, B - 750 ננומטר, C - 500 ננומטר, ו- D - 300 ננומטר. חיץ אמוניום אצטט (10 mM, pH 7.4) עם 5% מתנול שימש כ-eluent בקצב זרימה של 0.4 mL/min. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 7
תרשים 7. כרומטוגרמות זיקה קדמיות של 7,8-DHF עם תמצית גוטו קולה של 0.2% בעמודת CMAC TrkB. פרופיל אלוטיון חזיתי מייצג של (A) 500 ננומטר 7,8-DHF + 0.2% תמצית גוטו קולה (10 מ"ג/מ"ל) ו-(B) 500 ננומטר 7,8-DHF בעמודת CMAC TrkB. חיץ אמוניום אצטט (10 מ"מ, pH 7.4) עם 5% מתנול שימש כ-eluent בקצב זרימה של 0.4 מ"ל/ דקה.

Figure 8
איור 8. כרומטוגרמות זיקה קדמיות של 7,8-DHF עם תמצית גוטו קולה של 0.2% בעמודת ה-CMAC TrkB-NULL. פרופיל אלוהות חזיתי מייצג של (A) 500 ננומטר 7,8-DHF ו-(B) 500 ננומטר 7,8-DHF + 0.2% תמצית גוטו קולה (10 מ"ג/מ"ל) בעמודת TrkB-NULL CMAC. חיץ אמוניום אצטט (10 מ"מ, pH 7.4) עם 5% מתנול שימש כ-eluent בקצב זרימה של 0.4 מ"ל/ דקה.

Figure 9
איור 9. כרומטוגרמות UPLC-MS של שברים תמצית גוטו קולה. כרומטוגרמות UPLC-MS של שברים של תמצית גוטו קולה (A) נעו בין 0-5 דקות מעמודת TrkB-NULL CMAC ו-(C) הורחקו בין 50-55 דקות מעמודת CMAC TrkB. תרכובת עם זמן שמירה של 17.48 דקות בשני השברים, כפי שאושר על ידי התאמת ספקטרום מסה (B ו- D) זוהתה כקלסר TrkB פוטנציאלי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

מאגר הומוגניזציה
1 טריס(הידרוקסימתיל)אמינומתאן הידרוכלוריד (Tris-HCl) 50 mM
2 נתרן כלורי (NaCl) 100 mM
3 סידן כלוריד נטול מים (CaCl2) 3 מ"מ
4 מגנזיום כלוריד הקסהידרט (MgCl2) 2 מ"מ
5 אשלגן כלורי (KCl) 5 מ"מ
6 פניל-מתאנסולפוניל פלואוריד (PMSF) 0.1 מ"מ
7 בנזאמידין 3 מ"מ
8 קוקטייל מעכב פרוטאז (100X) (1/100)
9 גליצרול 10%
10 אדנוזין 5'-טריפוספט (ATP) דיסודיום מלח הידרט 100 מיקרומטר
11 חומצה אתילנדיאמינט-אצטית (EDTA) 5 דקותM

טבלה 1. הרכב מאגר הומוגניזציה.

מאגר סולוביליזציה
1 טריס(הידרוקסימתיל)אמינומתאן הידרוכלוריד (Tris-HCl) 50 mM
2 נתרן כלורי (NaCl) 100 mM
3 סידן כלוריד נטול מים (CaCl2) 3 מ"מ
4 מגנזיום כלוריד הקסהידרט (MgCl2) 2 מ"מ
5 אשלגן כלורי (KCl) 5 מ"מ
6 פניל-מתאנסולפוניל פלואוריד (PMSF) 0.1 מ"מ
7 בנזאמידין 3 מ"מ
8 קוקטייל מעכב פרוטאז (100X) (1/100)
9 גליצרול 10%
10 אדנוזין 5'-טריפוספט (ATP) דיסודיום מלח הידרט 100 מיקרומטר
11 נתרן כולאט 2%

טבלה 2. הרכב מאגר Solubilization.

מאגר דיאליזה
1 טריס(הידרוקסימתיל)אמינומתאן הידרוכלוריד (Tris-HCl) 50 mM
2 נתרן כלורי (NaCl) 100 mM
3 סידן כלוריד נטול מים (CaCl2) 0.1 מ"מ
4 חומצה אתילנדיאמינט-אצטית (EDTA) 5 מ"מ
5 פניל-מתאנסולפוניל פלואוריד (PMSF) 0.1 מ"מ

טבלה 3. הרכב מאגר דיאליזה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

זיהוי תרכובות פעילות הקיימות בתערובות מורכבות של מטבוליטים מיוחדים הוא משימה מאתגרת מאוד23. באופן מסורתי, תרכובות בודדות מבודדות, ופעילותן נבדקת במבחנים שונים. גישה זו גוזלת זמן ויקרה ומובילה לעתים קרובות לבידוד וזיהוי של התרכובות הנפוצות והמאופיינות ביותר23. כיום נעשה שימוש במבחני סינון בתפוקה גבוהה מסתמכים במידה רבה על סינון ספריות כימיה קומבינטוריות עם מטרות ידועות כבר, ואינם מיועדים לזהות ולבודד תרכובות פעילות ביולוגית הקיימות בתערובות מורכבות53.

CMAC מאפשר זיהוי של תרכובות המכוונות ל- TMPs 23,24,54. בטכניקה זו שברי ממברנת התא עם TMPs משותקים על פני השטח של חלקיקי פאזה נייחים IAM23,24. CMAC היא גישה ייחודית המאפשרת אימוביליזציה של שברי קרום התא עם חלבונים ממוקדים על התמיכה המוצקה המחקה את קרום התא פוספוליפיד דו-שכבתי24. זה מאפשר לשמר את הפונקציונליות של מטרות חלבון משותקות ומספק תנאים פיזיולוגיים קרובים לתנאים פיזיולוגיים תוך שימוש ב- CMAC כדי לזהות מולקולות קטנות המקיימות אינטראקציה עם TMPs. CMAC מציע את היתרון של הזדמנויות לגילוי פיגומים כימיים חדשים מספריות מוצרים טבעיים ייחודיות, שלא ניתן לבדוק באמצעות אף אחד מהמבחנים האחרים הנמצאים בשימוש כיום23 . הגישה המוצעת מאפשרת זיהוי של תרכובות המקיימות אינטראקציה עם TMPs מבלי לפענח את אופיה של אינטראקציה זו. יש לאמת את אופן האינטראקציה (אינטראקציה אלוסטרית או אורתוסטרית; עיכוב או הפעלה) באמצעות מבחנים פונקציונליים מבוססי תאים. CMAC עם מטרות החלבון המשותקות יכול לשמש גם באפיון של פרמקודינמיקה (למשל קבוע דיסוציאציה, Kd) או בקביעת קינטיקה מקשרת (kon ו- koff) של ליגנדות של מולקולות קטנות המקיימות אינטראקציה עם המטרה, כמו גם בתהליך של אפיון אתרי הקשירה על החלבון המשותק24 . למרות ש-CMAC מאפשרת רק זיהוי של תרכובות הנקשרות ל-TMPs, זוהי גישה חדשנית שמאיצה באופן משמעותי את הצעד הראשון בצנרת גילוי התרופות, מכיוון שהיא אינה דורשת טיהור תרכובות, שהיוותה כיום צוואר הבקבוק העיקרי בתהליך גילוי התרופות מתערובות טבעיות.

למרות שהפרוטוקול המוצג מתמקד בהשתקה של קולטן טרנס-ממברנה אחד (TrkB), ניתן להשתמש בטכנולוגיית CMAC להכנת עמודים עם מטרות אחרות. אחד ההיבטים המכריעים של הכנת CMAC הוא הבחירה בקו התא או ברקמה המשמשת לבידוד שברי קרום התא. אם נעשה שימוש בעמודות בהקרנה של תערובות מורכבות לתרכובות המקיימות אינטראקציה עם הקולטנים המשותקים, מומלץ להשתמש בקווי תאים המבטאים יתר על המידה את החלבון הממוקד. שימוש בקו תאים כזה יגרום למספר גבוה יותר של מטרות משותקות ויגדיל את הסיכוי לזיהוי תרכובות עם זיקה נמוכה יותר כלפי המטרה או מולקולות פחות בשפע. אם מתמקדים באפיון החלבון המשותק, מומלץ להשתמש בקו תאים מקומי, שכן שינויים לאחר התרגום שהחלבון עובר, כמו גם סביבת הפוספוליפידים, עשויים להיות שונים באופן משמעותי בקו התאים המוחמרים.

היבטים מסוימים של בידוד קרום התא ואימוביליזציה על חלקיקי IAM הם קריטיים ועשויים לדרוש שינויים בהתאם לסוג הקולטן או למקור החלבון. כדי למנוע ביקוע פרוטאוליטי של החלבונים המשותקים, חיוני להשתמש במעכבי פרוטאזות מתאימים במאגרי ההומוגניזציה והסולוביליזציה. מומלץ לחפש בספרות כדי לזהות מעכבי פרוטאזות נדרשים. בתהליך של אופטימיזציה של פרוטוקול, קבענו כי התוספת של ATP וגליצרול מגדילה את מספר אתרי הקישור (Bmax) בעמודות CMAC בעת שיתוק TrkB. גורמים משלימים אחרים עשויים להיות נחוצים בעת אופטימיזציה של אימוביליזציה של סוגים אחרים של מטרות transmembrane24. נכון לעכשיו, אנו חוקרים את תוספת הכולסטרול בתהליך של אימוביליזציה של TrkB, שכן לאחרונה כולסטרול נמצא לשנות את ההשפעות של ליגנדות TrkB48. בעבר דווח כי תוספת של כולסטרול ו/או שומנים אחרים עשויה להידרש לקבלת עמודות CMAC תפקודיות24.

ניתן להשתמש בסוגים שונים של גלאים כדי לנטר את העמודה, כולל גלאי מערך דיודות עבור ליגנדות עם כרומופורים, ספקטרומטריית מסה או גלאי זרימת רדיו עבור ליגנדות רדיואקטיביות.

לניטור היציבות של עמודות CMAC יש חשיבות קריטית. עמודות CMAC עשויות להיות יציבות עד מספר חודשים, בהתאם לסוג החלבון המשותק, תדירות השימוש ותנאי האחסון. מומלץ לאחסן את העמודה בתמיסת 0.05% נתרן אזיד ב-4 מעלות צלזיוס ב-4 מעלות צלזיוס אם העמודה נשארת לא בשימוש במשך יותר משבוע. חשוב לשטוף ביסודיות את העמוד עם חיץ אמוניום אצטט לאחר תקופות ארוכות יותר לפני שמנסים להשתמש בו. מומלץ לעקוב אחר הפונקציונליות של העמודה על ידי הזרקת ריכוז נבחר של ליגנד סמן מדי שבוע.

למרות יתרונות רבים, לטכנולוגיית CMAC יש מספר מגבלות שיש לקחת בחשבון בעת שימוש בעמודות במאמצי גילוי התרופות. ראשית, מספר המטרות הטרנס-ממברניות המשותקות פוחת עם הזמן, ולכן מומלץ לעקוב אחר המספר הכולל של אתרי הקשירה מדי שבוע24. אחת הסיבות לירידה זו היא התוצאה של תהליך האימוביליזציה המבוסס על ספיחה ואינו כרוך בהכנסת קשרים קוולנטיים. תרכובות ליפופיליות עשויות להישמר בחוזקה על עמודי CMAC עקב קשירה לא ספציפית משמעותית למשטח ה-IAM ולדו-שכבתיים של פוספוליפידים. זה מגדיל באופן משמעותי את זמן הניתוח ומפחית את התפוקה. תהליך הכנת עמודי CMAC הוא ספציפי לקו התאים ודורש הבנה מעמיקה של טבעם של חלבונים משותקים, מה שהופך אותו לפחות מתאים למטרות פחות מאופיינות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

לוקאש צ'יסלה משתף פעולה עם רג'יס טכנולוגיות, ספקית IAM. מחשב אישי. חלקיקי DD2.

Acknowledgments

Z.C.A. נתמך על ידי המועצה למחקר מדעי וטכנולוגי של טורקיה (TUBITAK) 2219 - תוכנית עמיתי מחקר בינלאומית לפוסט-דוקטורט. המחקר שדווח בפרסום זה נתמך על ידי המרכז הלאומי לרפואה משלימה ואינטגרטיבית של המכונים הלאומיים לבריאות תחת פרס מספר 1R41AT011716-01. עבודה זו נתמכה באופן חלקי גם על ידי מענק ההתחלה של האגודה האמריקאית למחקר פרמקוגנוזי, מענק רג'יס טכנולוגיות ל- L.C. התוכן הוא באחריותם הבלעדית של המחברים ואינו מייצג בהכרח את הדעות הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
7-8 Dihydroxyflavone hydrate Sigma-Aldrich D5446-10 mg ≥98% (HPLC)
Adenosine 5'-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate Sigma-Aldrich A2383-1 g
Ammonium acetate VWR Chemicals BDH BDH9204-500 g
BDNF antibody Invitrogen PA5-15198-400 μL Primary antibody; 2 mg/mL of concentration
Benzamidine hydrochloride hydrate Sigma-Aldrich B6506-25 g
Brain derived neurotrophic factor (BDNF) human Sigma-Aldrich B3795-10 μg Recombinant, expressed in E. coli, lyophilized powder, suitable for cell culture
Calcium chloride VWR Analytical BDH9224-1 kg
Cholic acid sodium salt Alfa Aesar J62050-100 g
Dounce homogenizer VWR 71000-516 40 mL, 285 mm (overall lenght), 32 x 140 mm (O.D. x H)
Ethanol Sigma-Aldrich 493511
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) VWR Analytical BDH-9232-500 g
Fetal bovine serum Sigma-Aldrich F2442-500 mL sterile-filtered, suitable for cell culture
G418 disulfate salt solution Sigma-Aldrich G8168-100 mL 50 mg/mL in H2O, 0.1 μm filtered, suitable for cell culture
Glycerol VWR Life Science E520-100 mL
Immobilized artificial membrane (IAM.PC.DD2) Regis Technologies, Inc. 1-771050-500
Magnesium chloride hexahydrate VWR Analytical BDH9244-500 mL
Methanol Sigma-Aldrich 322425
Nikon C2 DUVb Nikon Confocal laser scanning microscope
Normal goat serum (10%) Life Technologies 50197Z
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich P4333-100 mL
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) Thermo Scientific 36978-5 g
Phosphate buffered saline (PBS) VWR Life Science K812-500 mL 1x
Potassium chloride VWR Chemicals BDH 0395-1 kg
Protease inhibitor cocktail VWR Life Science Ambreso M221-1 mL Proteomics grade, containing 50 mM AEBSF, 30 µM aprotonin, 1 mM bestatin, 1 mM E-64 and 1 mM leupeptin
RPMI-1640 medium Sigma-Aldrich R8758-500 mL with L-glutamine and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture
Secondary antibody goat anti-rabbit IgG (H+L) Invitrogen Alexa Flour Plus 488 A32731
SH-SY5Y Neuroblastoma cell lines expressing Trk-B Kerafast ECP007
SH-SY5Y Trk-NULL cell line Kerafast ECP005
Snake skin dialysis tubing Thermo Scientific 88245 10K MWCO, 35 mm dry I.D.
Sodium azide Sigma-Aldrich S2002
Sodium chloride BDH VWR Analytical BDH9286-2.5 kg
Tricorn 5/20 column GE Healthcare 24-4064-08
Tris-HCl VWR Life Science 0497-1 kg
Trypsin-EDTA solution Sigma-Aldrich T4049-500 mL 0.25%, sterile-filtered, suitable for cell culture, 2.5 g porcine trypsin and 0.2 g EDTA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thomford, N. E., et al. Natural Products for Drug Discovery in the 21st Century: Innovations for Novel Drug Discovery. International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1578 (2018).
  2. Atanasov, A. G., Zotchev, S. B., Dirsch, V. M. International Natural Product Sciences Taskforce, Supuran, C.T. Natural products in drug discovery: advances and opportunities. Nature Reviews. Drug Discovery. 20 (3), 200-216 (2021).
  3. Altmann, K. H. Drugs from the Oceans: Marine Natural Products as Leads for Drug Discovery. Chimia. 71 (10), 646-652 (2017).
  4. Bernardini, S., Tiezzi, A., Laghezza Masci, V., Ovidi, E. Natural products for human health: an historical overview of the drug discovery approaches. Natural Product Research. 32 (16), 1926-1950 (2018).
  5. DeCorte, B. L. Underexplored Opportunities for Natural Products in Drug Discovery. Journal of Medicinal Chemistry. 59 (20), 9295-9304 (2016).
  6. Lee, J., Jo, D. G., Park, D., Chung, H. Y., Mattson, M. P. Adaptive cellular stress pathways as therapeutic targets of dietary phytochemicals: focus on the nervous system. Pharmacological Reviews. 66 (3), 815-868 (2014).
  7. Hornykiewicz, O. L-DOPA: from a biologically inactive amino acid to a successful therapeutic agent. Amino Acids. 23 (1-3), 65-70 (2002).
  8. Hoyer, D. Targeting the 5-HT system: Potential side effects. Neuropharmacology. 179, 108233 (2020).
  9. Nur, S., Adams, C. E. Chlorpromazine versus reserpine for schizophrenia. The Cochrane Database of Systematic Reviews. 4, (2016).
  10. Chung, H. Y., et al. Redefining Chronic Inflammation in Aging and Age-Related Diseases: Proposal of the Senoinflammation Concept. Aging and Disease. 10 (2), 367-382 (2019).
  11. Fitzgerald, K. N., et al. Potential reversal of epigenetic age using a diet and lifestyle intervention: a pilot randomized clinical trial. Aging. 13 (7), 9419-9432 (2021).
  12. Zhao, L., Lee, J. Y., Hwang, D. H. Inhibition of pattern recognition receptor-mediated inflammation by bioactive phytochemicals. Nutrition Reviews. 69 (6), 310-320 (2011).
  13. Corbi, G., et al. Dietary Phytochemicals in Neuroimmunoaging: A New Therapeutic Possibility for Humans? Frontiers in Pharmacology. 7, 364 (2016).
  14. Davinelli, S., et al. Dietary phytochemicals and neuro-inflammaging: from mechanistic insights to translational challenges. Immunity & Ageing: I & A. 13, 16 (2016).
  15. Ostan, R., et al. Inflammaging and cancer: a challenge for the Mediterranean diet. Nutrients. 7 (4), 2589-2621 (2015).
  16. Martucci, M., et al. Mediterranean diet and inflammaging within the hormesis paradigm. Nutrition Reviews. 75 (6), 442-455 (2017).
  17. Szarcvel Szic, K., Declerck, K., Vidakovic, M., Vanden Berghe, W. From inflammaging to healthy aging by dietary lifestyle choices: is epigenetics the key to personalized nutrition. Clinical Epigenetics. 7 (1), 33 (2015).
  18. Dean, E., Gormsen Hansen, R. Prescribing optimal nutrition and physical activity as "first-line" interventions for best practice management of chronic low-grade inflammation associated with osteoarthritis: evidence synthesis. Arthritis. , 560634 (2012).
  19. Ruiz-Núñez, B., Pruimboom, L., Dijck-Brouwer, D. A., Muskiet, F. A. Lifestyle and nutritional imbalances associated with Western diseases: causes and consequences of chronic systemic low-grade inflammation in an evolutionary context. TheJournal of Nutritional Biochemistry. 24 (7), 1183-1201 (2013).
  20. Agarwal, P., et al. MIND Diet Associated with Reduced Incidence and Delayed Progression of Parkinsonism in Old Age. The Journal of Nutrition, Health & Aging. 22 (10), 1211-1215 (2018).
  21. Morris, M. C., et al. MIND diet associated with reduced incidence of Alzheimer's Disease. Alzheimer's & Dementia: The Journal of the Alzheimer's Association. 11 (9), 1007-1014 (2015).
  22. Franceschi, C., Garagnani, P., Parini, P., Giuliani, C., Santoro, A. Inflammaging: a new immune-metabolic viewpoint for age-related diseases. Nature Reviews. Endocrinology. 14 (10), 576-590 (2018).
  23. Ciesla, L., Moaddel, R. Comparison of analytical techniques for the identification of bioactive compounds from natural products. Natural Product Reports. 33 (10), 1131-1145 (2016).
  24. Moaddel, R., Wainer, I. W. The preparation and development of cellular membrane affinity chromatography columns. Nature Protocols. 4 (2), 197-205 (2009).
  25. Ferrer, I., et al. BDNF and full-length and truncated TrkB expression in Alzheimer disease. Implications in therapeutic strategies. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 58 (7), 729-739 (1999).
  26. Numakawa, T., Odaka, H., Adachi, N. Actions of Brain-Derived Neurotrophin Factor in the Neurogenesis and Neuronal Function, and Its Involvement in the Pathophysiology of Brain Diseases. International Journal of Molecular Sciences. 19 (11), 3650 (2018).
  27. Lima Giacobbo, B., et al. Brain-Derived Neurotrophic Factor in Brain Disorders: Focus on Neuroinflammation. Molecular Neurobiology. 56 (5), 3295-3312 (2019).
  28. Wang, Z. H., et al. Deficiency in BDNF/TrkB Neurotrophic Activity Stimulates δ-Secretase by Upregulating C/EBPβ in Alzheimer's Disease. Cell Reports. 28 (3), 655-669 (2019).
  29. Devi, L., Ohno, M. TrkB Reduction Exacerbates Alzheimer's Disease-like Signaling Aberrations and Memory Deficits without Affecting beta-Amyloidosis in 5XFAD Mice. Translational Psychiatry. 5 (5), 562 (2015).
  30. Jiao, S. S., et al. Brain-derived Neurotrophic Factor Protects against Tau-related Neurodegeneration of Alzheimer's Disease. Translational Psychiatry. 6 (10), 907 (2016).
  31. Ng, T., Ho, C., Tam, W., Kua, E., Ho, R. C. Decreased Serum Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) Levels in Patients with Alzheimer's Disease (AD): A Systematic Review and Meta-Analysis. International Journal of Molecular Sciences. 20 (2), 257 (2019).
  32. Amidfar, M., de Oliveira, J., Kucharska, E., Budni, J., Kim, Y. K. The Role of CREB and BDNF in Neurobiology and Treatment of Alzheimer's Disease. Life Sciences. 257, 118020 (2020).
  33. Atasoy, I. L., et al. Both Secreted and the Cellular Levels of BDNF Attenuated due to Tau Hyperphosphorylation in Primary Cultures of Cortical Neurons. Journal of Chemical Neuroanatomy. 80, 19-26 (2017).
  34. Rosa, E., et al. Tau Downregulates BDNF Expression in Animal and Cellular Models of Alzheimer's Disease. Neurobiology of Aging. 48, 135-142 (2016).
  35. Xiang, J., et al. Delta-secretase-cleaved Tau Antagonizes TrkB Neurotrophic Signalings, Mediating Alzheimer's Disease Pathologies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (18), 9094-9102 (2019).
  36. Giuffrida, M. L., Copani, A., Rizzarelli, E. A Promising Connection between BDNF and Alzheimer's Disease. Aging. 10 (8), 1791-1792 (2018).
  37. Ando, S., et al. Animal Model of Dementia Induced by Entorhinal Synaptic Damage and Partial Restoration of Cognitive Deficits by BDNF and Carnitine. Journal of Neuroscience Research. 70 (3), 519-527 (2002).
  38. Fischer, D. L., Sortwell, C. E. BDNF Provides Many Routes Toward STN DBS-Mediated Disease Modification. Movement Disorders. Official Journal of the Movement Disorder Society. 34 (1), 22-34 (2019).
  39. Zhang, F., Kang, Z., Li, W., Xiao, Z., Zhou, X. Roles of Brain-derived Neurotrophic Factor/Tropomyosin-related Kinase B (BDNF/TrkB) Signalling in Alzheimer's Disease. Journal of Clinical Neuroscience: Official Journal of the Neurological Society of Australasia. 19 (7), 946-949 (2012).
  40. Pilakka-Kanthikeel, S., Atluri, V. S., Sagar, V., Saxena, S. K., Nair, M. Targeted Brain Derived Neurotropic Factors (BDNF) Delivery across the Blood-Brain Barrier for Neuro-protection using Magnetic Nano Carriers: An In-vitro Study. PLoS One. 8 (4), 62241 (2013).
  41. Jang, S. W., et al. A Selective TrkB Agonist with Potent Neurotrophic Activities by 7,8-Dihydroxyflavone. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (6), 2687-2692 (2010).
  42. Todd, D., et al. A Monoclonal Antibody TrkB Receptor Agonist as a Potential Therapeutic for Huntington's Disease. Plos One. 9 (2), 87923 (2014).
  43. Liu, X., et al. Optimization of a Small Tropomyosin-Related Kinase B (TrkB) Agonist 7,8-Dihydroxyflavone Active in Mouse Models of Depression. Journal of Medicinal Chemistry. 55 (19), 8524-8537 (2012).
  44. Liu, X., et al. Biochemical and Biophysical Investigation of the Brain-derived Neurotrophic Factor Mimetic 7,8-Dihydroxyflavone in the Binding and Activation of the TrkB Receptor. The Journal of Biological Chemistry. 289 (40), 27571-27584 (2014).
  45. Chen, L., Gao, X., Zhao, S., Hu, W., Chen, J. The Small-Molecule TrkB Agonist 7,8-Dihydroxyflavone Decreases Hippocampal Newborn Neuron Death After Traumatic Brain Injury. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 74 (6), 557-567 (2015).
  46. Liu, X., et al. Optimization of a Small Tropomyosin-related Kinase B (TrkB) Agonist 7,8-Dihydroxyflavone Active in Mouse Models of Depression. Journal of Medicinal Chemistry. 55 (19), 8524-8537 (2012).
  47. Zhang, Z., et al. 7,8-Dihydroxyflavone Prevents Synaptic Loss and Memory Deficits in a Mouse Model of Alzheimer's Disease. Neuropsychopharmacology: Official Publication of the American College of Neuropsychopharmacology. 39 (3), 638-650 (2014).
  48. Casarotto, P. C., et al. Antidepressant Drugs Act by Directly Binding to TRKB Neurotrophin Receptors. Cell. 184 (5), 1299-1313 (2021).
  49. Iyer, R., et al. Entrectinib is a potent inhibitor of Trk-driven neuroblastomas in a xenograft mouse model. Cancer letters. 372 (2), 179-186 (2016).
  50. Iyer, R., et al. Nanoparticle delivery of an SN38 conjugate is more effective than irinotecan in a mouse model of neuroblastoma. Cancer letters. 360 (2), 205-212 (2015).
  51. Ng, E. S., Chan, N. W., Lewis, D. F., Hindsgaul, O., Schriemer, D. C. Frontal Affinity Chromatography-Mass spectrometry. Nature Protocols. 2 (8), 1907-1917 (2007).
  52. Maciuk, A., Moaddel, R., Haginaka, J., Wainer, I. W. Screening of Tobacco Smoke Condensate for Nicotinic Acetylcholine Receptor Ligands using Cellular Membrane Affinity Chromatography Columns and Missing Peak Chromatography. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 48 (2), 238-246 (2008).
  53. Harvey, A. L., Edrada-Ebel, R., Quinn, R. J. The Re-emergence of Natural Products for Drug Discovery in the Genomics Era. Nature Reviews. Drug Discovery. 14 (2), 111-129 (2015).
  54. Ciesla, L., et al. Development and Characterization of the α3β4α5 Nicotinic Receptor Cellular Membrane Affinity Chromatography Column and Its Application for on line Screening of Plant Extracts. Journal of Chromatography A. 1431, 138-144 (2016).

Tags

ביוכימיה גיליון 179
עמודי כרומטוגרפיה של זיקה לממברנת התא לזיהוי מטבוליטים מיוחדים של צמחים המקיימים אינטראקציה עם קולטן Tropomyosin Kinase משותק B
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Arituluk, Z. C., Adhikari, B.,… More

Arituluk, Z. C., Adhikari, B., Maitra, U., Goodman, C., Ciesla, L. M. Cellular Membrane Affinity Chromatography Columns to Identify Specialized Plant Metabolites Interacting with Immobilized Tropomyosin Kinase Receptor B. J. Vis. Exp. (179), e63118, doi:10.3791/63118 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter