Summary
El protocolo describe la preparación de columnas de cromatografía de afinidad de membrana celular (CMAC) con fragmentos de membrana celular inmovilizados que contienen proteínas funcionales del receptor B de tropomiosina quinasa transmembrana. También se explica el uso de columnas de CMAC en la identificación de metabolitos vegetales especializados que interactúan con estos receptores y están presentes en mezclas naturales complejas.
Abstract
Los productos químicos sintetizados por plantas, hongos, bacterias e invertebrados marinos han sido una rica fuente de nuevos golpes y plomos de drogas. Medicamentos como las estatinas, la penicilina, el paclitaxel, la rapamicina o la artemisinina, comúnmente utilizados en la práctica médica, se han identificado y aislado por primera vez de productos naturales. Sin embargo, la identificación y el aislamiento de metabolitos especializados biológicamente activos de fuentes naturales es un proceso desafiante y lento. Tradicionalmente, los metabolitos individuales se aíslan y purifican a partir de mezclas complejas, después de la extracción de biomasa. Posteriormente, las moléculas aisladas se prueban en ensayos funcionales para verificar su actividad biológica. Aquí presentamos el uso de columnas de cromatografía de afinidad de membrana celular (CMAC) para identificar compuestos biológicamente activos directamente a partir de mezclas complejas. Las columnas CMAC permiten la identificación de compuestos que interactúan con proteínas transmembrana funcionales inmovilizadas (TMP) incrustadas en su entorno de bicapa de fosfolípidos nativos. Este es un enfoque dirigido, que requiere conocer el TMP cuya actividad se pretende modular con el candidato a fármaco de molécula pequeña recientemente identificado. En este protocolo, presentamos un enfoque para preparar columnas de CMAC con el receptor de tropomiosina quinasa B (TrkB) inmovilizado, que se ha convertido en un objetivo viable para el descubrimiento de fármacos para numerosos trastornos del sistema nervioso. En este artículo, proporcionamos un protocolo detallado para ensamblar la columna CMAC con receptores TrkB inmovilizados utilizando líneas celulares de neuroblastoma que sobreexpresan los receptores TrkB. Además, presentamos el enfoque para investigar la funcionalidad de la columna y su uso en la identificación de metabolitos especializados de plantas que interactúan con los receptores TrkB.
Introduction
Las mezclas botánicas son ricas en compuestos farmacológicamente activos1, sirviendo como una buena fuente para la identificación de nuevos fármacos golpea y conduce 2,3,4,5. El descubrimiento de nuevos medicamentos a partir de productos naturales ha sido un enfoque fructífero y muchos medicamentos actualmente aprobados se originaron a partir de compuestos identificados por primera vez en la naturaleza. La diversidad química de los compuestos naturales es difícil de igualar por las bibliotecas artificiales de moléculas sintetizadas químicamente. Muchos compuestos naturales interactúan y modulan los objetivos de proteínas humanas y pueden considerarse moléculas similares a fármacos optimizadas evolutivamente6. Estos compuestos naturales son particularmente adecuados para la identificación de plomo de fármacos para su uso en trastornos neurológicos6. Dos de los medicamentos actualmente aprobados por la FDA para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer (EA) se derivan de alcaloides naturales, a saber: galantamina y rivastigmina (un derivado de la fisostigmina)6. L-DOPA, actualmente el medicamento más comúnmente recetado para la enfermedad de Parkinson, se identificó por primera vez a partir del frijol ancho (Vicia faba L.) 7. Pergolida y lisurida, agonistas del receptor dopaminérgico son los derivados de los alcaloides naturales del cornezuelo de centeno del hongo parásito Claviceps purpurea8. La reserpina, un alcaloide aislado de la raíz de serpiente india (Rauvolfia serpentina (L.) Benth. ex Kurz) fue uno de los primeros fármacos antipsicóticos9. Recientemente, la respuesta inmune desregulada y la inflamación sistémica se han relacionado con el desarrollo de numerosas dolencias neurológicas, como el trastorno depresivo mayor o las enfermedades neurodegenerativas10. Se ha encontrado que una dieta basada en plantas junto con otras intervenciones de estilo de vida mejora las capacidades cognitivas y funcionales en los ancianos 11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 . Se ha encontrado que ciertas moléculas electrofílicas pertenecientes a triterpenos y polifenoles modulan las respuestas inflamatorias tanto en modelos in vitro como in vivo 12. Por ejemplo, los compuestos naturales que contienen α,β carbonilo insaturado (por ejemplo, curcumina, cinamaldehído) o grupo isotiocianato (por ejemplo, sulforafano) interfieren con la dimerización del receptor Toll-4 (TLR4) que inhibe la síntesis aguas abajo de citoquinas proinflamatorias en una línea celular pro-B dependiente de interleucina-3 murina12,22 . La evidencia epidemiológica apunta fuertemente a que los fitoquímicos dietéticos, presentes en matrices alimentarias complejas, también pueden constituir una fuente viable de nuevos fármacos6.
Uno de los principales obstáculos en la identificación de moléculas biológicamente activas presentes en los extractos de plantas, incluidos los alimentos de origen vegetal, es la complejidad de las muestras investigadas. Tradicionalmente, los compuestos individuales se aíslan, purifican y posteriormente se prueban para la actividad biológica. Este enfoque generalmente conduce a la identificación de los compuestos más abundantes y bien caracterizados. Los enfoques de descubrimiento de fármacos fenotípicos sin una diana molecular definida se basan en el fraccionamiento bioguiado de mezclas complejas23. En este enfoque, un extracto se fracciona en subfracciones menos complejas que posteriormente se prueban en ensayos fenotípicos. El aislamiento y la purificación de los compuestos activos se guían por la actividad biológica verificada en el ensayo. El conocimiento de la identidad de un objetivo farmacológico específico puede acelerar significativamente la identificación de compuestos farmacológicamente activos presentes en mezclas complejas. Esos enfoques generalmente se basan en la inmovilización del objetivo molecular, por ejemplo, una enzima, en una superficie sólida, como las perlas magnéticas23. Los objetivos inmovilizados se utilizan posteriormente en los experimentos de detección, lo que resulta en el aislamiento de compuestos que interactúan con el objetivo. Si bien este enfoque se ha utilizado ampliamente en la identificación de compuestos dirigidos a proteínas citosólicas, se ha aplicado con menos frecuencia en la identificación de sustancias químicas que interactúan con proteínas transmembrana (TMP)23. Un desafío adicional en la inmovilización de TMP se deriva del hecho de que la actividad de la proteína depende de su interacción con fosfolípidos de membrana celular y otras moléculas en la bicapa como el colesterol23,24. Es importante preservar estas interacciones sutiles entre las proteínas y su entorno de bicapa de fosfolípidos nativos cuando se intenta inmovilizar el objetivo transmembrana.
En la cromatografía de afinidad de membrana celular (CMAC) los fragmentos de membrana celular, y no las proteínas purificadas, se inmovilizan en las partículas de fase estacionaria de membrana artificial (IAM)23. Las fases estacionarias de IAM se preparan uniendo covalentemente análogos de fosfatidilcolina a sílice. Recientemente se han desarrollado nuevas clases de fases estacionarias de IAM en las que los grupos de amina libre y silanol tienen un límite final (IAM. PC. Partículas DD2). Durante la preparación de las columnas CMAC, los fragmentos de membrana celular se inmovilizan en la superficie de las partículas de IAM a través de la adsorción.
Las columnas de CMAC se han utilizado hasta la fecha para inmovilizar diferentes clases de TMP, incluidos los canales iónicos (por ejemplo, receptores nicotínicos), GPCR (por ejemplo, receptores opioides), transportadores de proteínas (por ejemplo, p-glicoproteína), etc.24. Las dianas proteicas inmovilizadas se han utilizado en la caracterización de la farmacodinámica (por ejemplo, constante de disociación, Kd) o en la determinación de la cinética de unión (kon y koff) de ligandos de moléculas pequeñas que interactúan con el objetivo, así como en el proceso de identificación de posibles nuevas derivaciones farmacológicas presentes en matrices complejas24 . Aquí presentamos la preparación de columnas CMAC con el receptor inmovilizado de tropomiosina quinasa B (TrkB), que ha surgido como un objetivo viable para el descubrimiento de fármacos para numerosos trastornos del sistema nervioso.
Estudios previos demostraron que la activación de la vía del factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF)/TrkB se asocia con la mejoría de ciertas dolencias neurológicas, como la EA o el trastorno depresivo mayor 25,26,27,28. Se informó que los niveles de BDNF y su receptor TrkB de expresión disminuyen en la EA, y reducciones similares perjudican la función del hipocampo en modelos animales de AD29. Se notificó disminución de los niveles de BDNF en suero y cerebro de pacientes con EA 30,31,32. Se encontró que la sobreexpresión de Tau o la hiperfosforilación regulan a la baja la expresión de BDNF en neuronas primarias y modelos animales de EA 33,34,35. Además, se informó que el BDNF tiene efectos protectores sobre la neurotoxicidad inducida por β-amiloide in vitro e in vivo36. Se demostró que la administración directa de BDNF en el cerebro de la rata aumenta el aprendizaje y la memoria en animales con deterioro cognitivo37. BDNF / TrkB surgió como un objetivo válido para mejorar los trastornos neurológicos y psiquiátricos, incluido el28,38 d.C. Dirigirse a la vía de señalización BDNF / TrkB para el desarrollo de terapias en la EA mejorará potencialmente nuestra comprensión de la enfermedad39. Desafortunadamente, el BDNF en sí no se puede usar como tratamiento debido a sus pobres propiedades farmacocinéticas y efectos secundarios adversos40. Se han explorado activadores de moléculas pequeñas de las vías TrkB/BDNF como ligandos TrkB potenciales 41,42,43. Entre los agonistas de moléculas pequeñas probados, se ha demostrado que la 7,8-dihidroxiflavona (7,8-DHF) activa la vía BDNF/TrkB 41,44,45,46. Un derivado de 7,8-DHF (R13; 4-Oxo-2-fenil-4H-cromona-7,8-diil bis(metilcarbamato)) está actualmente bajo consideración como un posible fármaco para la EA47. Recientemente, se demostró que varios antidepresivos funcionan a través de la unión directa a TrkB y la promoción de la señalización bdNF, enfatizando aún más la importancia de perseguir TrkB como un objetivo válido para tratar diversos trastornos neurológicos48.
El protocolo describe el proceso de ensamblaje de la columna TrkB funcional y la columna de control negativo TrkB-NULL. Las columnas se caracterizan utilizando un conocido ligando de pequeño molecular de producto natural: 7,8-DHF. Además, describimos el proceso de cribado de matrices complejas, utilizando extracto de planta como ejemplo, para la identificación de compuestos que interactúan con TrkB.
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Protocol
1. Cultivo celular de células de neuroblastoma SH-SY5Y (líneas celulares TrkB y TrkB-NULL (parentales))
NOTA: Las líneas celulares (SH-SY5Y Cell Line (TrkB, BR6) y SH-SY5Y Parental Cell Line (TrkB NULL))49,50 fueron compradas a Kerafast. Las células cultivadas se utilizan como fuente de los receptores transmembrana a inmovilizar para la preparación de columnas CMAC. Los siguientes pasos describen cómo obtener fragmentos de membrana celular y ensamblar columnas CMAC funcionales.
- Cultive las células en un medio de cultivo celular preparado mezclando 450 ml de medios RPMI, 50 ml de FBS, 5 ml de solución de penicilina/estreptomicina y 0,3 mg/ml de genetina (G418) en una placa de cultivo celular de 150 mm a 37 °C en una atmósfera húmeda con 5% de CO2.
2. Recolección celular
- Confirme la confluencia celular (80% -90%) utilizando un microscopio, alcanzada después de 3-4 días después del paso celular.
- Aspirar el medio de cultivo celular desde arriba de las células y lavar las células dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS, 1x, pH 7.4). Retire el PBS y agregue 2 ml de tripsina concentrada baja (0.25%) para separar las células.
- Gire suavemente la placa para cubrir uniformemente todas las células con solución de tripsina e incube las células durante aproximadamente 2 minutos a 37 ° C en una atmósfera húmeda con 5% de CO2. Agregue 8 ml de medio de cultivo celular a las células de separación y transfiera las células separadas a un tubo cónico de 50 ml y colóquelo en hielo.
- Utilice un hemocitómetro para estimar el número de células (aproximadamente 3 x 107 células). Mezcle la suspensión de la celda mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo para obtener una densidad celular uniforme en la mezcla. Coloque 10 μL de suspensión celular debajo del cobertor y cuente las células bajo un microscopio utilizando un objetivo 40x.
3. Homogeneización celular
- Prepare soluciones madre de los siguientes inhibidores de la proteasa: benzamidina (200 mM), fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF, 10 mM) e inhibidores de proteasa disponibles comercialmente (concentración de 100x) que contenga clorhidrato de fluoruro de 4-(2-aminoetil)bencenolfo (AEBSF), aprotinina, bestatina y leupeptina.
PRECAUCIÓN: El PMSF solo debe manipularse dentro de la campana de humos.- Prepare la solución madre de benzamidina (200 mM) disolviendo 120 mg de benzamidina en 5 ml de agua desionizada ultrapura. Conservar a 4 °C y utilizar en un día. Prepare la solución recién preparada antes de cada uso (recomendado).
- Preparar la solución madre de PMSF (10 mM) disolviendo 0,017 g de PMSF en 10 ml de etanol. Conservar a - 20 °C.
- Prepare el cóctel de inhibidores de la proteasa (100x) disolviendo la mezcla de inhibidores de la proteasa disponibles comercialmente en 1 ml de agua desionizada ultrapura. Mezclar bien y alícuota 200-300 μL del cóctel y conservar a - 20 °C antes de su uso.
- Preparar la solución madre de ATP (100 mM) disolviendo 55.114 mg de hidrato de sal disódica de ATP en 1 ml de agua ultrapura desionizada. Mezclar bien y alícuota 100 μL de la mezcla y almacenar a - 20 °C antes de usar.
- Preparar tampón disolviendo 3,03 g de clorhidrato de tris(hidroximetil)aminometano (Tris-HCl, 50 mM), 2,9 g de cloruro de sodio (NaCl, 100 mM), 0,22 g de cloruro de calcio anhidro (CaCl2, 3 mM), 0,2 g de cloruro de magnesio hexahidratado (MgCl2, 2 mM) y 0,19 de cloruro de potasio (KCl, 5 mM) en 500 mL de agua ultrapura desionizada.
- Preparar el tampón de homogeneización mezclando 17,3 ml del tampón preparado en la etapa 3,3 con 0,3 ml (3 mM) de solución madre de benzamidina, 0,2 ml (0,1 mM) de solución madre de FSPM, 0,2 ml de mezcla de cóctel inhibidor de la proteasa, 20 μL (100 μM) de solución madre de ATP, 2 ml (10%) de glicerol y 0,029 g (5 mM) de EDTA (Tabla 1). Ajuste el pH a 7.4 usando solución de ácido clorhídrico.
- Gire hacia abajo las células cosechadas en el paso 2.3 a 4 °C durante 5 min a 400 x g. Retire el sobrenadante y lave el pellet celular restante con 10 ml de PBS helado (1x, pH 7.4). Gire las células de nuevo a 4 °C durante 5 min a 400 x g.
- Deseche el sobrenadante y reemplácelo por 20 ml de tampón de homogeneización preparado en el paso 3.4. Coloque el tubo cónico sobre hielo.
- Transfiera la suspensión celular a una amoladora de tejido homogeneizador Dounce de 40 ml y colóquela en hielo. Homogeneiza la suspensión manualmente, sobre hielo, utilizando 40 golpes de mortero hacia arriba y hacia abajo. Transfiera la suspensión celular homogeneizada a un tubo cónico de 50 ml.
- Centrifugar el homogeneizado a 4 °C durante 7 min a 400 x g. Deseche el pellet y transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo cónico y centrífuguelo a 4 °C durante 30 min a 47900 x g. Guarde el pellet de membrana celular y deseche el sobrenadante.
4. Solubilización de la membrana celular
- Preparar el tampón de solubilización mezclando 8,7 ml de la solución tampón realizada en la etapa 3,3 con 0,1 ml (0,1 mM) de solución madre de FMP, 0,15 ml (3 mM) de solución madre de benzamidina, 0,1 ml de cóctel inhibidor de la proteasa, 10 μL (100 μM) de solución madre de ATP, 1 ml (10%) de glicerol y 0,2 g (2%) de colato de sodio (Tabla 2).
- Transfiera el tampón de solubilización al tubo cónico con fragmentos de membrana celular obtenidos en el paso 3.8 y vuelva a suspender el pellet. Gire la mezcla resultante a 150 rpm a 4 °C durante 18 h.
NOTA: En este punto, el experimento se puede pausar para la solubilización de pellets de membrana celular durante la noche.
5. Inmovilización de la membrana celular en IAM. PC. Partículas DD2
- Después de 18 h, centrifugar la mezcla de solubilización a 4 °C durante 30 min a 47900 x g.
- Mantenga el sobrenadante y deseche el pellet. Añadir 100 mg de IAM. PC. Partículas DD2, al sobrenadante, vórtice y gire la mezcla de suspensión resultante a 150 rpm a 4 °C durante 1 h.
- Facilitar la inmovilización de fragmentos de membrana celular en el IAM. PC. Las partículas DD2 pasan a la etapa de diálisis como se describe a continuación.
- Preparar tampón de diálisis en 4 L de agua desionizada ultrapura añadiendo 24 g de tris-HCl (50 mM), 23,4 g de NaCl (100 mM), 0,06 g de CaCl2 (0,1 mM), 5,85 g de EDTA (5 mM) y 0,07 g de PMSF (0,1 mM; Tabla 3).
NOTA: PMSF no es soluble en agua, por lo tanto, disuelva primero en un pequeño volumen de etanol y luego agregue lentamente al vaso de precipitados con el tampón. - Ajuste el pH a 7.4 con solución de ácido clorhídrico. Coloque el tampón a 4 °C durante un mínimo de 1 h antes de proceder a la etapa de diálisis.
- Prepare el tubo de diálisis cortando 10 cm de tubo de diálisis de membrana de celulosa (10 K MWCO, 35 mm) y transfiera la suspensión que contiene IAM. PC. Partículas DD2 y fragmentos de membrana celular en el tubo de diálisis. Use clips de tubos de diálisis para cerrar ambos extremos del tubo de diálisis.
- Coloque el tubo de diálisis que contiene el IAM. PC. Fase estacionaria DD2 en el tampón de diálisis y diálisis a 4 °C durante 24 h mientras se agita suavemente.
- Después de 24 h, coloque el tubo de diálisis en el tampón de diálisis recién preparado y continúe la diálisis durante otras 24 h.
- Preparar tampón de diálisis en 4 L de agua desionizada ultrapura añadiendo 24 g de tris-HCl (50 mM), 23,4 g de NaCl (100 mM), 0,06 g de CaCl2 (0,1 mM), 5,85 g de EDTA (5 mM) y 0,07 g de PMSF (0,1 mM; Tabla 3).
6. Embalaje de columna CMAC
- Prepare el tampón de acetato de amonio (10 mM, pH 7.4) que se utilizará para lavar el IAM. PC. Partículas DD2 y en experimentos de caracterización en columna disolviendo 0,7708 g de acetato de amonio en 1 L de agua ultrapura desionizada. Ajuste el pH a 7.4 con solución de ácido clorhídrico.
- Después de 48 h de diálisis, retire el tubo de diálisis del tampón de diálisis y transfiera el contenido del tubo de diálisis a un tubo cónico de 15 ml.
- Centrifugar la mezcla a 4 °C durante 5 min a 400 x g. Deseche el sobrenadante y lave el pellet restante tres veces con 10 ml de tampón de acetato de amonio, centrifugando la mezcla a 4 °C durante 5 min a 400 x g, después de cada lavado.
- Después del tercer lavado, vuelva a suspender el pellet restante en 1 ml de tampón de acetato de amonio. Mézclelo bien y use la suspensión resultante para empacar la columna de vidrio 5/20 para producir la columna de cromatografía CMAC.
- Para empacar la columna, primero coloque un filtro inferior previamente empapado con tampón de acetato de amonio, en el soporte del filtro. Coloque el soporte del filtro en la columna de vidrio y atornille la tapa de la columna para asegurar la posición del soporte. Coloque la columna verticalmente en una abrazadera para los dedos y asegúrela en el soporte de laboratorio. Coloque un vaso de precipitados debajo de la columna.
- Utilizando un pipeteador de un solo canal, transfiera un pequeño volumen de la lechada obtenida en el paso 6.4 a la columna de vidrio. Vierta el material lentamente, sosteniendo la punta de la pipeta contra la pared de la columna de vidrio. Deje que el material de embalaje se asiente antes de verter otro volumen de purín.
- Para acelerar el proceso de embalaje, retire el búfer de arriba del lecho estacionario utilizando una micropipeta entre cada paso. Repita estos pasos hasta que se empaquete 1 ml de la suspensión.
- Coloque un filtro superior y atornille la unidad adaptadora para que no quede ningún búfer restante por encima de la fase estacionaria, como se presenta en la Figura 1. Asegure la posición de la unidad adaptadora con el bloqueo del adaptador.
- Conecte la columna a una bomba de cromatografía líquida (HPLC) de alto rendimiento, ajuste el caudal a 0,2 ml/min y lave la columna durante la noche con tampón de acetato de amonio. La columna ya está lista para el paso de caracterización. Conservar la columna a 4 °C hasta su uso.
NOTA: Para un almacenamiento más prolongado (columna que no se utiliza durante más de una semana), ejecute la columna con una solución de azida de sodio al 0,05% en tampón de acetato de amonio y guárdela a 4 °C.
PRECAUCIÓN: La azida de sodio es altamente tóxica cuando se ingiere por vía oral o se absorbe a través de la piel; solo debe manipularse debajo de la campana de humos. Asegúrese de usar una bata de laboratorio, gafas de seguridad y guantes (se prefiere el nitrilo) cuando trabaje con azida de sodio.
7. Caracterización de la columna CMAC
- Microscopía confocal y unión BDNF
- Preparar IAM. Pcc. Partículas de fase estacionaria DD2 con fragmentos de membrana celular inmovilizados obtenidos por separado de las células de neuroblastoma SH-SY5Y que sobreexpresan las células TrkB y SH-SY5Y TrkB-NULL siguiendo las instrucciones del paso 1 al paso 6.4.
- Para las muestras que se incubarán con BDNF antes de la tinción de anticuerpos, prepare la solución madre de BDNF disolviendo 10 μg de BDNF en 100 μL de agua desionizada ultrapura. Guarde la solución a -20 °C.
- Transferencia en tubos de microcentrífuga separados de 1,5 ml, alícuota de 100 μL de IAM. PC. Material de embalaje de columna DD2 con células inmovilizadas de neuroblastoma SH-SY5Y que sobreexpresan TrkB y alícuota de 100 μL de IAM. PC. Material de embalaje de columna DD2 con células SH-SY5Y TrkB-NULL inmovilizadas suspendidas en tampón de acetato de amonio.
- Añadir 390 μL de tampón de acetato de amonio, 10 μL de solución madre de BDNF y 0,5 μL de solución madre de ATP (preparada en la etapa 3.2) en cada tubo e incubar durante 1 h a temperatura ambiente con balanceo.
- Para las muestras que no se incubarán con BDNF antes de la tinción de anticuerpos, transfiera 100 μL de alícuota de IAM. PC. Material de embalaje de columna DD2 con células inmovilizadas de neuroblastoma SH-SY5Y que sobreexpresan TrkB suspendido en acetato de amonio en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml.
- Añadir 400 μL de tampón de acetato de amonio y 0,5 μL de solución madre de ATP (preparada en la etapa 3.2) en cada tubo e incubar durante 1 h a temperatura ambiente con balanceo.
- Girar las muestras preparadas en los pasos 7.1.2 y 7.1.4 a 4 °C durante 1 min a 10.000 x g y desechar el sobrenadante.
- Lave los gránulos resultantes con 500 μL de tampón de acetato de amonio durante 10 min y gire de nuevo a 4 °C durante 1 min a 10.000 x g y deseche el sobrenadante.
- A cada uno de los gránulos, agregue 220 μL de tampón de acetato de amonio, 25 μL de suero de cabra normal al 10% y 5 μL de anticuerpo primario anti-BDNF. Incubar en una cámara frigorífica (4 °C) durante la noche con balanceo.
- Al finalizar la etapa de incubación, gire la mezcla durante 1 min a 10.000 x g a 4 °C y deseche el sobrenadante.
- Lave el pellet resultante 3 veces con tampón de acetato de amonio que contenga detergente suave al 1% (por ejemplo, colato de sodio) durante 10 min y haga girar las mezclas durante 1 min a 10.000 x g a 4 °C y deseche el sobrenadante.
- Preparar la solución de anticuerpos secundarios mezclando 900 μL de tampón de acetato de amonio, 100 μL de suero de cabra normal al 10% y 1 μL de anticuerpo secundario conjugado con fluoróforo (dilución 1:1.000). Añadir 300 μL de solución secundaria de anticuerpos a cada uno de los gránulos obtenidos en la etapa 7.1.9. e incubar durante la noche a 4 °C con balanceo.
- Girar la mezcla a 10.000 x g durante 1 min a 4 °C y desechar el sobrenadante.
- Lave el pellet resultante 3 veces con tampón de acetato de amonio que contenga detergente suave al 1% (por ejemplo, colato de sodio) durante 10 min y haga girar la mezcla durante 1 min a 10.000 x g a 4 °C y deseche el sobrenadante.
- Resuspender los gránulos resultantes en 50 μL de tampón de acetato de amonio. Coloque 20 μL de cada una de las mezclas en un portaobjetos y cúbralo con un cubrebocas.
- Imagen del IAM. PC. Partículas DD2 con los fragmentos de membrana celular inmovilizados utilizando un microscopio láser confocal con excitación a 488 nm y emisión a 520 nm generada mediante un sistema láser de estado sólido. Utilice un objetivo 20x con un NA de 0,75 y un WD de 0,35 mm.
- Cromatografía de afinidad frontal utilizando 7,8-DHF como ligando marcador
- Conecte una columna CMAC a un sistema HPLC con un detector de matriz de diodos y/o un espectrómetro de masas.
- Preparar 500 ml de solución de 1 mM de 7,8-DHF en tampón de acetato de amonio que contenga 5% de metanol.
- Bombee la concentración constante del ligando marcador (1 mM) a través de la columna CMAC a un caudal de 0,4 ml/min a temperatura ambiente. Supervise el perfil de elución utilizando un detector de detección de matriz de diodos (DAD) (longitud de onda de 254 nm) o un espectrómetro de masas (utilice el modo de monitoreo de iones únicos; m/z 253 en modo de ionización negativa).
- Después de completar la ejecución, realice un lavado nocturno pasando el tampón de acetato de amonio a través de la columna.
- Repita los pasos 7.2.2. - 7.2.4. utilizando diferentes concentraciones del ligando marcador (750 nM, 500 nM, 300 nM), lavando las columnas durante la noche después de cada carrera. Utilice la cromatografía de afinidad frontal para calcular el ligando Kd, como se revisó en detalle, en otro lugar. 24,51
- Estudios de desplazamiento con Centella asiatica (L.) Urb. (gotu kola) extracto
- Preparar 500 ml de solución de 500 nM de 7,8-DHF en tampón de acetato de amonio que contenga 5% de metanol y extracto acuoso de centella asiática al 0,2% (10 mg/ml).
- Bombear la concentración constante del ligando marcador (500 nM) con el extracto a través de la columna a un caudal de 0,4 mL/min a temperatura ambiente. Monitoree el perfil de elución utilizando un detector DAD (longitud de onda 254 nm) o un espectrómetro de masas (use el modo de monitoreo de iones únicos; m / z 253 en modo de ionización negativa).
- Después de completar la ejecución, realice un lavado nocturno pasando el tampón de acetato de amonio a través de la columna.
- Trazar los perfiles de elución para 500 nM 7,8-DHF y el obtenido después de ejecutar la solución con extracto de centella asiática para inspeccionar el desplazamiento del ligando marcador.
8. Falta un enfoque de cromatografía de pico para identificar posibles aglutinantes de TrkB a partir del extracto de centella asiática
- Fraccionamiento del extracto de centella asiática en columnas CMAC
- Conecte por separado las columnas CMAC TrkB y TrkB-NULL a un sistema HPLC e inyecte 50 μL del extracto acuoso de centella asiática (10 mg/ml) en cada una de las columnas. Tampón de acetato de amonio de bomba (10 mM, pH 7.4) que contiene 5% de metanol a través de la columna a un caudal de 0.4 mL/min a temperatura ambiente.
- Recopile fracciones por separado de las columnas CMAC TrkB y TrkB-NULL de la siguiente manera: 0-5 min, 5-10 min, 10-15 min, 15-20 min, 20-25 min, 25-30 min, 30-35 min, 35-40 min, 40-45 min, 45-50 min, 50-55 min, 55-60 min.
- Congelar y liofilizar las fracciones obtenidas. Resuspend fracciones liofilizadas en 50 μL de metanol antes de proceder a la cromatografía líquida de ultra rendimiento y al análisis de espectrometría de masas.
- Cromatografía líquida de ultra rendimiento quadrupolo de espectrometría de masas de tiempo de vuelo (UPLC-QTOF-MS) análisis de fracciones de gotu kola CMAC
- Analizar todas las fracciones obtenidas en el punto 8.1.3. utilizando un espectrómetro de masas acoplado a un sistema UPLC (modo de análisis UPLC-MSE ). Analice las fracciones utilizando una columna C18 (2,1 x 50 mm, 1,7 μm) con una precolumna C18 VanGuard (2,1 mm x 5 mm, 1,7 μm).
- Eluya la columna utilizando las siguientes soluciones de gradiente a un caudal de 0,3 mL/min con fase móvil A (agua con ácido fórmico al 0,1%) y B (acetonitrilo con ácido fórmico al 0,1%): 0,0 min 99% A 1% B, 1,5 min 84% A 16% B, 5,0 min 80% A 20% B, 7,0 min 75% A 25% B, 10.0 min 65% A 35% B, 20.0-24.0 min 1% A 99% B, 25.0-29.0 min 99% A 1% B.
- Ajuste el volumen de inyección para cada muestra a 3 μL. Realice MSE en modos de resolución de iones positivos y negativos, con energía de colisión a 4V para baja energía y 20-35 V para alta energía.
- Utilice las siguientes condiciones de fuente ESI en modo de ionización positiva: voltaje capilar 1.5 kV, cono de muestreo 40 V, compensación de fuente 80, temperatura de fuente 100 ° C, temperatura de dessolvación. 350 ° C, flujo de gas cono 38.0 L / h, gas de dessolvación 400 L / h.
- Utilice las siguientes condiciones de fuente ESI en modo de ionización negativa: voltaje capilar 1.45 kV, cono de muestreo 40 V, compensación de fuente 80, temperatura de fuente 110 ° C, temperatura de desolvación. 300 ° C, flujo de gas cono 50.0 L / h, flujo de gas de dessolvación 652 L / h.
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Representative Results
Siguiendo el protocolo, se ensamblaron dos columnas cromatográficas CMAC: una con los fragmentos de membrana celular de neuroblastoma SH-SY5Y inmovilizados con TrkB sobreexpresado y otra con fragmentos de membrana celular SH-SY5Y TrkB-NULL. La columna CMAC correctamente ensamblada se presenta en la Figura 1 y los pasos involucrados en la inmovilización de fragmentos de membrana celular se presentan en la Figura 2.
Desde la inmovilización de los receptores TrkB en IAM. PC. La fase estacionaria cromatográfica DD2 no se había intentado antes, la inmovilización exitosa de los receptores se confirmó mediante tinción de anticuerpos y cromatografía de afinidad frontal utilizando un ligando marcador: 7,8-DHF. En la Figura 2 se presenta una representación esquemática del experimento de tinción de anticuerpos. Los fragmentos de membrana celular obtenidos de la línea celular de neuroblastoma que sobreexpresan los receptores de TrkB y los fragmentos de la membrana celular de la línea celular parental sin receptores de TrkB (TrkB-NULL)) se inmovilizaron en IAM. PC. Partículas DD2 utilizando el protocolo optimizado. Posteriormente, las partículas con fragmentos de membrana celular inmovilizados se incubaron con BDNF (ligando fisiológico) y luego con anticuerpos secundarios primarios y marcados con fluorescentes (Figura 2). IAM. PC. Las partículas DD2 con fragmentos de membrana celular de TrkB de neuroblastoma inmovilizados y en presencia de BDNF dieron lugar a partículas marcadas fluorescentemente (Figura 3C). No se observó fluorescencia (excepto fluorescencia de fondo débil) cuando se investigaron partículas IAM encapsuladas en la membrana celular TrkB-NULL (Figura 3A) o cuando no se utilizó BDNF en el caso de partículas IAM encapsuladas en la membrana celular TrkB (Figura 3B).
Para caracterizar la unión de un pequeño ligando marcador (7,8-DHF) a los receptores TrkB inmovilizados se realizó cromatografía de afinidad frontal con diferentes concentraciones de 7,8-DHF. En la Figura 4 se presenta un cromatograma típico de concentraciones crecientes de 7,8-DHF en una columna CMAC funcional. La unión específica de 7,8-DHF al TrkB inmovilizado se confirmó por las disminuciones dependientes de la concentración en el tiempo de retención del ligando marcador. Los resultados de la cromatografía de afinidad frontal obtenidos en una columna CMAC no funcional se presentan en la Figura 5. La falta de cambios dependientes de la concentración en la retención del ligando marcador indica el intento fallido en la preparación de CMAC.
Los compuestos inyectados en la columna CMAC interactúan no solo específicamente, sino que también pueden interactuar no específicamente con IAM. PC. Partículas DD2, bicapa de fosfolípidos de los fragmentos de membrana celular inmovilizados y otras proteínas presentes en la bicapa. Para descartar compuestos que no interactúen específicamente con la columna CMAC durante el proceso de cribado de extractos complejos para aglutinantes TrkB, es importante preparar la columna de control negativo CMAC inmovilizando fragmentos de membrana celular de la línea celular parental que no expresan la proteína objetivo (en este caso TrkB-NULL). Los resultados de la cromatografía de afinidad frontal obtenidos en una columna TrkB-NULL de CMAC negativa se presentan en la Figura 6.
Las columnas funcionales de CMAC se pueden utilizar para diferentes propósitos, como la caracterización de la proteína objetivo, el estudio de las interacciones de compuestos individuales con los objetivos inmovilizados (por ejemplo, la obtención de constantes de disociación, Kd) o la determinación de la cinética de unión (kon y koff), etc.24. Las columnas también se pueden usar para examinar muestras complejas, como extractos de plantas para detectar la presencia de compuestos que se unen a los receptores de TrkB, por lo tanto, potencialmente contienen moléculas que actúan como agonistas o antagonistas de TrkB. Para verificar si un extracto contiene potencialmente compuestos que interactúan con los receptores inmovilizados, se realiza un experimento de desplazamiento simple. El resultado del experimento de competición realizado con extracto de centella asiática y 500 nM de 7,8-DHF en una columna TrkB funcional se presenta en la Figura 7. La adición de extracto acuoso de centella asiática al 0,2% (10 mg/ml) dio lugar a una reducción significativa de la retención de 7,8-DHF, lo que indica la presencia de ligandos competidores para el sitio de unión al agonista. El resultado del experimento de desplazamiento realizado en la columna TrkB-NULL negativa de CMAC se presenta en la Figura 8. La falta de reducción de la retención de 7,8-DHF en esa columna confirma aún más la falta de receptores TrkB funcionales en la columna CMAC TrkB-NULL.
Para identificar metabolitos especializados que interactúan específicamente con los objetivos inmovilizados, las columnas CMAC se utilizan en un enfoque llamado cromatografía de pico faltante52 después del experimento de desplazamiento. En este enfoque, un pequeño volumen del extracto investigado se cromatografía en paralelo en la columna que contiene el objetivo inmovilizado investigado y la columna de control negativo CMAC. Estas dos columnas difieren en la expresión del objetivo, por lo tanto, cualquier diferencia en los patrones de retención de moléculas individuales se debe a la naturaleza específica de las interacciones con los objetivos investigados en la columna CMAC que contiene estos TMP. Las fracciones cronometradas de ambas columnas se recogen, concentran y posteriormente analizan en una columna C18. Se comparan los cromatogramas obtenidos, y los compuestos representados por picos retenidos de manera similar en ambas columnas se etiquetan como moléculas que interactúan no específicamente. La presencia de un pico en fracciones posteriores en la columna CMAC con los receptores inmovilizados y la falta de un pico que represente el mismo compuesto en fracciones tempranas de la columna negativa CMAC representa la interacción específica del compuesto con el objetivo inmovilizado. Los compuestos identificados en este paso pueden ser objeto de aislamiento y pruebas adicionales, sin la necesidad de realizar fraccionamiento bioguiado. El enfoque de cromatografía de pico faltante se utilizó para identificar compuestos que interactúan específicamente con los receptores TrkB del extracto de centella asiática. El extracto de centella asiática se fraccionó en columnas TrkB y TrkB-NULL y los compuestos presentes en estas fracciones se analizaron utilizando UPLC-QTOF-MS. La investigación de los cromatogramas de cada una de las fracciones condujo a la identificación de un compuesto fuertemente retenido en la columna TrkB (fracción 50-55 min), mientras que eluyó tempranamente la columna TrkB-NULL (fracción 0-5 min), lo que indica una interacción específica con los receptores TrkB inmovilizados (Figura 9). El compuesto que se libera a ~ 17.48 min (Figura 9) ahora está dirigido para aislamiento y pruebas en ensayos funcionales.
Figura 1. Columna CMAC correctamente ensamblada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Pasos de preparación de CMAC y marcado de anticuerpos fluorescentes de los receptores inmovilizados. Representación esquemática de la preparación de una columna CMAC (1-4) y del experimento de marcado de anticuerpos (5-8). (1) Fragmentos homogeneizados de la membrana celular que contienen proteína transmembrana dirigida, TrkB. (2) Fragmentos de membrana celular solubilizados en una estructura micelar. (3) Fragmentos de membrana celular inmovilizados en la superficie de las partículas de IAM. (4) Partículas de IAM con fragmentos de membrana celular inmovilizados empaquetados en una columna de vidrio. (5) Receptor TrkB inmovilizado en los fragmentos de la membrana celular. (6) Unión del ligando natural BDNF al receptor TrkB funcional. (7) Unión de los anticuerpos primarios a las moléculas de BDNF. (8) Unión de anticuerpos secundarios marcados con fluoróforos a los anticuerpos primarios que dan lugar a fluorescencia verde. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Inmovilización de fragmentos de membrana celular con receptores TrkB sobre partículas IAM. Imágenes de microscopía confocal que muestran la inmovilización de fragmentos de membrana celular con receptores TrkB funcionales en partículas IAM. (A) Fragmentos de membrana celular de la línea celular SH-SY5Y TrkB-NULL inmovilizados en partículas de IAM después de la incubación con BDNF, anticuerpo primario y anticuerpo secundario marcado con fluoróforo. (B) Fragmentos de membrana celular de líneas celulares de neuroblastoma SH-SY5Y que expresan TrkB inmovilizado en partículas de IAM después de la incubación con anticuerpo primario y anticuerpo secundario marcado con fluoróforo sin BDNF. (C) Fragmentos de membrana celular de líneas celulares de neuroblastoma SH-SY5Y que expresan TrkB inmovilizado en partículas de IAM después de la incubación con BDNF, anticuerpo primario y anticuerpo secundario marcado con fluoróforo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Cromatogramas de afinidad frontal de 7,8-DHF en la columna TrkB CMAC. Cromatograma frontal de concentraciones crecientes de 7,8-DHF en la columna TrkB CMAC, donde A - 1 mM, B - 750 nM, C - 500 nM y D - 300 nM. Se utilizó tampón de acetato de amonio (10 mM, pH 7.4) con metanol al 5% como eluyente a una velocidad de flujo de 0.4 mL/ min. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. Cromatogramas de afinidad frontal de 7,8-DHF en columna TrkB CMAC no funcional. Cromatograma frontal de diferentes concentraciones de 7,8-DHF en la columna TrkB CMAC no funcional, donde A -1 μM, B - 1 μM, C - 750 nM y D - 500 nM. Se utilizó tampón de acetato de amonio (10 mM, pH 7.4) con metanol al 5% como eluyente a una velocidad de flujo de 0.4 mL/ min. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6. Cromatogramas de afinidad frontal de 7,8-DHF en la columna TrkB-NULL CMAC. Cromatograma frontal de concentraciones crecientes de 7,8-DHF en la columna TrkB-NULL CMAC, donde A - 1 mM, B - 750 nM, C - 500 nM y D - 300 nM. Se utilizó tampón de acetato de amonio (10 mM, pH 7,4) con 5 % de metanol como eluyente a un caudal de 0,4 ml/min. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 7. Cromatogramas de afinidad frontal de 7,8-DHF con extracto de centella asiática al 0,2% en la columna TrkB CMAC. Perfil de elución frontal representativo de (A) 500 nM 7,8-DHF + 0,2% de extracto de centella asiática (10 mg/ml) y (B) 500 nM 7,8-DHF en la columna CMAC TrkB. Se utilizó tampón de acetato de amonio (10 mM, pH 7.4) con metanol al 5% como eluyente a una velocidad de flujo de 0.4 mL/ min. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8. Cromatogramas de afinidad frontal de 7,8-DHF con extracto de centella asiática al 0,2% en la columna TrkB-NULL CMAC. Perfil de elución frontal representativo de (A) 500 nM 7,8-DHF y (B) 500 nM 7,8-DHF + 0,2% de extracto de centella asiática (10 mg/mL) en la columna TrkB-NULL CMAC. Se utilizó tampón de acetato de amonio (10 mM, pH 7.4) con metanol al 5% como eluyente a una velocidad de flujo de 0.4 mL/ min. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 9. Cromatogramas UPLC-MS de fracciones de extracto de centella asiática. Cromatogramas UPLC-MS de fracciones de extracto de centella asiática (A) eluuados entre 0-5 min de la columna TrkB-NULL CMAC y (C) eluidos entre 50-55 min de la columna CMAC TrkB. Un compuesto con un tiempo de retención de 17,48 min presente en ambas fracciones, como se confirma al hacer coincidir los espectros de masas (B y D) se identificó como un aglutinante TrkB potencial. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Búfer de homogeneización | ||||
| 1 | Tris(hidroximetil)aminometano clorhidrato (Tris-HCl) | 50 metros | ||
| 2 | Cloruro de sodio (NaCl) | 100 metros | ||
| 3 | Cloruro de calcio anhidro (CaCl2) | 3 mM | ||
| 4 | Cloruro de magnesio hexahidratado (MgCl2) | 2 mM | ||
| 5 | Cloruro de potasio (KCl) | 5 mM | ||
| 6 | Fluoruro de fenilmetanosulfonilo (PMSF) | 0,1 mM | ||
| 7 | Benzamidina | 3 mM | ||
| 8 | Cóctel inhibidor de la proteasa (100X) | (1/100) | ||
| 9 | Glicerol | 10% | ||
| 10 | Adenosina 5'-trifosfato (ATP) hidrato de sal disódica | 100 μM | ||
| 11 | Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) | 5mM | ||
Tabla 1. Composición tampón de homogeneización.
| Tampón de solubilización | ||||
| 1 | Tris(hidroximetil)aminometano clorhidrato (Tris-HCl) | 50 metros | ||
| 2 | Cloruro de sodio (NaCl) | 100 metros | ||
| 3 | Cloruro de calcio anhidro (CaCl2) | 3 mM | ||
| 4 | Cloruro de magnesio hexahidratado (MgCl2) | 2 mM | ||
| 5 | Cloruro de potasio (KCl) | 5 mM | ||
| 6 | Fluoruro de fenilmetanosulfonilo (PMSF) | 0,1 mM | ||
| 7 | Benzamidina | 3 mM | ||
| 8 | Cóctel inhibidor de la proteasa (100X) | (1/100) | ||
| 9 | Glicerol | 10% | ||
| 10 | Adenosina 5'-trifosfato (ATP) hidrato de sal disódica | 100 μM | ||
| 11 | Colato de sodio | 2% | ||
Tabla 2. Composición tampón de solubilización.
| Tampón de diálisis | ||||
| 1 | Tris(hidroximetil)aminometano clorhidrato (Tris-HCl) | 50 metros | ||
| 2 | Cloruro de sodio (NaCl) | 100 metros | ||
| 3 | Cloruro de calcio anhidro (CaCl2) | 0,1 mM | ||
| 4 | Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) | 5 mM | ||
| 5 | Fluoruro de fenilmetanosulfonilo (PMSF) | 0,1 mM | ||
Tabla 3. Composición del tampón de diálisis.
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Discussion
La identificación de compuestos activos presentes en mezclas complejas de metabolitos especializados es una tarea muy desafiante23. Tradicionalmente, los compuestos individuales se aíslan y su actividad se prueba en diferentes ensayos. Este enfoque requiere mucho tiempo y es costoso y a menudo conduce al aislamiento y la identificación de los compuestos más abundantes y bien caracterizados23. Los ensayos de cribado de alto rendimiento utilizados actualmente dependen en gran medida de las bibliotecas de química combinatoria de cribado con objetivos ya conocidos y no están diseñados para identificar y aislar compuestos biológicamente activos presentes en mezclas complejas53.
CMAC permite la identificación de compuestos dirigidos a TMP 23,24,54. En esta técnica se inmovilizan fragmentos de membrana celular con TMPs en la superficie de partículas de fase estacionaria IAM23,24. CMAC es un enfoque único que permite la inmovilización de fragmentos de membrana celular con proteínas específicas en el soporte sólido imitando la bicapa24 de fosfolípidos de membrana celular. Esto permite preservar la funcionalidad de los objetivos de proteínas inmovilizadas y proporciona condiciones fisiológicas cercanas al uso de CMAC para identificar moléculas pequeñas que interactúan con TMP. CMAC ofrece la ventaja de oportunidades para el descubrimiento de nuevos andamios químicos a partir de bibliotecas de productos naturales únicos, que no se pueden probar utilizando ningún otro de los ensayos utilizados actualmente23 . El enfoque propuesto permite la identificación de compuestos que interactúan con TMP sin desentrañar la naturaleza de esta interacción. El modo de interacción (interacción alostérica u ortostérica; inhibición o activación) debe verificarse mediante ensayos funcionales basados en células. CMAC con los objetivos de proteínas inmovilizadas también se puede utilizar en la caracterización de la farmacodinámica (por ejemplo, constante de disociación, Kd) o en la determinación de la cinética de unión (kon y koff) de ligandos de moléculas pequeñas que interactúan con el objetivo, así como en el proceso de caracterización de los sitios de unión en la proteína inmovilizada24 . Aunque CMAC solo permite la identificación de compuestos que se unen a TMP, es un enfoque innovador que acelera significativamente el primer paso en la tubería de descubrimiento de fármacos, ya que no requiere purificación de compuestos, que actualmente ha sido el principal cuello de botella en el proceso de descubrimiento de fármacos a partir de mezclas naturales.
Aunque el protocolo presentado se centra en la inmovilización de un receptor transmembrana (TrkB), la tecnología CMAC se puede utilizar en la preparación de columnas con otros objetivos. Uno de los aspectos cruciales de la preparación de CMAC es la elección de la línea celular o el tejido que se utiliza para aislar los fragmentos de la membrana celular. Si se utilizan columnas en el cribado de mezclas complejas en busca de compuestos que interactúan con los receptores inmovilizados, se recomienda utilizar líneas celulares que sobreexpresen la proteína objetivo. El uso de una línea celular de este tipo dará como resultado un mayor número de objetivos inmovilizados y aumentará la posibilidad de identificación de compuestos con una menor afinidad hacia el objetivo o moléculas menos abundantes. Si uno se centra en la caracterización de la proteína inmovilizada, se recomienda el uso de una línea celular nativa, ya que las modificaciones post-traduccionales que sufre la proteína, así como el entorno de fosfolípidos pueden diferir significativamente en la línea celular transfectada.
Algunos aspectos del aislamiento de la membrana celular y la inmovilización en partículas de IAM son críticos y pueden requerir modificaciones dependiendo del tipo de receptor o la fuente de la proteína. Para prevenir la escisión proteolítica de las proteínas inmovilizadas, es esencial utilizar inhibidores de la proteasa adecuados en los tampones de homogeneización y solubilización. Se recomienda una búsqueda bibliográfica para identificar los inhibidores de la proteasa requeridos. En el proceso de optimización del protocolo, determinamos que la adición de ATP y glicerol aumenta el número de sitios de unión (Bmax) en las columnas CMAC al inmovilizar TrkB. Otros cofactores pueden ser necesarios a la hora de optimizar la inmovilización de otros tipos de objetivos transmembrana24. Actualmente, estamos investigando la adición de colesterol en el proceso de inmovilización de TrkB, ya que recientemente se encontró que el colesterol modifica los efectos de los ligandos TrkB48. Anteriormente se informó que la adición de colesterol y/u otros lípidos puede ser necesaria para la obtención de columnas funcionales de CMAC24.
Se pueden usar diferentes tipos de detectores para monitorear el eluido de la columna, incluido el detector de matriz de diodos para ligandos con cromóforos, espectrometría de masas o detector de flujo de radio para ligandos radiactivos.
El monitoreo de la estabilidad de las columnas CMAC es de importancia crítica. Las columnas de CMAC pueden ser estables hasta por varios meses, dependiendo del tipo de proteína inmovilizada, la frecuencia de uso y las condiciones de almacenamiento. Se recomienda almacenar la columna en solución de azida de sodio al 0,05% en tampón de acetato de amonio a 4 °C si la columna permanece sin usar durante más de una semana. Es importante lavar bien la columna con tampón de acetato de amonio después de períodos más largos antes de intentar usarlo. Se recomienda controlar la funcionalidad de la columna inyectando una concentración seleccionada de un ligando marcador semanalmente.
A pesar de las numerosas ventajas, la tecnología CMAC tiene varias limitaciones que deben tenerse en cuenta al usar las columnas en los esfuerzos de descubrimiento de fármacos. En primer lugar, el número de dianas transmembrana inmovilizadas disminuye con el tiempo, por lo que se recomienda que el número total de sitios de unión se supervise semanalmente24. Una de las razones de esta disminución es la consecuencia del proceso de inmovilización que se basa en la adsorción y no implica la introducción de enlaces covalentes. Los compuestos lipofílicos pueden retenerse fuertemente en las columnas de CMAC debido a la unión inespecífica significativa a la superficie de IAM y las bicapas de fosfolípidos. Esto aumenta significativamente el tiempo de análisis disminuyendo el rendimiento. El proceso de preparación de la columna CMAC es específico de la línea celular y requiere una comprensión profunda de la naturaleza de las proteínas inmovilizadas, lo que lo hace menos adecuado para objetivos menos caracterizados.
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Disclosures
Lukasz Ciesla colabora con Regis Technologies, el proveedor del IAM. PC. Partículas DD2.
Acknowledgments
Z.C.A. fue apoyado por el Consejo de Investigación Científica y Tecnológica de Turquía (TUBITAK) 2219- Programa Internacional de Becas de Investigación Postdoctoral. La investigación reportada en esta publicación fue apoyada por el Centro Nacional de Medicina Complementaria e Integrativa de los Institutos Nacionales de Salud bajo el número de premio 1R41AT011716-01. Este trabajo también fue parcialmente apoyado por la American Society of Pharmacognosy Research Starter Grant, regis Technologies grant to L.C. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales de los Institutos Nacionales de Salud.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 7-8 Dihydroxyflavone hydrate | Sigma-Aldrich | D5446-10 mg | ≥98% (HPLC) |
| Adenosine 5'-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A2383-1 g | |
| Ammonium acetate | VWR Chemicals BDH | BDH9204-500 g | |
| BDNF antibody | Invitrogen | PA5-15198-400 μL | Primary antibody; 2 mg/mL of concentration |
| Benzamidine hydrochloride hydrate | Sigma-Aldrich | B6506-25 g | |
| Brain derived neurotrophic factor (BDNF) human | Sigma-Aldrich | B3795-10 μg | Recombinant, expressed in E. coli, lyophilized powder, suitable for cell culture |
| Calcium chloride | VWR Analytical | BDH9224-1 kg | |
| Cholic acid sodium salt | Alfa Aesar | J62050-100 g | |
| Dounce homogenizer | VWR | 71000-516 | 40 mL, 285 mm (overall lenght), 32 x 140 mm (O.D. x H) |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 493511 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | VWR Analytical | BDH-9232-500 g | |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F2442-500 mL | sterile-filtered, suitable for cell culture |
| G418 disulfate salt solution | Sigma-Aldrich | G8168-100 mL | 50 mg/mL in H2O, 0.1 μm filtered, suitable for cell culture |
| Glycerol | VWR Life Science | E520-100 mL | |
| Immobilized artificial membrane (IAM.PC.DD2) | Regis Technologies, Inc. | 1-771050-500 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | VWR Analytical | BDH9244-500 mL | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 322425 | |
| Nikon C2 DUVb | Nikon | Confocal laser scanning microscope | |
| Normal goat serum (10%) | Life Technologies | 50197Z | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333-100 mL | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Thermo Scientific | 36978-5 g | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | VWR Life Science | K812-500 mL | 1x |
| Potassium chloride | VWR Chemicals BDH | 0395-1 kg | |
| Protease inhibitor cocktail | VWR Life Science Ambreso | M221-1 mL | Proteomics grade, containing 50 mM AEBSF, 30 µM aprotonin, 1 mM bestatin, 1 mM E-64 and 1 mM leupeptin |
| RPMI-1640 medium | Sigma-Aldrich | R8758-500 mL | with L-glutamine and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture |
| Secondary antibody goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen Alexa Flour Plus 488 | A32731 | |
| SH-SY5Y Neuroblastoma cell lines expressing Trk-B | Kerafast | ECP007 | |
| SH-SY5Y Trk-NULL cell line | Kerafast | ECP005 | |
| Snake skin dialysis tubing | Thermo Scientific | 88245 | 10K MWCO, 35 mm dry I.D. |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Sodium chloride | BDH VWR Analytical | BDH9286-2.5 kg | |
| Tricorn 5/20 column | GE Healthcare | 24-4064-08 | |
| Tris-HCl | VWR Life Science | 0497-1 kg | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T4049-500 mL | 0.25%, sterile-filtered, suitable for cell culture, 2.5 g porcine trypsin and 0.2 g EDTA |
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